Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Sädehoito on yksi tärkeimmistä hoitostrategioiden syövän hoidossa. Telomere sitovan proteiinin TPP1 on tärkeä komponentti shelterin kompleksin nisäkkäiden telomeres. Aikaisemmat raportit osoittivat, että TPP1 ilmentyminen koholla säteilyresistenteille soluissa, mutta tarkka vaikutuksia ja mekanismeja TPP1 on radioherkkyyttä on epäselvä.

Keskeiset havainnot

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että kohonnut TPP1 ilmaisu korreloi merkitsevästi radioresistance ja pidempi telomeeripituuden ihmisen peräsuolen syövän solulinjoissa. Lisäksi TPP1 yliekspressio osoitti pidentyneet telomeeripituuden ja merkittävä lasku radioherkkyyttä röntgensäteilyä. TPP1 välittämä radioresistance korreloi vähentynyt apoptoosin nopeudella jälkeen IR altistuksen. Lisäksi TPP1 yliekspressio osoitti pitkittyneen G2 /M pidätyksen välittämiä ATM /ATR-Chk1 signaalireitin jälkeen IR altistuksen. Lisäksi TPP1 yliekspressio nopeutti korjaus- kinetiikka koko DNA-vaurioita ja telomeerivasta toimintahäiriön aiheuttama ionisoiva säteily.

Johtopäätökset

osoittaneet, että kohonnut ilmentymiä TPP1 ihmisen peräsuolen syöpäsoluissa voisi suojata telomere DNA vahingoittaa ja antaa radioresistance. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TPP1 voi olla potentiaalinen kohde on sädehoidon paksusuolen syövän.

Citation: Yang L, Wang W, Hu L, Yang X, Zhong J, Li Z, et al. (2013) Telomeeri-sitova proteiini TPP1 moduloi Telomeeri Homeostasis ja antaa Radioresistance Human peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (11): e81034. doi: 10,1371 /journal.pone.0081034

Editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. heinäkuuta 2013. Hyväksytty: 08 lokakuu 2013; Julkaistu: 19 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (No.81071825), tohtorin Fund opetusministeriön Kiina (No.20120141130010) ja perustutkimus rahastojen Keski yliopistojen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC), jossa on yli 1,2 miljoonaa uutta tapausta ja 608700 kuolemantapausta vuonna 2008, on suurin syy syöpään liittyvät kuolemat monissa maissa [1]. Sädehoito on yksi tärkeimmistä hoitostrategioiden peräsuolen syövän hoidon tehokas paikallinen valvonta, suojelu normaaleissa kudoksissa ja vähemmän systeemisiä vaikutuksia [2,3]. Kuitenkin monet potilaat vielä kokemusta toistumisen tai etäpesäke jälkeen sädehoitoa. Tärkein syy sädehoidon vika on solun radioresistance. Joten tunnistaa uusia tekijöitä, jotka ennustavat radioresistance on alue intensiivisen tutkimuksen ja voi olla suurta hyötyä hoidettaessa syöpiä.

Telomeerit ovat erikoistuneet DNA-proteiini-komplekseja päissä eukaryoottisten kromosomien koostuu vaihteleva määrä peräkkäin toistuvia TTAGGG sekvenssejä ja niihin liittyviä proteiineja [4]. Telomeres pelata ratkaiseva rooli pyrittäessä varmistamaan genomista vakauden ja eheyden [5-8]. Lisäksi tutkimukset ovat selvittäneet, että telomere homeostaasiin toimii mahdollisena kohteena syövän hoidossa, erityisesti sädehoidon [9-12]. Aiemmat tutkimuksemme osoitti myös, että oli merkittävä negatiivinen korrelaatio telomeeripituuden ja säteilyherkkyyttä ja telomeeripituuden voidaan käyttää lupaava väline ennustaa radioherkkyyttä ihmisen karsinoomien [13].

Telomeeri homeostaasin vaikuttaa useita tekijöitä, ja yksi tärkeimmistä säätölaitteet on shelterin. Shelterin kuuluu kuusi telomere liittyvien proteiinien: TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 ja POT1 [8]. Häiriöt shelterin johtaisi telomeerien toimintahäiriöitä ja mahdollisesti kromosomi epävakaus [14]. TPP1 (tunnetaan myös nimellä TINT1 /PTOP /PIP1) on kriittinen jäsen shelterin ja assosioituu muiden telomere sitovat proteiinit ytimen muodostamiseksi shelterin [8]. TPP1 heterodimerizes kanssa POT1 ja parantaa sen sukulaisuudesta telomere ssDNA [15,16]. POT1-TPP1 kompleksi kykenee rekrytoinnin ja stimuloiva telomeraasiaktiivisuus siten säännellä telomeeripituuden kautta TPP1-telomeraasin vuorovaikutus [17-19]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että TPP1 Knockdown aktivoi ATM-riippuvaisen DNA-vaurioita vastaus merkitty muodostumista telomere toimintahäiriön aiheuttama pesäkkeitä (TIFs) at telomeres [20]. Lisäksi havaitsimme, että TPP1 ilmentyminen koholla säteilyresistenteille soluissa ja TPP1 voi liittyä syöpään radioresistance [21]. Kuitenkin tarkka vaikutukset ja mekanismi TPP1 on radioherkkyyttä on epäselvä.

selventää toimintoja TPP1, tutkimme roolia TPP1 ilmentymisen vaikutus säteilyherkkyyttä ja telomeerivasta homeostaasin paksu- syöpäsoluissa tässä tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoito

Ihmisen peräsuolen syövän solulinjat (HCT116, SW480, LoVo, HT29 ja DLD-1) hankittiin Cell Bank of Kiinan Academy of Science, Shanghai, Kiina. Kaikki solut Tässä tutkimuksessa käytetyt viljeltiin 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. HCT116-solut transfektoitiin pcDNA6-flag-hTPP1 (ystävällinen lahja Dr. Joachim Lingner) [19], tai pcDNA6 tyhjän vektorin (Invitrogen) käyttäen Lipofectamine-2000 (Invitrogen). TPP1 yli-ilmentävät solut valittiin 5 ug /ml blastisidiinia (sigma) ja 4 viikkoa. Vakaa transfektio solulinjat nimettiin HCT116-TPP1 ja HCT116-Mock, vastaavasti.

röntgenkuvat säteilytys suoritettiin röntgenkuvat generaattori (Primus High-Energy Siemens), säteilevät kiinteällä annoksella nopeudella 2 Gy /min, energia röntgenkuvat käytetään säteilyttää solut on 0 -10 Gy.

klonogeeninen Pitoisuus

solut maljattiin 6-kuoppalevyllä dosviljelypulloihin. 24 tunnin kuluttua solut säteilytettiin erisuuruisina annoksina (0, 2, 4, 6, 8, 10 Gy) käyttäen X-ray generaattori (Primus High-Energy Siemens) annoksena nopeudella 2 Gy /min. Soluja viljeltiin sitten inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO 2 37 ° C: ssa 14 päivää. Myöhemmissä vaiheissa ja laskemalla elossa osa suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13] .Kaikki kokeet tehtiin vähintään kolmesti.

virtaussytometria analyysi Cell Cycle

Lyhyesti, solut altistettiin 6 Gy IR ja sitten inkuboitiin osoitetun kertaa (0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, ja 42 h) ja sitten solusyklin analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21]. DNA-histogrammit analysoitiin käyttämällä Modifit ohjelmistoa. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

virtaussytometria analyysi Apoptosis

Apoptoosi määritys suoritettiin käyttäen anneksiiniV-FITC apoptoosin detektioreagenssipakkaus (Beyotime, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Fluoresenssi mitattiin käyttäen virtaussytometriä (Beckman Coulter, Brea, CA), ja tiedot analysoitiin Cell Quest ohjelmisto. Kaikki näytteet määritettiin kolmena kappaleena.

Vasta-aineet ja Western blot -analyysi

Western blot suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [21]. Sen jälkeen vasta-aineita käytetään tässä tutkimuksessa: TPP1 (Abcam), ATR, fosfori-Ser345-Chk1 /Chk1 ja ATM (Cell Signaling Technology). Β-aktiini-vasta-ainetta (Santa Cruz) käytettiin normalisoimaan lastaus eroja näytteiden välillä.

telomeraasiaktiivisuuden määritys

mittaus telomeraasiaktiivisuuden suoritettiin käyttäen TRAP PCR ELISA-kittiä (Roche) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksityiskohtainen menetelmä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22] .Sample absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla (Bio-Rad) aallonpituudella 450/690 nm.

mittaus telomeeripituuden Southern Blotting

Terminal restriktiofragmentti määritys suoritettiin käyttäen TeloTAGGG telomeeripituuden Assay kit (Roche) noudattamalla valmistajan ohjeita. Keskimääräinen telomeeripituuden (keskimääräinen terminaalinen restriktiofragmentit pituus, TRF) määritettiin käyttäen kuva-analyysi-ohjelmisto (Bio-Rad).

Immunofluoresenssi

jälkeen ilmoitettu hoidon, solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä 15 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 PBS: ssa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen blokattiin blokkausliuoksella, soluja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa sitten pestiin ja inkuboitiin toisen vasta-aineen. Tumat värjättiin DAPI (Sigma) 5 min ajan huoneenlämpötilassa. Fluoresenssisignaalien otettiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss LSM710).

Telomeeri ChIP määritys ja Dot blot -analyysi

Telomeeri ChIP määritys ja Dot blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on raportoitu [19]. Saostamisen jälkeen kanssa TRF2 vasta-aineen, DNA puhdistettiin immunosaostettiin kromatiinin ja blotattiin Hybond-N-kalvolle (Amersham), ja telomeerien toista sekvenssit tunnistettiin TeloTAGGG telomeeripituuden iinianalyysikitissä (Roche Diagnostics). Epäspesifiseen koetin (Alu) käytettiin kontrollina. Signaalit mitattiin käyttämällä kuva-analyysi-ohjelmisto (Bio-Rad).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Studentin t-testiä käytettiin testaamaan tilastollista merkittävyyttä. P 0,05 pidettiin merkittävänä. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Kalifornia) ohjelmistoa käytettiin tilastollisen analyysin työkalu.

Tulokset

Korrelaatio välillä TPP1 Protein Expression, telomeeripituuden ja Luonnostaan ​​radioherkkyyttä

Ensin tutki TPP1 proteiinin ilmentymiseen ja telomeerien pituudet viisi paksusuolen syövän soluja (kuvio 1A ja B). Kuten kuviossa 1D, TPP1 proteiinin ilmentyminen korreloi merkitsevästi telomeeripituuden (R = 0,9783, P 0,05). Sitten solujen eloonjäänti mitattiin klonogeenisten määritys ja SF2 käytettiin indeksinä luontainen radioherkkyyttä (kuvio 1C). TPP1 ilmentyminen korreloi negatiivisesti luontainen radioherkkyyttä (R = 0,9792, P 0,05, kuvio 1 E). Yhteenvetona säteilyresistenteille solut ovat pidempään telomeres ja suurempi tuotanto TPP1 kuin että säteilylle soluissa. Nämä tulos osoitti, että oli merkittävä korrelaatio TPP1 ilme, telomeeripituuden ja solujen luontainen radioherkkyyttä.

(A) TPP1 tuotanto havaittiin western blottauksella ..

(B) telomeeripituuden oli tutkittiin Southern blot-analyysi.

(C) Suhteellinen TPP1 tuotanto, radioherkkyyttä (SF2) ja telomeeripituuden (TRF) ihmisen peräsuolen syövän solulinjoissa.

(D) välinen korrelaatio TPP1 tuotanto ja radioherkkyyttä (SF2) kolorektaalisyövän syöpäsolut tutkittiin.

(E) välinen korrelaatio TPP1 tuotanto ja TRF pituus kolorektaalisyövässä soluissa tutkittiin.

TPP1 yliekspressio Vähennykset herkkyys HCT116-solujen Säteily

vaikutuksen tutkimiseksi TPP1 ilmentymisen vaikutus solujen radioherkkyyttä, HCT116-TPP1 ja HCT116-Mock solut vahvistettu (kuvio 2A) ja solujen eloonjäänti mitattiin klonogeeniset määrityksessä. HCT116-TPP1 solut osoittivat merkitsevästi radioresistance verrattuna HCT116-Mock solujen jälkeen IR altistuksen (kuvio 2B).

(A) todentaminen TPP1 yliekspressio western blottauksella.

(B) HCT116-Mock ja-TPP1 soluja säteilytettiin röntgenkuvat ja sitten solujen selviytymiseen määritettiin käyttäen klonogeeniset määritystä.

(C) HCT116-Mock ja-TPP1 soluja säteilytettiin 6 Gy röntgen- ja talteen ilmoitettu kertaa. Solukierron analysoitiin FACS.

(D) väestö solut G2 /M vaiheiden ajallista HCT116- Mock ja -TPP1 soluja.

TPP1 yli-ilmentyminen in HCT116 Cancer solut Syyt Pitkäaikainen G2 /M pidätys jälkeen IR Altistus

Kuten kuviossa 2C, TPP1 yliekspressio ei ollut merkittävää vaikutusta solusyklin jakaumat puuttuessa DNA-vaurioita. Sen jälkeen säteilyaltistusta, havaitsimme, että G2 /M pidätys saavuttanut huipussaan 18 tunnin kuluttua IR altistuksen sekä HCT116-Mock ja -TPP1 soluja. Vielä tärkeämpää on, kinetiikka vasteen solulinjojen oli erilainen. In HCT116-Mock soluja, G2 /M huippu laski asteittain 18h jälkeen ionisoivaa säteilyä ja palasi normaalille tasolle noin 42 tuntia. Kuitenkin G2 /M huippunsa HCT116-TPP1 solut eivät vähennä vaan silti edelleen korkealla tasolla vasta 30-36 tunnin kuluttua IR. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TPP1 yli-ilmentymisen HCT116-soluissa pitkittynyt G2 /M pidätyksen jälkeen IR altistuksen.

TPP1 aiheuttama G2 /M pidätys pidentäminen välittyy ATM /ATR-Chk1 Pathway

tunnistamiseksi molekyylimekanismeja pitkittynyt G2 /M pidätyksen jälkeen IR altistuksen TPP1 yli-ilmentäviä soluja, mittasimme tuotannon ATM, ATR ja Chk1. Huomasimme, että ilmaukset ATM ja ATR molemmat koholla HCT116-TPP1 soluja (kuvio 3A). Sitten tutkimme aktivaatiot Chk1 tärkeä substraatti ATR ja ATM. Huomasimme, että fosforylaatio tasot Chk1 at Ser345 oli korkeampi vasta 36 tunnin kuluttua IR altistuksen HCT116-TPP1 soluissa. Sen sijaan tasot HCT116-Mock solut olivat palanneet normaalille tasolle noin 30h jälkeen IR altistuksen (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittavat, että pitkittynyt G2 /M pidättäneet TPP1 yli-ilmentyminen todennäköisesti johtuu ATM /ATR-Chk1 signalointireitistä.

(A) Western blot-analyysi osoitti, että TPP1 yliekspressio lisäsi ilmaus ATM ja ATR.

(B) HCT116-Mock ja-TPP1 soluja säteilytettiin 6 Gy röntgen- ja inkuboitiin osoitetun kertaa. Western blotit esimuotoiltu ekspression havaitsemiseksi Chk1 ja p-Ser

345-Chk1.

TPP1 yliekspressio inhiboi apoptoosia ionisoivan säteilyn aiheuttama

arvioitiin vaikutuksia TPP1 säteilyn aiheuttaman apoptoosin avulla virtaussytometrianalyysin. Kuten kuviossa 4 on esitetty, olemme huomanneet, että ei ollut merkitsevää eroa HCT116-Mock ja HCT116-TPP1 solujen (5,72 ± 0,15% ja 5,55 ± 0,12%, p 0,05), mutta TPP1 yli-ilmentyminen voi vaimentaa säteilyä (5Gy) indusoi apoptoosin tasoilla, 26,89% ± 0,75 kontrolliryhmässä solujen 17,47 ± 0,45%, että HCT116–TPP1 solujen (p 0,05). Nämä tiedot osoittivat, että lisääntynyt radioresistance mukaan TPP1 yli-ilmentyminen voi johtua lasku säteilyn aiheuttamaa apoptoosia.

HCT116-Mock ja-TPP1 soluja säteilytettiin 5 Gy X-ray ja inkuboitiin 24 tuntia. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen mitattiin virtaussytometrialla.

(A) edustavat tulokset on levitettävissä eri ryhmien on esitetty.

(B) esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

*, P 0.05.

TPP1 Yliekspressio Lisäykset telomeeripituuden vuonna HCT116 Solut

tutkimiseksi edelleen roolin TPP1 vuonna telomeeripituuden ohjaus, HCT116-TPP1 ja -Mock soluja viljeltiin 20 PD- ja telomeeripituuden mitattiin Southern-blottauksella. Olemme näkyy, että keskimääräinen telomeeripituuden ja HCT116-TPP1 solut vähitellen pidennetty kuin kontrollisoluissa (kuvio 5A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TPP1 yliekspressio voisi lisätä telomeeripituuden sisään HCT116-soluissa.

(A) Mean TRF pituudet eri PD havaittiin Southern blot. PD, väestö kaksinkertaistamista. Asemaa MW: (kb) on merkitty vasemmalle.

(B) TRAP PCR-ELISA-määritystä käytettiin analyysissä telomeraasiaktiivisuuden eri PD.

(C) Western blot -analyysi paljasti, että TPP1 yli-ilmentyminen ei ollut merkittävää vaikutusta ekspression hTERT.

(D) Telomeeri-chIP-kokeet suoritettiin käyttäen TRF2 vasta-ainetta tutkia telomeerisesti sitoutuneen DNA by TRF2. Input, supernatantti ennen immunosaostus; ppt, proteiini-DNA immuunisaostumassa monimutkainen. Specific (telomeerisesti) ja epäspesifinen (Alu) koettimilla.

telomeerisesti DNA sirulla (%) = telomeerisesti DNA signaalit ppt /telomeerisen DNA signaalien tulon * 100%.

TPP1 yliekspressio ei Impact telomeraasiaktiivisuutta

Sen tutkimiseksi, pitkänomaisen telomeres HCT116-TPP1 solut lisääntyneen telomeraasiaktiivisuuden, telomeraasiaktiivisuutta ja hTERT-proteiinin tasot HCT116-TPP1 soluja verrattiin HCT116-Mock solut. Ei ollut havaittavissa kasvua hTERT-proteiinin tasot tai telomeraasiaktiivisuuden HCT116-TPP1 soluissa verrattuna mock-solut tai emosoluista (kuvio 5B ja C). Tämä tulos osoittaa, että telomere pidentymisen TPP1 ei johdu yleiseen lisääntymiseen telomeraasiaktiivisuutta.

TPP1 Yliekspressio Nopeutettu Korjaa kinetiikka DNA aiheuttaman vaurion IR

käyttää TIF määritys sen selvittämiseksi TPP1 yliekspressio vaikutus korjaus kinetiikka DNA-vaurioita klo telomeres. Telomere-chip määritys paljasti, että TPP1 yliekspressio ei ole ollut vaikutusta yhdistyksen välillä TRF2 ja telomeres (kuvio 5D), joten TIFs valvoivat kolokalisaation TRF2 ja γ-H2AX tässä tutkimuksessa (kuvio 6A). Havaitsimme huomattavasti matalampia taajuuksia spontaanisti TIFs, että HCT116–TPP1 solujen kontrolliin verrattuna soluihin (p 0,05) (kuvio 6B) .Tämän jälkeen HCT116-TPP1 ja -Mock solut altistettiin 1 Gy IR ja värjätään tunnistaa TIF pesäkkeitä 0,5, 6 ja 12 h sen jälkeen, kun IR-altistuksen. Tutkimuksemme ymmärtää, että TPP1 yliekspressio solut kykenivät korjaamaan TIFs tehokkaammin kuin kontrolli solut. Esimerkiksi taajuudet IR indusoi TIFs oli samankaltainen HCT116-TPP1 ja HCT116-Mock-solut 0,5 h sen jälkeen, kun IR, mikä osoittaa, että TPP1 ei vähentää TIFs aiheuttama IR. Sitten TPP1 yliekspressio soluissa oli noin 0,53 TIFs /solu 12 h kuluttua IR, kun taas mock solut oli 1,04 TIFs /solu 12 h kuluttua IR (kuvio 6C). Siten HCT116-TPP1 solut osoittivat lisääntynyttä kykyä korjata vahinkoja telomeres. TIF määritys tunnistettu γ-H2AX pesäkkeitä at telomeres, sekä kokonaisia ​​γ-H2AX pesäkkeitä tumassa. Sitten kvantitoitiin muodostumista koko γ-H2AX pesäkkeet, merkkiaine DSB, tutkia tarkemmin taustalla mekanismi radioresistance. Samanlaisia ​​tuloksiin TIFs määrityksen, nopeus koko DNA double-lohkon murtuma korjaus kiihdytti TPP1 yli-ilmentymisen. Nämä tiedot osoittavat, että TPP1 yli-ilmentyminen saattaa kiihdyttää DNA korjauksen jälkeen säteilyaltistusta.

HCT116-Mock ja -TPP1 altistettiin 1 Gy IR ja inkuboidaan ilmoitettuina ajankohtina .. Tulokset perustuvat kolmen erillisen kokeen jossa keskimäärin 100 soluytimet analysoitiin koetta kohti per piste. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SEM 3 itsenäisen kokeen.

(A) edustaja kuvien TIFs näkyvät.

(B) Taajuudet spontaanin γ-H2AX positiivisia pesäkkeitä ja TIFs in HCT116-Mock ja -TPP1 soluja.

(C) korjaus kinetiikassa IR aiheuttama TIF HCT116-Mock ja -TPP1 peräsuolen solujen. Keskimäärin TIFs solua kohden eri ajankohtina jälkeen IR altistuksen kvantitoitiin.

(D) Korjaus kinetiikassa IR aiheuttama DNA-vaurioita HCT116-Mock ja -TPP1 peräsuolen solujen. Averageγ-H2AX positiivisia pesäkkeitä solua kohden eri ajankohtina jälkeen IR altistuksen kvantitoitiin.

Keskustelu

Olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, meidän tietomme, että TPP1 yliekspressio liittyy radioresistance peräsuolen syöpäsoluissa tässä työssä.

TPP1 on ratkaiseva rooli telomeeripituuden sääntelyn ja DNA-vaurioita vastaus. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että TPP1 ilmentyminen korreloi läheisesti telomeeripituuden ja radioherkkyyttä peräsuolen syöpäsoluja. Lisäksi huomasimme, että kohdunulkoinen yliekspressio TPP1 johti radioresistance ja telomeerivasta pidentäminen in HCT116-soluissa. Aiemmat tutkimukset todennettujen että oli merkittävä negatiivinen korrelaatio telomeeripituuden ja radioherkkyyttä [10,11,13]. Tutkimuksemme osoitti, että TPP1 mukana radioresistance kautta sääntelyn telomeeripituuden. Telomeres avainasemassa ylläpidossa kromosomi eheyden ja vakauden, ja lyhentää telomeeripituuden liittyy lisääntynyt riski sairastua syöpään [23]. POT1 proteiini arvot liittyvät telomeeripituuden mahasyövän [24,25]. TPP1 heterodimerizes kanssa POT1 mutta ei ole tuloksia korreloimisesta TPP1 tasojen ja telomeeripituuden syöpänäytteissä. Mielestämme korrelaatio TPP1 tasojen ja telomeeripituuden kolorektaalisyövässä näytteissä on suuri merkitys. Oikeastaan ​​tutkimuksessamme, yritimme tehdä tätä työtä käyttämällä parafiininäytteet mutta totesi, että tuore syöpä kudoksiin sopivat paremmin eteläisen blottaus kokeilu. Meidän opintojakso, keräämme enemmän tuoreita syöpä kudosnäytteitä ja tarkistaa suhde TPP1 ja telomeeripituuden kolorektaalisyövässä tuoreista syöpä kudoksia.

Huomasimme, että TPP1 yliekspressio pitkäaikainen säteilyn aiheuttamien G2 /M pidätyksen jälkeen IR altistumista. Solut pidätettiin G2 /M vaiheessa jää enemmän aikaa korjata vahinkoja annetaan siten radioresistance. Aktivointi tarkistuspisteitä säätelee pidätyksen solusyklin vastauksena DNA-vaurioita. Ataksia telangiectasia (AT) mutatoitunut (ATM) ja ATM sekä rad3 liittyvien (ATR) proteiinikinaasien suuria alkupään tarkistuspisteen kinaasien DNA-vauriota vastausta [26]. Olemme paljasti, että TPP1 yliekspressio kohonnut ilmaisuja sekä ATM ja ATR-proteiinia. Edellinen tutkimus osoitti, että lisääntynyt ATM proteiini tasoilla korreloivat luontainen radioresistance GBM kasvaimissa [27]. Kim ja työtovereiden totesi, että ATR yliekspressio johti pitkäaikaiseen G2 /M pidätyksen ja radioresistance in HCT116-soluissa [28]. Monet tutkimukset osoittivat myös, että inhibitio aktiivisuuden ATM tai ATR saattaisi johtaa radioherkkyyttä [29,30]. Chk1 on tärkeä substraatti ATM ja ATR. Lisäksi Chk1 on tehokas tavoite säteilylle herkäksi ihmisen syöpäsoluissa [31,32]. Fosforylaatio Chk1 on S345 pidetään indikaattorina Chk1 aktivointia. Tässä artikkelissa, huomasimme, että Chk1 fosforylaatio nostettiin ja jatkuva vasta myöhemmin pistettä, kun IR altistuksen TPP1 yli-ilmentäviä soluja verrattuna mock soluihin. Tutkimuksemme voi osoittaa, että pitkäaikainen G2 pidättäneet TPP1 johtuu todennäköisesti korkeampi ATM /ATR-Chk1 signaalireitin.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että telomere homeostaasiin toimii mahdollisena kohteena syövän hoidossa, erityisesti sädehoidon . Telomere homeostaasiin voidaan ylläpitää telomeraasin sekä niihin liittyviä proteiineja (kutsutaan kuten shelterin). Telomeeripituuden, telomeraasiaktiivisuutta ja telomeerivasta toimintahäiriöt ovat suuria markkereita telomere homeostaasin. Ensinnäkin telomeeripituuden analyysi osoitti merkittäviä telomere pidentyminen HCT116-TPP1 soluissa verrattuna ohjaus soluihin, mikä osoittaa, että TPP1 voi toimia positiivisena säätelijänä telomeeripituuden. Kuitenkin havaittiin, että ekspressio TPP1 ei ollut vaikutusta telomeeripituuden ihmisen fibrosarkooma HTC75 soluihin [16]. Ero näiden tulokset voivat johtua erillisiä valitun solulinjoissa. Mielenkiintoista on, että ei ollut havaittavissa kasvua telomeraasiaktiivisuuden tai hTERT-proteiinin tasojen HCT116-TPP1 soluissa verrattuna kontrollisoluihin. Tämä tulos osoittaa, että telomere pidentymisen TPP1 ei johdu yleiseen muutokseen telomeraasiaktiivisuutta, mutta saattaa johtua hTERT tumaansiirtymiseen tai paikallinen aktivointi telomeraasin klo telomere.

Co-lokalisointi telomeres ja aktivoitu DDR markkereita (kuten 53BP1 andγ-H2AX), ns telomere toimintahäiriön aiheuttama pesäkkeitä (TIF), on tyypillinen merkki telomere toimintahäiriö. TIFs tarkoita DDR rajaamattoman telomeres [33] .Recent tutkimukset osoittivat, että TPP1 kuuluu muun DNA-vaurioita vastaus ja tukahduttaminen TPP1 ilmaisun hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) tai ihmisen syöpäsoluja voisi käynnistää telomere toimintahäiriö [19,20]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että TPP1 yliekspressio esti spontaanin TIFs vuonna HCT116 peräsuolen soluissa. Joten TPP1 voi suojata telomeerien rakenne ja ylläpitää normaalia telomeerivasta toiminto.

Huomasimme, että TPP1 yliekspressio nopeuttanut korjaus kinetiikka kokonais-DNA kaksijuosteisen tauko aiheutti IR altistumista. Vielä tärkeämpää on, TIF määritys paljasti, että korjaus korko DNA vahinkojen telomeres sädehoidon vauhditti myös TPP1 yli-ilmentymisen. Telomere homeostaasiin oli tunnistettu toimia mahdollisena kohteena sädehoidossa. Tutkimukset ilmeni, että telomeraasin esto voisi johtaa telomeerien toimintahäiriö ja siten lisännyt radioherkkyyttä [22,34]. Lisäksi vahvistettiin, että häiriöt shelterin voi johtaa telomeeri- toimintahäiriö [14,20]. David Soler ja kollegat osoittivat, että huonosti telomeres ihmisen epiteelisolujen saattoivat häiritä tehokas korjaus säteilyn aiheuttama DSB ja sitten lisännyt radioherkkyyttä [35]. Tutkimuksemme osoittaa, että TPP1 voivat osallistua telomeerien homeostaasin ja voisi suojata telomeerivasta säteilyltä ihmisen peräsuolen syövän soluja.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että kohonneet TPP1 tasot suojata telomere DNA vaurioita ja antaa radioresistance ihmisen peräsuolen syöpä solut. Lisäksi tarjoamme todisteita korrelaatio TPP1expression, telomeeripituuden ja luontainen radioherkkyyttä. Lisäksi tämä tutkimus on edennyt ymmärrystä suhde telomeerien homeostaasiin ja säteilylle herkäksi. Nämä havainnot ehdotti, että TPP1 tasot voivat olla hyödyllinen indikaattori vastata sädehoitoa. Yhteenvetona, Tutkimuksemme ensimmäistä kertaa osoittaa, että TPP1 voi olla potentiaalinen kohde on sädehoidon paksusuolen syövän. Lisäksi TPP1 esto TPP1 esto voi tarjota funktionaalinen apuaine sädehoidossa, mahdollisuus parhaillaan tutkivat.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Joachim Lingner ((ISREC, Epalinges, Sveitsi)) hänen eräänlainen lahja on pcDNA6-lippu-hTPP1 plasmidiin.