Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman ja pohjukaissuolen homeobox-1 (PDX-1) on transkriptiotekijä, joka säätelee insuliinia ilmaisun ja saarekesolujen kunnossapidon aikuisen haimassa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että PDX-1 on onkogeeni haimasyövän ja yli-ilmennetään haimasyöpä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli osoittaa, että PDX-1 on terapeuttinen kohde sekä hormonaaliset oireita ja kasvaimen tilavuus hiirimalleissa haimasyöpä, insulinoma ja luoto neoplasia. Immunohistokemia Ihmisen haiman ja saarekesolujen kasvainten yksilöt paljasti merkitty PDX-1 yli-ilmentymisen, mikä viittaa PDX-1 on ”lääkekykyprofiili” tavoite sisällä näitä sairauksia. Tätä varten uusi RNA-interferenssi efektori alustan, bifunktionaaliset shRNA

PDX-1, kehitettiin ja tutkittiin hiiren ja ihmisen solulinjoissa sekä hiirimalleissa haimasyöpä, insulinoma ja luoto neoplasia. Systeemistä kuljettamista bi-shRNA

humanPDX-1 lipoplexes johti huomattavaan vähenemiseen kasvaimen tilavuuden ja parantaa selviytymisen ihmisen haimasyövän ksenografti- hiirimallissa. bi-shRNA

mousePDX-1 lipoplexes esti kuoleman hyperinsulinemiaan ja hypoglykemia käytettäessä insulinoomassa hiirimallissa. shRNA

mousePDX-1 lipoplexes päinvastainen hyperinsulinemiaan ja hypoglykemia immuuni-toimivaltaisen hiirimallissa saarekkeen neoplasia. PDX-1 yliekspressoitui haiman neuroendocrine kasvaimia ja nesidioblastoosi. Nämä tiedot osoittavat, että PDX-1 RNAi hoidon ohjaa hormonaalista oireita ja kasvaimen tilavuus hiirimalleissa haimasyöpä, insulinooma ja saarekkeiden neoplasia, siis PDX-1 on potentiaalinen terapeuttinen kohde näiden haiman sairauksia.

Johdanto-osan: liu SH, Rao DD, Nemunaitis J, Senzer N, Zhou G, Dawson D, et al. (2012) PDX-1 on terapeuttinen kohde Haimasyöpä, Insulinoma ja Islet neoplasiaa käyttäminen Novel RNA-interferenssi Platform. PLoS ONE 7 (8): e40452. doi: 10,1371 /journal.pone.0040452

Toimittaja: John J. Rossi, Beckman Research Institute of the City of Hope, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 15, 2012; Hyväksytty: 7 kesäkuu 2012; Julkaistu: 08 elokuu 2012

Copyright: © Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan R01-DK46441 National Institute of Diabetes ja Ruuansulatusjärjestelmään ja munuaistautirekisterin; apurahan R01-CA095731 National Cancer Institute; Alkek Foundation; Vivian L. Smith Foundation; MD Anderson Foundation; ja anteliaisuutta Bill ja Olivia Heintz perhe. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: D. Rao, N. Senzer, Z. Wang ja N. Templeton työskentelevät by Gradalis, Inc. seuraavat kirjoittajat ovat osakkaina Gradalis, Inc .: N. Senzer, FC Brunicardi, D. Rao ja J. Nemunaitis. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Haiman ja pohjukaissuolen homeobox-1 (PDX -1) on transkriptiotekijä, joka on kriittinen rooli säätelyssä embryologic haimassa kehitys sekä insuliinin ilmentymisen ja saarekesolujen ylläpito aikuisten haimassa [1], [2], [3], [4]. PDX-1 Knockout on tappava hiirillä ja mutaatio PDX-1 johtaa kypsyä diabeteksen nuorten (MODY alatyyppi IV) hiirillä ja ihmisen potilaat [5], [6]. Pysyvät yli-ilmentymisen PDX-1 johtaa rauhasrakkulasolujen jotta Duktaalinen risolumuuntumisessa hiirissä [7]. Yliekspressio PDX-1 solulinjoissa johtaa muutosta ei-insuliinia tuottavien solujen insuliinia tuottavissa soluissa, kun GLP-1 ärsyke [8], [9], [10], [11], [12], [13 ]. PDX-1 on tunnettu olennaisena säätelijänä monia haiman endokriinisten geenejä, kuten insuliinia [1], [2], [3], [4], glukokinaasi [14], saarekesolujen amyloidipolypeptidi [15], [16], [17], glukoositransportterin tyypin 2 [GLUT2] [18], [19], haiman polypeptidi [20] ja somatostatiini [21], [22], ja siksi on kriittinen rooli ylläpitää glukoosihomeostaasissa.

viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että PDX-1 on onkogeeni [23], [24]. Se on selvästi yli-ilmennetään haimasyövän [23], [25], [26], [27] ja säätelee leviämisen ja invaasion ihmisen haimasyövän soluja

in vitro

ja

in vivo

vuonna hiirillä [23]. PDX-1 yliekspressio hyvän- ja pahanlaatuisten solujen lisännyt kasvainten muodostumiseen, kun nämä solut istutetaan hiirillä [24]. Systeemistä kuljettamista shRNA

humanPDX-1 lipoplexes johti huomattavaan vähenemiseen kasvaimen tilavuuden ja pidensi elinaikaa ihmisen haimasyövän ksenografti hiirimallissa [23].

Tiimimme on kehittänyt uusi bifunktionaalinen RNA-interferenssi platform jossa käännös kohde-mRNA on tukahdutettu kautta sekä pilkkominen riippumaton ja pilkkominen riippuva RISC lastaus reittejä, jolloin ero Argonaut sisällyttäminen ja erillinen, mutta koordinoidut, tavoite inaktivoitumisen mekanismeja [28].

tässä tutkimuksessa, uusi RNAi efektori alustakohdistus PDX-1 kehitettiin ja tutkittiin ihmisen ja hiiren solulinjojen sekä hiirimalleissa haimasyöpä, insulinoma ja saarekkeen neoplasia onko PDX-1 on potentiaalinen terapeuttinen kohde valvontaa sekä hormonaaliset oireet ja kasvaimen tilavuus näissä haiman tauteja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

SCID hiiriin sijoitettu BL-4 laitos ja hoidetaan noudattaen ohjeiden in

Care ja laboratorioeläinten käyttöä

valmistetaan Institute of Laboratory Animal Resources, komission Life Science, National Research Council ja eläinten tutkimuskomitea on Baylor College of Medicine. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden on Baylor College of Medicine (Luvan numero: an 2404).

Ihmisen näytteitä saatiin alla ihmisen protokollaa, hyväksyi Institutional Review Board ( IRB) ja Baylor College of Medicine (Luvan numero: H 14054); näytteet käsiteltiin tiukasti menettelyjen mukaisesti sanelemia sanoi protokollaa. Kaikki ihmisen haiman neuroendokriinikasvain ja nesidioblastoosi näytteet de-tunnistettuja näytteitä saatu IRB suostumuksella (H 14054) ja tietoisen kirjallisen suostumuksen.

Solulinjat, vektoreita ja vasta

Hiiri βTC-6 ja ihmisen haimasyövän solulinja PANC-1-solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD), ja aiemmin on raportoitu [29]. Ihmisen haiman neuroendokriinikasvain yksilöitä ja ihmisten nesidioblastoosi näytteet ystävällisesti tri David Dawson osaston patologian UCLA ja tohtori Milton Finegold n patologian osaston Texas lastensairaalassa, vastaavasti. Hiiren PDX-1 shRNA (shRNA

mousePDX-1) suunniteltiin aiemmin kuvattu [23]. Kaksitoimisen hiiren (bi-shRNA

mousePDX-1) ja ihmisen PDX-1 (bi-shRNA

humanPDX-1) saatiin Gradalis Inc (Dallas, TX). pRIP-mCherry_CMV-eGFP ja pRIP-mCherry _CMVeGFP_H1-shRNA

mousePDX-1 subkloonattiin perustuen emoyhtiön vektorin RIP-mCherry-NLS-mCherry joka saatiin tri Michael Mancini Baylor College of Medicine. Vuohen anti-kani-anti-seerumia ja lampaan anti-hiiri anti-seerumia konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin hankittiin Amersham (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL). Kaniinin anti-vuohi-IgG saatiin ZYMED (Zymed Laboratories, Inc. South San Francisco, CA, USA).

Transfektio ja reportterimääritys

β TC-6 tai PANC-1-soluja maljattiin 10 cm: n soluviljelylevyillä 1 x 10

6 solua per malja tai 24-kuoppalevyille 1 x 10

5 solua /kuoppa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Transfektio analyysit suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeita. Fluoresenssisignaalien havaittiin ja laskettiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa kuten aikaisemmin on kuvattu [23] määrittämiseksi reportteri toimintaa.

Soluproliferaatiomääritys

in vitro

Solulisääntyminen määritettiin MTS määritystä (Promega, Madison, WI) ja BrdU sisältävät määritys (kolorimetrinen) (Roche Diagnosistics GmbH, Mannherim, Saksa) 12, 24, 48 ja 72 h transfektion jälkeen. Absorbanssi luettiin Multiskan EX levynlukijaa (Thermo Electronic Corp., Franklin, MA) 492 nm MTS ja 500 nm BrdU määritystä ja proliferaatiotasoja laskettiin edellä kuvatulla tavalla.

Western blot-analyysit

Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, kuten aiemmin on kuvattu [23], βTC-6-solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskurissa. Kaksikymmentä (20) ug solulysaateista pantiin SDS-PAGE-geeli-elektroforeesilla. Sitten proteiini siirrettiin kalvoihin voidaan tutkittiin erilaisten vasta-aineiden PDX-1, sykliini D1, sykliini E, Cdk2, Cdk4, ja p27. Immunokompleksit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi (ECL) havaitseminen käyttäen piparjuuriperoksidaasi konjugoitu sekundaarinen vasta-aineita.

Eläimet ja shRNA toimitus

SCID hiiriin sijoitettu BL-4 laitos ja hoidetaan noudattaen ohjeet

Care ja laboratorioeläinten käyttöä

valmistetaan Institute of Laboratory Animal Resources, komission Life Science, National Research Council ja eläinten tutkimuskomitea on Baylor College of Medicine. DNA annokset määritettiin täyttävien alle 10% hiiren kuoleman jälkeen injektion liposomaalisen shRNA monimutkaisten säännöllisesti SCID hiirillä. Uroshiirillä, iältään 8- 10-viikkoa vanha, inokuloitiin 1 x 10

6 β TC-6 tai PANC-1-solua per hiiri intraperitoneaalisesti (ip) injektion. Kaksi viikkoa myöhemmin, joko β TC-6 tai PANC-1 hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmitelty (30 hiirtä ryhmää kohti) ja ensimmäisen jakson shRNA

mousePDX-1 tai bi-shRNA

mousePDX-1 tai bi-shRNA

humanPDX-1, vastaavasti, annettiin häntälaskimon kautta injektion. Syklit toistettiin päivinä 14 ja 28 yhteensä kolme injektiota. Samaa protokollaa käytettiin SSTR

1/5

– /- hiirillä käyttäen 3 sykliä 35 ug shRNA

mousePDX-1. ShRNA lipoplexes valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [23].

Insuliinin ja glukoosin mittaukset

Päivinä 7, 21, 35, ja 120 seuraavat kunkin geenin toimitus, 50 ui kokoverta kerättiin ja kehrätty erottaa seerumista. Glukoositasot mitattiin käyttäen Beckman-Coulter Glucose Analyzer 2 (Coulter-Beckman, Fullerton, CA), ja esitetään keskiarvona ± SEM mg /dl. Insuliinitasot määritettiin käyttäen hiiren insuliinia ELISA -kittiä Mercodia (Linco Research, St Charles, MO) ja esitetään keskiarvona ± S.E.M. ug /l.

vatsaonteloon glukoosirasituskoe (IPGTT) B

SSTR

1/5

– /- hiirillä päivinä 7 ja 150 jälkeen alkuperäisen toimittamisen shRNA

mousePDX-1 paastosivat yön yli ennen verinäytteen ottoa kuin T

0. Ryhmitelty hiirille annettiin sitten 1,2 g glukoosia /kg kehon painoa i.p. injektio, jota seuraa verinäytteiden 15, 30, 60, ja 120 minuutin kuluttua injektion glukoosia. Glukoosi- ja insuliinitasot mitattiin kuten edellä on kuvattu.

Ruumiinavaus, kudoksen keräämistä, immunohistokemia ja TUNEL-määritystä

De-tunnistettu ihmisen haiman neuroendokriinikasvain ja nesidioblastoosi näytteet saatiin Dr. David Dawson ja Dr. William Fisher IHC. Hiiren haiman saarekkeet ja kasvaimen otettiin kudosnäytteet päivinä 0, 7, 21, 35, ja lopun aikaa sen jälkeen, kun alkuperäisen geenin toimituksen. Vatsakalvon kasvaimet makroskooppisesti ja mikroskooppisesti arvioitu ja suurempi (A) ja pienempi (B) halkaisijat mitataan ja tallennetaan. Kasvaimen tilavuus (V; rotaatio ellipsoidin) laskettiin seuraavan kaavan mukaan: V (mm

3) = A (mm) x B

2 (mm)

2/2. Kasvaimen kokonaistilavuus on laskettu asettamalla kaikki kasvaimet yhdessä. Hiiret sijoitettiin mukaan läsnä tai poissa kasvaimesta. IHC suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu. Anti PDX-1, insuliinin, PP, sykliini E, p27, Cdk4 tai PCNA-vasta-aineita sovellettiin liukuu 1:100 laimennus, jota seuraa yli yön inkubointi 4 ° C: ssa. Laseja inkuboitiin Cy3 tai FITC-konjugoitu anti-kani, vuohi, tai hiiren sekundääristä vasta-ainetta riippuen johtaminen ensisijaisen vasta yksi tunti, ja asennettu kansi liukuu. TUNEL-määritys (FragEL ™ DNA Fragmentation Detection Kit, kolorimetrinen-TdT Enzyme, Calbiochem, La Jolla, CA) suoritettiin valmistajan protokollan. Määrä apoptoosi ilmaista suhteena apoptoottisten syöpäsolujen kokonaismäärä endoteelisolujen 10 kentät x 100 suurennuksella.

Tilastollinen analyysi

paritonta Studentin

t

-testi käytettiin tilastollisia analyysejä glukoosipitoisuutta, insuliinitaso, ja soluproliferaatiota kanssa

P

0,05 osoittaa merkitys. Χ

2 testiä käytettiin hintavertailun. Rank-log käytettiin hiirten eloonjääminen vertailua. Kaplan-Meier SPSS 15.0 for MS Windows käytettiin piirtää eloonjäämiskäyrien.

Tulokset

PDX-1 yli-ilmentyy ihmisen yksilöiden haiman neuroendokriinisten kasvainten ja nesidioblastoosi sekä hiiren insulinoomasoluja ja siirtogeeninen luodolle liikakasvun hiirimallissa

PDX-1 yliekspressoitui 36 ihmisen haiman ja saarekesolujen kasvainten näytteet mukaan lukien 26 haiman neuroendokriinisiä kasvaimet (Fig. 1a) ja 10 nesidioblastoosi yksilöt (Fig. 1b). PDX-1 oli myös yli-ilmentynyt hiiren insulinoma (β TC-6-solut) (Fig. 1 c) ja molemmissa saarekesolujen ja asinaarisoluissa ja haimasta somatostatiinin reseptorialatyyppien 1 ja 5 knock-out-hiiret (SSTR

1/5

– /-) (Fig. 1 e, f, vastaavasti) verrattuna villin tyypin hiirissä (Fig. 1 d). Nämä tiedot osoittavat, että PDX-1 on merkittävästi yli-ilmentyy sekä ihmisen haiman neuroendokriinisiä kasvaimia, nesiodioblastosis ja hiiren saarekkeiden neoplasia, mikä viittaa siihen, se on potentiaalinen kohde näitä sairauksia.

Immunovärjäys anti-PDX-1-vasta-aine osoittaa yliekspressio PDX-1 ihmisen saarekesolujen neoplasia yksilöt (26 haiman neuroendokriinisiä kasvaimet (a), 10 nesidioblastoosi yksilöt (b), βTC-6 kasvaimet (c) ja 6 haimoissa yksilöitä SSTR1 /5

– /- hiiret (e, f ). PDX-1 yli-ilmentyy sekä saarekkeiden (e) ja asinaarisoluissa (f) on SSTR1 /5

– /- hiirillä verrattuna villin tyypin hiirissä, joissa vain saarekesolujen ilmaistaan ​​PDX-1 (d). PDX-1 positiivisia on merkitty nuolella (x 200).

Targeting PDX-1 bi-shRNA

humanPDX-1 ohjaa kasvaimen tilavuuden ihmisen haimasyövän ksenografti hiirimallissa

in vitro

tutkimuksissa.

Koska PANC-1-solut ovat ihmisen haimasyövän soluja, jotka selvästi yli-ilmentävät PDX-1, näitä soluja käytettiin sekä

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa. bi-shRNA

humanPDX-1 transfektointi PANC-1-soluissa johti knock down of PDX-1. Tämä liittyi vähentäminen soluproliferaation 58%, 40% ja 38% verrattuna tyhjällä vektorilla valvonnan 24, 48 ja 72 h transfektion jälkeen, vastaavasti. Oli suurempi soluproliferaation inhibointi kuin mitä havaittiin shRNA

humanPDX-1: n 0,6 ug ja 1,2 ug /ml väliainetta annoksia (Fig. 2a, 2b), käsitellään potentiaalinen etu bi- shRNA

humanPDX- 1 RNAi hoito haimasyöpä.

MTS-määritys osoitti, että ajan kuluessa soluproliferaatiota PANC-1 (a), jotka on transfektoitu bi-shRNA

mousePDX-1 ja bi-shRNA

humanPDX-1, vastaavasti. Vertailu soluproliferaation inhibition prosenttiosuudet välillä bi-shRNA ja shRNA transfektio eri annoksilla on esitetty PANC-1-soluissa (b).

In vivo

tutkimuksissa.

PANC-1 SCID-hiirimallissa on kehitetty ja tutkittu paljon laboratoriossamme; kun se asetetaan vatsaonteloon SCID-hiirissä, PANC-1-soluja kasvoi suuria kasvaimia kahden kuukauden kuluessa. Kaksi viikkoa implantoinnin jälkeen, kun solut, kolmen syklin bi-shRNA

humanPDX-1 lipoplexes (35 ug /hiiri, intravenoosisesti päivinä nolla, 14 ja 28), vähentää merkittävästi PANC-1 kasvaimen tilavuus on vain muutamia hiirtä, joissa jäljellä kasvaimet keskimäärin 51 mm

3 verrattuna 100% valvonnan hiirten kasvainten keskimäärin 1199 mm

3 90 päivän ajan käsittelyn jälkeen (p 0,05; Fig. 3a). Survival hoitoryhmässä oli merkitsevästi pidempi kuin kontrolleilla (115 ± 9.5d vs. 85 ± 1.4D, vastaavasti, (p = 0,001; Kuva. 3b) ilman merkittävää eroa eloonjäämisen välillä tyhjän vektorin käsiteltyjen hiirten ja käsittelemättömien hiirten (85 ± 9d vs. 76 ± 8d, p = 0,981). Näissä hiiriä jäljellä kasvaimia, kasvaimen PDX-1 ilmentyminen väheni merkitsevästi 95 ± 11,1%: sta 12 ± 1,3% päivinä 0 ja 90 jälkikäsittelyä, vastaavasti (Fig. 3c yläpaneeli). IHC analyysi jäljellä kasvainten paljasti vähentynyttä ilmentymistä solujen lisääntymisen markkereita, proliferatiivisen solun tuma-antigeenin (PCNA) ja sykliini E, (84 ± 9,6%: sta 15 ± 0,8% ja 66 ± 10,2%: sta 9 ± 2,3% vastaavasti; Fig. 3c 2

nd ja 3

rd paneelit), ja kasvu P53 lauseke (Fig. 3c 4

th paneeli). Merkittyjä apoptoosin nähtiin jäljellä kasvaimia päivä 90 post käsittely, mikä viittaa jäljellä kasvaimet koostuvat apoptoottisten solujen, joilta puuttuu PDX-1 ilmentymisen. (Fig. 3c alapaneeli). Yllättävää kyllä, kolmen syklin bi-shRNA

humanPDX-1 lipoplexes ei ollut vaikutusta systeemiseen glukoosin ja insuliinin tasot , mikä korostaa, että lajikohtaiset suunnittelu PDX-1 RNAi (kuvio. S1).

kasvaimen arvioitiin ja verrattiin 90 ja 120 päivän kuluttua alkuperäisen kohtelun käsitellyissä ja kontrolliryhmissä (a). Eloonjäämislukuja hiirten hoidon ja saaneista tyhjän vektorisäätö analysoitiin Kaplan-Meier SPSS (b). Immunovärjäys kasvaimen liukuu PDX-1, PCNA, sykliini E, ja P53 sekä TUNEL-määritys suoritettiin ja analysoitiin (c). Positiivinen Kunkin markkerin on merkitty nuolella (x 200).

Nämä tiedot osoittavat, että useita kierroksia systeemisen bi-shRNA

humanPDX-1 lipoplexes olivat hyvin siedettyjä ja vähentää tehokkaasti ihmisen haimasyövän kasvaimen tilavuus ja pidentynyt eloonjääminen SCID-hiirissä. Nämä tiedot osoittavat, että PDX-1 on mahdollinen kohde käyttämisen uusia terapeuttisia alustan kaikkein aggressiivinen muoto haiman kasvainten.

Targeting PDX-1 bi-shRNA

mousePDX-1 hillitsee liiallista insuliinin eritystä hiiren insulinoomasoluja ja hiirimallissa insulinoomasta

in vitro

tutkimuksissa.

bi-shRNA

mousePDX-1 johti huomattavasti suurempi pudotus on PDX- 1 ilmentyminen β TC-6 solua annoksilla 0,6 ug ja 1,2 ug /ml väliainetta kuin shRNA

mousePDX-1 ja tyhjän vektorin valvontaa sekä western blot (kuvio. 4a; p 0,05) ja immunohistokemia (IHC) analyysit (Fig. 4b yläpaneeli).

Comparison of tehoa bi-shRNA

mousePDX-1, shRNA

mousePDX-1 tai tyhjän vektorin estyminen PDX-1 ilmentymisen β TC-6 soluissa esitetään käyttäen western blot (a) ja solujen immunovärjäys (yläpaneeli, b nuolella). Insuliinin ilmentymisen ja glukoosin stimuloimaa eritystä vasteena pudotus PDX-1 on esitetty solujen immunovärjäyksellä (alapaneeli, b merkitty nuolella) (x 200) ja ELISA-määritystä (d), vastaavasti. Kukin koe toistettiin viisi kertaa. PDX-1 ja insuliinin ilmentymisen immuno- β TC-6 soluja kvantitoidaan (c). PDX-1 ilmentymisen vaikutti RIP-suunnatun reportterin ilmentymisen (RIP-mCherry) in βTC-6 solua (e ja f). Ilmentävien solujen mCherry (punainen) ja GFP (vihreä) visualisoitiin ja valokuvattiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa (e ja f). (X 200).

bi-shRNA

mousePDX-1 johti huomattavasti suurempi esto insuliinin ilmentymisen ja PDX-1 ilmentymisen kuin mitä havaittiin shRNA

mousePDX-1 ja tyhjän vektorin kontrollisoluja, vastaavasti (Fig. 4c, p 0,05, ja Fig. 4b). Transfektio bi-shRNA

mousePDX-1 johti huomattavasti suurempi esto glukoosin stimuloiman insuliinin eritys β TC-6 solua

in vitro

verrattuna nähdään shRNA

mousePDX-1 ja tyhjän vektori tarkastuksia glukoosipitoisuuksien 5 ja 11 mM (p 0,05), tässä järjestyksessä (Kuva. 4d). Nämä havainnot osoittavat, että bi-shRNA

mousePDX-1 estää insuliinin ilmentymisen ja erittymisen kautta PDX-1 knockdovvn, ja niin suuremmassa määrin kuin tavanomaiset shRNA

mousePDX-1 hiiren insulinoomasoluja.

määritellä tarkemmin mekanismi, jonka knockdovvn PDX-1 estää insuliinin ilmentymisen ja erityksen vähentyneen aktivaation rotan insuliini promoottori-1 (RIP), toimittaja rakentaa (RIP-mCherry) kanssa tai ilman shRNA

mousePDX-1 transfektoitiin osaksi β TC-6 solua. RIP-mCherry-H1-shRNA

mousePDX-1 johti huomattavaan vähenemiseen mCherry ilmaus kuin verrattuna RIP-mCherry ilman shRNA

mousePDX-1 (10 ± 1,6% vs. 35 ± 8,1% ja 12 ± 2,1 % vs. 66 ± 13,2%: iin 24 tunnin ja 48 tunnin, vastaavasti, p 0,05; Fig. 4e). Transfektio RIP-mCherry-CMV-eGFP-H1 paljasti, että 90% soluista oli onnistuneesti transfektoitujen, mistä on osoituksena eGFP ilmaisua. Lisäksi, 69% eGFP-ilmentävien solujen ilmaistuna mCherry ja RIP-mCherry-CMV-eGFP-H1-shRNA

mousePDX-1 transfektoituja soluja, 88%: ssa soluista ilmaistuna eGFP; Kuitenkin vain 12% soluista ilmaistuna mCherry (p 0,05; Fig. 4f). Vähentynyt PDX-1 ilmentymisen varmistettiin käyttämällä western blot. Nämä tiedot viittaavat siihen, että aktivointi insuliinin promoottorin merkittävästi inhiboi shRNA

mousePDX-1 kautta pudotus PDX-1 ilmentymisen.

Transfektio bi-shRNA

mousePDX-1: n β TC-6 solut johtanut merkittävään solujen proliferaatio käytetään kahta eri määritystä: MTS-määritys paljasti vähennykset 52%, 38%, ja 31% vs. tyhjän vektorin valvonta 24, 48, ja 72 h transfektion jälkeen, vastaavasti (Fig. 5a) ja BrdU paljasti vähennykset 42%, 35%, ja 42%: iin 12, 24 ja 48 h transfektion jälkeen, vastaavasti (Fig. 5b) (p 0,05 kaikkina ajankohtina). bi-shRNA

mousePDX-1 aiheutti suuremman soluproliferaation inhibointi kuin shRNA

mousePDX-1 pienillä annoksilla (6 ug /10-cm malja) 48 tunnin kuluttua transfektion (Fig. 5c). Solusyklin proteiini analyysi osoitti suurempaa alas-säätely positiivisia sääntelyviranomaisten, sykliini E, Cdk2-, ja Cdk4, ja ajan säätely alipaineensäätöventtiileillä, p53 ja p27, kaksoistislatussa shRNA

mousePDX-1-käsitellyissä soluissa verrattuna tyhjän vektorin (p 0,05; Fig. 5d). Nämä tiedot osoittavat, että PDX-1 pudotus inhiboi hiiren insulinoma soluproliferaatiota kautta muutoksia solusyklin proteiineja.

MTS-määritys osoitti, että ajan kuluessa soluproliferaatiota β TC-6 (a), jotka on transfektoitu bi-shRNA

mousePDX-1 ja bi-shRNA

humanPDX-1, tässä järjestyksessä. Vertailu prosenttiosuudet soluproliferaation inhibition välillä bi-shRNA ja shRNA transfektio eri annoksilla on esitetty β TC-6-solut (b). Solujen lisääntyminen määritetään BrdU myös näkyy (c). Western blot-analyysi 20 ug lysaattia Beeta TC-6-soluja, jotka transfektoitiin shRNAi

mousePDX-1 48 tunnin kuluttua suoritettiin anti-PDX-1, sykliini E, Cdk2, Cdk4, p53 ja p27 (d).

In vivo

tutkimuksissa.

Aiemmin laboratoriossamme kehittänyt tappavan hiiren insulinoma malli, jota on hyvin tutkittu. SCID-hiiriin implantoidaan hiiren insulinoomasoluja ja periksi hyperinsulinemian ja hypoglykemia noin 60 päivää. Tässä hiirimallissa, kolmen syklin joko laskimoon kahden shRNA

mousePDX-1 lipoplexes (25 ug /hiiri kerran kahdessa viikossa) tai shRNA

mousePDX-1 lipoplexes (35 ug /hiiri joka toinen viikko) esti kuoleman hyperinsulinemian ja hypoglykemia ( Fig. 6a ja b ja c ja d, vastaavasti). Ohimenevä hyperglykemia ja hypoinsulinemia havaittiin, mutta palautuivat lähtötasolle päivänä 150 alkuhoidon jälkeen molemmissa hoitoryhmissä. Kontrolliryhmässä, tyhjä vektori lipoplexes ei ollut vaikutusta tappava hyperinsulinemia ja hypoglykemia, kuten on esitetty kuviossa. 6a ja b.

Glukoosipitoisuudet A ja C vastaavat insuliinitaso B ja D hankittiin β TC-6 hiiriä hoidettiin bi-shRNAi

mousePDX-1 tai shRNAi

mousePDX-1 vastaavasti. Jokaisessa luku a-d, viiva viiva kontrolliryhmän data ja pistekatkoviivalla edustaa hoitoryhmässä tiedot. Saarekesolujen solut, jotka ilmentävät PDX-1, insuliinin, PP, PCNA, p27, sykliini E ja CDK4: n osoitettiin IHC ja saarekesolujen apoptoosi on esitetty TUNEL-määritys, kuten nuolet (x 200) (e). Hiiri selviytymisen kolmen hoitojaksoa joko tyhjän vektorin tai kahden shRNAi

mousePDX-1 ja tyhjän vektorin tai shRNAi

mousePDX-1 arvioitiin ja verrattiin käyttäen Kaplan-Meier SPSS (f).

Kaiken hengissä bi-shRNA

mousePDX-1 ja shRNA

mousePDX-1 hoitoryhmässä oli merkitsevästi pidempi kuin valvonta (106 ± 7.8d vs. 53 ± 1.4D ja 146 ± 9.5d vs 53 ± 1.4D, vastaavasti, p 0,05 vs valvontaa, Fig. 6f, Fig. S2). On huomattava, että merkityksetön ero selviytymisen välillä hoitoryhmien johtui tahallinen uhraaminen kaksisuuntaisesti shRNA

mousePDX-1 ryhmä hiiriä sitä ennen (kuva. S2F). Nämä tiedot osoittavat, että PDX-1 Knockdown käyttäen systeemistä bi-shRNA

mousePDX-1 lipoplexes estää tehokkaasti hyperinsulinemic, hypoglykeeminen kuolema käytettäessä insulinoma SCID-hiirimallissa; Siksi hoidot hallita liiallisesta hormonaalisen erityksen liittyy tämänkaltaisen saarekesolujen kasvainten.

Merkillistä, systeeminen bi-shRNA

mousePDX-1 ja shRNA

mousePDX-1 lipoplexes aiheuttaa ajallista hyperglykemia, jotka edustavat ennustettavissa off-tavoite vaikutus hiiren saarekkeiden, sillä PDX-1 on vallitseva säätelijä insuliinin ilmentymisen. Käsittelyn jälkeen bi-shRNA

mousePDX-1,

in situ

luoto PDX-1 ilmentyminen väheni hoidon riippuvaisella tavalla, mistä 88 ± 10,1% päivänä 0-71 ± 8,6%, 49 ± 9,7% ja 23 ± 6,6% päivinä 7, 21, 35 jälkeen hoitojen, vastaavasti, ja palasi 83 ± 12,4% päivänä 120 käsittelyjen jälkeen, kuten esitetty kuvassa. 6e, yläpaneeli. Insuliini ilme oli myös merkitsevästi väheni 92 ± 8,3% päivänä 0-61 ± 9,8%, 32 ± 5,3%, ja 12 ± 1,9% päivinä 7, 21, 35 jälkeen hoitojen, vastaavasti, ja palasi 89 ± 15,3% päivänä 120 käsittelyjen jälkeen, kuten kuvassa. 6e, 2

nd paneeli. Ekspressiotasot PP myös vähentynyt merkittävästi samalla pisteitä hoidon jälkeen (Kuva. 6e, 3

rd paneeli). Merkkiaineiden saarekesolujen proliferaatiota, solusyklin proteiineja ja apoptoosin Lisäksi tutkittiin ennen ja jälkeen hoidon. Islet PCNA ilmentyminen väheni merkittävästi 16 ± 1,4% ja 10 ± 0,8%, 7 ± 0,6%, 5 ± 0,2% ja 14 ± 2,0% päivinä 0, 7, 21, 35 ja 120 käsittelyjen jälkeen, vastaavasti (Fig. 6e, 4

th paneeli). Sekä IHC ja western blot analyysit haiman osien osoittivat yhä p27 ilmentymistä ja vähentää ilmentymistä proteiinin tasot sykliini E ja Cdk4 seuraavien kolmen hoitokerran (Fig. 6e, 5

th, 6

th ja 7

th paneelit, ja Fig. S3, vastaavasti). bi-shRNA

mousePDX-1 johti merkittävään kasvuun apoptoosin hiiren saarekkeiden 1 ± 0,2% päivänä 0, 14 ± 2,4%, 24 ± 3,6%, 42 ± 5,5%, ja 10 ± 1,1% päivinä 7, 21, 35 ja 120 jälkeen hoitoja, tässä järjestyksessä (Kuva. 6e alapaneeli). Tyhjä vektorisäätö hoito ei ollut vaikutusta saarekkeen PDX-1, insuliinin, PP ilme, solusyklin proteiineja ja apoptoosin. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​havaintojen nähdään seuraavat PDX-1 knockdovvn hiiren insulinoomasoluja

in vitro

. Ne viittaavat myös siihen, että systeeminen bi-shRNA

PDX-1 lipoplexes johtaa ajallisesti, lievä hyperglykemia peräisin tukahduttaminen PDX-1 sisällä Langerhansin saarekkeissa myöhempien tukahduttaminen insuliinin ja PP ilme, korreloi muutoksiin saarekesolujen solusyklin proteiineja ja lisääntynyt luoto apoptoosin.

Expression kaikkien saarekkeen merkkiaineiden palautuivat lähtötasolle tappamisen, mikä viittaa uusiutumiskyvyn hiiren saarekkeiden, jolloin normalisoituminen perusinsuliinia ja glukoosipitoisuutta. Tämä on päinvastoin kuin PANC-1 solun jäljellä kasvaimia, jotka oli alhainen PDX-1 ja selvästi kohonneita apoptoosia, mikä viittaa siihen, puute palautuminen. Samanlaiset ilmentymisen PDX-1, insuliinin, PP, ja solusyklin proteiineja ja apoptoosin saarekesolujen myös havaittiin kolmen syklin shRNA

mousePDX-1 lipoplexes (Fig. S4). Nämä tiedot osoittavat, että systeeminen bi-shRNA

mousePDX-1 lipoplexes estävät tehokkaasti hypoglykeeminen kuolema käytettäessä insulinoma SCID hiirimallissa ja johtaa

in situ

knockdovvn PDX-1 saarekkeissa, mikä tukahduttaminen insuliinin ilmaisun ja eritystä ja myöhemmin hyperglykemiaa. Merkillistä, mitään off-tavoite saareke vaikutukset olivat lieviä ja ajallisen, mikä viittaa uusiutumiskyvyn hiiren haiman. Koska ei ole jäljellä insulinoomasoluja löytyy tässä mallissa hoidon jälkeen, saarekesolujen tiedot osoittavat kykyä systeemisesti toimitettuna hoitoa pudotus PDX-1 tässä mallissa.

systeeminen shRNA

mousePDX-1 lipoplexes käänteinen hyperinsulinemia ja hypoglykemia ja muuttaa glukoositoleranssin somatostatiinireseptoripositiivisten alatyyppeihin 1 ja 5 (SSTR

1/5

– /-) hiirten

SSTR1 /5

– /- hiirimallissa käytettiin hiiriä edustavat immunokompetenteissa insulinoma kaltainen hiirimallissa yliekspressioon PDX-1 sekä rakkulasoluissa ja saarekesolujen, varustellun hyperinsulinemia ja hypoglykemia. Halusimme selvittää useiden laskimoon hoidot olisi käänteinen pohjapinta hyperinsulinemian ja hypoglykemian ja suvaita näissä immuunijärjestelmän hiirissä. Kolme sykliä shRNA

mousePDX-1 lipoplexes (35 ug /hiiri) olivat hyvin siedettyjä ja merkittävästi käänteinen pohjapinta hyperinsulinemiaan ja hypoglykemia SSTR

1/5

– /- hiiret (3 ± 0,2 ug /l ja 83 ± 19,5 mg /dl päivänä 0 ja 0,5 ± 0,1 ug /l ja 205 ± 25,9 mg /dl 35. päivänä kolmen hoitokerran jälkeen, vastaavasti, kuten nähdään Fig. 5a ja b); tyhjä vektori lipoplexes ei ollut vaikutusta hyperinsulinemia ja hypoglykemia (Fig. 7a ja b). Merkillistä, systeeminen glukoosi- ja insuliinitasot palasivat perustasolle päivänä 150 alkuvaiheen jälkeen hoidon, mikä viittaa uusiutumiskyvyn näistä hiiren saarekkeiden.

Glukoosipitoisuudet (a) ja vastaava insuliinitaso (b) mitattiin, kuten on kuvattu menetelmän osassa. Immuunivärjäytyminen haiman diat PDX-1, PCNA ja TUNEL määritys tehtiin. Red värjäystä yläpaneelissa (c) osoittaa PDX-1 ilmentymisen (nuoli); vihreä värjäys keski paneeli (c) osoittaa PCNA lauseke (nuoli). Apoptoottisten kasvainsolujen SSTR1 /5

– /- hiiret värjätään ruskea ja ne esitetään pohjapaneelin (c) (nuoli) (x 200). IPGTT testi osoitti glukoosipitoisuutta ja insuliinitasot (d) päivänä 7 ja glukoositasot ja insuliinitasot (e) päivänä 150 jälkeen shRNA

mousePDX-1-hoidon. Data esitetään keskiarvoina ± S.E.M. ja P 0,05 osoittavat merkitys.

vatsaonteloon glukoosinsieto testejä (IPGTT) suoritettiin SSTR

1/5

– /- hiirillä päivinä 7 ja 150 jälkeen