Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Sirtuin 1 (SIRT1) toimii keskeisenä säätelijänä endoteelikasvutekijä homeostaasin, angiogeneesi, ja endoteelin toimintahäiriö. Kuitenkin taustalla mekanismi SIRT1-välitteisen keuhkosyöpä angiogeneesin edelleen tuntematon. Tässä raportoimme, että nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi 1 (NAD1) -riippuvaista deasetylaasi SIRT1 voi toimia sisäinen negatiivinen modulaattori Delta-, kuten ligandi 4 (DLL4) /Notch-signaloinnin Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) -ksenografti johdettu verisuonten endoteelisolujen ( keuhkosyöpä johdetun EC).

Keskeiset havainnot

SIRT1 säätelee negatiivisesti Notch1 solunsisäinen domeeni (N1IC) ja Notch1 kohdegeenien HEY1 ja HEY2 vastauksena Delta kaltainen ligandi 4 (DLL4) stimulaatio. Lisäksi SIRT1 deasetyloitiin ja tukahdutettu N1IC ilme. Kvantitatiivinen kromatiinin immunosaostus (qChIP) analyysi ja geenin toimittaja määrityksessä osoitti, että SIRT1 sitoutuneena yhteen erittäin konservoitunut alue, joka sijaitsi noin -500 bp ylävirtaan transkription aloituskohdasta Notch1, ja tukahdutettu Notch1 transkription. Esto endoteelisolujen kasvua ja itäneet angiogeneesin DLL4 /Notch signalointi parannettiin SIRT1-vaiennetaan keuhkosyöpä johdettu EY ja pelastettiin Notch estäjä DAPT. In vivo, kasvua proangiogeeninen aktiivisuuden havaittiin Matrigel tulpat endoteelispesifistä SIRT1 knock-hiirillä. SIRT1 myös parannettu kasvaimen uudissuonittumisen ja kasvaimen kasvua LLC ksenograftien.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittavat, että SIRT1 helpottaa endoteelisolujen haarautuvia ja lisääntymistä lisätä suonitiheys ja edistää keuhkojen kasvaimen kasvua läpi alas-säätely DLL4 /Notch signalointi ja deasetyloiminen N1IC. Näin ollen, SIRT1 aktiivisuutta ja /tai geenin ekspressio voi edustaa uutta mekanismia hoidossa keuhkosyöpään.

Citation: Xie M, Liu M, hän C-S (2012) SIRT1 Säätelee Endothelial Notch Signaling in Lung Cancer. PLoS ONE 7 (9): e45331. doi: 10,1371 /journal.pone.0045331

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 24 elokuu 2011; Hyväksytty: 21 elokuu 2012; Julkaistu: 18 syyskuu 2012

Copyright: © Xie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia tieteen ja teknologian suunnittelu projekti Guangdong, Kiina (numero 83050) ja lääkinnällisistä tieteellinen tutkimussäätiö Guangdong, Kiina (numero A2009265). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD): sta riippuvainen deasetylaasi SIR2 säätelee elinikä useita organismien vastauksena kalorien rajoittaminen [1]. Nisäkäshomologit SIR2 käsittävät perheen seitsemän proteiineja, joita kutsutaan sirtuins (luokka III histonideasetylaaseja (HDAC) SIRT1-SIRT7), ja on luonnehdittu keskeinen säätelijöinä useita tärkeitä fysiologisia prosesseja liittyy aineenvaihduntaan ja kestää rasitusta [ ,,,0],2].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että SIRT1 on tärkeä välittäjä verisuonten endoteelin homeostaasin, nimenomaan edistää angiogeneesiä, verisuonten sävy, ja endoteelin toiminnot [3]. Erityisesti, SIRT1 ilmentyy suuresti verisuonistossa aikana verisuonten kasvua, jos se ohjaa angiogeenistä aktiivisuutta endoteelisolujen. Lisäksi menetys SIRT1 tuloksia säätely alaspäin liittyvien geenien verisuonten kehitykseen ja verisuonten remodeling, joka johtaa inhibitioon versoja angiogeneesin ja haarautuvia morphogeneesiä endoteelisolujen [4].

Notch polku säätelee lukuisia solukohtalo- /linjaa päätöksiä monisoluisten organismien normaalin alkionkehityksen ja postnataalikehitykseen [5]. Kun sitoutuminen Notch ligandin sen vastaavan reseptorin, proteolyyttinen pilkkominen kaskadin on aloitettu intramembrane domeenin reseptorin. Lopullinen lohkaisu vaiheen katalysoi γ-sekretaasin proteiinin monimutkainen ja johtaa vaikuttava aine vapautuu Notch solunsisäisen domeenin. Tämä proteiini fragmentti sitten translokoituu tumaan ja toimii kofaktorina säädellä transkriptiota Notch kohdegeenien [6]. Lisäksi Notch1 ja Notch4 reseptoreihin, verisuonten endoteelin solut ilmentävät myös Jaggedin 1, Delta-like ligandia 1 (DLL1), ja endoteelisoluspesifiseksi DLL4 [7]. Zhang et ai. raportoitu, että inaktivaatio yhden alleelin DLL4 johti alkion kuolleisuutta, mikä viittaa siihen, että DLL4 /Notch signalointi on välttämätöntä verisuonen kehitystä. DLL4 ilmentyminen rajoittuu pitkälti endoteeliin kehittää alusten ja kärjen solujen kehittäminen verisuonet, jossa se toimii säätelemään lukumäärä kärjen solujen ohjata aluksen itämistä ja haarautuvia [8].

Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että muutokset Notch aktiivisuus voi olla merkittäviä vaikutuksia endoteelin käyttäytymiseen ja verisuonten muodostumista. Kuitenkin tiedetään vähän sääntelyä ja mukauttaminen endoteelin Notch vasteita keuhkosyöpä angiogeneesiä. Nykyisessä tutkimuksessa olemme eristetty verisuonten endoteelisoluissa Lewis keuhkokarsinooma (LLC) ihonalainen vierassiirrännäiset endoteelisoluspesifiseksi SIRT1 knock-in C57BL /6J-hiirissä. Tuloksemme osoittavat, että endoteelisolujen puuttuu SIRT1 aktiivisuus herkistyneet Notch signalointi, mikä parantaa Notch kohdegeenin ilmentymisen ja heikentynyt versoa venymä vastauksena DLL4 stimulaatiota. Tuloksemme tukevat oletusta, että Notch signalointi dynaamisesti säätelevät asetylaatio ja viittaavat siihen, että SIRT1 toimii reostaatti hienosäätää endoteelin Notch vastauksia.

Tulokset

eristäminen keuhkosyöpään Vieraslajisiirteen johdettuja Vascular endoteelisoluissa (Lung Cancer johdetut EC) B

Keuhkosyöpä johdettu hankittua eristettiin LLC ihonalainen vierassiirrännäiset endoteelisoluspesifiseksi SIRT1 knock-in C57BL /6J-hiiriä [9] (Fig. 1A). Kuten on esitetty kuviossa. 1B, keuhkosyöpä johdettu hankittua osoittivat tyypillisiä mukulakivikadut morfologia ja ilmaisivat CD31, ehtiä kypsien endoteelisolujen. Lisäksi nämä EC ilmaistuna korkeita EY-erityisiä endoteelin typpioksidin nopaliinisyntaasin (Enos), mutta ei E-kadheriinin (Fig. 1 C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että LLC xenogaft on tehokkaasti rikastettu keuhkosyöpä johdettu hankittua. Näitä soluja käytettiin sitten myöhemmin in vitro kokeissa.

LLC ksenografteja resekoitiin hiiristä injektoitiin ihonalaisesti selän kylkeen LLC-soluja (3 x 10

6 suspendoitiin 50 ui PBS) 30 päivä . Poistamisen jälkeen ilmeinen nekroottista kudokset tai ylimääräisiä rasva koostumuksia, jauhettu kudokset jauhettiin jäällä käyttäen lasinhioja ja sitten suodatetaan solun- poistamiseksi kudosjäte. (EN) CD31-ilmentävät keuhkosyöpä johdettuja hankittua eristettiin yhden solususpensiota immunomagneettisella lajittelua, on osoituksena skannaamalla mikroskoopilla, ja viljeltiin in vitro. (B) CD31 havaittiin eristetty keuhkosyöpä johdettu hankittua käyttämällä immunofluoresenssilla. CD31-vasta-aineen värjäys keuhkosyövän johdettu EY kalvoja näkyy punaisena, ja ydinvoiman DAPI värjäytyminen näkyy sinisenä. (C) kokonaismäärä proteiini eristettiin rikastettu keuhkosyöpä johdettu hankittua, bEnd.3 solut (positiivinen kontrolli), ja MLE-12 (negatiivinen kontrolli) soluissa. Western blot analyysi suoritettiin käyttäen vasta-aineita eNOS ja E-kadheriinin ja β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

vaikutus Hypoksia on SIRT1 Expression in Lung Cancer johdettu hankittua

SIRT1 ilmentyminen arvioitiin keuhkosyöpä johdettu hankittua, ja kuten on esitetty kuviossa. S2A, SIRT1 oli hyvin ilmaistu näissä soluissa. Koska hypoksia on ominaista kaikkein kasvaimia, tutkimme SIRT1 ilmentyminen eri hypoksisissa olosuhteissa näissä soluissa Western blot -analyysiä käyttämällä. Tuloksemme osoittivat, että SIRT1 proteiinin tasot lisääntyivät ajan riippuvalla tavalla ja saavutti maksimaalisen 8 h altistuksen jälkeen keuhkosyöpä johdettu hankittua hypoksialle (Fig. 2A). Sen määrittämiseksi, ovatko nämä muutokset SIRT1 proteiinin tasot aikana hypoksia johtuivat muutoksista SIRT1-geenin transkription, mittasimme SIRT1 mRNA tasot käyttäen tosiaikaista RT-PCR. Meidän data paljasti, että samankaltaisia ​​löydöksiä kuin havaittu SIRT1 proteiinin ilmentymisen (Fig. 2B). Nämä tulokset osoittivat vaikutusta hypoksia SIRT1 ilmentymistä keuhkosyövässä johdettu hankittua.

(A) Western blot-analyysi SIRT1 keuhkosyövässä johdettu hankittua alttiina hypoksia (2% O

2) varten ilmoitettuun aikaan käyttämällä vasta-ainetta SIRT1. (B) SIRT1 mRNA-tasot, mitattuna reaaliaikaisen RT-PCR, ja kokonais-RNA saadaan keuhkosyöpä johdettuja hankittua altistettiin hypoksialle (2% O

2) ja osoitettu aika. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta riippumattomasta kokeesta Kustakin ajankohdasta suoritettiin kolmena kappaleena. * P 0,05 verrattuna kontrolliin.

SIRT1 säätelee negatiivisesti N1IC deasetyloinnilla ja säätimet Notch kohdegeenien Lung Cancer johdettu hankittua

Kun translokaation tumaan, solunsisäinen domeeni Notch1 (N1IC) vuorovaikutuksessa DNA: ta sitovien CSL proteiinin (nimetty CBF1 nisäkkäillä, Su (H) Drosophilassa, ja Lag-1 Caenorhabditis elegans), joka johtaa transkriptionaalisen aktivaation Notch1 geenikohteet. Koska N1IC metaboloituu nopeasti ubikitiini-välitteisen hajoamista ja asetylointi voi heikentää ubikitinaation [10], tutkimme vaikutus SIRT1 on N1IC ilmaisun ja totesi, että inaktivointi SIRT1 lisäsi N1IC proteiinin ilmentymistä vasteena DLL4 stimulaation (Fig. 3A). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että SIRT1 säätelee negatiivisesti Notch signalointi endoteelisoluissa kun DLL4 /Notch1 signaalit on aktivoitu.

(A) Keuhkosyöpä johdettu hankittua transfektoitiin ohjaus- tai SIRT1 siRNA 48 tuntia ja viljeltiin puuttumisen tai läsnä DLL4 vielä 6 h. Sitten N1IC-proteiinin ekspressio havaittiin Western blot -analyysiä käyttämällä. siRNA-välitteinen salpaus SIRT1 aktiivisuuden endoteelisoluissa kasvoi endogeenisen N1IC proteiinin tasoja. (B) Keuhkosyöpä johdettu hankittua transfektoitiin HA-N1IC, pcDNA-SIRT1, pcDNA-SIRT1 H363Y, tai pcDNA3 (4 ug /ul kumpaakin) 48 tuntia ja käsiteltiin tämän jälkeen tai ilman 5 nM NAM vielä 12 h. Sen jälkeen solu-uutteet immunosaostettiin anti-HA-vasta-aineella ja altistetaan western blot -analyysi anti-asetyyli lysiini (ylempi paneeli) tai anti-HA-vasta-ainetta (alempi paneeli). (C) Keuhkosyöpä johdettu hankittua oli kolminkertainen transfektoitiin N1IC, asetyylitransferaasin p300, ja yhä enemmän SIRT1, ja solut hajotettiin 48 tuntia myöhemmin. Vertailukelpoiset N1IC immunosaostettiin ja siirrettiin varten asetyloidut lysiinijäännöksissä (IP: HA ja IB: anti-asetyyli; yläpaneeli). Blotti uudelleenseulottiin HA, joka osoitti suunnilleen yhtäläinen HA-N1IC (IP: HA ja IB: HA, alempi paneeli). (D) Keuhkosyöpä johdettu hankittua transfektoitiin N1IC, asetyylitransferaasin p300, ja kasvavia määriä SIRT1 yhdessä Renilla lusiferaasireportteri- ja pGL3-CBF plasmidi, joka sisältää tulikärpäsen lusiferaasi reportterigeeni 24 tuntia. Sitten lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasireportteri- määrityksessä. Tiedot normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuutta (keskiarvo ± SD, n = 3). (E) qChIP analyysi SIRT1 käyttöaste on Notch1 proksimaalisessa promoottorialueen keuhkosyöpä johdettu hankittua. SIRT1 miehitetty tietyllä alueella on -500 emäsparia Notch1 lokuksen. SIRT1 immunosaostettiin (IP) anti-SIRT1 seerumit (SIRT1 IgG) tai esi-immuuniseerumeita (normaali IgG, käytettiin kontrollina) (keskiarvo ± SEM, n = 3). * P 0,05 verrattuna kontrolliin. (F) Luciferase reportterigeenimäärityksessä tuloksia. pGL3, pGL3-Notch1 -500-400 (N + 400), tai pGL3-Notch1 + 400-1750 (N + 1750) transfektoitiin HEK293-soluihin tai ilman SIRT1. * P 0,05. Virhe palkit edustavat SEM. (G) Expression of Notch kohdegeenien HEY1 ja HEY2 arvioitiin ohjaus siRNA- ja SIRT1 siRNA-transfektoiduissa keuhkosyöpä johdettu hankittua, jotka myöhemmin transfektoitiin tyhjällä vektorilla tai N1IC jopa 48 tuntia. SIRT1 puutteesta endoteelisolujen näytetään tehosti merkittävästi HEY1 ja HEY2 toimintaa vasteena N1IC yli-ilmentymisen. * P 0,05 verrattuna kontrolliin. (H) Keuhkosyöpä johdettu hankittua transfektoitiin valvontaa tai SIRT1 siRNA: t ja käsiteltiin DMSO: ssa tai 20 mM NAM 24 tuntia, jonka jälkeen inkuboitiin Matrigelillä vielä 5 h. Seuraavaksi putken muodostumiseen arvioitiin käyttämällä käänteisen vaiheen mikroskoopilla. Pylväiden edustavat densitometrian tuloksia. * P 0,05 verrattuna kontrolliin.

Seuraavaksi testasimme, onko SIRT1 säätelee negatiivisesti N1IC kautta deasetylaatio. Lyhyesti, eri versioita HA-merkitty N1IC (HA-N1IC) ilmennettiin keuhkosyöpä johdettu hankittua vektoreilla, jotka koodaavat joko SIRT1 tai SIRT1 mutantti, josta puuttuu deasetylaasi-aktiivisuus (SIRT1 H363Y). Solu-uutteet immunosaostettiin anti-HA-vasta-ainetta ja detektoitiin immunoblottauksella käyttäen vasta-ainetta vastaan, asetyyli-lysiini. Tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen asetyloitu HA-N1IC väheni merkittävästi soluissa, jotka ilmentävät koko SIRT1, verrattuna proteiinin tasot soluissa, jotka ilmentävät SIRT1 H363Y (Fig. 3B). Kuitenkin, kun solut käsiteltiin 5 nm NAM, The SIRT1 estoa N1IC asetylaatio oli helpottunut. Lisäksi transfektio keuhkosyöpään johdettujen hankittua kanssa N1IC, asetyylitransferaasin p300, ja yhä suurempia määriä SIRT1 paljasti, että p300 kykeni asetylointi N1IC (Fig. 3C) ja parantamalla N1IC transkriptioaktiviteettia (Fig. 3d). Kuitenkin lisääminen SIRT1 poisti asetyloitu muodossa N1IC ja merkittävästi vähentynyt N1IC aktiivisuuden aiheuttamien p300. Nämä tulokset viittaavat siihen, että deasetylaasit aktiivisuus SIRT1 vähensi runsaasti asetyloitu N1IC. Lisäksi aktivointi SIRT1 mukaan SRT1720 tai SRT2183 (aktivaattoreita NAD

+ – riippuvaista deasetylaasi) pienentää endogeenisen N1IC proteiinipitoisuuden (Fig. S1A), ja estämällä deasetylaasi aktiivisuus SIRT1 kanssa Sirtuin estäjän nikotiiniamidi (NAM) lisääntynyt endogeenisen N1IC tasot endoteelisoluissa (kuvio. S1B).

Voit määrittää mekanismi, jonka SIRT1 tukahduttaa N1IC ilme, tutkimme rekrytointi SIRT1 että Notch1 lokukseen vastauksena DLL4 stimulaation avulla qChIP analyysiä. On huomioitava, että Notch1 lokus ajatellaan sisältävän yli 20 hyvin säilyneitä [11]. Tuloksemme osoittivat, että SIRT1 sitoutuneena yhteen erittäin konservoitunut alue, joka sijaitsi noin -500 bp ylävirtaan transkription aloituskohdasta Notch1 (Fig. 3E). Tämä havainto viittaa siihen, että SIRT1 voi suoraan ohjata Notch1 ilmentymistä sitoutumalla proksimaalisen promoottorialueen Notch1. Määrittää toiminnallisen seurauksena SIRT1 sitoutumisen Notch1 lokukseen, lusiferaasireportteri- konstrukteja, jotka sisältävät Notch1 reportterigeenin transfektoitiin HEK293-soluihin. Nämä tulokset osoittivat, että SIRT1 inhiboi merkittävästi Notch1 toimittaja aktiivisuus, kun SIRT1 sitoutumiskohta oli läsnä (Fig. 3F, N + 400), jota ei ole havaittu, kun SIRT1 sitoutumiskohta ollut läsnä (Fig. 3F, N + 1750). Tämä edelleen vahvisti havaintomme että SIRT1 tukahdutettu Notch1 transkriptio sitoutumisen kautta Notch1 promoottori.

HEY1 ja HEY2 ovat suoria kohdegeenien Notch signalointireitin aikana verisuonten kehitys [12]. Jotta voitaisiin edelleen tutkia vaikutusta SIRT1 on HEI ilmaisun, SIRT1 ilmentymistä vaiennettu keuhkosyövän johdettu hankittua siRNA, ja ilmaus HEY1 ja HEY2 määritettiin. Varsinkin SIRT1 puutteesta keuhkosyöpä johdettuja hankittua yli-ilmentävät N1IC näkyy huomattavan kohottamiseen HEY1 ja HEY2 aktiivisuutta (Fig. 3G). Samoin vaiennettaisi SIRT1 merkittävästi parannettu HEY1 ja HEY2 ilmentymistä keuhkosyövässä johdettu hankittua vastauksena DLL4 stimulaatio, kun taas mitään muutoksia ei havaittu stimuloimattomissa keuhkosyöpä johdetun EC (Fig. S1C). Tämä tulos osoitti, että SIRT1 säätely Notch kohdegeenien riippui DLL4 stimulaatiota. Lisäksi parannettu Notch reagointikykyä DLL4 että SIRT1-puutteellinen keuhkosyöpä johdettu hankittua kumottiin lisäämällä γ-sekretaasin estäjä DAPT (Fig. S1C). Sen sijaan, aktivointi SIRT1 signaloinnin avulla, että pienten molekyylien SRT1720 tai SRT2183 esti DLL4-välitteisen induktion HEY1 ja HEY2 ilmaisu, joka osoittaa, että SIRT1 negatiivisesti moduloitu DLL4 /Notch1 signalointia keuhkosyöpä johdettu EC (Fig. S1D).

SIRT1 Säätelee angiogeenisen Activity keuhkosyöpään johdettujen hankittua

estyminen endoteelisolujen kasvua DLL4 /Notch signalointi parannettiin SIRT1-vaiennetaan keuhkosyöpä johdettu hankittua ja pelastettiin Notch estäjä DAPT (Fig. S2A). Myöhään vaiheessa angiogeneesin, endoteelisolujen kokoontuvat itsestään putket muodostavat uusia verisuonia [13]. Sitten tutkittiin vaikutuksia SIRT1 on uudissuonittumisen tutkimalla putken muodostumiseen. Kuten on esitetty kuviossa. 3H, putkimainen muodostuminen estyi merkittävästi SIRT1-vaiennetaan keuhkosyöpä johdettu hankittua. Samoin, putken muodostumiseen keuhkosyövän johdettu hankittua myös tukahduttaa, kun soluja käsiteltiin SIRT1 deasetylaasin inhibiittorilla NAM. Tämän vahvistaa SIRT-säätelyyn endoteelisolujen toiminto, kolmiulotteinen in vitro angiogeneesin analyysit suoritettiin käyttäen kollageeni geelin upotettu endoteelin palloset, jotka oli transfektoitu valvontaa tai SIRT1 siRNA. Kuten on esitetty kuviossa. S2B, kumulatiivinen verso pituudet rakeita keuhkosyövän johdettu hankittua transfektoitu SIRT1 siRNA olivat huomattavasti lyhyempi kuin kontrolliryhmän-transfektoiduissa soluissa. Lisäksi hoito DAPT kumosi inhibition angiogeenisen vasteen keuhkosyöpää peräisin olevien EC-indusoidun kautta SIRT1 vaiennettu, viittaa siihen, että SIRT1 on tärkeä modulaattori endoteelin angiogeeninen toiminta.

vaikutus SIRT1 on kasvaimen uudissuonittumisen LLC ksenoqraftit

roolin tutkimiseksi SIRT1 on vascularization in vivo, Matrigel tulppa määritys suoritettiin. Toisin kuin tulpat ohjaus C57BL /6J-hiiriä, tulpat SIRT1 knock-siirtogeenisissä hiirissä näytetään kirkkaan punainen väri, mikä osoitti, että SIRT1 oli indusoitu uusien verisuonten muodostumista. Hemoglobiinin taso, joka osoittaa, että angiogeneesin laajuus, oli suurempi Matrigel tulpat SIRT1 siirtogeenisten hiirten kuin valvonnan C57BL /6J-hiirten (Fig. 4A). Tutkia vaikutus SIRT1 geenin kasvaimen verisuonittumisen ja kasvaimen kasvua, LLC-solut injektoitiin subkutaanisesti SIRT1, SIRT1 H363Y, ja villityypin C57BL /6J-hiirissä. Nämä tulokset osoittivat, että LLC kasvain tilavuus SIRT1 knock-siirtogeenisissä hiirissä oli 115% ja joka havaittiin kontrollihiirissä 30 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen. Sen sijaan, kasvaimen kasvu SIRT1 H363Y siirtogeeniset hiiret laskettiin, ja se oli samanlainen kuin havaittiin villityypin hiirissä. Lisäksi kun SIRT1 siirtogeenisiä hiiriä, kasvaimen kasvu aleni, kun deasetylaasi aktiivisuus SIRT1 blokattiin hallinnon luokan III HDAC estäjä nikotiiniamidi (Fig. 4B). Kun arviointi mikroverisuonitiheys indeksin CD31-vasta-värjäys, kasvaimen kasvu parannus havaittiin SIRT1 knock-siirtogeenisissä hiirissä liittyy kasvaimen verisuonten muodostumista. Lisäksi, anti-Dll4 hoitoa paljasti, että vähensi kasvainten kasvua, jotka liittyvät ilmeinen vähennys kasvaimen verisuonten tiheyden (Fig. 4C).

(A) SIRT1 edistää angiogeneesiä in vivo. Matrigel tulpat injektoidaan subkutaani- osaksi vatsat ohjaus- tai SIRT1 hiiret, ja tulpat uutettiin 7 päivää myöhemmin määrittää suonittumisen laajuuden. Hemoglobiinin määrä läsnä pistokkeet kvantitoitiin indikaattorina muodostumista funktionaalisen verisuonten (keskiarvo ± SD, n = 10 kussakin ryhmässä). * P 0,05 verrattuna kontrolliin. (B) muutokset mediaani tuumorin tilavuudet mitattiin villityypin (kontrolli) C57BL /6J, SIRT1 tai SIRT1 (H363Y) hiirissä istuttamisen LLC solujen osoitettu aika. * P 0,05 verrattuna SIRT1 hiirillä. (C) mikrovalokuvia CD31 IHC värjäytymistä osissa LLC ksenograftien (suurennos, x 200) villityypin, SIRT1 tai SIRT1 (H363Y) hiirillä. Kun ksenografti kasvaintilavuudet olivat noin 100 mm

3, hiiret satunnaistettiin ohjausvarsi (n = 8) tai kokeellista varren (DLL4 monoklonaalinen vasta-aine; n = 10). Korkean suurennus kentät (x 400) analysoitiin mikroverisuonitiheys count käyttäen ImageJ ohjelmistoa (keskiarvo ± SD, n = 10 kussakin ryhmässä). * P 0,05 verrattuna SIRT1 hiirillä. Keskimääräinen kasvaimen volyymit villityypin, SIRT1 ja SIRT1 (H363Y) hiirillä mitattiin 4 viikkoa hoidon jälkeen. * P 0,05 verrattuna kontrolliin.

Keskustelu

Tämä tutkimus laajenee rooli SIRT1 sisällyttää erityisiä modulaatio angiogeenistä aktiivisuutta endoteelisoluissa. Jotta voidaan tutkia vaikutus SIRT1 keuhkosyöpään angiogeneesiin, loimme LLC ksenograftimalleissa endoteelisolujen erityisiä SIRT1 ja SIRT1 H363Y ilmentyminen siirtogeenisissä hiirissä. Endoteelisoluja onnistuneesti eristettiin LLC vierassiirrännäisiä SIRT1 siirtogeenisiä hiiriä käyttäen CD31-konjugoituja magneettihelmiä sekä useita vaiheita poistaa kaikki kontaminoivat kasvainsolujen ja leukosyyttien. Blockade of SIRT1 toiminta lakkautetaan endoteelin putken muodostumiseen ja versoa muodostumista in vitro, joka kumottiin Notch estäjä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SIRT1 välittämää sääntely Notch väylän endoteelisolujen voidaan moduloida.

Meidän tutkimuksissa SIRT1 oli hyvin ilmaistu keuhkosyöpä johdettu hankittua. Lisäksi hypoksia on osoitettu olevan yksi tärkeimmistä laukaisee uusien verisuonten kasvua pahanlaatuisia kasvaimia [14]. Zhang et ai. osoittivat, että koska HIC1 (hypermetyloitunut Cancer 1) sitoutuneena SIRT1 promoottori, alenevasta CtBP rekrytointi väheni transkription repression ja indusoi SIRT1 ilmentyminen keuhkosyövän soluihin [15]. Oletimme, että SIRT1 asetuksen aikana hypoksiaa voitaisiin siirrettävä muutosten kautta SIRT1 geenien ilmentyminen keuhkosyövässä johdettu hankittua. Tietääksemme tämä oli ensimmäinen tutkimus osoittaa, että SIRT1 ilmentyminen lisääntyy ajassa riippuvaisella tavalla aikana hypoksiaa kasvaimen endoteelisolujen.

Seuraava kysytään SIRT1 vuorovaikutuksessa erityisesti transkription kumppaneiden verisuonten endoteelisoluja välittävät sen erityisiä vaikutuksia. Guarani et ai. [16] aiemmin osoitti, että asetylaatio N1IC säilyneisiin lysiinejä kontrolloi amplitudi ja kesto Notch vastausten kautta muuttanut N1IC proteiinia liikevaihdon. SIRT1 assosioituu N1IC ja toimii N1IC deasetylaasin estää asetylointi aiheuttamaa N1IC vakauttaminen. Johdonmukaisesti, tuloksemme osoittivat myös, että SIRT1 deasetyloitiin ja tukahdutettu N1IC ilmaisun, joka johti tehostettua angiogeenisten itävyys ja tubulogenesis säätelee SIRT1 riippuvaisen angiogeenisten signalointireitin. Vielä tärkeämpää on, osoitimme ensimmäistä kertaa, että SIRT1 rekrytoitiin yksi erittäin konservoitunut alue sijaitsee -500 bp ylävirtaan Notch1 transkription aloitus- sivusto, jossa ehdotettiin, että SIRT1 voisi sitoutua suoraan Notch1 promoottori, mikä rajoitti geeniekspressiota. Muistiinpanoja, SIRT1 säätelee negatiivisesti Notch1 kautta deasetylaatiolla, jolloin muutokset transkription tasolla Notch voi myös olla rooli vähentämiseen Notch aktiivisuuden vaikuttaa SIRT1. Tämä on määriteltävä tarkemmin.

HEY on helix-loop-helix (bHLH) transkription repressori. HEI perheenjäsenet pidetään kohdegeenien Notch1 signalointi endoteelin koska niiden ilmentyminen voidaan indusoida Notch1 [12]. Tässä tutkimuksessa tutkimme kyky SIRT1 säätelemään geenien ilmentymistä ohjataan N1IC, kuten HEY1 ja HEY2. Suostumuksella raportit Mulligan et al. [17], tuloksemme paljasti, että SIRT1 säätelee negatiivisesti ilmaus HEY1 ja HEY2 keuhkosyövässä johdettu hankittua. Lisäksi Takara et ai. osoittivat, että SIRT1 toiminnallisesti vuorovaikutuksessa Karvainen ja tehostajana-of-split bHLH repressors [18]. Jotta voitaisiin edelleen tutkia vaikutukset SIRT1 Notch-välitteisen soluvasteen ja kasvaimen kasvua, tutkimme verso muodostumista keuhkosyöpä johdettu hankittua ja totesi, että inaktivointi SIRT1 heikentynyt itää muodostumista ja venymä. Nämä vaikutukset päinvastaiseksi lisäämällä o Notch1 estäjä DAPT, mikä viittaa siihen, että SIRT1 moduloi endoteelisolujen angiogeenisten toimintoja säätelemällä Notch signalointi. Kuitenkin inaktivaatio SIRT1 ei täysin estä versoa muodostumista. Niinpä arveltu, että lisäksi Notch1, uusia SIRT1 säädelty transkriptio tekijät voivat myös olla mukana verisuonten kehitykseen, vaikka tulevaisuudessa tutkimuksia edellytetään puuttua rooli näiden tuntematon sääntelyviranomaisten keuhkosyöpään.

Guarani et al. kertoi, että p300 voisivat sitoutua N1IC ja toimivat yhteistyössä aktivaattori at Notch-säädellään promoottorit [16]. Lisäksi meidän tutkimus osoitti, että p300 ei vain pystyy asetylointi N1IC mutta voisi myös aktivoida sen transkription. Vielä tärkeämpää on, SIRT1 esti asetyloitu muodossa N1IC ja merkittävästi vähentynyt N1IC aktiivisuus, kun läsnä on p300. Sitä vastoin hoidon deasetylaasin estäjän NAM johtanut merkittävään kasvuun N1IC mRNA ilmaisun. Niinpä pääteltiin, että SIRT1 deasetylaasi toimintaa muuttanut endoteelin Notch signalointiryöpyn deasetyloimalla N1IC ja antagonisoiva p300. Hansson et ai. osoittivat, että MAML1 (Notch koaktivaattorikompleksien) saattavat voimistaa p300 autoacetylation ja p300 transkription aktivointi [19]. Kuitenkin meidän tulokset viittaavat siihen, että SIRT1 fyysisesti vuorovaikutuksessa ja tukahduttaa p300 transaktivaatiota NAD-riippuvainen tavalla. SIRT1 tukahduttaminen P300 on osoitettu tapahtua deasetyloitumisen kahden lysiinitähteet (1020 ja 1024) puitteissa p300 kysteiinirikkaan domeenin (CRD1) [20]. Koska P300 on gating transkription kofaktorin, deasetyloitumista ja tukahduttaminen p300 mukaan SIRT1 voi toimia tärkeänä integraation vaiheessa aineenvaihduntaa ja solujen erilaistumista.

Kun sitoutuminen transmembraanisen ligandin päässä Delta /Jagged perheisiin Notch transmembraani- reseptoreihin tarjota signaaleja, jotka ohjaavat solujen kohtalon päätöksiä. Erityisesti, DLL4 vaaditaan verisuonten kehitystä ja ilmentyy voimakkaasti tuumoriverisuoniin [21]. Lisäksi tutkimuksessa SIRT1 knock-hiirillä osoittivat, että SIRT1 toimivat ylläpitämään uudissuonittumisen kapasiteettia vastaamaan DLL4 stimulaation kasvaimen verisuonten endoteelin. Määrittää toiminnon DLL4 aikana kasvaimen angiogeneesin SIRT1 siirtogeenisiä hiiriä, me vähensi DLL4 taso on läsnä hiiren tuumorin malli käyttäen anti-DLL4 monoklonaalinen vasta-aine. Tuloksemme viittaavat siihen, että esto DLL4-Notch signalointi johti lisääntyneeseen verisuonten kasvain tiheys. Yllättävää kyllä, tämä verisuonten liikakasvua fenotyypin johti kasvaimen kasvun inhibitiota. Yksi todennäköinen selitys voisi olla, että liiallinen haarautuminen johtaa erittäin kaoottinen verisuoniverkosto puuttuu hierarkian välttämättömiä tehokkaan suuntaava verenkiertoa. Perfuusio tutkimukset osoittivat, että hypersprouting kasvaimen verisuonistossa oli toimimaton [6], jossa ehdotetaan, että saarto DLL4-Notch signalointi voi johtaa kasvaimen alus ”abnormalization” ja esti kasvaimen kasvua. Endoteelisoluissa, SIRT1 moduloi transkriptionaalista aktiivisuutta Foxo1 ja p53, ja aktivoi entsymaattinen aktiivisuus endoteelin typpioksidisyntaasin (eNOS). Koska lukuisia loppupään tekijöiden kohteena SIRT1 varten deasetylaation SIRT1 on oletettu toimimaan keskeisenä säätelijänä useita reittejä mukana kasvaimen kasvua ja verisuonten muodostumista [22]. Tulosten perusteella näyttää, että pharmacological- tai molekyyli-pohjainen saarto SIRT1 toiminta voi edustaa lupaavaa ja uusi lähestymistapa estää syövän etenemiseen.

Yhdessä tutkimuksemme osoittaa uusi rooli SIRT1, jolloin SIRT1 toimii solu- autonominen negatiivinen modulaattori Notch signalointia, ja nämä tulokset tunnistaa palautuva asetylointi N1IC keskeisenä molekyyli- mekanismin, jolla Notch vasteita voidaan moduloidaan dynaamisesti. SIRT1 estää asetyloitu muodossa N1IC ja vähentää huomattavasti N1IC indusoimaa p300, mikä rajoittaa DLL4 /Notch signaloinnin vasteen ja tuumorin angiogeneesiä (Fig. 5). Tuloksemme viittaavat siihen, että salpaus SIRT1 aktiivisuuden ja /tai geenin ilmentyminen voi antaa uusia mahdollisuuksia syövän hoidossa.

Tutkimuksemme osoittavat, että Delta-kaltainen ligandi 4 (DLL4), joka ilmentyy vahvasti verisuonisoluille aikana tuumoriangiogeneesissa, sitoutuu Notch1 reseptoriin ja käynnistää proteolyyttisen cleavages. Lopullinen intramembrane lohkaisu katalysoi γ-sekretaasin johtaa vaikuttava aine vapautuu Notch1 solunsisäinen domeeni (N1IC), joka translokoituu tumaan ja rekrytoi proteiinin MAML1 ja histoni ase- tyylitransferaaseja (HAT, kuten p300) rajoitetun lähdekielen monimutkainen. Tämä rekrytointi johtaa aktivoinnin Notch1 kohdegeenien HEY1 ja HEY2. Lisäksi p300 acetylates N1IC ja parantaa sen transkriptioaktiviteettia taas SIRT1 estää asetyloitu muodossa N1IC ja merkittävästi vähentää N1IC indusoimaa p300, mikä rajoittaa DLL4 /Notch signalointi vasteen ja estämällä kasvaimen angiogeneesiä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläin työ tehtiin alle hoitokäytännön Guangdong ja hyväksymä Käytä komitean animal Care. Hyväksyntä saatiin myös eettinen komitea Guangzhou Institute of Respiratory Disease Research (ID. 2009-2130).

Reagenssit ja

in vitro

Cell Hoidot

Nicotinamide ja N – [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyyli] -S- fenyyliglysiini-t-butyyliesteri (DAPT) saatiin Sigma-Aldrich (USA). SRT2183 ja SRT1720 ostettiin Sirtris Pharmaceuticals (USA). DLL4 ostettiin R & D Systems (USA). Kontrolliryhmät käsiteltiin vastaaviin ajoneuvoihin. Anti-DLL4 monoklonaalinen vasta-aine (ihmisen IgG1-isotyyppiä, että rajat reagoi sekä ihmisen ja hiiren DLL4, 1 ug /ml) oli lahja MedImmune, LLC (USA).

ksenograftimalleissa

C57BL /6J-hiiriä (naaraita, ikä 6-8 viikkoa, paino 15-22 g) ostettiin Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Kiina). Endoteelisoluspesifiseksi SIRT1-knock-in tai SIRT1 (H363Y) -transgenic C57BL /6J hiiriä toimittanut Kiinan Academy of Medical Sciences. Tuottaa endoteeli-spesifinen SIRT1 tai SIRT1 (H363Y) -transgenic hiirissä, ihmisen SIRT1 cDNA (NCBI ref: NM_012238.4) tai SIRT1 (H363Y) cDNA ligatoitiin hiiren VE-kadheriini-promoottori, ja tuloksena kloonit kutsutaan VE-S.