Krooninen sairaus

tiivistelmä

Metastasoitunut peräsuolen syöpä (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) tukeutuu irtoaminen aggressiivisen pahanlaatuisten solujen primaarikasvaimen verenkiertoon ja, yhtäpitävästi, The läsnäolo näistä verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) liittyy huonoon ennusteeseen. Tässä työssä, molekyyli luonnehdinta CTC peräisin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista lähestyttiin, jonka tavoitteena on ymmärtää niiden biologian ja parantaa niiden kliinistä käyttökelpoisuutta hallinnassa peräsuolen syöpäpotilailla. Tätä varten EpCAM-pohjainen immunoeristämistä CTC yhdistettiin koko transcriptome vahvistus ja hybridisaatio päälle cDNA mikrosiruja. Geenien ilmentyminen tietoja metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaille kerran taustalla epäspesifisen immunoeristämistä ryhmästä valvonnan oli vähennetty, johti 410 geenit, jotka olivat tunnusomaisia ​​CTC väestöstä. Bioinformatiikka käytettiin biologisen tietojen tulkintaa, paljastaen että CTC on ominaista geenit liittyvät solun liikkumista ja tarttuvuus, solukuoleman ja lisääntymistä, ja solujen signalointi ja vuorovaikutusta. RTqPCR riippumattomaan sarja metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaiden ja verrokkien käytettiin validointi useita geenejä, jotka liittyvät pääasiassa solun toimintoja kuvaavat CTC väestöstä. Vertailu ensisijainen karsinoomat ja keuhkojen ja maksametastaaseista liittyi lisäksi CTC-geenien edistämisessä etäpesäke. Lisäksi korrelaatio CTC-geenin ilmentymisen kanssa kliinisten parametrien osoittaneet havaitseminen ja ennusteen merkitys. Lopuksi molekulaarinen CTC peräisin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista ja tunnistaminen ja ennustavia biomarkkerit edustavat innovatiivista ja lupaava lähestymistapa kliinisessä hoidossa tämäntyyppisen potilaista.

Citation: Barbazan J, Alonso-Alconada L , Muinelo-Romay L, Vieito M, Abalo A, Alonso-Nocelo M, et al. (2012) Molecular karakterisointi Kiertävä kasvainsolujen in Human metastasoituneen kolorektaalisyövän. PLoS ONE 7 (7): e40476. doi: 10,1371 /journal.pone.0040476

Editor: Xin Wei Wang, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 tammikuu 2012; Hyväksytty: 8 kesäkuu 2012; Julkaistu: 10. heinäkuuta 2012

Copyright: © 2012 Barbazan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain rahoittama Espanjan terveysministeriön (CP08 /00142) ja Euroopan komissio Program Fondo Europeo de Desarrollo Regional (EAKR). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. J. Barbazan ja L. Alonso-Alconada vastaanottavat apurahoja Espanjan opetus- ja tiede- ja Baskimaan hallitus (Espanja), tässä järjestyksessä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja toiseksi naisilla, yli 1,2 miljoonaa uutta syöpätapausta arvioidaan tapahtuneen maailmanlaajuisesti vuonna 2008 [1]. Kliinisesti kaukainen kasvain levittämistä ja etäpesäkkeiden ovat tärkeimpiä tekijöitä ennusteeseen: kun taas ei-invasiivisia vaiheen I karsinoomat esittää 90% viisi vuotta-eloonjääminen, vaihe IV karsinoomat kaukaisiin etäpesäkkeitä korreloi dramaattinen pudotus 10% eloonjääneitä [2 ]. Näin ollen uusia terapeuttisia strategioita määrä tehostaa vastaan ​​etäpesäkkeitä ja tarkka biomarkkereita seurantaa CRC potilaat ovat suuria haasteita yhdessä varhainen havaitseminen ja seulonta korkean riskin populaatiot.

syövän leviämisen vetoaa irtoaminen aggressiivisen pahanlaatuisten solujen primaarikasvaimen verenkiertoon pääasiallisena lähteenä edelleen etäpesäkkeiden [3]. On yleisesti hyväksytty, että verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) oma tai hankkia kyky kiertää isännän immuunijärjestelmää ja saavuttamaan kaukainen elin, yleensä maksan CRC, jossa he perustaa toissijainen kasvaimen kasvua sivusto on erittäin tehoton mutta dramaattinen prosessi [4]. Yhtäpitävästi, läsnäolo CTC ääreisveressä on liitetty huonoon ennusteeseen eri syöpätyyppien, mukaan lukien CRC [5], [6]. Kuten oletetut perustajat synnyttämisessä etäpesäkkeiden, CTC on tulossa kiinnostava aihe, ja ymmärtää niiden biologiasta voi avata uusia näkökulmia onkologian. Jotka koskevat niiden molekyylitason karakterisointi, viime vuosina useita ryhmiä ovat esittäneet ekspressiotietojen keskittyneet tiettyihin geeneihin tai signaalinvälitysreittien liittyvät syöpään parantamiseen herkkyys ja spesifisyys havaitsemiseen [7], [8]. Smirnov et ai. lähestyi profilointi CTC kautta sekalaiset rinta-, eturauhas- ja paksusuolen ja peräsuolen metastaattinen näkökulmasta [9]. Lisäksi tiedot on syntymässä mahdollisuudesta opiskella biologiaa ja hyödyllisyys arvioida kohdistettuja hoitomuotoja perustuvat genomiseen profiloinnin CTC [10], [11].

Tässä skenaariossa määritelty rajoitettu tehoa nykyisten solunsalpaajahoitojen metastaattisen CRC (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) ja CTC avaintekijöiksi hallinnassa etäpesäkkeitä erityisiä molekyyli profilointi CTC väestöstä lähestyttiin. Yhdistelmä CTC EpCAM-pohjainen immunoeristämistä ja tarkka RNA: n eristäminen hyvin pieni määrä CTC plus koko transcriptome vahvistus, mahdollisti hybridisoitua cDNA CTC väestöstä päälle geeni-ilmentymisen mikrosiruja. Soveltamalla tätä menettelyä ryhmään metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista verrattuna taustan epäspesifisen eristetyt hematopoieettisten solujen, väestö immuunieristettyjä CTC profiloitiin nimenomaan. Sen lisäksi, että molekulaarinen CTC ymmärtämiseksi biologian pääasiallinen lähde etäpesäkkeiden CRC, nämä tiedot ovat mahdollisia terapeuttisia kohteita ja diagnostisten /prognostisten biomarkkereita.

Tulokset

CTC immunoeristämistä ja Molecular Profilointi

menettelyt CTC immunoeristämistä, RNA ja vahvistus hybridisa; seen päälle cDNA mikrosiruja on kuvattu kuviossa 1A. Lyhyesti, CTC oli immuunieristettyjä 7,5 ml ääreisverenkierron Vaiheen IV metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilailla (n = 6, taulukko S1). Magneettiset helmet käytettiin, jotka oli päällystetty monoklonaalisella vasta-aineella kohti ihmisen epiteelisolujen Cell Adhesion Molecule (EpCAM), pinta-molekyyli ilmentyy suuresti epiteelissä-alkunsa kasvaimia, kuten CRC. RNA eristetyistä CTC puhdistettiin käyttämällä kittiä suunniteltu erityisesti alhainen runsautta näytteitä. Samanaikaisesti samaa protokollaa sovellettiin verinäytteitä terveiltä luovuttajilta (n = 3) luoda perusuran tausta epäspesifistä kuin CTC immunoeristämistä. Ennen geenin ilmentymisen analyysi, kun läsnä on eristetty CTC varmistettiin suoralla immunofluoresenssilla visualisointi cocktail vasta-aineiden sytokeratiineja 8, 18 ja 19 (kuvio S1), ja yhdistelmä kahdesta biomarkkereiden validoitu tarkkaa kvantifiointia CTC metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaat (GAPDH-CD45; [12]) (Mann-Whitney U, p-arvo 0,05) (kuvio 1 B). Lisäksi tarkkuus menetelmää arvioitiin hyödyntämisaste aikana immunoeristämistä johti mediaani 91,56% (Methods S1).

(A) Kaavamainen esitys menettelystä käytetään CTC molekulaarinen. CTC eristettiin 7,5 ml ääreisverenkierron immunomagneettisella erottaminen käyttäen anti-EpCAM päällystettyjä magneettisia helmiä. Eristetyt solut altistettiin RNA, jota seuraa koko transcriptome vahvistus prosessi (WTA). Lopuksi monistettu cDNA hybridisoitiin päälle Agilent geeniekspression taulukot. (B) GAPDH-CD45 tasot kontrolleissa ja metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaita mitattuna reaaliajassa PCR. Vaakapalkeilla edustavat mediaani kunkin ryhmän (* p 0,05). (C) Spearman korrelaatioanalyysiä välillä GAPDH-CD45 tasoja, jotka on saatu jälkeisistä array data ja qPCR ennen WTA vahvistusta. (D) SAM analyysi lähtö kuvaaja, joka esittää geenin ilmentymisen eroja potilaiden ryhmän ja valvontaa. Dots korostettu vastaavat geenien kanssa tilastollisesti merkittävästi lisätä ilmentymistasoissa potilaiden ryhmässä kontrolliin verrattuna tausta, pidetään luonnehtia CTC väestöä metastasoituneen kolorektaalisyövän.

Jotta luonnehtia CTC väestön eristetty alkaen metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaiden kuvaamat menetelmät Gonzalez-Roca et al. mukautettiin, tarkkoja geeniekspressioprofilointi hyvin pienten solupopulaatioiden [13]. Pohjimmiltaan, puhdistettu RNA käsiteltiin edelleen DNaseI, monistettiin käyttäen WTA2 koko transcriptome amplifikaatiomenetelmän ja komplementaarinen DNA leimattiin ja hybridisoitiin päälle Agilent ilmaisu paneelit (kuvio 1A) (Gene Expression Omnibus, GEO. Liittyminen numero: GSE31023). Kun ensimmäinen esikäsittelyä raakadataa, keskimäärin 21,070 täplät suodatettiin kriteerien mukaisesti on kuvattu materiaaleissa Menetelmät, jotka edustivat 47,35%: n paikkoja microarray enintään 32443 ja vähintään 13247. Kun Suodatuksen% variaatiokerroin (CV) ja kopioidaan antureista vaihteli 5,98%: sta 12,13%. Normalisointi kussakin microarray suoritettiin käyttäen lössi menetelmää, jossa oletetaan, että useimmat geenit mikrosiruja ei ekspressoituu differentiaalisesti verrattuna kontrolliin, joten normalisointi kaikkien microarray data suoritti Aquantile menetelmä toteutetaan Limma paketti R tilastollisen ohjelmisto. Tämä menetelmä varmistaa, että A-arvot (keskiarvo voimakkuudet) oli sama empiirinen jakautuminen mikrosiruja kuitenkin jätettävä M arvot (log-suhde) muuttumattomina. Korrelaatio analyysi RTqPCR GAPDH-CD45 tasoa ennen ja jälkeen monistuksen osoitti vahvaa lineaarisuus prosessin aikana transcriptome vahvistus (Spearman kerroin: 0,8667, p-arvo 0,005) (kuvio 1C).

Seuraava vaihe mukana geeni-ilmentymisen profilointi CTC eristettyjen metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista taustaa vasten kontaminoivien solujen aikana immunoeristämistä. Tätä varten normalisoitu geenien ilmentyminen intensiteetit metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaiden ja ryhmästä valvonnan käsiteltiin käyttäen MeV (MultiExperiment Viewer) ohjelmiston (katso Methods S1). Saadut signaalit terveiden verrokkien katsottiin taustan ei-spesifisesti eristetty verisolut, jotka olivat pääasiassa lymfosyyttejä. Saatu signaali metastasoituneen kolorektaalisyövän potilailla edustaa summa tämän ei-spesifisen tausta sekä spesifisen geenin ilmentymisen mallia CTC. Vähentämällä Tätä taustaa kontaminoivat ei-CTC väestön poistettiin, ja tuloksena saatu geenit osoittavat tilastollisesti merkittävän ilmentymisen katsottiin luonnehtia CTC väestön metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaalla (kuvio 1A). Yhtäpitävästi, kaikki merkittävät geenit esitellään positiivinen ilmaisun metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaalla kun vähentämällä taustan terveiltä luovuttajilta (kuvio 1 D), joka oli yhdenmukainen läsnäolo CTC vain metastasoituneen kolorektaalisyövän näytteissä. Tämä strategia johti tunnistamiseen lopulliset 410 geenejä, jotka olivat ominaisia ​​CTC väestöstä (taulukko S2), jossa on hierarkkinen klusterointi analyysi selvästi erotteleva välillä metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaiden ja verrokkien (kuvio 2A).

(A) hierarkkinen klusterointi erilaisesti ilmaisi geenien välillä (n = 6) ja valvonta (n = 3) (CTC geenit). (B) RTqPCR validointi yhdentoista geenien valittu joukko tietoja. CD45-normalisoitu kertainen muutos eroja metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaiden (n = 20) ja terveiden verrokkien (n = 10) (harmaa palkki) CTC rikastunut jae (mustat palkit; *** p 0,0001). Huomattavaa on, että mitään eroa ei ollut havaittavissa metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilailla (n = 5) ja valvonta (n = 5) jäljellä murto jälkeen CTC immunoeristämistä (valkoiset pylväät).

bioinformatiikka- analyysi Ingenuity Pathway Analysis ( IPA) ja Genecodis (Gene ontologia) ohjelmisto palveli tulkita tuloksena listan geenien kuvaavat CTC väestöstä. Tärkein solun toimintoja on määritelty näiden CTC-spesifisten geenien, jotka liittyvät solun liikkuvuuteen, soluadheesio, solukuoleman ja proliferaatiota, solu-solu-signaloinnin ja vuorovaikutus, ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyn (kuvio S2A ja C). Mielenkiintoista, IPA analyysi kanoninen reittejä, mikä edusti näiden geenien, myös esiin useita tunnettujen signalointireittien mukana solumigraatioon /invaasion ja soluadheesiota, kuten proteiinikinaasi A, RhoA, Integriinit, ILK tai Aktiinisytoskeletonin signalointimolekyylien (Kuva S2B). Lisäksi analyysi geeni-geeni vuorovaikutusta sulatettu biologiset verkot, jotka luonnehtivat CTC väestöä metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaista. Joukossa, syöpä ja solujen liikkumista ja morfologia havaittiin olevan pääasiallinen liittyvät tapahtumat CTC fenotyypin, kun taas tämä tulkinta voisi olla vääristyneinä tärkeää merkitystä syövän tietokantoihin (kuva S3). Kaikki nämä analyysit osoittavat tasapaino joukossa geenien taustalla solun selviytymisen, vuorovaikutus ympäristön ja solujen liikkeen perustavaa laatua biologisista prosesseista, jotka on lähentyvät väestön CTC onnistuneen kehittämisen etäpesäkkeiden CRC.

reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR validointi ja tunnistaminen diagnostisia ja Prognostiset biomarkkerit

seuraava vaihe käsitti RTqPCR validointi yhdentoista geenien esittää korkealla log2 suhdelukuja metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaiden ja toiminnallinen merkitystä biologisia prosesseja kuvaavat CTC väestönsiirron riippumaton sarja metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaiden ja verrokkien. Erityisiä näiden geenien ilmentymistä arvioitiin vertaamalla CTC väestön ryhmästä metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaiden (n = 20), jossa tausta terveiden verrokkien (n = 10), kun ne oli normalisoitu CD45 markkerina unspecificity aikana CTC eristäminen. Nämä geenit sisältyvät APP, CLU ja TIMP1, jotka liittyvät solukuolemaan ja anti-apoptoottista aktiivisuutta; VCL, ITGB5, BMP6 ja TGFp 1, jotka ovat liittyvät geenit solumigraatioon ja invaasion ja solujen morfologia; ja TLN1, ITGB5, LIMS1, RSU1 ja CD9, jotka liittyvät solun tarttumisen. Kuten havaitaan kuviosta 2B (mustat palkit), kaikki valitun ehdokkaan geenit validoitu tämän uuden sarjan näytteiden RTqPCR merkittäviä eroja potilaiden ryhmässä ja ryhmän (p-arvo 0,0001).

Tärkeää on, sen varmistamiseksi, että ilmentyminen valitun geenin oli ominaista CTC eikä artefakti johtuen vaihtelusta geeniekspression lymfosyyteissä syöpäpotilailla, niiden ilmentymistä verrattiin jäljellä ei-eristetty osa, kun CTC rikastamiseen in joukko metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista (n = 5) ja valvonta (n = 5). Kuten kuviossa 2B (valkoiset pylväät), ei havaittu mitään eroja molempien ryhmien yksitoista kandidaattigeeneihin, vahvistamaan niiden spesifisyys ilmaisun CTC väestöstä. Kun viisi näytettä CTC eristetty jae valittiin satunnaisesti, huomattavasti korkeampi olivat johdonmukaisesti löydettiin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää näytteistä, mikä osoittaa, että puute eroja potilaiden ja verrokkien että eristämätön osa ei johtunut näytteen koko esineistö (tuloksia ei ole esitetty) .

edelleen arvioimista osallistumisen ehdokkaan geenien metastaattisen potentiaalin CTC CRC, niiden ilmentymistä verrattiin joukossa ensisijaisen karsinoomien (n = 14) ja keuhkojen (n = 7) ja maksan ( n = 7) etäpesäkkeitä. Kuten kuviossa 3A, kaikki valitut geenit säädellään ylöspäin etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen vaurioita, jossa seitsemän yhdestätoista geenien esittää tilastollista merkittävyyttä. Joukossa, CLU ja TIMP1 esitteli erityinen ylössäätöä maksan etäpesäke, mikä viittaa mahdollinen rooli näiden geenien kudosspesifisiin kykyä metastasoitunutta kolorektaalisyöpää CTC asuttaa maksaan (kuvio 3B). Lisäksi kolme yhdestätoista valitun geenit osoittivat huomattavasti ilmaus leviämisrintamassa ensisijaisen kasvaimia verrattuna pariksi ei-invasiivisia pinnallinen alueella, mikä viittaa siihen, linkki hankinta aggressiivisen fenotyypin (kuvio 3C). Kaikki nämä tulokset validoitu strategiaa molekulaarisesti profiloida CTC metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilailla, läsnäolon vahvistamiseksi CTC väestön ja tehokas immunoeristämistä CTC peräisin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista, sekä kykyä nimenomaan luonnehtia nämä solut molekyylitasolla.

(A) geenien ilmentyminen erot keuhkojen ja maksan etäpesäkkeiden CRC potilaista (n = 14) ja ensisijaisen kasvain (n = 14) yksitoista validoitu geenejä. (B) erot geeni-ilmentymisessä ja CLU ja TIMP1 välillä keuhkojen (n = 7) ja maksan (n = 7) etäpesäkkeitä (M) verrattuna primaarikasvaimen. (C) Erityinen säätely ylöspäin TGFp 1, TIMP1 ja CLU invasiivisessa edessä CRC ensisijainen kasvain (n = 14) verrattuna ei-invasiivisia alue (* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001).

Lopuksi molekyyli profilointi CTC tulisi johtaa tunnistamiseen mahdollisesti luotettavien biomarkkereiden havaitsemiseksi CTC väestön metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaista. Arvioida tässä vaiheessa, tarkkuus RTqPCR validoitu geenien havaitsemiseen etäpesäkkeitä arvioitiin sarjassa metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaiden ja verrokkien. Kuten taulukosta 1, kaikki validoidut geenien esitti erinomaisia ​​erotteleva arvojen kannalta AUROC (arvot vaihtelevat 0,94-1, p-arvo 0,0001). Lisäksi ja lukuun ottamatta CD9 ja TLN1, valitun biomarkkerit osoittivat erinomaista käyttäytymistä ennustajina taudin etenemisen. Nämä tiedot takaavat lisätutkimuksia suuret ikäluokat potilaita varten käyttää näitä biomarkkereiden kliinisessä ympäristössä.

Keskustelu

Molecular profilointia käytetään laajasti voimakas strategia luonnehtia tietyntyyppisiin kasvainten erityisiä alatyyppejä karsinoomien tai erityisiä liittyviä tapahtumia syövän synnyn. Sen lisäksi edistää ymmärrystä molekyyli liittyvien tapahtumien syntyyn ja sen etenemistä syövän geenien ilmentymisen profilointi on johtanut tunnistamiseen terapeuttisia kohteita ja biomarkkereita, jolla pyritään parantamaan hallintaa syöpäpotilaille kliinisessä ympäristössä. Tässä työssä pyrittiin puuttumaan hyvin erityinen ja houkutteleva populaatio syöpäsolujen jotka ovat alkuperä etäpesäke, kiertävän kasvainsoluja (CTC). Yhdistelmä CTC immunoeristämistä, tarkka RNA uuttamalla hyvin vähän soluja, koko genomin monistamisen ja massiivinen geenien ilmentymisen profilointi karakterisointiin ja tulkinta biologiaan CTC metastaattisessa kolorektaalisyövässä on esitetty tässä. Teknisesti vahvistaa tämän strategian profilointi CTC peräisin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista oli lähestynyt vähentämällä taustan epäspesifinen erillään ryhmä tervettä verrokkia. Seuraava haaste on vertailla geenien ilmentyminen profiilin CTC väestön ensisijainen CRC vaurioita ja jossa avoin etäpesäkkeitä, jotta voidaan paremmin ymmärtää mekanismit sopeutuminen kasvainsolujen prosessin aikana etäpesäkkeiden ja ylikuulumisen ympäristön kanssa. Vähennyslasku taustan ryhmästä valvonnan katsottiin myös olevan enemmän merkitystä kuin taustalla samasta metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaille, sillä se vaatisi kaksi kierrosta CTC eristäminen saman näytteet, jotka edustavat merkittävää lähde teknisiä artefakteja. Erot taustalla ei voida sulkea pois, koska systeeminen etäpesäkkeitä, vaikka analyysi jäljellä murto jälkeen CTC eristämisen ei tee mitään eroja valitun geenit.

Mitä immunoeristämistä, ja vaikka CTC väkevöimisen EpCAM kanssa kytkettyä vasta-aineilla on osoitettu olevan ylivoimainen muihin Sytometrisen menetelmiä ja luotettava menetelmä CTC havaitsemiseksi metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilailla [14], tämä CTC kaapata menettely on herättänyt jonkin verran keskustelua, koska riippuvuus on tätä tekniikkaa ilmaisun EpCAM. Aluksi kuvataan 30 vuotta sitten, kuten määräävän antigeenin ihmisen paksusuolen karsinooman kudosta, oletetaan, että vähentynyttä ilmentymistä epiteelin markkerit aikana tapahtuu epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT), joka liittyy tuumorin invaasiota [15]. Tärkeää on, EpCAM ilmeisesti tarvitaan ylläpitämään erillistä syöpäsolun ominaisuudet ja mahdollisesti syövän kantasolujen fenotyyppi [16]. CD133 + soluja, tällä hetkellä yksi parhaista merkkiaineita luonnehdinta paksusuolensyöpä kantasolujen ja riippumaton prognostinen markkeri, joka korreloi alhaisen säilymiseen, ovat positiivisia EpCAM [17]. Samoin vasta-aineita EpCAM voi tehokkaasti kohdistaa peräsuolen kasvain-aloitus Cells [18], joka antaa huomattavasti lisäarvoa EpCAM-eristetty CTC väestön kannalta hoitotoimenpiteitä. Tässä esitetyt tiedot lopullisesti osoitettu tehokkaaksi eristämiseksi CTC peräisin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista.

Tärkein saavutus oli, että alueella käännös kuvaamaa menetelmää Gonzalez-Roca et al. tarkkaan ilmentymisen profilointi hyvin pieni solupopulaatioiden [13], tulee kliinisesti merkittävää solupopulaation. Koko transcriptome vahvistus sallittu luonnehdinta CTC väestöstä eristetty metastaattinen CRC potilaista molekyylitasolla. Tähän mennessä suurin osa tutkimuksissa on kuvattu ekspressiotasot rajallinen määrä geenejä eri CTC populaatioissa, pääasiassa havaitsemista varten [19], [20]. Käytetty lähestymistapa täällä sallitaan molekyyli- profilointi CTC peräisin metastasoituneen kolorektaalisyövän, ja niiden määrittely kuin solupopulaatio oletetun vaeltavia ja liiman ominaisuuksia. Tämä vastaa alapopulaation syöpäsolujen on hankittava aggressiivinen ja invasiivisen fenotyypin avulla irtaantuu primäärivamma, mikä hyökkäyksen ympäröivän strooman ja niiden intravasation ja selviytyminen verenkiertoa. Lisäksi nämä solut voivat myös ekstravasoitumaan ja menestyksekkäästi istuttaa kaukaisessa kudoksessa tavoite tuottaa mikrometastaasin [19]. Luettelo geenien fenotyyppisesti kuvaavat CTC väestöä metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista kuuluu ehdokkaita liittyvät kaikki edellä kuvatut toiminnot (kuvio 4), jotka oikeuttavat lisätutkimuksia määrittelemään implisiittisesti etäpesäkkeisessä käyttäytymistä CTC väestön CRC. Geenit kuten VCL, ITGB5, BMP6 tai TGFp 1 on liittynyt hankintaan invasiivisen fenotyypin [8], [21], [22], osittain kautta EMT. Samoin TLN1, APP, CD9, LIMS1 ja RSU1 ovat liittyneet tarttuvuus ja maahanmuutto, CD9 moduloimalla lokalisointia TLN1, kriittinen säätelijä integriinin aktivaation, jotta paikallisia tarttumista [23], tai LIMS1 olla mukana soluadheesiota ja integriini signalointi, ja erityisesti, jossa RSU1 ja Ras koulutusjakson aikana solujen vaeltamiseen [24]. Keskeinen vaihe syövän levittäminen on kyky muuttaa ja edetä kohti ja intravasate lähellä veren kapillaareja. Kun verenkierrossa, CTC on voitettava isännän immuunijärjestelmän lisäämällä niiden apoptoosin resistenssiä muita mekanismeja. Geenit kuten TIMP1 ja CLU ovat keskeisiä molekyylejä, jotka liittyvät tähän prosessiin [25]. Mielenkiintoista, TIMP1 on yhdistetty prosessi anoikis vastustuskyvyn eri syövän mallia, joka mahdollistaa kiertämisen solukuoleman puuttuessa alustan kiinnityspisteen [26]. Päästyään kohde-elin, CTC on voitava ekstravasoitumaan ja muodostavat pesäkkeitä, ja CD9 on kuvattu kriittinen prosessi istutusta ja mikrometastaasien muodostuminen liittyy kantasolujen ominaisuuksia, jotka liittyvät näihin tapahtumiin [27]. Mielenkiintoista, merkittävää päällekkäisyyttä löydettiin kanssa maksaspesifiset etäpesäke allekirjoitettavaksi CRC [28] (katso taulukko S4), mikä viittaa aktiivinen mukanaolo näissä tropismista ja mikrometastaasin potentiaali CTC tämän elimen CRC. Erityisesti ja sopusoinnussa korrelaatio TIMP1 ilmentymisen CTC ja maksan etäpesäke, se on kuvattu säätelijänä maksan microenvironment, alttiutta lisäävät tämän elimen tuumorisoluihin [29]. Kaiken kaikkiaan osallistuminen valittujen geenien etäpesäkkeitä kapasiteetit CTC on myös vahvistanut niiden ylössäätöä keuhkoissa ja maksassa etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen peräsuolen karsinoomat.

In vitro

ensisijainen CTC kulttuureissa ja

in vivo

malleja CTC CRC varmasti tarjota tutkijoille vankkaa näyttöä vahvistaa rooli näiden geenien kyky CTC tuottaa micrometastases, ja strategioiden määrittelemiseksi erityisesti tätä populaatio metastaattisen CTC.

tuloksena microarray aineisto, joitakin tärkeimpiä geenit osoittivat suhteessa tiettyjä ominaisuuksia prosessin etäpesäkkeiden.

samoin suhteen biomarkkereita hallinnan metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaita, molekyyli profilointi CTC peräisin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista sulatettu arvokkaita työkaluja havaitsemiseen ja kvantifiointiin etäpesäkkeitä, sekä ennustamiseen sairauden etenemisen. Korkea spesifisyys ja herkkyys osoituksena Edellä esiteltyjen validoitu geenejä CTC väestön metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista takaa tutkimus näiden biomarkkereiden arvioinnissa terapeuttisen vaikutuksen tai valittaessa potilaita kohdennettuja hoitoja.

Yhteenvetona tässä tutkimuksessa kuvattu, tietojemme mukaan ensimmäinen erityinen molekyyli profilointi CTC eristettyjen metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaista. Tämä geeni-ilmentymisen analyysi sovellettiin luonnehdinta Tässä nimenomaisessa väestöstä oletetun liimalla, muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia, sekä moduloidun vastauksena solukuolema onnistuneesti päätökseen prosessin etäpesäke. Lisäksi tunnistaminen terapeuttisten strategioiden erityisesti suunnattu CTC väestön pitäisi parantaa tehoa torjumista ja ehkäisemistä CRC etäpesäke, kun taas armamentarium erittäin spesifisiä ja herkkiä arvokkaita markkereita pitäisi vaikuttaa johdon ja seurantaan metastaattisen CRC potilaista.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

Kaikki osallistujat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen nimenomaan hyväksytty tähän tutkimuksen eettisen komitean Complexo Hospitalario Universitario Santiago de Compostela (koodi hyväksynnän: 2009/289). Inclusion kriteerit metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaat olivat läsnä mitattavissa metastasoituneen kolorektaalisyövän ja Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) toimintakykyluokka ei suurempi kuin 2. terveiden verrokkien kanssa puuttuminen aiemman syövän episodi ja ikä Hyväksytty potilasta valittiin. Yksityiskohtaiset tiedot potilaiden mukana analyysissä on saatavana taulukossa S1.

CTC immunoeristämistä

CTC eristettiin käyttämällä CELLection ™ epiteelikasvaimet Enrich (Invitrogen, Dynal) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 7,5 ml verta metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaiden ja terveiden kontrollien inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa 100 ui magneettisten helmien. Pesun jälkeen, CTC kytketty magneettihelmet suoraan suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan RNAlater® liuosta (Ambion), ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes käsitellään RNA.

Gene Expression Analysis

kokonais-RNA CTC uutettiin kanssa QIAmp viruksen RNA mini kit (Qiagen), suunniteltu erityisesti erittäin alhainen sellulaarisuus näytteitä. Puhdistettu RNA oli vieressä altistetaan koko transcriptome monistusreaktion (WTA2, Sigma Aldrich), Cy3 leimattu ja hybridisoitu päälle Agilent 4 × 44 k geeni-ilmentymisen taulukot. Signaalinkäsittely ja suodatus sekä geenien ilmentyminen tietojen analysointi kuvataan yksityiskohtaisesti Supplemental Materiaali. Geenien ilmentyminen tiedot ovat saatavissa laitoksesta NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokantaan (hakunumero: GSE31023).

reaaliaikaiset kvantitatiiviset PCR Validation

RTqPCR validointi suoritettiin riippumaton sarja 10 terveiden verrokkien ja 20 vaiheen IV metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaille (katso taulukko S1). CTC eristettiin kuvatulla, ja RNA puhdistettiin RNA operaattorin parantaa saantoa ja vakautta. cDNA syntetisoitiin käyttäen SuperScriptIII kemiaa (Invitrogen) valmistajan ohjeita noudattaen. Optimoimiseksi edelleen herkkyys havaita, teimme esivahvistus askel käyttämällä TaqMan® Esivahvistustaso Master Mix Kit (Applied Biosystems) 14 reaktiosykleissä. Esivahvistetun tuotteet alistettiin TaqMan® reaaliaikaisen PCR-monistuksen yksitoista kandidaattigeenit (katso taulukko S3 määritystä lisätietoja).

Lisäksi arvioimme RTqPCR ekspressiotasoja ehdokas geenien solufraktiosta jäljellä upon CTC immunoeristämistä, 5 metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaalla ja 5 terveillä verrokeilla. Lyhyesti, suoritimme punasolujen lysointi osa jää jäljelle, kun EpCAM immuuni-helmi inkuboinnin ja CTC eristäminen, ja RNA puhdistettiin jäljellä tumalliset verisolut RNeasy mini -kittiä (Qiagen). RNA määrä ja puhtaus arvioitiin NanoDrop mittaus, cDNA syntetisoitiin käyttäen MuLV-käänteistranskriptaasia järjestelmän (Applied Biosystems), ja TaqMan® qPCR suoritettiin yhdestätoista kandidaattigeeneihin.

Expression-arvot kullekin geenille normalisoitiin CD45 kuin merkkiaine ei-spesifinen eristäminen. Kertainen muutos eroja potilaiden ja verrokkien analysoitiin tilastollisesti kanssa GraphPad Prism-ohjelmiston, soveltamalla Mann-Whitney epäparametrinen t-testi ja harkitsee p-arvo 0,05 merkittävinä.

Gene Expression Analysis primaarikasvaimia ja etäpesäkkeitä

Ensisijainen peräsuolen karsinoomat (n = 14) ja etäpesäkkeiden (maksa etäpesäke, n = 7; keuhkoetäpesäkkeet, n = 7) on käsitelty patologian osaston Complexo Hospitalario Universitario Santiago de Compostelan. Pinnallinen ei-invasiivisia alueen ja syvä invasiivisia alueen ensisijainen kasvainten makroskooppisesti leikeltiin, varmistaa samanlaiset kasvain prosenttiosuudet. RNA puhdistettiin (TRIZOL reagenssi, Invitrogen, RNeasy kit, Qiagen), cDNA syntetisoitiin (MuLV käänteistranskriptaasia, Applied Biosystems), ja geenien ilmentyminen arvioitiin (TaqMan RTqPCR, Applied Biosystems). Data oli edustettuna kertainen muutos suhteessa ilmaisua pinnallinen ei-invasiivisia alue. GAPDH käytettiin latauskontrollina. Ei-parametriset Mann-Whitneyn t-testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden harkitsee p-arvo 0,05.

alapuolella oleva alue ROC Curve (AUROC) ja Kaplan-Meier analyysi

tarkkuus yhdestätoista kandidaattigeeneihin biomarkkereina diagnoosin arvioitiin ROC käyrät, vaikka Kaplan-Meier -käyrät rakennettiin niiden arvioimiseksi merkkiaineita ennustetta. Sulku arvot asetettiin parhaiten sopivan arvot kunkin merkin. Potilaat Progression Free Survival kertaa perustettiin koska välinen aika kemoterapian linjan käynnistys ja sairauden eteneminen arvioidaan kuvantaminen, tai potilas kuollut tahansa syystä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Edustavia kuvia epiteelisolujen eristetty metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaan verestä.