Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia ja tulehdus ovat tiukasti toisiinsa molemmat samansuuntaiset eturauhassyöpää etenemiseen. Lukuisia raportteja korostaa roolia kasvainsolujen synteesissä proinflammatoristen molekyylien ja osoittavat, että hypoksia voivat moduloida useita näistä geeneistä merkittävänä kasvu syövän aggressiivisuutta. Kuitenkin tiedetään hyvin vähän siitä, miten tärkeää kasvaimen fenotyypin tässä prosessissa. Esillä olevassa tutkimuksessa tarkastellaan, miten eri ominaisuuksia, mukaan lukien erilaistuminen ja aggressiivisuutta, eturauhasen kasvainsolulinjojen vaikutus hypoksinen remodeling proinflammatoristen geenien ilmentyminen ja maligniteetti. Suoritimme tutkimuksemme kolmeen solulinjoissa lisääntyessä metastaattinen potentiaali: hyvin eriytetty androgeeniriippuvaisen LNCaP ja vähemmän eriytetty ja androgeenista riippumaton DU145 ja PC3. Analysoimme jonka mukaan hypoksinen hoito on on moduloiva proinflammatoristen geenien ilmentyminen ja arvioida rooli HIF isoformeja ja NF-kB pelata ylläpitämisessä tässä prosessissa. DU145 ja PC3-solujen osoituksena suuremman normoxic ilmaisun ja täydellisemmän hypoksinen induktioon proinflammatoristen molekyylien verrattuna hyvin eriytetty LNCaP-solulinjasta. Rooli HIF1α ja NF-kB, päällikön sääntelyviranomaisten hypoksia ja tulehduksen vastaavasti ylläpitämisessä hypoksinen proinflammatoristen fenotyyppi oli erilainen solutyypin mukaan. NF-kB havaittiin pelata pääosassa DU145 ja PC3-solut, joissa hoito NF-kB estäjä Parthenolide pystyi torjumaan sekä hypoksinen proinflammatoristen shift ja HIF1α aktivointia, mutta ei LNCaP. Tuloksemme korosta, että kasvaimen eturauhassoluhomoge- fenotyyppi osaltaan on eri määrin ja eri mekanismeja hypoksia proinflammatoristen geenien ilmentymisen, jotka liittyvät syövän etenemiseen.

Citation: Ravenna L, Principessa L, Verdina A, Salvatori L, Russo MA, Petrangeli E (2014) Erilliset fenotyypit ihmisen eturauhassyövän solut liittyvät yhteen eri mukauttamista Hypoksia ja Pro-tulehduksellinen Gene Expression. PLoS ONE 9 (5): e96250. doi: 10,1371 /journal.pone.0096250

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 syyskuu 2013; Hyväksytty: 04 huhtikuu 2014; Julkaistu: 06 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Ravenna et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain opetusministeriön korkeakoulujen ja tutkimuksen (MIUR, COFIN 2006062242). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä osoittaa heterogeeninen solupopulaatio lukien harvinainen syöpä kantasolut (CSC) ja pluripotentteihin esisolujen (Ps) upotettu massa solutyypeissä eriasteisia erilaistumista. Suhteellinen runsaus CSC + Ps ja erilaistumista irtotavarana solujen korreloi kasvaimen pahanlaatuisuuden [1], [2]. Kuitenkin vain harvat tiedot ovat saatavilla vaikutuksista fenotyypin irtotavarana kasvainsolujen sopeutumisessa ympäristön stressiä ja erityisesti hypoksia. Hypoksia on vähentää normaalia kudosta hapen paineen, joka voi esiintyä ihmisillä esiintyvät sairaudet. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että hypoksia edistää aggressiivisempia metastaattinen fenotyyppi ihmisen syövissä kuten rinta- [3], glioblastooma [4], kilpirauhasen [5], paksusuolen [6], haiman [7] ja erityisesti eturauhaskasvaimissa [8] – [10], joka on liitetty huonoon ennusteeseen. Hypoksian indusoima tekijä (HIFs) ovat keskeisiä säätelijöitä transkriptionaalisen vastaus hypoksinen stressiin [11]. Ne ovat heterodimeerejä muodostettu O

2 herkkä α-alayksikköä ja konstitutiivisesti β-alayksikköä (HIF1β). Kolme indusoituvaa isoformia HIFα ovat läsnä nisäkkäillä. HIF1α ja HIF2α ovat parhaiten karakterisoitu ja rakenteeltaan samanlaisia ​​isoformien [12]. HIF3α on enemmän sukua oleva yksi lukuisista silmukointivariantit [13]. Läsnäollessa hapen, HIF1α läpikäy proteasomaalisten hajoamista. Hypoksisissa olosuhteissa, se kertyy solutumissa, muodostaa heterodimeerejä HIF1β ja sitoo hypoksiavaste elementtejä kohdegeenin loci. Myös HIF2α ja HIF3α läsnä hypoksinen vakauttamista ja sitoutumaan HIF1β vaikkakin eri kinetiikkaa. Sekä HIF2α ja HIF3α näkyvät ilmaistu soluspesifisen tavalla ja pelata non tarpeeton rooleja sopeutumisessa hypoksia ja hypoksinen kasvaimen kasvua ja etenemistä [14], [15]. Lisääntyvä todistusaineisto osoittaa, että tulehduksellinen microenvironment on lisäksi tekijä, joka johtaa syövän kehityksen eturauhasen [16], [17]. Inflammatorinen geeni vastaus riippuu useista transkriptiotekijät, joista NF-kB on keskeinen rooli. Klassista muotoa NF-kB on heterodimeeri p50 /p65. Sen jälkeen aktivointi, NF-kB dimeerejä translokoituvat tumaan, jossa ne voivat läpikäydä fosforylaatio, sitovat kohdegeenien ja stimuloida transkriptio [18]. Rajat talk välillä NF-kB ja HIF reittejä on dokumentoitu laajasti [19] – [21]. Todellakin, NF-kB alayksiköiden p50 ja p65 suoraan vuorovaikutuksessa NF-kB konsensus sivuston HIF1α promoottori ja edistää pohjapinta tasoilla HIF1α mRNA ja proteiini joissakin malleissa [22], [23]. Toisaalta, hypoksia vaikuttaa aktivoida NF-kB riippuvaista geenin transkription [24]. Kuitenkin taustalla olevien mekanismien yhdistää hypoksia tulehdukseen ja tulehdusta kasvaimen etenemiseen edelleen epäselvää. Viimeaikaiset tapahtumat ovat osoittaneet rooli hypoksisten kasvainsolujen synteesissä tulehdukseen liittyvän molekyylien rintojen [3], glioblastooma [4], kilpirauhasen [25] ja eturauhasen [26] pahanlaatuisen syövän etenemistä. Lisäksi he osoittivat, että koordinoitu reitin, mukaan lukien tulehdus- ja korjaava molekyylejä on läsnä kasvainkudoksessa ilman havaittavaa leukosyyttien infiltraatiota (CD45 +) ja on säädelty transformoiduissa soluissa.

Esillä oleva tutkimus toteutettiin analysoidakseen suhteellinen merkitys HIF ja NF-kB reittejä modulaatioon hypoksia tulehduksellinen eturauhasessa solumalleissa osoittaa selvästi fenotyyppejä yhä erilaistumista. Selventäminen erityinen edistää näiden kahden reitin sisään kasvaimensisäisellä heterogeenisiä soluissa voisi olla hyödyllinen laskeuman kliinisen tutkimuksen ja hoidon [27]. Tämän vuoksi suoritimme meidän kokeita hyvin eriytetty, androgeeniriippuvainen LNCaP ja vähemmän eriytetty, androgeeni-riippumaton DU145 ja PC3 kasvain eturauhasen solulinjoissa alhainen, kohtalainen ja korkea metastaattinen potentiaali, vastaavasti [28] – [32] . Otimme huomioon edustava joukko geenejä, jotka liittyvät synnynnäiseen immuunivasteeseen suuresti osallisena eturauhasen syövän etenemiseen jotka näytettiin yläreguloituja kasvainkudoksessa [26], [33]. Näitä ovat: vahinkojen reseptorin glykaation lopputuotteiden (RAGE) ja puriini-reseptori (P2X7R), verisuonten kasvutekijän A (VEGF) osallistuvien kasvainangiogeneesissä, indusoituva entsyymit ciclo-oksigenaasi-2 (COX2) vastuussa prostaglandiinien synteesi, akuutin vaiheen proteiini pentraksiini 3 (PTX3) ja CXC kemokiinireseptoria 4 (CXCR4) on stroomasolulinja eristetyn hyytymistekijä, säätelijä invasiivisen kasvun ja etäpesäkkeiden muodostumista. Lisäksi olemme analysoineet tasoja hemin-oksigenaasi 1 (HO1), nopeutta rajoittava entsyymi hemin hajoamista, koska prototyyppi tulehdusta säädin [34], [35]. Arvioidaan vaikutusta NF-kB on hypoksian ajettu modulaatio analysoitu proinflammatoristen geenien, tutkimme vaikutuksia NF-kB estäjä Parthenolide. Osuus HIF1α ja yhdistetty toiminta NF-kB ja HIF1α analysoitiin androgeenista riippumattoman DU145 solujen vakaasti pudotus varten HIF1α.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP, DU145 ja PC3 saatiin American Type Culture Collection. LNCaP kasvatettiin RPM1-1640 väliaineessa, DU145 ja PC3 D-MEM-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% v /v inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Thermo Scientific HyClone), ja 100 U /ml penisilliiniä + 100 ug /ml streptomysiiniä. Puromysiinin dihydrocloride (Sigma-Aldrich) 2 ug /ml lisätään aina keskipitkällä HIF1α pudotus klooneja. Soluja ylläpidettiin tavanomaisissa happiolosuhteissa (95% ilmaa ja 5% CO

2) kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Kokeita varten hypoksinen olosuhteet, solut ympättiin ruokia täydellisessä kasvualustassa tiheydellä pituudesta riippuen hoidon päästä alakonfluenssista kun analyysi tehtiin. Päivänä Kokeen väliaine korvattiin esikäsiteltyjen hypoksinen keski- ja soluviljelmissä alistettiin hypoksia sinetöidyssä modulaarisen hautomo kammio (Billups-Rothenberg) huuhdeltiin 1% O

2, 5% CO

2 ja 94% n

2 mukaan valmistajan ohjeiden ja viljeltiin 37 ° C: ssa. Parthenolide (Sigma-Aldrich) käsittelyt suoritettiin pitoisuudella 5 uM osoitetun ajan, aina edeltää 2 h esikäsittelyn normoksia.

Proteiinin uutto ja western blot määritys

Nuclear uutteet valmistettiin tumaekst- kit (Active motiivi). Yhteensä 5-20 ug proteiineja erotettiin Tris-HCl-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin elektroforeettisesti polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Invitrogen). Membraanit blokattiin PBS-rasvaton maito 5% (Bio-Rad Laboratories) 1 tunnin ajan, koettimena sopivan primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa ja sen jälkeen inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitu sekundäärisen vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Immunokompleksit visualisoitiin käytetään vahvistettua kemiluminesenssireagenssia Kit (EuroClone). Digitaalisia kuvia tuloksena kvantitoitiin jonka Määrä One ohjelmistopaketti (Bio-Rad Laboratories) ja ilmaistiin mielivaltainen densitometrisellä yksikköä.

Seuraavat ensisijainen ja toissijainen vasta-aineita käytettiin: hiiren anti-HIF1α (1:500 , BD Bioscience); hiiren anti-HIF2α ja kanin anti-p50 (1:500, 1:1000, Novus Biologicals); kanin anti-HIF3α (1:1000, Aviva Biological Systems); Hiiren anti-p65 (1:2000, Santa Cruz Biotechnology); kanin anti fosfo-NF-kB p65 (Ser 276) (1:1000, Cell Signaling); hiiren anti β-aktiini (1:10000, Sigma Aldrich); piparjuuriperoksidaasi konjugoitu anti-hiiri, ja anti-kani-(1:2000, Bio-Rad Laboratories).

RNA: n eristys ja reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio

Kokonais-RNA uutettiin Trizol-reagenssia ja käänteistranskriboitiin käyttäen Superscript II käänteistranskriptaasia ja satunnaisia ​​alukkeita (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Kvantitatiivinen RT-PCR tehtiin ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Life Technologies). TaqMan Gene Expression Assay sarjoja käytettiin HIF1α, HIF2α, HIF3α, VEGF, RAGE, P2X7R, COX2, PTX3, CXCR4, HO1 ja 18S rRNA (Life Technologies) valmistajan oletus sykliolosuhteita. MRNA taso kunkin geenin kvantitoitiin käyttäen sopivaa standardikäyrän ja normalisoitiin housekeeping geenin 18S rRNA.

Stable geenien

Mission shRNA Bakteeri Glycerol Stock kätkeminen sekvenssi varmistettiin shRNA lentivirukselle plasmidivektoreihin ( klooni numerot TRCN0000003810 ja TCRN0000010819), jotka ilmentävät lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) kohdistaminen HIF1α (HIF1α shRNA) ja ei-kohdistuksen shRNA negatiivinen kontrolli plasmidit (NTshRNA) ostettiin Sigma-Aldrich. Bakteeriviljelmät monistettiin ja shRNA plasmidit puhdistettiin (PureLink, Invitrogen) ja transfektoitiin DU145-soluissa. Vakaa transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 10

6 solua ympättiin ruokia ja 6 cm halkaisijaltaan. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin 4 ug plasmidia väliaineessa ilman antibiootteja. Kuusi tuntia myöhemmin väliaine korvattiin tavallisella väliaineen ja, 24 tuntia aloittamisen jälkeen transfektion jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä ja ympättiin eri laimennoksilla. Toiset 24 tuntia, selektiivinen antibiootti puromysiinihydrokloridi lisättiin lopulliseen konsentraatioon 2 ug /ml. Kymmenen valitaan pesäkettä kullekin plasmidivektoriin monistettiin ja testattiin HIF1α mRNA: n ilmentymisen. Pesäkkeet alennettu HIF1α mRNA tasolla (-20% keskimääräisestä paino- arvo) hiljentäminen plasmidivektoreita ja mRNA tasolla kuin p- solujen NTshRNA plasmidivektori tarkastettiin HIF1α ydin- proteiinin Western blot, 4 h hypoksinen stimulaatiota. Vähentää vaihtelua hypoksisen vastausta, suoritetaan kokeissa kolmeen eri pudotus klooneja, ja esitämme keskiarvo ± SE saatujen tulosten kunkin kloonin. Valvontaa, yhdistelmä kolme ei kohdistamisen plasmidivektorit transfektoidut kloonit käytettiin. NTshRNA DU145 ja p- soluissa ei ilmennyt mitään merkittäviä eroja normoxic ja hypoksinen tasojen kaikki parametrit analysoitiin. Siksi me osoittavat nimellä ”paino” keskiarvo ± SE tietojen, jotka on saatu paino ja NTshRNA DU145 soluja.

Tilastollinen

Kukin koe suoritettiin vähintään kolme kertaa ja edustavia tuloksia ovat esitetty. Arvot pylväsnäyttöä annetaan keskiarvoina ± SE. Tilastollinen merkitys yhden vertailua normaalijakaumaa tietojen määritettiin Studentin t-testiä tai Mann-Whitney Rank Sum testi tietoja ei normaalisti jakautunut. Kaikki tilastot analysoitiin Prism-ohjelma. P-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä (* /° /# P 0,05, ** /°° /## P 0,01, *** /°°° /### P 0,001).

tulokset

Protein tumaansiirtymiseen ja mRNA transkriptio HIF1α HIF2α ja HIF3α vuonna hypoksinen eturauhassyövän solut LNCaP, DU145 ja PC3

tumaansiirtymiseen on mitta aktivoitumista HIF isoformeja. Siksi tunnettu ydinvoiman ilmaus profiilia HIF1α, HIF2α ja HIF3α kasvaimen eturauhasen solulinjoissa LNCaP, DU145 ja PC3 seuraava hapenpuutteen (kuvio 1A). Vuonna normoxic ohjaus, HIF1α proteiini oli havaittavissa tai läsnä hyvin alhaisella tasolla. Yksi% happea kasvatti tumaansiirtymiseen kaikilla tarkasteltavilla solulinjoissa samankaltaisia ​​kinetiikka. Tumakertymään aloitettiin varhain jälkeen hapenpuutteen (1 h), saavutti huippunsa 4 h ja laski lähelle pohjan tasolle 48 h. HIF2α oli läsnä tumassa kaikissa solumalleissa myös normoksia ja sen määrä ei ollut merkitsevästi moduloitu missään tutkituissa malleissa. 72 kDa ydin- HIF3α proteiini oli havaittavissa vain normoxic DU145 soluissa, joissa myöhäisessä induktio havaittiin myös alkaa 24 tunnin kuluttua stimulaation. Densitometri-analyysi osoitti lisätä enintään 2,8 ± 0,8 taittuu verrattuna normoxic soluihin 48 tunnin kuluttua happi peruuttamista ja hitaaseen arvoihin edelleen korkeammat kuin tarkastusten jälkeen 72 h hypoksian (tuloksia ei ole esitetty).

Cell olivat altistuneet 1% O

2 1 korkeintaan 48-72 tuntia, mukaan koesuunnitelma tai ne jätetään hoitamatta. Proteiinin ekspressiota havaittiin tumauutteita immunoblot-analyysillä. Edustava koe jokaisen geenin tutkittuihin solulinjoissa näkyy. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. B mRNA määritykset suoritettiin reaaliaikaisella PCR, normalisoitu taloudenhoito geeni 18S rRNA ja ilmaistiin kertaiseksi induktio suhteen normoxic valvontaa (sarja 1). Keskiarvoja ± SE.

vaikutukset hypoksia HIF1α, HIF2α ja HIF3α mRNA tasoilla tutkittu solumalleissa on kuvattu kuviossa 1B. HIF1α mRNA ilmentyy kaikissa stimuloimattomissa soluissa. Vuonna hapenpuuteympäristössä, HIF1α mRNA pysyi muuttumattomana 4 tuntia ja sitten yhtäkkiä laski 40-50% perusarvoa ja pysyi vakaasti alhainen till 48 h hoidon. Myös HIF2α mRNA ilmentyi kaikissa normoxic solulinjoissa ja osoitti myöhään ja lievä nousu vain androgeeniriippuvaisissa LNCaP jälkeen 24 ja 48 tuntia hapen puutetta. HIF3α mRNA oli havaittavissa vain DU145. Tässä solumallin, hypoksia määritetty mRNA ylössäätö edeltänyt kasvu tumaproteiinin alkaen 4 h ja saavutti huippunsa 48 h stimulaation (10,8 ± 1,5 kertaiseksi induktio).

Kaikkiaan tietomme highlight että HIF1α isoformi, kolmesta analysoitu, on tärkein toimija vastauksena hypoksia riippumatta solun fenotyypin. HIF3α aktivointi on solu erityinen ja ei näytä liittyvän syöpäsolun aggressiivisuutta.

Hypoksia aktivoi NF-kB väylän DU145 ja PC3 mutta ei androgeeniriippuvaisissa LNCaP

arvioitiin vaikutusta hypoksia NF-kB tilan western blot-analyysi, tuen määrän ydinvoiman p50 ja p65-alayksiköiden aika-kurssi kokeissa hapen puutetta. Basal NF-kB aktivaation havaittiin kaikissa solulinjoissa. Tumaansiirtymiseen Sekä p50 ja p65 lisääntyivät merkitsevästi verrattuna normoxic soluja PC3 (1-4 h) ja DU145 (2-4 h), kun taas hapen puutteen ei merkittävästi moduloida ydinaseiden NF-kB tasolla LNCaP samassa ajassa span (kuva 2).

Solun altistettiin 1% O

2 0,5 24 tuntia tai jätettiin käsittelemättä. Sen jälkeen osoitettuina aikoina, solut käsiteltiin ja ydin- sisällön p50 ja p65 havaittiin immunoblot-analyysillä. β-aktiini käytettiin lastaus valvontaa. Edustava koe jokaisen geenin kaikissa tutkituissa solulinjoissa näkyy. Mean densitometrian NF-kB p50 ja p65 suhteessa p-aktiini ± SE on osoituksena myös ja ilmaistaan ​​mielivaltaisia ​​yksiköitä. * Hypoxic solut

vs

normoxic ohjaus soluja.

Nämä tulokset antavat näyttöä siitä, että hypoksia on erilainen vaikutus NF-kB-reitin mukaan kasvainsolun fenotyyppiin.

hypoksinen ylössäätely tulehdukseen liittyvän fenotyypin eturauhaskasvainsoluissa

sitten tutkittiin rooli hypoksia moduloinnissa synteesissä proinflammatoristen molekyylien kuvattu eturauhassyövän solulinjoissa. Tätä varten olemme valinneet joukon edustavia jäseniä geenin perheiden osallistuvat tulehduksen ja kudosten korjaamiseen yliekspressoituvat eturauhasen kasvain tai etäpesäkkeitä ja niiden ilmaisun ajan kuluessa akuutin (2 ja 4 h) ja krooninen (24, 48, 72 h) hypoksinen stimulaatio mitattiin reaaliaikainen PCR.

laadullinen ja määrällinen eroja havaittiin pohjan tasolla ja hypoksinen induktion valitut molekyylit mukaan solun fenotyyppiin ja metastaattinen potentiaali.

LNCaP olivat vähemmän aktiivisia tuottajia molekyylien opiskellut normoksia. Emme havainneet selostukset PTX3 ja COX2 ja kaikki muut geenit, paitsi CXCR4, olivat huomattavasti vähemmän transkriptoidaan verrattuna androgeenista riippumattoman DU145 ja PC3-solut (taulukko 1).

Hypoksia pystyi indusoi VEGF, RAGE, CXCR4 ja HO1 muttei P2X7R-mRNA transkriptio. RAGE mRNA kasvu rajoittui akuutti stimulaation (4 h), kun taas mRNA transkriptio muiden geenien saavutti huippunsa 24 tunnin jälkeen happivajeeseenja laski 72 h (kuvio 3A).

Solut altistettiin 1% O

2 2 jopa 72 tuntia. mRNA-tasot VEGF, RAGE, P2X7R, PTX3, COX2, CXCR4 ja HO1 analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitiin housekeeping geenin 18S rRNA. Kuvaajat osoittavat, suhde ekspression hypoksia käsiteltyjen solujen suhteen normoxic kontrollisoluja (asetettu 1). Keskiarvoja ± SE. * Hypoxic solut

vs

normoxic ohjaus soluja.

DU145 ja PC3-soluista ilmensi suuremman määrän valitun tulehdukseen liittyvän geenejä, jotka yliaktiivista hypoksia täydellisempi ja pysyviä vaste aggressiivisemman PC3-soluissa. Erityisesti DU145 osoituksena pohjapinta selostukset kaikille tutkituissa molekyylit paitsi P2X7R. Vuonna hypoksia, PTX3-mRNA osoitti varhaiskypsä ja määräaikainen korotus, kun taas transkription VEGF, RAGE, COX2, CXCR4 ja HO1 huipussaan 24 tunnin kuluttua stimulaation ja laski 72 h (kuvio 3B). PC3-solut ilmaistu havaittavissa pohjapinta mRNA-tasoja kaikkien analysoitiin tulehdusta molekyylejä. Myös tässä solulinjassa PTX3 ja RAGE olivat enimmillään aiheuttama akuutti hypoksia jälkeen 2 ja 4 tuntia stimulaation, vastaavasti. Eri muihin solumalleja, hypoksia kasvua VEGF, P2X7R, COX2, CXCR4 ja HO1 ilme oli vielä huipussaan kuluttua 48-72 h hapen puutteen (kuvio 3C).

Yhdessä edellä tulokset korostaa, että ilmaisu ja hypoksinen säätelyä molekyylien osallistuvat yleensä tulehdusta ja etäpesäkkeiden eturauhasen kasvain voi suuresti vaihtelevat solun fenotyyppiin.

NF-kB estäjä Parthenolide ehkäisee hypoksian aiheuttamaa tulehdusta edistävät fenotyypin DU145 ja PC3 mutta ei LNCaP ja indusoi HO1 transkriptio kaikilla solumalleissa

havainto, että hypoksia on erilainen vaikutus NF-kB aktivaation mukaan solulinjan fenotyyppi sai meidät tutkimaan rooliin NF-kB in hypoksista säätelyä tulehduksellinen liittyvän fenotyypin kaikissa eturauhasen solut käyttämällä luonnollista NF-kB estäjä Parthenolide. Kuvioissa 4A, 4B ja 4C vaikutukset 5 uM Parthenolide sen ilmentymisen hypoksia moduloidun proinflammatoristen geenien LNCaP, DU145 ja PC3-soluissa on kuvattu, sekä hypoksinen ja happiolosuhteissa. Kullekin geenille, esitämme, jotka on saatu aikaan kohdassa, jossa hypoksian kohdistuu sen maksimi kasvu transkription, kuten on esitetty kuvioissa 3A, 3B ja 3C. Parthenolide merkittävästi torjua hypoksian aiheuttamaa ylösajon useimpien näiden geenien DU145 ja PC3-soluissa paitsi P2X7R ja CXCR4 PC3-soluissa. Päinvastoin, lääke ei ole mitään merkittävää vaikutusta ekspression hypoksian indusoiman molekyylien vähemmän aggressiivisia LNCaP-soluissa.

LNCaP (A), PC3 (B), DU145 (C) solut pidettiin normoksia ja altistettiin 1% O

2: n läsnä ja poissa ollessa 5 uM Parthenolide. mRNA-tasot VEGF, RAGE, P2X7R, PTX3, COX2, CXCR4 ja HO1 analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä, normalisoitu taloudenhoito geeni 18S rRNA ja ilmaistiin kertaiseksi induktio suhteessa normoxic käsittelemätön kontrolli (asetettu 1). Kunkin geenin esitämme vaikutus Parthenolide ajanhetkellä, jossa hypoksian kohdistuu suurin lisäys sen transkription. * Hypoxic Parthenolide käsitellyt solut

vs

hypoksinen soluja. C: kontrolli normoxic käsittelemättömät solut. P: normoxic Parthenolide käsiteltyihin soluihin. H: hypoksinen soluja. HP: Parthenolide käsitelty hypoksinen soluja.

Toiminnan Parthenolide moduloinnissa HO1, avainentsyyminä vastustamaan tulehdusvaurion, oli täysin erilainen (kuva 5). Parthenolide pystyi liian varhain ja indusoivat voimakkaasti HO1 kaikissa normoxic ja hypoksisiin eturauhasen kasvainsolujen maksimaalisen vaikutuksen 4 h stimulaation. Tämä vaikutus vähitellen laski, mutta oli edelleen läsnä 24 tunnin kuluttua hoidon LNCaP ja DU145 jälkeen 48 h PC3-soluissa. Näissä ajankohtina vaikutus Parthenolide ja hypoksia HO1 ilme olivat lisäaineena.

LNCaP, PC3 ja DU145 soluja pidettiin normoksia ja altistettiin 1% O

2: n läsnä ja poissa ollessa 5 uM Parthenolide. mRNA-tasot HO1 analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä, normalisoitu taloudenhoito geeni 18S rRNA ja ilmaistiin kertaiseksi induktio suhteessa normoxic käsittelemätön kontrolli (asetettu 1). Me osoittavat vaikutuksen Parthenolide 4 h hoidon kun lääke maksimaalisesti ilmen- tymisen lisääntymisen HO1 ilmaisun normoxic kulttuureissa ja 24 tunnin kuluttua (LNCaP, DU145) ja 48 h (PC3) stimulaation kun hypoksia aiheuttivat enimmäiskorotus sen transkription. Keskiarvoja ± SE. * Normoxic ja hypoksinen Parthenolide käsiteltyjä soluja

vs

normoxic ohjaus soluja. C: kontrolli normoxic käsittelemättömät solut. P: normoxic Parthenolide käsiteltyihin soluihin. H: hypoksinen soluja. HP: Parthenolide käsitelty hypoksinen soluja.

Nämä tulokset osoittavat, että NF-kB on keskeinen rooli siirtämällä aggressiivisempia DU145 ja PC3 muttei LNCaP hypoksisia eturauhaskasvainsoluissa kohti tulehdusta, malignimpiin fenotyyppi. Lisäksi kaikissa solulinjoissa, NF-kB näyttää olevan osallisena hypoksian riippumaton inhibitio anti-inflammatorisen geenin HO1.

Parthenolide vaikuttaa HIF1α ja HIF3α hypoksia riippuvainen aktivaatio DU145 ja PC3 solulinjoja

valvonta HIFs ja erityisesti HIF1α aktivaation NF-kB on Kiistanalaista. Testasimme Parthenolide ollut vaikutusta ydinvoiman kertyminen HIF1α 4 h hypoksinen stimulaation että aiheuttama korkeimman tumaansiirtymiseen meidän koeolosuhteissa. Kuvio 6A esittää, että NF-kB estäjä Parthenolide merkittävästi vähentynyt HIF1α proteiinia ydin- kertymistä DU145 ja PC3 solujen (-30%, P 0,05). Mielenkiintoista, HIF1α ydin- taso ei vaikuttanut NF-kB esto vain LNCaP jotka eivät osoittaneet merkittävää NF-kB aktivaation hypoksian.

LNCaP, DU145 ja PC3-solut pidettiin normoksia ja altistuvat 1% O

2 4 h, kun läsnä ja poissa ollessa 5 uM Parthenolide. HIF1α pitoisuus mitattiin tumafraktios- immunoblot-analyysillä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Jokaista geeniä edustava koe esitetään. Mean densitometrisesti HIF1α suhteessa p-aktiini on osoituksena myös ja ilmaistaan ​​mielivaltaisia ​​yksiköitä. B DU145-soluja inkuboitiin normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 48 h, kun läsnä ja poissa ollessa 5 uM Parthenolide. HIF3α pitoisuus mitattiin tumafraktios- immunoblot-analyysillä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Jokaista geeniä edustava koe esitetään. Mean densitometrisesti HIF3α suhteessa p-aktiini on osoituksena myös ja ilmaistaan ​​mielivaltaisia ​​yksiköitä. Keskiarvoja ± SE. C: kontrolli normoxic käsittelemättömät solut. P: normoxic Parthenolide käsiteltyihin soluihin. H: hypoksinen soluja. HP: Parthenolide käsiteltiin hypoksisia soluja. * Hypoxic Parthenolide käsitellyt solut

vs

hypoksisia soluja.

Kuten on kuvattu kuviossa 1A, HIF3α asetus oli soluspesifisen ja sen ilmentyminen rajoittui DU145-solujen joukossa eturauhassyövän malleja tutkitaan. Me tutkimme, NF-kB ollut merkitystä myös hypoksia-riippuvaisen aktivaation HIF3α ja havaitsimme, että Parthenolide merkittävästi vähentynyt HIF3α ydin- tason jälkeen 48 h hypoksinen stimulaatio (~65%, P 0,01) (kuvio 6B).

Kaiken kaikkiaan nämä tiedot korostaa, että Parthenolide voi vaikuttaa hypoksinen HIF1α aktivointi vain kasvainsoluissa, joissa NF-kB reagoi hapen puutetta. Estovaikutusta Parthenolide havaitaan myös HIF3α.

rooli HIF1α remontin proinflammatoristen fenotyyppi DU145 soluissa. Yhdistetty toiminta HIF1α Knockdown ja Parthenolide

poiketen LNCaP, vähemmän eriytetty DU145 ja PC3-solut, NF-kB-reitin oli vahvasti mukana remontin proinflammatoristen fenotyypin hypoksiaolosuhteissa. Määritellä osuus HIF1α tässä prosessissa, loimme vakaa HIF1α pudotus klooneja (HIF1α shRNA) alkaen DU145 soluista. Kuviossa 7A tason ydinvoiman HIF1α proteiinin paino, vuonna NTshRNA vektori transfektoiduissa soluissa ja edustava HIF1α shRNA transfektoitu klooni kolmesta valittu kokeissa, kuluttua 4 h hapenpuutteen. Erittäin alhainen ydin- proteiinin HIF1α Knockdown soluissa juontuu 87% ± 1 keskimääräinen tippa HIF1α mRNA (tuloksia ei ole esitetty). Kuten villityypin soluissa, me tunnettu NTshRNA ja HIF1α shRNA kloonien normoksia ja hypoksia varten mRNA ja tumaproteiinin taso HIF2α ja HIF3α ja NF-kB tila. HIF1α pudotus solut vahvisti HIF2α reagoimattomuus hypoksisiin hoitoon meidän kokeellisissa olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty). Sekä HIF3α mRNA ja proteiini indusoitiin yllä hypoksia paljon vähäisemmässä määrin kuin p- soluissa (kuviot 7B, 7C). Lisäksi Parthenolide ei merkittävästi vaikuttanut HIF3α tumaproteiinin tasolla kuluttua 48 h hypoksinen stimulaatio (kuvio 7C). Myös HIF1α Knockdown soluissa hypoksia tehosti aktiivisuutta NF-kB on osoituksena lisääntynyt ydinvoiman taso p50 ja p65 1% happea (kuvio 7D), vaikka aktivointiaika oli lyhyempi kuin paino- soluissa.

villityypin, NTshRNA ja HIF1α shRNA transfektoidut DU145-soluja pidettiin normaaleissa happiolosuhteissa ja alle hypoksia (1% O

2) 4 tuntia. HIF1α pitoisuus mitattiin tumafraktios- immunoblot-analyysillä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. C: kontrolli normoxic käsittelemättömät solut. H: hypoksinen soluja. B Villityypin ja HIF1α shRNA soluja pidettiin normaaleissa happiolosuhteissa ja alle hypoksia 24, 48 ja 72 tuntia. mRNA tasolla HIF3α analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitiin housekeeping geenin 18S rRNA. Kuvaaja osoittaa suhde ilmentymistä hypoksia käsiteltyjen solujen suhteen normoxic ohjaus soluviljelmiin (asetettu 1). Keskiarvoja ± SE. C Villityypin ja HIF1α shRNA soluja pidettiin normaaleissa happiolosuhteissa ja hypoksiaolosuhteissa 48 tuntia, kun läsnä ja poissa ollessa 5 uM Parthenolide. Sisällön HIF3α ydin- proteiini havaittiin immunoblot-analyysillä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. C: kontrolli normoxic käsittelemättömät solut. P: normoxic Parthenolide käsiteltyihin soluihin. H: hypoksinen soluja. HP: Parthenolide käsiteltiin hypoksisia soluja. D HIF1α shRNA soluja pidettiin normaaleissa happiolosuhteissa ja alle hypoksia 1, 2 ja 4 tuntia. Ydin- sisältö p50 ja p65 havaittiin immunoblot-analyysillä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Densitomet- analyysi p50 ja p65 suhteessa p-aktiini ilmaistiin mielivaltaisia ​​yksiköitä ja esitetään kertaiseksi induktio suhteen normoxic ohjaus soluviljelmiin (asetettu 1). Keskiarvoja ± SE. * Hypoxic HIF1α shRNA solut

vs

HIF1α shRNA normoxic ohjaus.

mitataan ilmentyminen valitun tulehdukseen liittyvän geenien ajan kokeet, akuutin (2, 4 h ) ja krooninen (24, 48, 72 h) hypoksinen stimulaation puuttuessa ja läsnä oli 5 uM Parthenolide. Kuten odotettua, NTshRNA solut eivät merkittävästi poikkea paino- soluja kaikissa analysoitiin parametrit (tuloksia ei ole esitetty). Siksi olemme yhdistäneet saadut tiedot sekä paino- ja NTshRNA DU145 soluissa. Tuloksia HIF1α shRNA soluissa olivat varsin erilaiset. Vertasimme niiden arvot, jotka on saatu p- soluissa ilmaisemalla mRNA-tasoja kunkin geenin HIF1α shRNA soluissa kertaiseksi induktio suhteessa keskimääräiseen normoxic taso havaittiin p- soluissa, jotka oli asetettu 1. Kuva 8A esittää tietoja Nokian havainnot VEGF, RAGE, PTX3, COX2 ja CXCR4 geeniekspression ajanhetkellä jossa hypoksian kohdistaman sen korotuksen enimmäismäärä transkriptio (2 h PTX3, 48 h VEGF, COX2 ja CXCR4). Normoxic VEGF ja PTX3 RNA-arvot olivat merkitsevästi vähemmän Knockdown verrattuna paino- soluihin, mikä vahvistaa rooli HIF1α heidän perusekspression. Hypoksia merkittävästi voimistunut VEGF, COX2 ja CXCR4 ilmaisun tasolle verrattavissa havaittiin p- soluissa.