Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aktivointi somaattiset mutaatiot

epidermaalisen kasvutekijän reseptori

(

EGFR

) antavat ainutlaatuiset biologinen ominaisuuksia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin, mutta transkription välittäjiä EGFR tässä alaryhmässä NSCLC ei ole täysin selvitetty.

Menetelmät /Principal havainnot

Tässä käytetyt geneettiset ja farmakologinen lähestymistapoja valaista transcriptomes NSCLC solulinjoissa. Olemme transkriptionaalisesti profiloitu paneelin

EGFR

-mutant ja -wild-tyypin NSCLC solulinjoja viljeltiin tai ilman EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittoria. Hierarkkinen analyysi paljasti, että solulinjat erillisiä perusteella

EGFR

mutaatiostatuksesta riippumatta (mutantti vs. villityyppi), ja ilmaisun allekirjoitukset tunnistettiin valvottu analyysin että erottaa solulinjat perustuu mutaatiostatuksesta riippumatta (villityypin versus mutantti) ja tyyppi mutaatio (L858R vs. Δ746-750). Käyttämällä

EGFR

mutaatio ilmentymistä allekirjoituksen koettimena, me louhittu geeniekspressioprofiilien kahden itsenäisen kohortteja NSCLC potilaiden ja löysi allekirjoituksen osajoukko. EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittori hoidon säännellään useiden geenien ekspressiota, ja farmakologinen esto proteiinin tuotteiden kaksi niistä (

PTGS2

ja

EphA2

) esti ankkurista riippumaton kasvu

EGFR

-mutant NSCLC soluja.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme selvitetty geenit ole aikaisemmin yhdistetty

EGFR

-mutant NSCLC, joista kaksi tehosti kyky muodostaa klooneja näiden solut, erottaa nämä välittäjäaineiden muilta aiemmin osoitettu ylläpitää solujen eloonjäämistä. Nämä havainnot on mahdollista kliinistä merkitystä, jos saatavilla on farmakologisen työkaluja estää proteiinituotteiden näiden geenien.

Citation: Choi K, Creighton CJ, Stivers D, Fujimoto N, Kurie JM (2007) Transcriptional profilointi Non -Pieni keuhkosyöpä solut sisältävät aktivointi

EGFR

Somaattiset mutaatiot. PLoS ONE 2 (11): E1226. doi: 10,1371 /journal.pone.0001226

Academic Editor: Janet Kelso, Max Planck Institute for Evolutionary antropologian, Saksa

vastaanotettu: 06 syyskuu 2007; Hyväksytty: 01 marraskuu 2007; Julkaistu: 21 marraskuu 2007

Copyright © 2007 Choi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute myöntää P50 CA70907, P30 CA125123, ja R01 CA117965.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hoito epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) johtaa nopea ja kestävä kasvaimen kutistumisen osajoukko, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [1] – [3]. Kasvain solujen näillä potilailla on somaattisten mutaatioiden

EGFR

kinaasialue että konstitutiivisesti aktivoida EGFR [1] – [3]. Aktivoiva mutaatiot tunnistettiin tähän mennessä klusteri alueella, joka koodaa kinaasidomeeni (eksonit 18-21), ja ne ovat useimmin joko Δ746-750 deleetio tai L858R pistemutaatioita [1] – [3]. Hiiri malleja rakennettu tutkimaan onkogeenisuustutkimuksessa mutanttien

EGFR

kehittää invasiivisen keuhkojen adenokarsinooman että taantua hoidon jälkeen EGFR TKI [4, 5]. Ikuisti ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen hankkia pahanlaatuinen ominaisuudet transfektion jälkeen mutantti

EGFR

[6]. Hoito EGFR TKI indusoi apoptoosia näissä

EGFR

-transfected solut ja NSCLC-solujen somaattisia mutaatioita

EGFR

[7, 8]. Siten näyttö ihmisen, hiiren, ja solu malleja osoittaa, että mutantti

EGFR

on onkogeeninen ja antaa riippuvuus EGFR varten NSCLC solujen eloonjäämistä.

potenssi mutantti

EGFR

kuten onkogeenin tukee näyttöä siitä, että sen biokemialliset ominaisuudet poikkeavat jyrkästi kuin villityypin EGFR. EGFR-kinaasi domeeni konstitutiivisesti aktivoitu somaattiset mutaatiot, ja se näyttää parannetun sitoutumisen ja herkkyys EGFR TKI [9] – [11].

EGFR

-mutant NSCLC-solut tyypillisesti ilmentävät korkeita EGFR ja sen dimeerinen kumppaneiden ErbB2 ja ErbB3 ja useita ErbB ligandeja, jotka kaikki voimistavat EGFR-riippuvaisen signaloinnin [8]. Useita signalointireittejä konstitutiivisesti aktivoitua näissä soluissa, joista on osoitettu edistävän solujen eloonjäämistä. Esimerkiksi EGFR muodostaa heterodimeerisen kompleksin ErbB3, joka sitoutuu ja aktivoi suoraan fosfatidyyli 3-kinaasin ja ylläpitää solujen selviytymisen kautta AKT-riippuvainen mekanismeja [12]. Muut pro-eloonjääntisignaaleja välittyvät Src-ryhmän kinaasien, jotka konstitutiivisesti aktivoidaan

EGFR

-mutant NSCLC-solut [13; 14].

Toisin kuin edistystä selvittämisessä välittäjäaineita solujen eloonjäämistä, vähemmän on edistytty ymmärtämisessä mekanismeja, joilla mutantti

EGFR

antaa muita neoplastisia ominaisuuksia, kuten kyky siirtää, hyökätä, lisääntyvät ankkurointi-riippumattomalla tavalla, ja edistää angiogeneesiä. Täällä pyrimme tunnistamaan ne välittäjiä kyselemällä transcriptomes paneelin NSCLC solulinjoja, jotka on ominaista läsnäolo

EGFR

mutaatioita. Löysimme transkription profiilia

EGFR

-mutant NSCLC-soluja, jotka sisälsivät geenit, ei ole aikaisemmin tiedetty olevan EGFR-riippuvainen. Vaikka erilaisia ​​solun funktioihin johtuvan näiden geenien on laaja, ja monet niistä ovat linkitetty tiedetty tai ennustettu proteiini-vuorovaikutuksen verkkoja. Lopuksi transkription profiilin tunnistettu

EGFR

-mutant NSCLC-solut on ilmoittanut meille biologinen prosessien ja mahdollisten terapeuttisten kohteiden, jotka voivat olla tehokkaita potilailla, joilla on tämä tauti.

Tulokset

transkriptionaalinen analyysi NSCLC Cell Lines

Käytimme paneeli kahdeksan NSCLC solulinjoja (taulukko 1), joka oli tunnettu siitä, että läsnä tai poissa somaattisten

EGFR

mutaatiot (viisi solulinjoja tällaisia ​​mutaatioita ja kolme ilman) ja

Ras

mutaatiot (kaksi solulinjaa tällaisia ​​mutaatioita ja kuusi ilman). Viiden

EGFR

-mutant solulinjoissa, kolme oli eksoni 19 deleetiomutaatioita (Δ746-750) (HCC827, HCC2279, H4006), yksi oli eksoni 21 pistemutaatio (L858R) (H3255), ja yksi oli L858R yhdessä T790M portinvartijan mutaatio, joka antaa vastustuskyvyn EGFR TKI (H1975). Kolmen

EGFR

-wild-tyypin solulinjoja, yksi oli somaattinen mutaatio

N-ras

(H1299), ja yksi oli

K-ras

mutaatio (H460). RNA uutettiin ja valmistettiin soluista sen jälkeen, kun ne oli viljelty 2 tuntia 70% konfluenssiin läsnä ollessa tai poissa ollessa EGFR-TKI gefitinibin (1,0 uM). Tämä kesto TKI hoidon valittiin tunnistaa varhaisessa transkription tapahtumien aiheuttama EGFR esto ja minimoida havaitseminen geenien ilmentymisen muutoksia johtuen apoptoosin. RNA alistettiin Affymetrix geeniekspressioprofilointi, ja profiilit tutkittiin eroja geenien ilmentymisessä lähtötilanteessa ja TKI hoidon.

tutki ensin

EGFR

mutaatiostatuksesta asemaa luokittelija transkription profiileja. Hierarkkinen analyysi paljasti kasautumiseen solulinjoista perustuu mutaatiostatuksesta riippumatta;

EGFR

-mutant solujen linjat selvästi erotettuja -wild-tyypin solulinjoja (Fig. 1). Kuitenkin, ei ollut selkeä erottaminen toisistaan ​​kahden mutaatiota (L858R vs. Δ746-750) (Fig. 1). Valvottuna analyysi käyttäen tiettyjä perusteita (vähintään 2,0-kertainen tai 50%: n lasku

EGFR

-mutant solulinjoja että verrattuna villityypin,

P

0,05) , 194 ainutlaatuinen geenejä tunnistettiin, että erotettava

EGFR-

mutantti solu linjat -wild-tyypin solulinjoja. Nämä geenit luetellaan File S1 ja havainnollistettu klusteroidussa lämpöä kartan kuvassa. 2

. Tutkimme 29 194 geenien kvantitatiivisella PCR: llä ja vahvistanut, että kaikki 19 (68%) kuului ilmentyvät eri välillä

EGFR

-mutant ja -wild-tyypin solulinjoja (File S2).

dendrogrammi havainnollistaa sukulaisuuden ilmaisun profiileja solulinjoista käsiteltiin (+) tai ilman (-) gefitinibi. Läsnäolo tai puuttuminen

EGFR

somaattisista mutaatioista ja mutaatioiden tyyppi, mukaan lukien L858R pistemutaatio (P) tai Δ746-750 deleetiomutaatio (D), on osoitettu. WT, villityypin.

(A)

194-geenin allekirjoitus, joka erottaa

EGFR

-wild-tyypin (WT) alkaen -mutant NSCLC solusta linjat (käsitelty [+] tai ilman [-] gefitinibi) on kohdistettu ilmaus profiilit

(B) B Michigan kohortti (86 potilasta) ja Harvard kohortti (84 potilasta) ja

( D) B-MCF-7-soluja transfektoitiin osoitetuilla geenejä. Luettelo geenien päällekkäisiä kaikissa kolmessa tietokokonaisuuksia näkyy oikeassa reunassa. (

C

) numerot potilaista Michiganissa ja Harvard ikäluokat ilmentää mutantti

EGFR

ekspressiokuvioiden (

P

0,05, Pearsonin korrelaatio), yhdessä numero ilmentää satunnaisesti malli (SD perustuu 100 simulaatiot). (

E

) Venn kaavio, joka kuvaa päällekkäisyyden allekirjoitukset

EGFR

-mutant NSCLC-solujen ja

EGFR

-transfected MCF-7-solut.

tunnistetiedot Mutant

EGFR

allekirjoitus kohortit potilaat, joilla on NSCLC

seuraava kysellä yleisesti saatavilla geenin ilmentymisen tietokantoja Tuumorinäytteiden näytteiden johdettu kaksi riippumatonta ikäluokat potilaista NSCLC päässä Yhdysvallat (15, 16) onko osajoukko kasvaimia ilmaisivat tämän geneettisen allekirjoitus. Niistä 194 geenit, 102 (53%) olivat edustettuina profilointia alustaa käytetään Harvard kohortin ja 65 (34%) olivat edustettuina Michigan kohortissa. Perustuen lämpöä kartalla edustus niiden geeniekspressiomalleja, ihmisen keuhkojen kasvaimet olivat heterogeenisiä ilmentymiskuviot; kuitenkin, osajoukko kasvaimia (9 84 [11%] Harvard kohortin ja 10 86 [12%] in Michigan kohortissa) osoitti ekspressiokuviota samanlainen kuin

EGFR

-mutant NSCLC geeni allekirjoitus (Fig. 2

B

).

Voit selvittää havaittujen samankaltaisuuksien lämmöllä kartta analyysi oli tilastollisesti merkitsevä, muuttujat luotiin joka määritellään samankaltaisuus positiivisena Pearsonin korrelaatio

P

0,05 (kaksipuolinen) välillä mutantti

EGFR

allekirjoitus kuvio ja geenien ilmentymisen arvoja kasvain, ottaen huomioon sekä yli- ja ilmaisi geenien allekirjoitus. Tämän määritelmän, kasvaimet ilmentää tätä allekirjoitusta kerrata malleja yli-ja ali-ilmentyminen havaittiin

EGFR

-mutant solulinjoissa. Ilmaantuvuus kasvainten ilmentää allekirjoitus oli tilastollisesti merkitsevä (

P

0,01 kunkin kohortin), joka perustuu simulaatiot 100 satunnaisesti valitun geenin allekirjoitukset syntyy kustakin kohortteja (Fig. 2C).

Vaikka

EGFR

mutaatiostatuksesta riippumatta kasvainten näistä potilasaineistoihin on, tietojemme mukaan ei ole raportoitu,

K-ras

(kodonit 12, 13 tai 61) tiedetään on mutatoitunut 29% ja 45% kasvaimista peräisin Harvardin ja Michiganin kohortteja vastaavasti [15; 16]. Somaattiset mutaatiot

EGFR

ja

K-ras

ovat toisensa poissulkevia NSCLC [17], mikä on johtanut tutkijat oletuksen, että nämä tapahtumat ovat geneettisesti tarpeettomia ja että muutos molemmat geenit ei koituu lisäksi etua, kun nämä tapahtumat tapahtuvat yhdessä samassa solussa [17]. Me olettaisi, että jos nämä somaattiset tapahtumat ovat geneettisesti tarpeettomia, sitten ottaa

K-ras

mutaatio antaa mutantti

EGFR

transkription profiilin. Tämän mukaisesti ajatuksen, olemme huomanneet, että

K-ras

mutaatiostatuksesta riippumatta korreloivat, vaikkakin heikosti, jossa mutantti

EGFR

geeni allekirjoitus (Fig. 2

B, P

= 0,07 ja

P

= 0.04 Harvard ja Michigan ikäluokat, tässä järjestyksessä, Wilcoxonin-summa testit kohortin profiilien tilaama keskimääräinen geenien ilmentymisen että korotettiin

EGFR

-mutant solu linjat).

Mutant

EGFR

Signature Rikastettu EGFR-Dependent Genes

tutkia onko joitakin geenien 194-geenin allekirjoitus oli säännelty EGFR-riippuvaista tavalla, me kysyi julkinen tietokanta MCF-7 rintasyövän soluja, jotka oli stabiilisti transfektoitu konstitutiivisesti aktiivinen kinaasien (

Raf1

,

MEK1

,

ErbB2

) tai villiin

EGFR

, joka aktivoitiin lyhytaikainen EGF hoidossa [18]. Olemme tutkineet päällekkäisyyden geeni allekirjoitukset

EGFR

-transfected MCF-7-solut ja

EGFR

-mutant NSCLC soluja. Niistä 194 geenit mutantti

EGFR

allekirjoitus, 139 (72%) olivat edustettuina profilointia alustan MCF-7 solutransfektantteja (11079 geenit kaikissa olivat edustettuina sekä MCF-7 ja NSCLC aineistot ). Analyysi näistä 139 geenien paljasti, että osajoukot geenien korotettiin MCF-7-soluissa, koska MEK, Raf1 tai EGFR transfektio päällekkäin kuin mutantti

EGFR

ilmaisun allekirjoitettavaksi NSCLC soluissa (Fig. 2

D

).

Niistä 119 geeniä, jotka olivat molemmat edustettuina MCF-7 aineisto ja lisääntynyt

EGFR

-mutant NSCLC-solut, 44 (31%) oli lisääntyi

P

0,05

EGFR

-transfected MCF-7-soluissa, joka edusti erittäin huomattavaa päällekkäisyyttä (

P

1E-12, yksipuolinen Fisherin testiä, Fig. 2

E

). Sattumalta, 14 119 geenien voidaan olettaa päällekkäisiä, mikä osoittaa, että limitys havaitsimme ylitetään, mitä olisi odotettavissa, jos

EGFR

-transfected MCF-7-soluissa ja

EGFR

-mutant NSCLC-solut mitään biologisesti yhteistä keskenään. Kun käytimme tiukempia leikkaus pisteen

P

0,01 sijaan

P

0,05 määritellä geenejä, korotettiin

EGFR

-transfected MCF-7 solut (576 geenejä kaikki), 28 päällekkäin mutantti EGFR NSCLC allekirjoitus (mahdollisuus odotettu seitsemän geenien,

P

1E-10, yksipuolinen Fisherin tarkka testi). Me päätellä, että sillä perusteella, mikä yhtäläisyyksiä kanssa allekirjoituksen

EGFR

-transfected MCF-7-solut, allekirjoitus alkaen

EGFR

-mutant NSCLC soluja rikastettiin geenejä transkriptionaalisesti up-säännellään EGFR .

tunnistetiedot

PTGS2

kuin geenin vaaditaan ankkurista riippumaton kasvu

geenit, jotka ilmentyvät differentiaalisesti

EGFR

-mutant NSCLC solulinjoja putosi laaja toiminnallisia luokkia (luokiteltu Gene ontologia Molecular toiminnot, www.geneontology.org) (tiedostot S3 ja S4). Luokat korkeimmalla edustus olivat signaalitransduktion, aineenvaihdunta, immuunivasteen, ioninkuljetusmeka-, ja solusyklin ja lisääntymistä. Geenejä näihin ryhmiin olivat erittäin esiin muun muassa ne, jotka koodaavat ErbB ligandit (

TGFa, AREG

, ja

ereg

), syklo-oksigenaasi-2 (

PTGS2

), ligandi CX3CR1 kemokiinireseptoria (

CX3CL1) B, solunsisäisiä ja kalvon läpäisevä kinaasien (

TRIB2, MET, MYLK, STK39, ACVR1, TAOK3, ja IFIH1

), proteiini fosfataasit (

PTPN22, DUSP10 , PPAP2B, PTPRR,

ja

PTPRE

), lipidi fosfataasi (

SGPP2

), adheesiomolekyylien (

CEACAM6, ITGAV, PCDH7,

ja

THBS1

), ja kalsiumionin-sitovia proteiineja (

S100A14

ja

S100A16

).

tutkia nämä ilmentyvät eri geenejä, joilla on erilaisia ​​biologisia toimintoja, kuuluivat yhden tai useamman signaalin siirtoon verkoissa, analysoimme niiden tehtävissä tunnettu tai ennustettu maailmanlaajuinen proteiini vuorovaikutuksen verkkoja (interactomes) käyttäen HiMAP ohjelma (https://www.himap.org/index.jsp). Interactomes tunnistaa tämän lähestymistavan on järjestetty sarjaan moduulirakennelmien ominaista keskeisellä paikalla solmujen (kutsutaan solmukohdat), joissa on useita yhteyksiä muihin proteiineihin [19]. Vaikka tämä lähestymistapa on puhtaasti valmisteleva ja kuljettaa mitään tilastollista painoa, löydökset hiiva osoittavat, että keskeisyys proteiini interactome ennustaa proteiinin biologinen merkitys [20].

Niistä 194 ilmentyvät eri geenit, 118 oli selityksin Gene ontologia, joista 102 sisällytettiin HiMAP ohjelman (19). Näistä 102 geenejä, 52 kartoitettu yhden verkon (Fig. 3). Keskiöt verkkoon eniten linkkien (≥ 10) sisältyvät

CD44, MET, insuliinireseptorisubstraatti 1, GRB10, ITGA2, PTGS2, ja THBS1,

jotka kaikki olivat erittäin ilmaistaan ​​

EGFR

-mutant NSCLC-solut, mikä osoittaa, että jotkut differentiaalisesti ilmentyvien geenien olivat keskikohdissa tämän signaloinnin verkkoon.

Teoreettinen proteiini-proteiini fyysisen ja toiminnallisen vuorovaikutuksen kartta (interactome) vedettiin käyttäen HiMAP ohjelmistoa. Geenit allekirjoitus on merkitty punaisella.

Kun otetaan keskeisyyden

PTGS2

geenin interactome verkon ja tunnetun merkityksen geenituotteekseen COX-2 (COX -2) selviytymisen ja etäpesäke syöpäsolujen ja sen mahdollinen kliininen vaikutus, jos saatavilla on farmakologinen työkalut estää sen entsymaattista toimintaa [21], pyrimme tutkia sen roolia

EGFR

-mutant NSCLC soluja. Tutkimme, onko syklo-oksigenaasi-2-estäjän selekoksibia kumottu kyky näiden solujen lisääntymään yksikerrosviljelmissä ja muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa. Käyttämällä selekoksibi pieninä annoksina (0,5 uM ja 1,0 uM) minimoida epäspesifinen vaikutuksia, pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa väheni annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4), kun taas lisääntymistä monolayers ei muutu (tuloksia ei ole esitetty).

kuvat ovat pesäkkeiden NSCLC solulinjojen (ylempi paneeli) kvantifioitiin (alempi paneeli) jälkeen kasvattamalla niitä pehmeässä agarissa läsnä ollessa tai poissa ollessa selekoksibia. Tulokset ovat keinoja vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Cell Lines

EGFR

poistot ja pistemutaatioita on erilaiset Expression Profiles

Potilailla, joilla

EGFR

-mutant NSCLC, erot eloonjäämisen kesto ja vastata EGFR TKI hoitoon on havaittu riippuen on

EGFR

somaattinen mutaatio (eksoni 21 pistemutaatiot versus eksoni 19 poistot) [22; 23] , mikä viittaa siihen, että nämä kaksi somaattisten mutaatioiden antaa selvä biologinen ominaisuuksia NSCLC soluihin. Tätä mahdollisuutta tukee todisteita siitä, että nämä kaksi somaattisista mutaatioista antaa erillisiä biokemiallisia ominaisuuksia EGFR [9] – [11]. Vaikka hierarkkinen ryhmittely ei erotella kaksi mutaatiota kahteen eri alaryhmään (Fig. 1), me arveltu, että valvottu analyysi paljastaa transkription eroja näiden kahden mutaation. Todellakin, kirkas transkription havaittu eroja. Käyttämällä erityisiä perusteita (

P

0,01, ainakin kaksinkertaiseksi muutos), tunnistimme 270-geenin allekirjoitettavaksi

EGFR

-mutant solulinjoja (joita ei ollut läsnä

EGFR

-wild-tyypin solulinjoja), joka erottaa nämä kaksi mutaatiota. Nämä geenit luetellaan File S5 ja havainnollistettu klusteroidussa lämpöä kartan kuvassa. 5. Tutkimme 7 270 geenien kvantitatiivisella PCR: llä ja vahvistanut, että kaikki 4 (57%) oli ilmennetty eri välillä solulinjoissa L858R mutaatioita verrattuna niihin, joilla Δ746-750 mutaatioita (File S6). 270-geeni allekirjoituksen analysoitiin rikastamiseen tietyillä geenifunktioiden määrittelemän Gene ontologia Signature Database. L858R-mutantti-soluja rikastettiin geenien syklisen AMP-riippuvainen proteiini kinase-, proteiini fosfataasi-2ε-, Ras-perheen jäsen RAB3D-, ja fosfolipaasi-Cβ1 riippuvaisten reittien, kun taas Δ746-750 mutantit rikastettiin geenien CXC-kemokiini ligandit (2 ja 3) -, integriinin α6-, guanylate sitovat proteiinit (1, 2, ja 3) -, ja interleukiini-7 ja 10-riippuvaisten reittien (File S7), mikä osoittaa, että geeni asettaa aktivoidaan kaksi mutaatio tyypit ovat toiminnallisesti erillisiä.

194-geeni allekirjoitus läsnä

EGFR

-mutant muttei EGFR-villityypin solulinjoilla erottaa L858R (PM [pistemutaatio]) alkaen Δ746- 750 (poistetaan). Soluja käsiteltiin (+) tai ilman (-) gefitinibi. Osittainen luettelo geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti kaksi ryhmää on osoitettu oikealla.

Genes säätelemä EGFR-TKI Treatment

Tunnistaa geeniekspression muutoksia, jotka edelsivät, ja mahdollisesti osaltaan, biologinen vaikutus EGFR-TKI hoidon

EGFR

-mutant NSCLC-solut, solut altistettiin lyhytaikaiseen hoito gefitinibin. Negatiivisena kontrollina tässä kokeessa käytimme TKI-resistenttejä H1975-soluja, jotka on T790M mutaatio, joka estää sitoutumista EGFR TKI [17]. Käyttämällä erityisiä perusteita (

P

0,05), huomasimme, että 54 geenit säätelevät TKI yksinomaan TKI-herkän solulinjoissa (HCC827, H3255 ja H4006) (File S8), joista yksikään ei ole , tietojemme mukaan raportoitu olevan EGFR-riippuvainen geeneistä. Näistä geeneistä, tutkimme 14 kvantitatiivinen PCR ja vahvistanut, että kaikki 10 (71%) oli differentiaalisesti säännelty TKI-herkkien ja resistenttien solujen (File S9). Geenejä, jotka kasvoivat vasteena TKI sisältyvät, muun muassa, solusyklin säätölaitteet (

CCNG2, CDKN1B, ID2, ja KNTC2

) ja ligandin EphA2 (EFNA1). Geenit, jotka laskivat sisältävät

EphA2

reseptorityrosiinikinaasia, sytokiinien (

LIF, CCL20,

ja

IL17B

), transkriptiotekijöitä (

FOXD1

ja

POU1F1

), ja proteiini fosfataasit (

DUSP4

ja

DUSP6

).

vastavuoroinen asetukseen EphA2 ja EFNA1 on EGFR-Dependent

Kun otetaan huomioon merkitys EphA akselin kasvainten synnyssä [24; 25], me tutki tarkemmin vaikutuksia TKI hoidon ilmaisun EphA2, muiden EphA perheenjäseniä, ja heidän ligandin EFNA1. Kvantitatiivinen PCR ja western-analyysi vahvisti, että gefitinibi rakenteellisesti säädellä ilmentymistä EphA2 ja sen ligandin EFNA1 on TKI-herkkien solulinjojen (HCC827, H4006 ja H3255), mutta ei TKI-resistenttejä H1975-solut (Fig. 6

A- C

). EphA1, EphA5, ja EphA6 eivät muuttuneet gefitinibin hoitoon (Fig. 7

A, E, ja F

); EphA4 laski vain osa TKI-herkkien solujen (H4006, mutta ei HCC827) (Fig. 7

C

); ja EphA3 estyi EGFR-riippumattomalla tavalla (merkitty TKI-indusoidun suppression in H1975-solut) (Fig. 7

B

). Täydemmin arvioimiseksi, tukahduttaminen EphA2 ilmentyminen EGFR välittämän, tutkimme toisen vaikutusta EGFR-TKI, erlotinibi, ja totesi, että se liian esti EphA2 ilmentymistä TKI-herkkien solujen, siinä määrin samanlainen kuin gefitinibin (kuvio . 7

F

).

kvantitatiivinen PCR-analyysi

(A, B) B ja western blotting

(C) B on EphA2

(A , C) B ja EFNA1

(B, C) B-solulinjoissa käsiteltiin 6 h (+) tai ilman (-) gefitinibi. Kvantitatiivinen PCR tulokset edustavat avulla vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta ja normalisoitiin perustuen ekspressioon housekeeping-geenin L32. Numerot alla bändit ovat tulokset densitometrinen analyysin normalisoinnin jälkeen lastaus erot perustuvat aktiini.

Soluja käsiteltiin 6 h ajoneuvon, 1 uM gefitinibi (A-E), tai 1 uM erlotinibi (F). RNA uutettiin ja suoritettiin kvantitatiivinen PCR. Tulokset edustavat hoidettava vähintään kolmen erillisen kokeen ja normalisoitiin perustuen L32 ilme.

EphA2 aktivoitumista tarvitaan Anchorage riippumattoman kasvun

olettaisi, että EphA2 signalointi ylläpitää neoplastisia ominaisuuksia NSCLC-solujen ja testattu tämän hypoteesin käsittelemällä HCC827 soluja EphA2-Fc, joka on yhdistelmä-DNA-peptidin, joka sisältää EphA2 solunulkoisen domeenin fuusioituna F

c fragmentti IgG, joka estää vuorovaikutuksen Efriini ligandeina endogeenisen EphA tehokkaasti estää EphA aktivointi [26]. Suhteessa, että hallintalaitteiden, EphA2-Fc-käsitellyt solut osoittivat laski pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa (Fig. 8), kun taas niiden leviämiseen yksikerrosviljelmissä ei muutu (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että EphA oli tarvitaan kiinnittämisestä riippumaton leviämisen näiden solujen.

kuvat ovat pesäkkeiden NSCLC solulinjojen (ylhäällä) ja kvantifiointia pesäkkeiden (alhaalla), kun kasvu pehmeässä agarissa läsnä ollessa tai poissa ollessa EphA2-Fc. Tulokset ovat keinoja vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Keskustelu

Kirjoittajat raportoivat, että NSCLC solut somaattisten

EGFR

mutaatiot on ainutlaatuinen transkription profiilin ja että solulinjat kahden yleisintä

EGFR

mutaatiot on selkeät transkription eroja. Kaivos- geenin ilmentymisen tietokantoja mutantti

EGFR

erityinen allekirjoitus koettimena, huomasimme, että monet geenit tämä ilmaus allekirjoitus oli EGFR-riippuvaista, yhdistelmälaitteiden yhteisiksi verkkoihin perusteella tunnettujen tai ennustetun proteiinin interactomes, ja ilmaistiin kasvaimia potilasalaryhmässä NSCLC. Kaksi geeniä selvitetty,

EphA2

ja

PTGS2

, että edisti kyky muodostaa klooneja

EGFR

-mutant NSCLC-solut, jotka ovat erityisen kiinnostavia kliinisestä näkökulmasta, koska ne voivat estyä farmakologisesti.

Geenit sisällä mutantti

EGFR

geeniekspressiota allekirjoitus koodaavat proteiineja, joilla on monipuolinen kokoelma solutoiminnoille. Vaikutus EGFR tämän allekirjoituksen osoitettiin sen päällekkäisyydestä että EGFR-transfektoitujen MCF-7-soluihin ja läsnäolo tunnettujen EGFR transkription tavoitteita, mukaan lukien

PTGS2,

ErB ligandit

ereg

ja

AREG,

ja

Met

, tyrosiinikinaasireseptorin että äskettäin raportoitu aktivoitava

EGFR

-mutant NSCLC-solujen ja edistää TKI vastarintaa näissä soluissa [ ,,,0],8; 27-29]. Tässä osoitimme, että geenituote on

PTGS2

, COX-2-, on tärkeä rooli, edistää kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Tämä allekirjoitus sisälsi monia geenejä ei aikaisemmin tiedetä olevan erittäin ilmaistaan ​​

EGFR

-mutant NSCLC, mukaan lukien

LY96

ja

CX3CL1

, jotka ovat tunnettuja immunomodulaarisia toimintoja.

LY96

koodaa MD2, apumolekyyli tarvitaan aktivointi Toll-kaltainen reseptori-4, joka edistää solujen eloonjäämistä ja indusoi eritystä immunosuppressiivisia molekyylejä, jotka edistävät kasvaimen kiertäminen päässä immuunivalvonnan [30].

CX3CL1

koodaa erittyvää proteiinia nimeltä fraktalkiini joka rekrytoi CX3CR1-luontaisen tappaja ja T-lymfosyyttejä tuumoriin mikroympäristössä, mikä edistää luonnon tappaja-riippuvaisten kasvainten vastainen vasteita

in vivo

[31]. Toisaalta, fraktalkiini on myös osoittanut pro-metastasoitunut ominaisuudet perustuvat todisteet siitä, että se edistää kasvainten solujen vaeltamiseen ja parantaa tarttuvuutta syöpäsolujen endoteelisoluihin [32; 33].

geenien tunnistamiseen säännellään EGFR -riippuvaista tavalla, käsittelimme

EGFR

-mutant NSCLC solujen gefitinibin. Kaksi geenien tunnistaa tämän lähestymistavan,

EphA2

ja sen ligandin

EFNA1

, säädeltiin vastavuoroisesti tavalla. Potentiaalisesti välittävät tätä gefitinibin, mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi, alavirtavaikuttajainhibiittorit EGFR, estää

EFNA1

ilmaisua, mikä vähentää EFNA1 aiheuttama tukahduttaminen

EphA2

ilmaisun [25]. Lisäksi olemme havainneet, että EphA2 /EFNA1 vuorovaikutukset olivat tarpeen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun HCC827 soluja, jotka vahvistavat havainnot aikaisemmassa tutkimuksessa osoitetaan, että v-erbB-riippuvaisten solujen transformaatio vaimennetaan EphA2 ligandia sitova [25]. Muita geenejä löysimme säänneltävä gefitinibin TKI-herkkien solujen sisältävät

CCNG2, CDKN1B, ID2, ja KNTC2

, ovat osana solusyklin säätelyreittejä. Koska niiden ilme muuttui ennen biokemiallinen näyttö proliferatiivisia pidätyksen tai apoptoosin, nämä geenit saattavat olla osa antiproliferatiivinen signalointi ohjelma aktivoidaan gefitinibi. Lopuksi kaksi geeniä, jotka laskivat runsaasti kanssa gefitinibin hoito (

CEACAM-6

ja

DUSP6

) on myös hyvin ilmaistu

EGFR

-mutant soluja, mikä viittaa siihen, että nämä geenit ovat mahdollisesti tärkeitä EGFR transkription tavoitteita näissä soluissa.

Yhteenvetona olemme tunnistaneet transcriptome NSCLC soluissa, jotka selventää mutantti

EGFR

indusoitu geenien ilmentymisen muutoksia ja tarjoaa transkription perustan biologinen havaitut erot NSCLC kahden yleisimmin esiintyviä tyyppejä

EGFR

mutaatioita. Tarkempi analyysi näistä geeneistä voi ilmoittaa meille biologinen prosesseja voidaan käyttää tunnistamaan solunsisäisiä kohteita potentiaalisia terapeuttista hyötyä potilaille, joilla on tämä sairaus.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Gefitinibi (Astra Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE) ja erlotinibin (OSI Pharmaceuticals, Melville, NY) olivat lahja. Olemme hankkineet rekombinantti hiiren EphA2-Fc-kimeeran (R GIBCO-BRL, MD), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, Utah).

geeniekspressioprofilointi

-RNA: t eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ja hybridisoitiin Affimetrix U133 + 2,0 geeniekspression pelimerkkejä MD Anderson Cancer Center Microarray Core Facility (tukee osittain apurahan CA # 16672). dChip (https://www.dchip.org) (2005 versio) käytettiin poimia ilmaisua arvot kullekin koetinsarjaa. Ohjaus koetinsarjojen ja koetinsarjojen suffiksoituna ”_s_at” ja ”_x_at” heidän ID jätettiin (koska nämä koetinsarjojen voivat kohdistaa enemmän kuin yksi ainutlaatuinen sekvenssi), jättäen 39114 of 54675 alkuperäisen koetinsarjojen tarkempaa analysointia.

määritys erilaisesti ilmaisi geenien

Kaksi-näyte

t

testeissä (käyttäen log-transformoituja data) käytettiin määrittämään merkittäviä eroja geenien ilmentyminen välillä

EGFR

-mutant ja -wild-tyyppinen NSCLC solulinjojen ja välillä EGFR-transfektoiduissa ja vanhempien MCF-7-solut (

P

arvot olivat kaksipuolisia). Analysointiin gefitinibin hoidon vaikutuksia, pariksi ero laskettiin log

2 (gefitinibi-käsitelty /ajoneuvo-käsitelty).

GO rikastamiseen analyysi

Funktionaaliset geenin ryhmiä määritellyn