Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Aberrant verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF) signalointi on liittynyt eturauhassyöpä (PCA) eteneminen. Kuitenkin sen rooli sääntelyn Eturauhassyövän solujen kasvua ja selviytymistä ole hyvin tunnettu.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttäen kokeellisia malleja, jotka läheisesti matkivat kliininen patofysiologiassa PCa etenemisen, osoitimme, että PDGF on selviytymisen tekijä PCa soluihin säätelyä myeloidisolun leukemia-1 (Mcl-1). PDGF indusoi nopean tumaansiirtymiseen ja β-kateniinin, oletettavasti välittämä c-Abl ja p68 signalointia. Kiinnostavaa, PDGF edistää muodostamalla ydin transkription, joka koostuu β-kateniinin ja hypoksia-indusoituva tekijä (HIF) -1α, ja sen sitoutuminen Mcl-1-promoottori. Poistetaan oletetun hypoksiavaste elementti (HRE) sisällä Mcl-1 promoottori heikennettyjä PDGF vaikutuksia Mcl-1 ilme. Blockade PDGF-reseptorin (PDGFR) signalointia farmakologisesti estäjän AG-17 kumottu PDGF induktio Mcl-1, ja indusoi apoptoosia metastaattisessa PCa soluissa.

Johtopäätökset /merkitys

Tutkimuksemme selvitetty ratkaiseva selviytymismekanismi PCA soluissa, mikä osoittaa, että keskeytys PDGF-Mcl-1 eloonjäämissignaalin voi aikaansaada uudenlainen strategia hoitoon PCa etäpesäkkeitä.

Citation: Iqbal S, Zhang S, Driss A, Liu ZR, Kim H-RC, Wang Y, et ai. (2012) PDGF ylössäätelee Mcl-1 Kautta aktivaatio β-kateniinin ja HIF-1α-Dependent Signaling in Human eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 7 (1): e30764. doi: 10,1371 /journal.pone.0030764

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 20 joulukuu 2011; Julkaistu: 20 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Iqbal et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat puolustusministeriön PC060566, American Cancer Society RSG-10-140-01, Emory University Research komitean Award, Kennedy Seed Grant (DW), National Cancer Institute avustus 1R43CA141870 (AW), National Cancer Institute myöntää P01 CA98912, R01 CA122602 , Department of Defense PC060866 (LWKC), Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Grant (OK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

verihiutaleperäinen kasvutekijät (PDGF) perheen koostuu viidestä dimeerisen isoformien: PDGF-AA, -AB, -BB, -CC ja -DD [1], jotka aiheuttavat niiden solujen vaikutuksia kahden rakenteellisesti samanlaisia tyrosiinikinaasin reseptorit (PDGFR-α ja -β) ilmaisi monien eri solutyyppien [2]. Ligandin sitoutumista PDGFRs tuloksia dimerisaation ja autofosforylaation reseptorin kinaasien myöhemmin rekrytointi tiettyjen Src homologia 2 (SH2) domain sisältävät sovittimen proteiineja (esim., Src, Grb2 ja Shc) erityisiä fosforyloituja tyrosiinitähteitä. Useat signa-, mukaan lukien Ras-mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK), fosfolipaasi-γ ja phos-phatidyl-inositoli-3′-kinaasi (PI3K) /Akt, on ollut tunnusomaista merkittävä alavirran polut välittäjänä PDGF toiminnot [3] . Muut sovitin molekyylejä (esim Fer ja Fes tyrosiinikinaasiperheen) ja transkriptiotekijöitä (esim β-kateniinin) osallistuvat myös PDGF signalointi tietyissä solutyypeissä [4], [5], [6], [7], [8].

Aberrant PDGF ilmentyminen on usein liittyvät neoplastisten osa ihmisen kasvaimista, kun taas PDGFRs esiintyy lähinnä fibroblastiselle ja verisuoni kasvain strooman [9], [10], [11], [ ,,,0],12], [13]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että tuumorista peräisin PDGF voi pääasiassa toimia paracrine signalointi molekyyli kiinteitä kasvaimia. Tukee tätä käsitettä, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että PDGF on voimakas pro-angiogeeninen tekijä edistämällä rekrytointia ja kasvua strooman fibroblastien, verisuonia ja endoteelisoluihin, mikä epäsuorasti vaikuttaa kasvaimen kasvua, metastaattisen levittäminen ja lääkeresistensseihin [2], [3 ], [14], [15], [16]. Mielenkiintoista, syntymässä näytön mukaan PDGF autokriinisella signalointi voi myös olla tärkeä rooli aikana syövän etenemiseen. Mutaatiotutkimukset aktivointi tai koekspressio PDGF ligandien ja reseptorien kykenevät stimuloimaan kasvainsolujen kasvua ja proliferaatiota useita nonepithelial maligniteettien, mukaan lukien glioblastoomat ja osteosarkooma [17]. Viime aikoina, autokriinisellä PDGF signalointi on yhdistetty epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) karsinoomassa soluja rinta-, paksusuoli-, eturauhas- ja maksassa, mikä viittaa siihen, kausaalinen rooli autocrine PDGF signaloinnin etäpesäkkeiden [7], [8], [18], [19]. Siitä huolimatta, vaikka vakiintunut korrelaatio vapautuneilla paracrine PDGF signalointi ja syövän etenemiseen, toiminnot ja mekanismit autocrine PDGF signaloinnin epiteelisyöpäsolujen jäädä hämäräksi [3], [17].

hankinta apoptoosin vastus on ominaisuus etäpesäkekasvainten soluja, jotka voivat antaa selviytymisen etuja aikana invaasion, etäpesäke ja kolonisaatio [20]. Olemme hiljattain korreloi yliekspressio myeloidisolun leukemia-1 (Mcl-1), jäsen Bcl-2-perheen, jossa etenemistä eturauhassyövän (PCA) kohti luumetastaasipotilailla [21]. Tässä tutkimuksessa olemme osoitettava, että PDGF-BB on Survival tekijä metastaattisessa PCa soluissa säätelemällä Mcl-1 ilmentymisen kautta signalointimekanismin välittämän transkriptiotekijöitä β-kateniinin ja hypoksia-indusoituva tekijä (HIF) -1α.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen PCa solulinjat ARCaP

E, ARCaP

M [22], LNCaP (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas , VA), C4-2 [23] ja PC3 (ATCC) ylläpidettiin rutiinisti T-väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), jossa 5% naudan sikiön seerumia (FBS). Jotta hoidot PDGF-isoformien, PCa-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (3000 solua /kuoppa) seerumia yli yön, korvataan tuoreella seerumittomalla T-väliaineessa, ja inkuboitiin, kun läsnä oli vaihtelevia konsentraatioita rekombinanttia ihmisen PDGF- AA, -AB, -BB (R keskimmäinen paneeli: qRT-PCR-analyysi Mcl-1 mRNA: n ilmentymisen vastauksena PDGF-BB hoidon ARCaP

M-solut (24 h); oikea paneeli: vaikutukset PDGF-BB: hoito (20 ng /ml, 72 h) on Mcl-1-proteiinin ilmentymisen ARCaP

M-soluissa. ImageJ käytettiin kvantifioimaan suhteellinen ekspressio Mcl-1-proteiini. (D) vaikutukset eksogeenisen PDGF-BB sytotoksisuuteen Doketakselin ARCaP

M-solut, määritettynä MTS-määritys.

PDGF-BB indusoi Mcl-1 ilmentymisen ja antagonisoi apoptoosin PCA soluissa

Kiehtovaa, PDGF-BB todettiin olevan huomattavasti aiheuttaa Mcl-1 ilmentymisen PCA soluissa (kuvio 1C, Supplemental kuva S1). Hoito ihmisen rekombinantti PDGF-BB kasvoi Mcl-1 mRNA annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, vaikka optimaaliset olosuhteet mahdollisimman kertymistä Mcl-1 mRNA vaihteli PCa solulinjoissa. Western blot-analyysi vahvisti induktioilmiöiden PDGF-BB Mcl-1 ilmentymisen proteiinin tasolla. Nämä tiedot tunnistettu PDGF-BB uutena säätelijänä Mcl-1 ilmentymisen, joka voisi tarjota selviytymismekanismi suojella PCa soluja apoptoosin. Itse asiassa, lisäämällä PDGF-BB: PCa soluviljelmissä tehokkaasti antagonisoi sytotoksisuutta dosetakselin laajalla annosalueella (kuvio 1 D).

Expression profile of PDGF autocrine signalointi komponenttien PCa soluissa

Olemme tutkineet ekspressiokuviota PDGF ja niiden reseptorien PCa-soluissa (kuvio 2A). RT-PCR-analyysit osoittivat, että PDGF-isoformit ilmentyvät eri mRNA tasolla, ja niiden joukossa, lisääntynyt PDGF-B ja PDGF-D havaittiin C4-2 ja ARCaP

M soluja verrattuna vanhempien LNCaP ja ARCaP

E-soluissa, vastaavasti. Yhdenmukaisesti aiempien tutkimusten [19], PC3-solut havaittiin ilmentävän korkeita PDGF-D, PDGFR-α ja -β. Mielenkiintoista, PDGFR-α-mRNA: t näyttivät olevan huomattavasti ilmaistaan ​​PCa soluja, jotka vahvistettiin proteiinin tason Western blot-analyysi. Että päinvastoin, vaikka PDGFR-β-mRNA: t detektoitiin RT-PCR: llä useimmissa PCa solulinjoissa, immunoblotting-analyysin voi ainoastaan ​​vahvistaa proteiinin ilmentymistä ARCaP

E ja ARCaP

M-soluissa (kuvio 2A, oikeanpuoleinen paneeli). Yhdessä nämä tulokset viittasivat toiminnallinen PDGF autokriinistä signalointi tietyissä PCa soluissa.

(A) Expression profiili PDGFR signalointi komponenttien PCA soluissa analysoituna RT-PCR ja Western blottauksella. (B) vaikutuksia PDGF-BB (20 ng /ml) on fosforylaatiota PDGFR-α ja -β in ARCaP

M-soluissa. (C) vaikutukset heikentävien PDGFR-α tai /ja -B on Mcl-1-proteiinin ilmentymisen ARCaP

M-soluissa. Solut transfektoitiin joko isotyyppispesifisessä siRNA: t kohdistuvat PDGFR-α (vasen paneeli, 30 nM) tai PDGFR-β (keskilevyn, 100 nM), tai seosta, PDGFR-α ja -β siRNA (oikea paneeli) 48 h, seerumin puutteessa yön yli, ja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa PDGF-BB (20 ng /ml) 72 tuntia. (D) Ylähavas: Aika riippuva vaikutukset AG-17 (100 nm) Mcl-1 mRNA: n ekspression ARCaP

M-solut; pohjapaneeli: vaikutukset AG-17 käsittely ilmentymistä Mcl-1 ja pilkottiin PARP läsnäollessa (20 ng /ml) tai poissa PDGF-BB (20 ng /ml) ARCaP

M-soluissa. (E) vaikutukset AG-17 hoitoa (100 nM, 72 h) elinkelpoisuudesta ARCaP

E ja ARCaP

M-soluissa.

autokriini PDGFR signalointi sovittelee PDGF- BB sääntely Mcl-1 PCA soluissa

sekä PDGFR-α ja -β olivat erittäin ilmaistaan ​​luun metastaattisen ARCaP

M-solut, ja nopeasti fosforyloidaan ajasta riippuva tavalla vastauksena stimulaation eksogeenisen PDGF-BB: tä (kuvio 2B). Mielenkiintoinen, ehtyminen joko PDGFR-α tai -β by isoentsyymiselektiivisiä erityisiä siRNA ei estänyt indusoivaa vaikutusta PDGF-BB Mcl-1 ilmentymisen (kuvio 2C, vasemmalle ja keskiosiksi), mikä viittaa siihen, että aktivaatio joko reseptorien voi olla riittävä että ylösajon Mcl-1. Tätä hypoteesia tukevat, lyhytaikaisella transfektiolla seoksella siRNA: iden kohdistaminen sekä PDGFR-α ja -β esti perusilmennystä Mcl-1, ja kumotaan PDGF-BB: induktio Mcl-1 ARCaP

M-soluja (kuvio 2C, oikea paneeli ). Vaihtoehtoisesti hoito AG-17 (Tyrphostin), selektiivinen farmakologinen estäjä PDGFRs [28], vähentää Mcl-1 ilmentymisen sekä mRNA ja proteiini tasoilla ja kittävästi kasvanut pilkkominen poly-ADP riboosi-polymeraasi (PARP), indikaattori apoptoosin . Nämä vaikutukset vaimennettu läsnäolo PDGF-BB: in kulttuureissa (kuvio 2D). Johdonmukaisesti, AG-17 hoito pienillä annoksilla (esimerkiksi 100 nM) tehokkaasti indusoi apoptoosin ARCaP

E ja ARCaP

M-solut (kuvio 2E), mikä osoittaa keskeinen rooli PDGFR signalointi selviytymisen Eturauhassyövän soluja.

β-kateniinin välittää PDGF sääntely Mcl-1 ilmentymisen PCA soluissa

aktivointi β-kateniinin polku on alavirtaan tapahtuma PDGF signaloinnin tietyissä epiteelisyöpäsolujen [7], [ ,,,0],8], [29]. Western blot analyysissä havaittiin, että β-kateniinin ja TCF4, suuri β-kateniinin-vuorovaikutuksessa transkriptiotekijä [30], jotka ilmentyvät differentiaalisesti PCa-soluissa (kuvio 3A), mikä viittaa toiminnallisen β-kateniinin-TCF4 signalointia näissä soluissa. Itse asiassa, keinotekoinen TCF promoottori käyttää molemmissa LNCaP-C4-2 ja ARCaP

E-ARCaP

M solu suvusta, ja reportteri toiminta näytti olevan liittyy lisääntynyt

in vivo

metastaattinen potentiaali C4-2 ja ARCaP

M-solut (kuvio 3B). On syytä huomata, että sekä β-kateniinin ja TCF4 olivat huomattavasti esitetty ytimen ARCaP

E ja ARCaP

M-solut (kuvio 3A, pieni paneeli), jolla oli selvästi suurempi pohjapinta TCF toimintaa kuin kumpikaan LNCaP tai C4 -2-soluja (by -100-kertainen) (kuvio 3B).

(A) Expression profiili β-kateniinin-TCF signalointi komponenttien PCa soluissa. (B) TCF reportteri aktiivisuus LNCaP-C4-2 ja ARCaP

E-ARCaP

M-soluissa. (C) Ylempi paneeli: vaikutukset PDGF-BB (20 ng /ml) on ydinalan translokaatiota β-kateniinin ARCaP

M-solut; Pohjalevy: vaikutukset PDGF-BB (20 ng /ml) annetun TCF reportteriaktiivisuutta läsnäollessa (100 nM) tai puuttuminen AG-17. (D) vaikutukset ektooppinen ilmentyminen β-kateniinin (72 h) on Mcl-1-ilmentymisen sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. (E) vaikutukset β-kateniinin heikentymisen PDGF-BB sääntely Mcl-1 ilmentymisen ARCaP

M-soluissa. Solut transfektoitiin β-kateniinin siRNA tai ohjata siRNA (30 nM) 48 h, seerumia yli yön, ja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa PDGF-BB (20 ng /ml) 72 tuntia. (F) vaikutukset β-kateniinin heikentymisen Mcl-1 reportteri aktiivisuuden ARCaP

M-soluissa. Solut transfektoitiin β-kateniinin tai ohjata siRNA (30 nM) 48 tuntia, ja edelleen on transfektoitu ihmisen Mcl-1 toimittaja 24 tuntia. Seuraavat seerumistarvaatio yön yli, soluja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa PDGF-BB (20 ng /ml) 48 h.

Kun PDGF-BB hoitoa, ydin- läsnäolo β-kateniinin oli lisääntynyt nopeasti ARCaP

M-solut (kuvio 3C, yläpaneeli). Johdonmukaisesti, TCF reportteriaktiivisuutta oli myös merkitsevästi lisääntynyt seuraavat PDGF-BB stimulaatio, joka lievitti esikäsittelyssä kanssa AG-17 (kuvio 3C, alapaneeli). Nämä tulokset osoittivat, että PDGF-BB aktivoitu β-kateniinin signalointi on PDGFR-riippuvaisella tavalla.

roolin tutkimiseksi β-kateniinin säätelyssä Mcl-1 ilmentymisen, ARCaP

M soluja ohimenevästi transfektoitu konstruktilla ilmentävät villityypin β-kateniinin. RT-PCR: llä ja Western blot-analyysit osoittivat, että ektooppinen epression on β-kateniinin increseased Mcl-1 sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoja (kuvio 3D). Vuonna Päinvastoin, β-kateniinin ehtyminen käyttämällä siRNA altaan tehokkaasti estämällä sekä perusilmennystä Mcl-1 ja sen induktion PDGF-BB (kuvio 3E). Johdonmukaisesti, kun taas PDGF-BB merkittävästi indusoi lusiferaasin aktiivisuuden täyspitkän ihmisen Mcl-1 promoottori ARCaP

M transfektoitujen solujen ei-kohdistuksen ohjaus siRNA: t, tämä vaikutus kumottiin ohimenevä ehtyminen Endogeenisen β-kateniinin (kuva 3F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että aktivaatio β-kateniinin signalointi voi olla riittävä, ja tarvitaan Mcl-1 ilmentymisen PCa soluissa.

PDGF aktivoi p68-β-kateniinin signalointi PCa soluissa

tutkittiin, c-Abl-p68-riippuvaisen reitin kautta on mukana PDGF aktivointi β-kateniinin signalointi PCa-soluissa [7]. Western blot-analyysit havaittiin, että c-Abl ja p68 olivat ekspressoituu differentiaalisesti PCa-soluissa (kuvio 4A). Kun PDGF-BB: hoito, tyrosiinifosforylaatio c-Abl ja p68 olivat nopeasti käyttöön, mistä on osoituksena immunosaostuksella-immunoblottauksella määrityksissä (kuvio 4B, vasemmalla ja keskellä paneelit). Tärkeää on, että läsnäolo β-kateniinin p68 Immunosaostumien lisääntyi myös ajasta riippuva tavalla, mikä viittaa lisääntyneeseen fyysiseen yhdistyksen välillä β-kateniinin ja p68-proteiineja (kuvio 4B, keskimmäinen paneeli), joka vahvistettiin edelleen vastavuoroisesti immunosaostuskokeesta (kuvio 4B, oikea paneeli). Itse asiassa, PDGF-BB aiheuttama nopea tumaansiirtymiseen of p68 30 min (kuvio 4C), joka oli yhteydessä lisääntyneeseen kolokalisaation p68 ja β-kateniinin tumassa (kuvio 4D). Nämä tulokset osoittivat, että PDGF-BB voi aktivoida c-Abl-p68 cascade ja myöhemmät β-kateniinin signalointi PCA soluissa.

(A) Expression of c- Abl ja p68 PCA soluissa. (B) Vasen paneeli: vaikutukset PDGF-BB (20 ng /ml) on fosforylaatiota c-Abl; keskimmäinen paneeli: vaikutukset PDGF-BB (20 ng /ml) on fosforylaatioon p68 ja ilmentymistä β-kateniinin että p68 immunopresipitaateista ARCaP

M-soluissa. Fosforylaatioon p68 on tyrosiini sivustot havaittiin käyttäen yleiseurooppalaisen fosforyloitu-Tyr vasta-aine; oikea paneeli: vaikutukset PDGF-BB (20 ng /ml) ilmenemistä koskevat p68 että β-kateniinin immunopresipitaateista ARCaP

M-soluissa. (C) vaikutukset PDGF-BB (20 ng /ml) on ydinalan translokaatiota p68 in ARCaP

M-soluissa. (D) Konfokaalimikroskopia vaikutusten analysointi PDGF-BB on kolokalisaation β-kateniinin ja p68 tumassa ajassa kurssi kokeilu ARCaP

M-soluissa. (E) vaikutukset p68 heikentymisen PDGF sääntelyä Mcl-1 in ARCaP

M-soluissa. Solut transfektoitiin p68 tai ohjata siRNA (30 nM) 48 h, seerumia yli yön, ja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tuntia (ylempi paneeli) tai 72 h ( alapaneeli). Ylempi paneeli: RT-PCR-analyysi mRNA ilmentymisen p68 ja Mcl-1; pohjapaneeli: Western blot-analyysi proteiinin ilmentymistä p68, β-kateniinin ja Mcl-1. (F) vaikutukset p68 heikentymisen Mcl-1 reportteri aktiivisuuden ARCaP

M-soluissa. Solut transfektoitiin p68 tai ohjata siRNA (30 nM) 48 tuntia, ja edelleen transfektoitu ihmisen Mcl-1 toimittaja 24 tuntia. Seuraavat seerumistarvaatio yön yli, soluja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa PDGF-BB (20 ng /ml) 48 h.

Sen tutkimiseksi, onko p68 tarvitaan sääntelyä Mcl-1 ilmaisu, ARCaP

M-solut transfektoitiin p68 siRNA tai valvoa siRNA, ja analysoitiin ilmentymisen Mcl-1: n mRNA: n ja proteiinin tasot. Kuten on esitetty kuviossa 4E, ehtyminen p68 inhiboi endogeenisen β-kateniinin ja tehokkaasti vaimennettu PDGF-BB: induktio Mcl-1 ilmentymisen. Johdonmukaisesti, Mcl-1 promoottorin aktiivisuus estyi merkittävästi käsittelemällä kanssa p68 siRNA ARCaP

M-soluissa, tai ilman läsnäoloa PDGF-BB: n viljelmät (kuvio 4F). Nämä tulokset osoittivat välttämätön toiminto p68 säätelyssä Mcl-1 PCA-soluissa.

PDGF-BB edistää proteiinin vuorovaikutusta β-kateniinin ja HIF-1α PCA soluissa

Aikaisemmat tutkimukset osoittivat tärkeä rooli HIF-1α luun metastaattisen PCa soluihin [25]. Mielenkiintoista, transfektion HIF-1α-spesifisten siRNA vähentää merkittävästi Mcl-1-proteiinin ekspression ARCaP

M-soluja (kuvio 5A), mikä viittaa siihen, että HIF-1α voidaan tarvita Mcl-1 asetuksen PCa soluissa. Sen tutkimiseksi, PDGF-BB voi aiheuttaa fyysistä vuorovaikutusta HIF-1α ja β-kateniinin, tumaproteiinit valmistettiin ARCaP

M soluja käsiteltiin PDGF-BB vaihtelevia aikoja. Western blot analyysissä havaittiin, että sekä HIF-1α ja β-kateniinin oli lisääntynyt nopeasti tumassa (kuvio 5B). Aktiivisesti immunosaostus määritys osoitti, että vasteena PDGF-BB: stimulaatio, ydin- läsnäolo β-kateniinin lisääntynyt nopeasti HIF-1α immunosaostumissa (kuvio 5C, ylempi paneeli). Vastavuoroinen samanaikainen immunosaostus anti-β-kateniinin vasta-vahvistivat lisääntyneenä yhdistys ydinvoiman HIF-1α kanssa β-kateniinin seuraavat PDGF-BB käsittely (kuvio 5C, alapaneeli). Parannettu kolokalisaation β-kateniinin ja HIF-1α-proteiineja osoitettiin edelleen konfokaalimikroskopiaa, joka näytti acheive enimmäisintensiteetin 30 min upon PDGF-BB stimulaatio (kuvio 5D). Nämä tulokset osoittivat, että repsonse PDGF-BB stimulaatio, β-kateniinin fyysisesti vuorovaikutuksessa HIF-1α tumaan, mikä voi johtaa aktivoinnin Mcl-1 transkription PCa soluissa.

(EN) vaikutukset HIF-1α heikentymisen Mcl-1 ilmentymisen ARCaP

M-soluissa. Solut transfektoitiin HIF-1α tai ohjata siRNA (30 nM) 72 tuntia, ja analysoitiin Mcl-1 ilmentymisen immunoblottauksella. (B) Western blot analyysi vaikutuksista PDGF-BB (20 ng /ml) on ydinalan translokaatiota β-kateniinin ja HIF-1α in ARCaP

M-soluissa. (C) Co-immunopresipitaatiomäärityksiä vaikutusten PDGF-BB (20 ng /ml) väliseen vuorovaikutukseen β-kateniinin ja HIF-1α tumaan ARCaP

M-soluissa. (D) Konfokaalimikroskopia vaikutusten PDGF-BB (20 ng /ml) on kolokalisaation β-kateniinin ja HIF-1α tumaan ARCaP

M-soluissa.

Oletettu HRE motiivi vaaditaan PDGF-BB aktivointi Mcl-1 promoottori

HIF-1α sitoutuu HRE

cis

-elementin sisällä edistäjiä hypoksia reagoivien geenien ja säätelee niiden ilmaisun [31]. Tutkimme, onko PDGF-BB-indusoitu tumakertymään HIF-1α liittyi aktivointi HRE-riippuvaista transkriptiota. Vuonna ARCaP

M-solut, PDGF-BB hoito lisäsi merkittävästi lusiferaasin ilmentymistä keinotekoinen HRE-promoottori (pHIF-luc) (kuvio 6A). Mielenkiintoista on, että otaksuttu HRE motiivi, ei tunnistettu ihmisen Mcl-1-promoottorin alue, joka sijaitsee välillä -900 ja -884 nukleotidia 5′-ylävirtaan transkription aloituskohdasta [24]. Tutkia mahdollisuuksia roolia tämän

cis

-elementti in PDGF sääntelyn Mcl-1 transkriptio, me tunnettu deleetiomutantti oletetun HRE motiivi käyttäen ihmisen Mcl-1 promoottorialueen kuin malli (kuvio 6B). Saatu Reportteri-konstrukti (p-Mcl-1-Luc: ΔHRE), tai lusiferaasireportteri- ohjaavat täyspitkän Mcl-1-promoottori (p-Mcl-1-Luc), ilmennettiin väliaikaisesti ARCaP

M-soluissa vastaavasti, ja käsiteltiin PDGF-BB tai PBS: ää. IL-6, joka on osoitettu aktivoivan Mcl-1 transkriptio PCA ja kolangiokarsinooma soluihin signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription 3 (Stat3): sta riippuva mekanismi [32], [33], sisällytettiin positiivisena kontrollina. Lusiferaasiaktiivisuus määritys osoitti, että PDGF-BB: indusoimaa aktivoitumista p-Mcl-1-Luc-promoottorin suuremmassa määrin kuin IL-6 ARCaP

M-soluissa. Merkittävää on, poistetaan HRE motiivi ei ainoastaan ​​vähentänyt pohjapinta aktiivisuuden Mcl-1-promoottorin, mutta myös kumosi induktiiviset vaikutukset PDGF-BB toimittaja toimintaa. Vuonna Päinvastoin, p-Mcl-1-Luc: ΔHRE, jotka sisältävät Stat3 sitovan sekvenssin välissä -92 ja -83 [32], pysyi aktivoituu IL-6 hoitoa (kuvio 6C). Samanlainen vaikutus HRE poistamisesta sillä ero vasteen Mcl-1 promoottori PDGF-BB ja IL-6 on havaittu myös C4-2 soluissa (Supplemental kuva S2). Nämä tulokset osoittivat, että oletetun HRE

cis

-elementti vaaditaan PDGF-BB aktivointi Mcl-1 ilmentymisen PCA soluissa.

(A) vaikutukset PDGF-BB HIF -1 reportteri toimintaa ARCaP

M-soluissa. Solut transfektoitiin ohimenevästi HIF-1 toimittaja tai pGL3: ssa 24 tuntia, seerumin puutteessa ja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa PDGF-BB (20 ng /ml) 48 tuntia. (B) Kaavakuva ihmisen Mcl-1-promoottori ja sen poisto mutaatio oletetun HRE sivustolla. (C) vaikutukset poistaminen oletetun HRE sivuston PDGF sääntelyä Mcl-1 promoottorin aktiivisuuden ARCaP

M-soluissa. IL-6 (200 ng /ml) sisällytettiin mukaan positiivisena kontrollina. (D) ChIP-Re-ChIP määritys vaikutuksia PDGF-BB: hoito (20 ng /ml) on sitoutumisen β-kateniinin ja HIF-1α ihmisen Mcl-1-promoottorin alue ARCaP

M-soluissa.

PDGF-BB edistää sitova sekä β-kateniinin ja HIF-1α ja Mcl-1 promoottorialueen

olivatko PDGF-BB edistänyt spesifistä sitoutumista sekä β-kateniinin ja HIF-1α ja Mcl-1 promoottori peräkkäinen ChIP määritystä. Fraktioitua chromatin kontrollien ja PDGF-BB-käsitelty ARCaP

M-soluissa oli aluksi immunosaostettiin β-kateniinin vasta-aine, ja sakka altistettiin uudelleen ChIP määrityksessä, jossa HIF-1α-vasta-ainetta.