Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä pidetään tappava ja hoidolle huonosti tauti. Saada voimakas syöpälääkettä, sytotoksista vaikutusta 2- (bentso [d] oksatsol-3 (2H) -yylimetyyli) – 5 – ((sykloheksyyliamino) metyyli) bentseeni-1,4-dioli, dihydrokloridi (NSC48693) ihmisen haimasyöpäsoluissa CFPAC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3 arvioitiin

vitro

. Leviämisen CFPAC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3 inhiboi IC

50-arvo 12,9 ± 0,2, 20,6 ± 0,3, ja 6,2 ± 0,6 uM 48 tuntia, vastaavasti. Tämä löytö on seurannut lisäanalyysi osoittaa, että NSC48693 inhibitio johtuu apoptoosin induktion, mukaan lukien anneksiini V-värjäys, kromatiini värjäys, ja pesäkkeitä muodostavien määrityksissä. Se on lisäksi ilmi, että NSC48693 indusoi vapautuminen sytokromi

c

vähentää Mitokondrioiden kalvon potentiaalia tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja, ja aktivoi kaspaasi. Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että NSC48693 pääasiassa indusoi apoptoosia CFPAC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3-solujen mitokondrioiden-välitteisen apoptoottisen reitin. Jännittävän tutkimuksessa korostetaan rohkaisevaa estovaikutusta, että ihmisen sikiön munuaisen (HEK-293) ja maksan (HL-7702) solut ovat vastustuskykyisiä Kasvua estävät vaikutukset NSC48693 verrattuna kolmen syöpäsolulinjoja. Tästä näkökulmasta NSC48693 pitäisi auttaa avaamaan uuden mahdollisuuden potilaiden hoitoon haimasyöpä.

Citation: Liu Z, Li D, Zhao W, Zheng X, Wang J, Wang E (2012) voimakas Lyijy aiheuttaa apoptoosia haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (6): e37841. doi: 10,1371 /journal.pone.0037841

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 elokuu 2011; Hyväksytty: 28 huhtikuu 2012; Julkaistu: 20 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China kanssa avustuksista No.90713022 ja 20735003. J. Wang kiitos National Science Foundation ja National Institutes of Health taloudellista tukee. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä pidetään aggressiivinen syöpä, koska se yleensä menee havaitsematta, kunnes se saavuttaa myöhäisessä vaiheessa [1]. Vuonna 2010 haimasyöpä oli 4

th yleisin syy syövän liittyvän kuoleman eri puolilla maailmaa [2]. Potilaille, joilla on haimasyöpä riippuu pääasiassa leikkaus, sädehoito, kemoterapia tai yhdistää terapeuttisia menetelmiä. On tunnettua, että haimasyövän on usein huono ennuste, koska 80-85%: lla potilaista läsnä paikallisesti edennyt tai metastaattinen vaiheessa esteenä leikkaus, koska sen korkea taipumus paikallisille invaasiota ja etäispesäkkeitä. Kemoterapia voidaan käyttää parantamaan elämänlaatua ja saada vaatimaton eloonjäämishyötyä haimasyövän. Single-agentti gemsitabiini hyväksynyt FDA vuonna 1998, edustaa tällä hetkellä tehokkain kemoterapeuttinen lääke, joka parantaa elämänlaatua ja pidentää aikaa joilla on pitkälle edennyt haimasyöpä 5 viikon. Koska esiintyminen chemoresistance gemsitabiiniannokseen [3], gemsitabiini sisältäviä yhdistelmiä, kuten gemsitabiini-erlotinibin, -placebo ja -oxaliplatin, keksittiin ja näytteillä synergiaetuja ja heikentynyt vastustuskyky [4]. On valitettavaa, että pieni vakuuttavia tuloksia löytyvät kliinisesti merkittäviä parannuksia elämänlaadun ja selviytymistä. Tämän kysymyksen, näyttäisi olevan kiireellinen tarve kehittää uusien syöpälääkkeiden.

ymmärtäminen molekyylitason mekanismeja kehittämiseen haimasyövän on tarjonnut monia toiveita löytämään uusia kemiallisia terapeuttisia aineita haimasyövän hoidossa [5]. Apoptoosin on tärkeä rooli heikkenemiseen prosessissa haimasyövän kuten muutkin kasvaimia [6]. Apoptoosi, tai ohjelmoitu solukuolema, on hyvin valvotulla fysiologinen prosessi ja ytimen signalointireitin [7]. Näin ollen, syöpälääkkeiden kuten apoptoottisten induktori on ehdotettu ja laajalti hyväksytty hoito syöpien [8]. Jotkut työt ovat osoittaneet, että apoptoottinen-välittävä hoito on lupaava horisontti terapiaan syövät vähän myrkyllisyys ympäröiville normaalit solut johtuu niiden fysiologisesti ohjataan selviytymisreittiin [9], [10]. Apoptoosin-asiakkuutta siis edelleen ovat merkittävä suunnan uusien lääkkeiden hoitoon potilailla, joilla on haimasyöpä.

Tässä tutkimuksessa, joka on voimakas johtoon kutsua kuin 2- (bentso [d] oksatsol -3 (2H) – yylimetyyli) – 5 – ((sykloheksyyliamino) metyyli) bentseeni-1,4-dioli, dihydrokloridi (NSC48693, Fig. 1) estää proliferaatiota haimasyövän soluja CFPAC-1, MiaPaca-2, ja BxPC -3 indusoimalla apoptoosin mitokondrion välittämän reitin

vitro

. Jännittävän, sytotoksista vaikutusta NSC48693 syöpäsolujen on voimakkaampaa kuin normaalissa ihmisen alkion munuaisen (HEK-293) ja maksan (HL-7702) soluja. Nämä tulokset tukevat rooli NSC48693 tehokkaana apoptoottisen indusoija haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Kaikki kemikaaleja kuten Ac-DEVD-fmk ( kaspaasi-3: n estäjä) ja Ac-LEHD-fmk (kaspaasi-9: n estäjä) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO), ellei toisin ole mainittu. DMEM, IMDM ja naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Gibico (Grand Island, NY). Ensisijainen vasta-aineita kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, Bcl-2, Bax, sytokromi

c

ja peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri tai antirabbit sekundaarinen vasta-aine sekä isotyyppi hiiren IgG1, vuohen anti- hiiren IgG1 FITC hankittiin BD Bioscience (San Jose, CA). NSC48693 oli ystävällisesti toimitti NCI /DTP Open Chemical Repository (https://dtp.cancer.gov). NSC48693 liuotettiin DMSO tehdä varastoliuosta (10 mg /ml) ja laimennettiin eri pitoisuuksina kanssa kahdesti tislattua vettä, joka sisälsi 10% DMSO.

tausta NSC48693

laajoja tutkimuksia haimasyöpä Havaitsimme, että Ras signalointi on osallisena apoptoosin säätelyyn. Kehittämään lääkkeitä kohdistaminen Ras ja aiheuttamaan apoptoosin ollaan laatimassa intensiivisesti lääkekehityksen. Aktiivisen GTP: hen sitoutuneen Ras on tasapainossa kolme erillistä valtiota, joista yksi on avoin ei-signalointi konformaatio on ohimenevä välituote aikana GTP hydrolyysin [11]. Tämä tarkoittaa, että Ras väli on yhtenevä pisteen hengissä signaloinnin haimasyöpä. Tällä hetkellä, siis avoin konformaatio näyttää olevan lupaavin kohde lääkeaineen suunnitteluun. Rakenne GppNHp sitoutuneen RasG60A-GTP (ATE ID: 1XCM [11]) käytettiin telakointi laskelmissa. Kaikki telakointi laskelmat tehtiin käyttäen AUTODOCK paketti [12]. Tietokanta National Cancer Institute (NCI) monimuotoisuus sarja käytettiin virtuaaliseulonnan. Sitten sijoittui nämä pienet molekyylit mukaan ennustetun affiniteetti ja spesifisyys on määritelty [13]. 2- (bentso [d] oksatsol-3 (2H) -yylimetyyli) -5 – ((sykloheksyyli- amino) metyyli) bentseeni-1,4-dioli, dihydrokloridi (NSC48693) poimitaan NCI tietokannasta osoitti kasvun estämistä vaikutus leukemiasolulinjoja CCRF-CEM ja MOLT-4 esitetyllä tavalla NCI Cancer Screen Nykyinen tieto (https://dtp.nci.nih.gov). Pieni ponnistelut keskittyvät vaikutuksesta NSC48693 on haimasyöpä, joten se tarjoaa valikoituja laadukkaita apoptoosin indusoija.

Cell Culture

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa CFPAC-1, MiaPaca -2, ja BxPC-3 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja viljeltiin DMEM ja IMDM-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja (100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia), vastaavasti. Ihmisen alkion munuaisen 293 (HEK-293) ja maksan (HL-7702) solut saatiin Kiinan tiedeakatemian Type Culture Collection (Shanghai, Kiina) ja inkuboitiin DMEM täydennetty 10% FBS: ää. Solut irrotettiin yksikerroksista käyttämällä 0,25% trypsiiniä ja 0,53 mM EDTA: ta 5 minuuttia 37 ° C: ssa, kun soluja kasvatettiin lähes konfluenssiin.

Hoechst 33342 Värjäys

kolme ihmisen haiman syöpäsolut (1 x 10

5 solua /levy) on vastaavasti ympättiin 6-kuoppaisille lasipohjaisella levylle ja annettiin kiinnittyä yön yli. Soluja viljeltiin 135 pl DMEM-alustassa käsiteltiin käyttäen joko 15 ui 250 ug /ml NSC48693 (lopullinen pitoisuus 25,0 gg /ml), koe-ryhmiä tai 15 ui kahdesti tislattua vettä, joka sisälsi 10% DMSO: ta kontrollina ryhmät, ja sitten viljeltiin 48 h 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 olosuhteissa. Sen jälkeen solut kiinnitettiin MeOH-HOAc: a (03:01, v /v) 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja värjättiin sitten käyttämällä Hoechst 33342-kittiä (KEYGEN Biotech, Nanjing, Kiina). Värjätyt solut analysoitiin konfokaalisella-laser skannaus mikroskooppi (TCS SP2, Heidelberg, Saksa).

sytotoksisuusmääritykset

solujen elinkelpoisuuden kolmen haimasyövän soluja ja kaksi ihmisen normaaleja soluja (1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisella levyllä) jälkeen käsitellään kahdesti tislattua vettä, joka sisälsi 10% DMSO: ta kontrollina ryhmät tai erilaisia ​​pitoisuuksia NSC48693 koe ryhmät arvioitiin tiatsolyyli blue liumbromidi (MTT). Soluja käsiteltiin 48 h ja sen jälkeen optinen tiheys (OD) 490 nm: ssä luettiin 96-kuoppaisella multiscanner Autoreader (Biotech Instruments, New York). MTT ei häiritse NSC48693 ja aiheuttaa positiivisen vasteen.

Soft Agar määritykset

Soft agar-määritykset suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [14]. Yksittäinen solususpensioita haiman syöpäsoluja, joka sisältää 1 x 10

4 solut 0,3% agar asetettiin 3,5 cm ruokia päälle geelimäinen kerros 1% agaria (DMEM tai IMDM 10% FBS) ja viljeltiin kahteen kertaan tislatulla vedellä, joka sisälsi 10% DMSO: ta kontrollina ryhmät tai erilaisia ​​pitoisuuksia NSC48693 koe ryhmien 37 ° C: ssa. Pesäkkeet kiinnitettiin 2,5% glutaraldehydillä ja lasketaan pisteytys vain pesäkkeet, jotka olivat suurempia kuin 10 solua halkaisijaltaan alle Olympus X71 käänteisvaiheisella mikroskooppi (Dr. Schumann Optik OHG, Hessen, Saksa). Prosenttiosuus pesäkkeitä muodostavaa tehokkuutta laskettiin pesäkkeiden määrä /100 ympätty soluja.

Apoptosis Analyysit

apoptoosin Kolmen haimasyövän soluja (1 x 10

6 solua /kaivo 24-kuoppalevylle) jälkeen käsitelty kahdesti tislattua vettä, joka sisälsi 10% DMSO kontrolliryhmien tai erilaisia ​​pitoisuuksia NSC48693 kuin koeryhmään mitattiin anneksiini V-FITC /propidiumjodidia (PI) apoptoosin havaitseminen kit (Keygen Biotech, Nanjing, Kiina ). Kvantifiointi PI ja FITC signaaleja suoritettiin fluoresenssi soluerottelijaa FACSAria (BD Bioscience, San Jose, CA) ja prosenttiosuus värjäytyneiden solujen kussakin neljänneksessä kvantitoitiin käyttäen Diva 6.0 -ohjelmisto (BD Bioscience, San Jose, CA). Yhteensä 10000 tapahtumaa analysoitiin kussakin näytteessä.

kaspaasi-aktiivisuusanalyysi

Soluja viljeltiin 6-kuoppaisella levyllä (5% CO

2, 37 ° C) istutustiheyteen 2 x 10

6 solua /kuoppa. Levyjä esi-inkuboitiin yön yli, ennen kuin liuokset lääkkeen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Ajan jälkeen altistus (24 tai 48 h) eri pitoisuuksilla NSC48693, solut kerättiin trypsinoimalla trypsiini /EDTA-liuoksella pestiin PBS-liuoksella ja kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 määritettiin kaspaasi aktiivisuus iinianalyysikitissä (Keygen Biotech, Nanjing, Kiina), tässä järjestyksessä. DEVDase, IETDase, ja LEHDase aktiivisuus mitattiin mittaamalla proteolyyttisen kromogeenisia substraatteja Ac-DEVD-pNA, Ac-IETD-pNA, ja Ac-LEHDpNA, joita käytettiin substraatteina kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi -9-kaltaisten proteaasien, vastaavasti [15]. Absorbanssi entsymaattisesti vapautuu pNA mitattiin 490 nm: ssä multiscanner Autoreader.

24 tunnin kuluttua noudattaminen, solut (1 x 10

5 solua /malja), käsiteltiin 25,0 ug /ml NSC48693 48 tuntia. Sitten solut tutkittiin käyttäen CLSM.

Analyysi Sytokromi

c

Release

Soluja viljeltiin 24-kuoppalevylle (5% CO

2, 37 ° C) istutustiheyteen 5 x 10

4 solua /kuoppa. Levyjä esi-inkuboitiin yön yli, ennen kuin liuokset lääkkeen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Ajan jälkeen altistus (6 tai 12 h) eri pitoisuuksilla NSC48693, solut kerättiin trypsinoimalla trypsiini /EDTA-liuoksella ja pestiin Hanksin tasapainotetulla suolaliuoksella, johon oli lisätty 2% naudan seerumin albumiinia ja 0,2% atsidia. Sen jälkeen solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin Cytofix /Cytoperm Kit (BD Bioscience, San Jose, CA). Epäspesifinen sitoutuminen anti-sytokromi

c

vasta-blokattiin hiiren IgG1. Anti-sytokromi

c

(7H8.2C12) lisättiin vielä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten soluja inkuboitiin vuohen anti-hiiri-lgG1 FITC (01:20) 30 min ajan 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen Perm /Wash liuosta, solut analysoitiin välittömästi virtaussytometrialla (FCM). Täysin, 10000 tapahtumaa kohti näytettä hankittiin ja analysoitiin.

mittaus mitokondrioissa Membrane Potential (ΔΨm) B

Muutokset ΔΨm mitattiin Rhodamiinilla 123 (Rho-123) väriaine [16] . Soluja viljeltiin 24-kuoppaisella levyllä (5% CO2, 37 ° C) istutustiheyteen 5 x 10

4 solua /kuoppa. Levyjä esi-inkuboitiin yön yli, ennen kuin liuokset lääkkeen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Ajan jälkeen altistus (48 h) eri pitoisuuksilla NSC48693, solut kerättiin trypsinoimalla trypsiini /EDTA-liuoksella pestiin PBS-liuoksella ja inkuboitiin Rho-123 (10 ug /ml). Sen jälkeen Rho-123 fluoresenssi mitattiin FCM. Prosenttiosuus Rho-123- soluihin edustaa tehokasta romahti ΔΨm; vähentäminen Rho-123 ilmaisee menetys ΔΨm soluissa [16]. Yhteensä 10000 tapahtumaa analysoitiin kussakin näytteessä.

Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) B

virtaussytometrinen havaitsemiseen ROS suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, soluja viljeltiin 24-kuoppaisella levyllä (5% CO

2, 37 ° C) istutustiheyteen 5 x 10

4 solua /kuoppa. Levyjä esi-inkuboitiin yön yli, ennen kuin liuokset lääkkeen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Ajan jälkeen altistus (2 h) eri pitoisuuksilla NSC48693, solut kerättiin trypsinoimalla trypsiini /EDTA-liuoksella ja sen jälkeen ROS fluoresenssi-intensiteetti määritettiin FCM. ROS tasot ilmaistiin prosenttiosuutena, joka laskettiin Diva 6.0 -ohjelmisto. Yhteensä 10000 tapahtumaa analysoitiin kussakin näytteessä.

24 tunnin kuluttua noudattaminen, solut (1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisella levyllä tai 1 x 10

4 solut 3,5 cm: n malja) käsiteltiin eri pitoisuuksilla NSC48693 kuten 48 tuntia. Sitten kasvun inhibitio arvioitiin MTT-menetelmällä (A) ja ankkurointi riippumattoman kasvun määritykset (B), vastaavasti. Kukin arvo edustaa keskiarvo ± SD kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Western-blottaus

Solut (2 x 10

6 solua) siemeniä 10 cm: n levy ja viljeltiin inkubaattori yössä. Sitten solut altistettiin 1 tai 2 x IC

50 pitoisuus NSC48693 ja 10% DMSO: ta (kontrolli) 24 tunnin ajan. Koko-solu proteiinit ja mitokondrioiden fraktiot eristettiin käyttäen proteiini Extraction Kit (Keygen Biotech, Nanjing, Kiina). Proteiinin pitoisuudet määritettiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityksellä kit (KEYGEN Biotech, Nanjing, Kiina). Yhtä suuret määrät proteiineja fraktioitiin käyttämällä 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten polyvinylideenidifluoridi (PVDF). Membraanit inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, sytokromi

c

, Bcl-2, ja Bax, sen jälkeen, kun on estetty ja 3% BSA: ta TBS: ssä. Membraanit inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri tai antirabbit sekundaarisella vasta-aineella. Aktiini käytettiin valvontaa lastaus. Vuonna inhibitiokoe kaspaasi-3 ja kaspaasi-9-solut esikäsiteltiin 20 uM Ac-DEVD-fmk tai Ac -LEHD-fmk 2 tuntia kiinnittymisen jälkeen, ja väliaine vaihdettiin, että viljelmä, joka sisälsi 2 x IC

50 pitoisuus NSC48693 tai 10% DMSO: ta.

tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmennettiin keskiarvoina ± SD kolminkertaisista kokeista, ja toistettavuus vahvistettiin ainakin kolme erillistä koetta. Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen SPSS 11.5 tilasto-ohjelmalla.

24 tunnin kuluttua noudattaminen, solut (1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisella levyllä) käsiteltiin eri pitoisuuksilla NSC48693 kuten varten 48 h. Sitten kasvun inhibitiomääritykset arvioitiin MTT-menetelmällä. Kukin arvo edustaa keskiarvoa ± SD kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

laajuus indusoiman apoptoosin syöpäsoluissa (1 x 10

6 solua /kuoppa 24-kuoppaisella levyllä) käsiteltiin 25,0 ug /ml ja NSC48693 in MiaPaca-2, 12,5 ug /ml NSC48693 in CFPAC-1, ja 6,25 ug /ml NSC48693 in BxPC-3 24 tai 48 h mitattiin FCM, vastaavasti. Edustaja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta on esitetty; ja kukin arvo edustaa keskiarvoa ± SD kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

Tulokset

NSC48693 muutokset Solumorfologia

Cellular morfologiaa voidaan käyttää parametrin mittaamiseksi vaikutus yhdisteen solun myrkyllisyyttä. Koska ydin- tiivistyminen tapahtuu tässä vaiheessa apoptoosin, apoptoottisen morfologian ydin on ilmeistä, kun värjäys [18]. Ydinvoima värjäys Hoechst 33342 osoittaa, että solut kontrolliryhmien ovat suhteellisia ja jaeltu (Fig. 2). Verrattuna normaaliin ydin- morfologia, tyypilliset morfologiset muutokset, kuten solun tukirangan romahtaa, muodostumista apoptoottisten kappaleiden ja ydinvoiman pirstoutuminen, havaitaan käsitellyissä soluissa, kuten on esitetty nuolilla kuvassa. 2. Nämä ominaisuudet johdonmukaisesti tapahtui tämän solukuoleman muotoa, jotka olivat kaikki yhteiset merkit solukuoleman [19].

Solut (2 x 10

6 solua /kuoppa 6-kuoppaisella levyllä) käsiteltiin NSC48693 ilmoitettuina pitoisuuksina 24 (A, B, C) tai 48 h (D, E, F) tutkittiin sitten. Kukin arvo edustaa keskiarvo ± SD kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Solut (5 x 10

4 solua /kuoppa 24-kuoppaisella levyllä) hoidettiin osoitetussa annoksina 6 (CFPAC- 1 ja BxPC-3) tai 12 h (MiaPaca-2). Solunsisäinen sytokromi

c

havaittiin vasta-7H8.2C12 kiinteissä ja permeabilzed soluja. Prosenttiosuudet ovat solujen osuus madallettu sytokromi

c

signaali. Edustaja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta on esitetty; ja kukin arvo edustaa keskiarvo ± SD kolmessa riippumattomassa kokeessa.

NSC48693 Estää Cell Proliferation

Lisäksi yksityiskohtainen vertaileva analyysi morfologiset muutokset, sytotoksisuus NSC48693 soluihin havaittiin kautta solun elinkyvyn menetykseen käyttämällä MTT-määritystä [20]. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, elinkelpoisuutta syöpäsolujen merkittävästi vähentynyt NSC48693 kanssa valotus annosta suurentaa. NSC48693 estää syöpäsolujen lisääntymistä IC

50 arvosta 12,9 ± 0,2 uM CFPAC-1, 20,6 ± 0,3 uM MiaPaca-2, ja 6,2 ± 0,6 uM BxPC-3 klo 48 h. Tätä tukee lisäksi kyky NSC48693 estää kiinnittymisestä riippumaton syöpäsolujen kasvua pehmeässä agarissa. Verrattuna kontrolliryhmiin, syöpäsolut muodostavat pienempiä ja vähemmän pesäkkeitä, kun kasvatetaan läsnäollessa NSC48693. Kuten kuviossa. 3B, tämä vaste tapahtuu annoksesta riippuvalla tavalla. Yhdessä tulokset, voimme päätellä, että NSC48693 vähentää syöpäsolujen lisääntymistä annoksesta riippuvalla tavalla.

sytotoksiset vaikutukset NSC48693 on HEK-293 ja HL-7702

osoitti kuviossa . 4, solujen elinkelpoisuuden HEK-293 ja HL-7702 on 63,4 ± 4,1% ja 91,2 ± 2,9% annoksella 25,0 ug /ml NSC48693, vastaavasti. NSC48693 estää HEK-293 ja HL-7702-solujen lisääntymistä kanssa IC

50-arvo 144,5 ± 8,8 uM ja 198,6 ± 11,3 uM 48 h. On selvää, että sytotoksisia vaikutuksia NSC48693 normaaleilla ihmisen solut ovat yhtä herkkiä kuin syöpäsolujen CFPAC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3 verrattuna kuvassa. 3.

Solut (5 x 10

4 solua /kuoppa 24-kuoppaisella levyllä) käsiteltiin osoitetussa annoksilla 48 tuntia. Sitten kokeet joutuivat FCM. Edustaja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta on esitetty; ja kukin arvo edustaa keskiarvo ± SD kolmessa riippumattomassa kokeessa.

NSC48693 indusoi apoptoosia

sulkea pois mahdollisuutta, että solujen kasvun esto johtui sytotoksisille vaikutuksille, apoptoosin määritys suoritettiin . Solut positiivinen anneksiini V-FITC ja negatiivinen PI ovat alkuvaiheessa apoptoosin esitetyn Q4 neljänneksessä, kun taas solut positiivisia sekä anneksiini V-FITC ja PI ovat myöhäisessä vaiheessa apoptoosin tai nekroosin esitetyn Q2 neljänneksessä [21 ]. Täten aste apoptoosin korreloi määrän positiivisia anneksiini V-FITC-soluja. Ja ehjän kalvon eheyttä arvioitiin negatiivisten PI värjäytyminen viittaa siihen, että apoptoosin, mutta ei kuolion on merkki apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 5, on vain vähän sitova anneksiini V-FITC kontrollisoluihin, kun taas sitova hoidon jälkeen NSC48693 on lisääntynyt, kuten on esitetty Q4 neljänneksessä. Kuten MiaPaca-2-soluja käsiteltiin pitoisuus 25,0 ug /ml NSC48693, sitoutuminen on kasvanut 73,1 ± 1,0%: sta 82,7 ± 2,8%: iin 24 h ja 48 h. Sitoutuminen on kasvanut 37,1 ± 2,0%: sta 50,5 ± 3,1%: iin 24 tunnin ja 48 tunnin jälkeen, kun CFPAC-1-solut käsiteltiin 12,5 ug /ml NSC48693. Vaikka sitoutuminen on kasvanut 46,4 ± 2,4%: sta 55,0 ± 1,1%: iin 24 tunnin ja 48 tunnin jälkeen, kun BxPC-3-soluja käsiteltiin 6,25 ug /ml NSC48693. Yhdistettynä nämä havainnot, on selvää, että vaikutus NSC48693 syöpäsolujen välittyy pääasiassa indusoimalla apoptoottista solukuolemaa.

kaspaasi

Koska merkittäviä välittäjiä apoptoosin aktivointi kaspaasi riippuu proteolyyttinen pilkkominen prokaspaasi. Paremmin Käsityksemme onko kaspaasin oli mukana NSC48693 aiheuttaman apoptoosin syöpäsoluissa, tutkimme entsyymiaktiivisuudet kaspaasien kanssa spectrofluorometric määritys käyttämällä niiden substraatteja [22]. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, C, D, F, aktiivisuus kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 lisääntyi annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla verrattuna käsittelemättömiin soluihin kolmessa syöpäsolujen; aktiivisuus kaspaasi-8 liittyy kuolema reseptoreihin ei lisätään CFPAC-1 ja BxPC-3-solut (Fig. 6B, E). Kuitenkin kaspaasi-8 MiaPaca-2-soluissa on lisääntynyt annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että NSC48693 aktivoi luontainen mitokondrioiden-välitteisen apoptoottista johtava väylä kaspaasin aktivaation indusoimaan apoptoosin CFPAC-1 ja BxPC-3-soluja. Sillä MiaPaca-2-solut, NSC48693 aktivoi sekä mitokondrioiden ja kalvon kuoleman reseptori apoptoottisen reitin.

soluja (5 x 10

4 solua /kuoppa 24-kuoppaisella levyllä), käsiteltiin osoitetulla annoksia 2 h. Sitten kokeet joutuivat FCM. Edustaja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta on esitetty; ja kukin arvo edustaa keskiarvoa ± SD kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

Yhtä suuret määrät solun proteiinien fraktioitiin 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Aktiini käytettiin ohjaamaan lastaus.

Release sytokromi

c

vapautuminen Sytokromi

c

on ratkaiseva askel ohjaamiseksi apoptosome polku. Klooni 7H8.2C12 on valittu erityisesti tunnistamaan solunsisäiseen sytokromi

c

. Siksi vähentäminen sytokromi

c

signaali havaitaan vasta-7H8.2C12 kuvastaa mitokondrioiden sytokromi

c

vapautumista ja varhain alkanut apoptoosin [23]. Kuten on esitetty kuviossa. 7, BxPC-3 solujen kontrolliryhmissä on alhainen sytokromi

c

(11,8 ± 1,7%), kun taas NSC48693 hoito parantaa mitokondrioiden sytokromi

c

vapautumista 32,9 ± 1,3%: sta 36,9 ± 1,4% pitoisuuksina 25,0 ja 50,0 ug /ml 6 tunnin ajan. CFPAC-1-soluissa käsittelemättömiä mukaan NSC48693 normaali mitokondrion sytokromi

c

taso (7,9 ± 1,9%), kun taas mitokondrio sytokromi

c

vapautumisen tasot kasvoi 35,9 ± 1,2%: sta 47,6 ± 0,6 0,9% pitoisuuksina 25,0 ja 50,0 ug /ml 6 tunnin ajan. Myös MiaPaca-2-solut käsiteltiin NSC48693 on parannettu mitokondrion sytokromi

c

vapautuminen 4,6 ± 1,8% vertailuryhmässä 19,0 ± 1,3% ja 29,3 ± 2,8% pitoisuus 25,0 ja 50,0 ug /ml: ssa 12 h, vastaavasti.

menetys ΔΨm

ΔΨm voidaan tuottaa silloin, kun protoneja pumpattiin mitokondrion matriisin välisen mitokondrion tilaan [24]. Ja hukkaamisen ΔΨm on yhdistetty joitakin apoptoottisia reittejä, mukaan lukien mitokondrion apoptoottista koulutusjakson [25]. Ehdottomasti eniten käsittelemättömät solut on ehjä solukalvon ja normaali ΔΨm kuitenkin menetys ΔΨm osoittaa annoksesta riippuva lisäys tavalla, sen jälkeen, kun solut käsiteltiin NSC48693 12,5 ja 25,0 ug /ml 48 h (Fig. 8). Jälkeen MiaPaca-2-soluja, joita hoidetaan NSC48693, prosenttiosuus ΔΨm romahtaa saavuttaa 13,3 ± 1,9% ja 24,7 ± 1,8%, vastaavasti. Ja prosenttiosuus ΔΨm romahduksen CFPAC-1-solujen saavuttaa 18,9 ± 1,1% ja 34,2 ± 2,9%, tässä järjestyksessä. Vaikka prosenttiosuus ΔΨm romahduksen BxPC-3-soluissa on ilmeinen ja saavuttaa 24,9 ± 2,4% ja 92,9 ± 8,9%: lla. Kokeissa riittävän tarkka perusteella voidaan päätellä, että syöpäsolut käsiteltiin NSC48693 menettää ΔΨm.

Yhtä suuret määrät solun proteiinien fraktioitiin 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Aktiini käytetään ohjaamaan lastaus.

Generation ROS

sukupolven ROS on suoraan verrannollinen mitokondrioiden [16]. Kuten osoitettu kuvassa. 9, virtaussytometrianalyysin paljastaa, että MiaPaca-2-solut käsittelemättömiä on alhainen endogeenisen ROS (18,0 ± 0,3%), kun taas NSC48693 hoito parantaa merkitsevästi solunsisäisten ROS tasoilla 58,0 ± 2,3%: sta 68,0 ± 4,4% pitoisuuksina 50,0 ja 100,0 ug /ml 2 tunnin ajan. CFPAC-1-solut käsittelemättömiä mukaan NSC48693 on normaali endogeeninen ROS taso (2,5 ± 1,6%), kun taas ROS tasot kasvoivat 74,0 ± 2,8%: sta 81,4 ± 0,5% pitoisuuksina 12,5 ja 25,0 ug /ml 2 tunnin ajan. Myös ROS tasot kasvoivat 9,8 ± 1,3%: sta 16,4 ± 2,7%, kun BxPC-3-soluja käsiteltiin NSC48693 pitoisuuksina 25,0 ja 50,0 ug /ml: ssa 2 h.

vaikutus NSC48693 on apoptoosin liittyvät proteiinit

vaikutus NSC48693 apoptoosiin liittyvien proteiinien varmistettiin western-blottauksella, kuten on esitetty kuviossa. 10. NSC48693 käsittely lisäsi pilkkominen kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 annoksesta riippuvalla tavalla. Ekspression katkaistun kaspaasi-8 oli lähes havaitsematon CFPAC-1 ja BxPC-3-soluja. Kuitenkin lohkaisu kaspaasi-8 ollut ilmeinen MiaPaca-2-soluissa, jotka oli kanssa kaspaasiaktiivisuus kuten on esitetty kuviossa. 6. Samanaikaisesti Bcl-2-proteiinin ekspressio oli sääteli ja Bax nousi säänneltyä. Sytokromi

c

sisään sytosoliin parannettiin samanaikaisesti tarkoin vaimennus sytokromin

c

mitokondrioita. Lisäksi spesifisiä inhibiittoreita kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 lähes kokonaan poisti NSC48693 aiheuttama lohkaisu kaspaasi-9 ja kaspaasi-3, vastaavasti (Fig. 11).

Keskustelu

Vaikka kattamaton kemoterapeuttisten ei vielä ole saavutettu mitään todellista edistystä kliinisessä toistaiseksi kemoterapia on edelleen selkäranka edenneen haimasyövän nykyisin [25]. Siten, uusia kemoterapeuttisia lääkkeitä, joilla on erilaiset toimintatavat ovat aina tarpeen hoitoon haimasyövän potilaille. Mekanismi indusoimaa solukuolemaa kemoterapeuttisten lääkkeiden ajatellaan olevan endogeenisen apoptoottisen mekanismi. Täten apoptoosin syöpäsoluissa on tunnustettu innovatiivinen lääkekehitysyhtiö strategia syövän hoidossa [26] – [28].

Mahdolliset apoptoottisia indusoijia pitäisi tappaa syöpäsoluja sijaan aiheuttaa liiallista myrkyllisyys normaaleille niistä. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet jossa arvioitiin NSC48693 kuoleman indusoimalla apoptoosin ihmisen haimasyövän soluja CFPAC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3

vitro

. Näyttää siltä, ​​että syöpä- ja normaalien solujen reagoivat eri tavalla NSC48693 altistumisen MTT määrityksissä. Tulokset solujen elinkelpoisuuden osoittavat, että elinkelpoisuus syöpäsolujen merkittävästi inhiboi NSC48693 IC 50 oli 12,9 ± 0,2 uM CFPAC-1, 20,6 ± 0,3 uM MiaPaca-2, ja 6,2 ± 0,6 uM BxPC-3, vastaavasti. Kuitenkin herkkyys normaaleihin soluihin NSC48693 on huomattavasti erilainen. Sen sijaan ei ole selvää sytotoksisuutta havaitaan normaaleissa soluissa IC

50 144,5 ± 8,8 uM HEK-293 ja 198,6 ± 11,3 uM HL-7702, vastaavasti. Nämä tulokset antavat suoria todisteita siitä, että normaaleissa soluissa HEK-293 ja HL-7702 ovat vastustuskykyisempiä anti-kasvun vaikutukset NSC48693 verrattuna syöpäsoluihin CFPAC-1, MiaPaca-2, ja BxPC-3. Joka perustuu kasvua estävä vaikutus aiheuttama NSC48693 syöpäsoluja, kuten on esitetty kuviossa. 3, solun apoptoosin vasteena NSC48693 tutkittiin. Kuva. 5 ehdottaa, että NSC48693 laukaisee apoptoottisen solukuoleman haimasyövän soluja, mikä merkitsee sitä, että NSC48693 on suurempi sytotoksisuus kautta indusointiin merkitty apoptoottista solukuolemaa syöpäsoluissa. Lisäksi erilaisia ​​solutyyppejä vaihtelevat syvästi niiden alttiutta apoptoosin induktio, joka Leas erillisille cellular kynnysarvojen nykyisiä apoptoosin induktion [29]. Kriittinen kysymys on ympäröivän normaaleissa kudoksissa tai solut voivat keskeyttää ja korjata vahinkoja, kun kasvainsolut kuolevat apoptoosin kautta. NSC48693 näyttää olevan vähemmän myrkyllisiä normaaliksi solulinjoja, jotka voivat jakaa tätä mahdollisuutta, että normaalit solut on joitakin suojamekanismeja vastaan ​​NSC48693 [30]. Normaalissa solujen vähentäminen, vetyperoksidia tuottaa ja hydroksyyliradikaalin tapahtuu. Näitä voi kadota kautta irtoamisen tai ajetaan pois, mikä hapettumista. Normaalit solut on suojamekanismeja puhdistaa liiallisen ROS, mikä vähentää toksisia vaikutuksia NSC48693 on HEK-293 ja HL-7702.

Apoptoosi voidaan laukaista useat ärsykkeet, ja mitokondriot pidetään pelata keskeinen rooli sekä kaspaasiriippuvaisen ja kaspaasi-riippumattoman apoptoosin [31]. Mitokondriot aloittaa kaksi erillistä apoptoosin väyliä, eli luontainen mitokondrioiden polku ja ulkoisten kalvo kuolema reseptorireitin [32]. Suurimpien kemoterapeuttisten lääkeaineiden, apoptoosin aloitetaan luontainen mitokondrioiden reitti [27], [28]. Siten ymmärtäminen sääntely luontaisen mitokondrioiden apoptoottisen reitin on tärkeää kehittää uusia apoptoosin indusoija ja todentamiseen apoptoosin.