Krooninen sairaus

tiivistelmä

Valaistaan ​​toiminta MAS liittyvien GPCR, jäsen D (MRGD) in syövät, tutkimme

in vitro

ja

in vivo

onkogeenisia funktiona MRGD käyttäen hiiren fibroblastisolulinjaa NIH3T3 jossa MRGD stabiilisti ilmaistu. Ekspressiokuviota MRGD kliinisissä näytteissä analysoitiin myös. Huomasimme, että yliekspressio MRGD NIH3T3 aiheuttama keskittyy muodostumista ja monisoluisten pallomainen muodostumista, ja edistetään kasvaimia nude-hiirissä. Toisin sanoen, yliekspressio MRGD NIH3T3 indusoi kontakti-inhibition menetys, kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun ja

in vivo

tuumorigeneesiin. Lisäksi todettiin, että ligandi MRGD, beeta-alaniini, parannettu pallojakaantuminen muodostumista MRGD ilmentäviä NIH3T3-soluja. Vuodesta tutkimus syövän kliininen kudosten, löysimme korkea ilmentyminen MRGD useissa keuhkosyöpä immunohistokemiallisesti sekä reaaliaikainen PCR. Näiden tulosten perusteella, MRGD voidaan kasvaimien syntyyn liittyvien ja se voisi myös olla uusi syöpälääkkeen kohde-.

Citation: Nishimura S, Uno M, Kaneta Y, Fukuchi K, Nishigohri H, Hasegawa J, et al. (2012) MRGD, MAS liittyvä G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori, Edistää Tumorigenisis ja ilmentyy voimakkaasti Lung Cancer. PLoS ONE 7 (6): e38618. doi: 10,1371 /journal.pone.0038618

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 05 syyskuu 2011; Hyväksytty: 08 toukokuu 2012; Julkaistu: 08 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Nishimura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Daiichi Sankyo Co. Ltd. rahoittajia oli rooli tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: SN, MU, YK, KF, HN, JH, NK, FN, ja TA työskentelee Daiichisankyo Co. Ltd. Tutkimus rahoittanut myös Daiichi Sankyo Co. Ltd. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

G-proteiiniin kytketty reseptori (GPCR) perheenjäsenet aktivoida erilaisia ​​fysiologisia signalointi ja on tärkeä rooli kehitettäessä sekä toiminto jokaisen elimen [1]. Lisäksi erilaisia ​​GPCR: ien on havaittu yliekspressoituvan primaarinen ja metastaattinen kasvaimen solujen pään ja kaulan okasolusyöpä, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, rintasyöpä, eturauhassyöpä ja mahalaukun tuumorit, melanooma ja suodatettua suuri B-solujen lymfooma [2]. Jotkut GPCR: ien on myös raportoitu olevan toiminnallisesti mukana syövän etenemistä [3], kuten gastriini-vapauttavan peptidin reseptorin (GRPR) eturauhassyövän [4], CXCR4 metastaasissa [5], ja niin edelleen. MAS1, on ensimmäinen GPCR raportoidaan olevan mitään tekemistä syövän kehittymisen. Kerrottiin, että NIH3T3-solut ektooppisesti ilmentävät MAS1 edistänyt painopiste muodostumista

in vitro

ja helpottanut tuumorigeneesiä nude-hiirissä [6], mutta kumpikaan merkittävä MAS1 ilmaisu eikä aktiivinen MAS1 mutaatio on raportoitu kliinisissä syövissä, siis roolia MAS1 syövässä on vielä epäselvä. Toisaalta, korkea ilmentyminen MAS1 havaittiin keskushermostoon, kuten hippokampuksessa ja pikkuaivoissa, ja MAS1 parannettu ligandista riippuvan kalsiumin Ang II-reseptorin (AT2R), jossa MAS1 muodostivat kompleksin AT2R. Nämä viittaavat siihen, että MAS1 on tärkeä rooli keskushermostossa [7], [8].

MAS liittyvät G-proteiiniin kytketty reseptori, D (MRGD), jota kutsutaan myös hGPCR45 [9], tai TGR7 [10], tunnistettiin uutena GPCR hiiren ja ihmisen genomien [11]. Todettiin, että MRGD toimii reseptorin beeta-alaniini [12]. Useat MRG perheenjäsenet ilmoitettiin ilmaistaan ​​erityisiä alaryhmien aistihermoilla, jotka tunnistavat kipuärsykkeille [11]. Kuten MRGD, sen ekspressio havaittiin takajuuren (DRG) ja co-paikallistaa Vanilloidireseptoriantagonisteja-1 (VR-1), joka on olennainen reseptori lämmön ja kivun tunne [12]. Lisäksi geneettinen ablaatio MRGD ilmentävien hermosolun vähentää käyttäytymiseen herkkyys mekaanisille ärsykkeille muttei kuumuudelle tai kylmä ärsykkeitä hiirillä [13]. Siten MRGD pidetään yhtenä toimijoista kivun tunne ja /tai transduktio. On myös raportoitu, että MRGD transdusoi solunsisäisen signaloinnin angiotensiini (Ang) II metaboliitin, Ang (1-7) [14]. Kuten edellä on kuvattu, toiminta MRGD on keskushermostossa on havaittu useita ryhmiä.

On olemassa useita GPCR perheenjäseniä osoittaa aminohapposekvenssin samankaltaisuus MAS1 kuten MRGA, MRGB, MRGC, MRGD, MRGE , MRGF, MRGG, MRGH ja MRGX [11]. Vuonna Fylogeeninen puusta MRG perheen, MAS1, MRGD, MRGE, MRGF ja MRGH luokitellaan kuuluvaksi samaan haara [11]. Tämä nosti hypoteesia, että geenit Fylogeeninen haaran lukien MAS1 voisi olla samankaltaisuutta toiminto tai signaalitransduktion. Huomasimme kyky MAS1 edistää tuumorigeenisia toiminto NIH3T3, ja tässä tutkimuksessa yrittänyt valottaa kasvaimia toiminta MRGD, joka raportoidaan toimimaan keskushermoston kuten MAS1. Tutkimme myös ilmentymisen MRGD ihmisen syöpäkudoksissa. Huomasimme, että MRGD edistää kontakti-inhibition menetys, kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ja

in vivo

kasvainten synnyssä ja on myös erittäin ilmaistu useissa ihmisen keuhkosyövässä, mikä viittaa siihen, että MRGD voisi olla tärkeä merkitys ihmisen syövän.

tulokset

vaikutus MRGD soluproliferaatioon ja tuumorigeenisyystesti in vitro

selkeyttämiseksi vaikutuksen MRGD solujen kasvuun, NIH3T3-MRGD solulinjaa, joka NIH3T3-solut transfektoitiin stabiilisti jossa MRGD retrovi- ekspressiovektorilla perustettiin ja sen kasvuun liittyviä profiilit analysoitiin. Geeniekspressiota MRGD, että NIH3T3-MRGD solulinja vahvistettiin RT-PCR ja sekvensointi (kuvio S1). Käyttäen NIH3T3-MRGD soluja, painopiste muodostumista määrityksessä (katso materiaalit ja menetelmät) suoritettiin, missä merkittävä pesäkkeitä muodostuminen nähtiin NIH3T3-MRGD soluviljelmässä, kun taas mitään tällaisia ​​pesäkkeitä havaittiin NIH3T3-Mock (kuvio 1A). Nämä tiedot osoittavat, että MRGD geenin ilmentymistä peruuttaa kontakti-inhibition NIH3T3-soluja, yksi niistä ominaisuuksista normaalien fibroblastien. Määrittämään MRGD muut kasvuun liittyviä ominaisuuksia, pallomainen kasvun määrityksessä (katso materiaalit ja menetelmät) suoritettiin, jossa NIH3T3-MRGD solujen ja NIH3T3-Mock-soluja viljeltiin 96-kuoppaisen tarttumattomat U-pohjaisille levy, vastaavasti. Ensinnäkin, huomasimme, että suurempia palloset havaittiin NIH3T3-MRGD kuin NIH3T3-Mock 5. päivänä pinnoitus. Rakeiden NIH3T3-Mock kutistunut viljelyn aikana, kun taas NIH3T3-MRGD ilmeisesti kasvoi päivä päivältä, kuten kuviossa 1B on esitetty. Me määritetään tämän kasvuun liittyviä merkin mittaamalla muutos halkaisijat sferoidien ja mittaamalla eroa ATP aktiivisuus pallosia (kuvio 1C ja D). Merkittävästi suurempia sferoidiviljelmiä halkaisijat havaittiin NIH3T3-MRGD kuin ne, NIH3T3-Mock 2-8 päivää jälkeen pinnoituksen (kuvio 1 C, p 0,005, U-testi, 2 hännät). Myös paljon enemmän ATP sisältöä nähtiin NIH3T3-MRGD verrattuna NIH3T3-Mock 6 päivän kuluttua pinnoituksen (kuvio 1D, p 0,005, U-testi, 2 hännät). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin [

3H] tymidiinista määrityksessä mittaus (kuvio S2, File S1). Nämä tulokset osoittavat, että MRGD edistää merkittävästi kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun normaalin fibroblastien, toisin sanoen, MRGD hallussaan onkogeenisen ominaisuus.

. Edustavia kuvia painopiste muodostuminen yksikerroksisiin NIH3T3-solut, jotka ilmentävät stabiilisti Mock (NIH3T3-Mock-solut, vasen) tai MRGD (NIH3T3-MRGD soluja, oikealla). Solut värjättiin kristallivioletilla kiinnityksen jälkeen 4% paraformaldehydillä. B. Edustavia kuvia NIH3T3-MRGD tai NIH3T3-Mock sferoidiviljelmiä päivinä 1 ja 7. C. Sferoidiviljelmiä kasvukäyrät. Rakeiden koot NIH3T3-MRGD (suljettu) tai NIH3T3-Mock (avoin) Days 2, 3, 5 ja 7, on esitetty niiden halkaisijat (keskiarvo ± SD). * Osoittaa p 0,005 (U-testi, 2 hännät). D. Cell leviämisen sferoidiviljelmiä NIH3T3-MRGD tai NIH3T3-Mock. Luminenssi vähintään kokosolu ATP sisältö (keskiarvoja ± SD) mitattiin 6 vuorokauden kuluttua pinnoitus. * Osoittaa p 0,005 (U-testi, 2 hännät).

vaikutus MRGD soluproliferaatioon ja tuumorigeenisyystesti in vivo

Seuraavaksi, jotta arvioida

in vivo

tuumorigeenisia aktiivisuus, me ihon alle ympätty NIH3T3-MRGD tai NIH3T3-mock on kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Merkittävä kasvu siirretty kudos havaittiin hiirten ihon alle istutettiin NIH3T3-MRGD solujen mutta ei NIH3T3-Mock-solut (taulukko 1). Keskimääräinen kasvaimen volyymit NIH3T3-MRGD-solujen-oksastettu hiiret ylittivät 2,000 mm

3 21 päivää inokulaation jälkeen. Sen sijaan ei ole merkittävää kasvua oli NIH3T3-Mock-solut oksastetun hiiret ennen kuin 21 päivää inokulaation jälkeen. Tallustella solujen havaittiin NIH3T3-Mock-solut oksastetun hiiriin 24 päivää inokulaation jälkeen, mutta se oli edelleen hyvin pieni ja sen keskimääräinen tilavuus oli alle 400 mm

3. Kuten NIH3T3-MRGD muodostunut suuri tallustella

in vivo

teimme HE värjäys vahvistamaan, että NIH3T3-MRGD möykky hallussaan kasvain kaltaisia ​​patologisia piirteitä. HE värjäys siirretty kudos osat NIH3T3-MRGD-solujen-oksastettu hiiret osoittivat fibrosarcoma kaltainen morfologia (kuvio S3). Yhdessä tämä tulos viittaa siihen, että MRGD ilmaisu aiheuttaa paitsi

in vitro

mutta myös

in vivo

kasvainten muodostumiseen.

induktio solukasvun ligandin stimulaation

vaikutuksen arvioimiseksi beeta-alaniini, joka on yksi MRGD ligandien [12], on pallomainen kasvua edistää MRGD, beeta-alaniini eri pitoisuuksia lisättiin pallomainen kulttuurin NIH3T3-MRGD soluja tai NIH3T3-RASV12 solut. NIH3T3-Mock solut eivät kasva hyvin sferoidiviljelmiä kulttuuriin eikä vakaata kasvua aiheutettiin vaikka läsnä beeta-alaniini (tuloksia ei esitetty), ja näin ollen NIH3T3-Mock solun ryhmä ei ole asetettu tässä tutkimuksessa. Tässä kokeessa merkittävän edistäminen solukasvun beeta-alaniini annoksesta riippuvalla tavalla havaittiin NIH3T3-MRGD mitattuna ATP aktiivisuus (p 0,05, Mann-Whitney U-testi, 2-hännät), kun taas mitään vaikutusta beeta-alaniini nähtiin NIH3T3-RASV12 pallomainen kasvu jopa 2000 ug /ml beta-alaniini (kuvio 2). Nämä tiedot osoittavat, että kiinnittymisestä riippumattoman kasvun MRGD ilmentäviä soluja voidaan parantaa sen ligandin stimulaation.

NIH3T3-solut, jotka on transfektoitu MRGD tai RASV12 viljeltiin RPMI1640, joka sisälsi 0,1% BSA: ta ja eri pitoisuus beeta-alaniini 7 päivää. Tiedot saatiin kolmesta itsenäisestä soluviljelmistä (keskiarvo ± SD). * Osoittaa p 0,05 (U-testi, 2 hännät), verrattuna NIH3T3-MRGD ilman beeta-alaniini, ja NIH3T3-RASV12.

ilmentäminen MRGD ihmisen syövissä

Selvitimme MRGD ilmentymistä useissa kliinisissä syöpiä. Ensimmäinen, selventää MRGD ekspressiotaso keuhkosyövän näytteistä, suoritimme IHC käyttämällä paria kasvain ja normaalin kudoksen osien 33 paria ihmisen keuhkosyövän näytteet (katso materiaalit ja menetelmät). IHC, kanin anti-MRGD vasta-aine nostettiin ja antigeenispesifisyys vasta-aineen vahvistettiin, kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät; värjäys signaalit anti-MRGD vasta-aineen ulomman kalvon havaittiin formaliinikiinnitetyt HEK293 /a vp 3-soluja, jotka on transfektoitu MRGD, joskaan ei Valetransfektoitu HEK293 /a vp 3-soluissa (kuvio 3A ja B). Tämän vasta-aineen, 22 ulos 33 kliinisen keuhkosyöpää osoitti MRGD positiivisia signaaleja (22/33): adenokarsinoomat (9/10), huonosti erilaistunut okasolusyöpää (7/10) ja hyvin eriytetty okasolusyöpää (6 /10) (taulukko 2). Huomasimme erityisen vahvoja signaaleja joissakin näytteissä, mukaan lukien adenokarsinoomat (8/9) (kuvio 3C ja S4), huonosti erilaistunut okasolusyöpää (3/7) ja hyvin eriytetty okasolusyöpää (2/10). Toisaalta, mitään värjäytymistä signaalia ei havaittu pieniä cell carcinoma (päivämäärä ei esitetty).

Cell lohkon näytteitä käytettiin vahvistamaan vasta-spesifisyyden immuunivärjäykseen. HEK293 /a vp 3-soluja, jotka on transfektoitu MRGD ekspressiovektorilla (A) tai Mock vektorin (B) on esitetty. C. edustaja värjäytyminen keuhkojen adenokarsinooma, joka on positiivinen MRGD.

analysoitiin myös MRGD geenin ilmentymisen kliinisissä syöpien kvantitatiivisen RT-PCR: llä. Satakaksikymmentä seitsemää RNA-näytteiden, sekä syöpä ja ei-syöpä osia keuhkojen, ruokatorven, rinta-, munuais-, vatsa-, kohtu- ja paksusuolen syöpä kudoksia käytettiin. Näytteissä kohtuun tai paksusuolen kudosta, MRGD ilmentymistä syövän osuus ei ylittänyt 3-kertainen määrä normaalin osaan. Kuten keuhkosyövässä, keskiarvo MRGD ilmaisun syöpä osaan ylittivät yhtä suuri kuin 3 kertaa niin paljon kuin keuhkoissa normaali osa, ja 12 ulos 33 keuhkojen parin näytteiden MRGD ilmentyminen syövän osaan ylitti 3 kertainen summa pariksi normaali osa (kuva 4). Kaikissa 7 syövän lajien määritelty tässä, keuhkojen parin näytteet osoittivat korkeimman taajuuden (36%) korkeampi MRGD ilmentymistä syövän osaan verrattuna normaalin osan kriteerit on yli 3-kertainen määrä (kuva 4). Joitakin muita syöpää näytteiden, kuten rinnat (3 out of 16), esophagi (2 out of 12), munuaiset (1 10) ja vatsat (1 ulos 25), osoittivat myös 3 kertaa suurempi ilmentyminen syövän osaan verrattuna ja että normaalin osaan. Emme nähneet tilastollinen ero kokonaisvertailun mRNA-signaalin normaalin ja syövän osuudet kussakin syöpätyypin yksisuuntaisella ANOVA. Tarkempi luokittelu potilaita on tarpeen saada tilastollista merkittävyyttä. Kuitenkin tiedot osoittavat selvästi, että yli 3-kertainen ekspression signaalit esitetään kasvain eikä tavanomaista osan joillakin syöpäpotilailla. Korkeampi ilmentyminen syövän osan keuhkosyövässä oli myös hyvin sopusoinnussa tulosten IHC. Nämä viittaavat siihen, että tiedot ovat erittäin merkityksellisiä osoitteeksi seuraavalle suuntaan tutkimusta MRGD ilmaisun syöpään.

Satakaksikymmentä seitsemää RNA-näytteet syövän ja ei-syöpä osia samasta potilaalla on keuhko ( n = 33), ruokatorven (n = 12), rintojen (n = 16), munuaisen (n = 10), vatsa (n = 25), kohtu (n = 12) tai paksusuoli (n = 19) syöpä. Suhteet määrää MRGD mRNA kasvain annos per että normaalissa osaan kussakin tapauksessa piirretty. Palkki ilmaisee keskiarvon suhteen kussakin syöpätyypin.

Keskustelu

osoitettu, että MRGD ilmaus indusoi kontakti-inhibition menetys, kiinnittymisestä riippumaton sferoidiviljelmiä kasvu

vuonna vitro

ja myös kasvaimen kehittymisen

in vivo

, joita ei nähty vanhempien normaalissa fibroblastisoluja (kuvio 1, taulukko 1). Nämä funktionaalisten fenotyyppejä havaittiin MRGD ovat melko samanlaiset kuin edustavan onkogeeni, RASV12 [15]. Meillä on myös vahvistanut, että RASV12 ilmentyminen edistää peruutus kontakti-inhibition normaalien fibroblastien soluja ja saa aikaan myös pallomainen kasvua tai kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun (dataa ei näytetty). Lisäksi olemme osoittaneet, että NIH3T3-MRGD soluissa johti merkittävä kasvu fibrosarkooman kaltaisten solujen

in vivo

(kuvio S3), ja niiden morfologiset fenotyypit olivat varsin samanlaisia ​​kuin NIH3T3-RASV12 soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset tukevat vahvasti, että MRGD transdusoi tuumorigeenisemmiksi signalointi ja edistää ankkurista riippumaton solun kasvua nähty RASV12. Kerrottiin, että iPS-solut tehtiin hiiren alkion fibroblasti (MEF) ohjelmoida uudelleen tuomalla markkinoille useita geenejä, mukaan lukien onkogeenien [16]. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet kasvaimia funktio MRGD, saattaa kuitenkin olla myös kiinnostava selventää, onko MRGD voi edistää stemness. Ilmaus stemness markkereita, kuten Oct-3/4, Nanog ja niin edelleen [16] – [19] NIH3T3-MRGD ja muut MRGD-positiivisia soluja, sekä ilmentymistä MRGD itse kantasoluja ja ohjelmoida uudelleen MEF, kiinnostavat tietää merkityksen MRGD tästä aiheesta ja olisi selvitetty tulevaisuudessa.

Useat raportit osoittavat, että ei ainoastaan ​​onkogeeni kuten RASV12 myös proto-onkogeenien kuten ErbB2 ja FYN antavat samanlaisia tuumorigeenisia fenotyypin fibroblastisoluissa [20], [21]. Lisäksi ilmaus kuten onkogeenien ja /tai proto-onkogeenien on usein lisääntyi useissa ihmisen syövissä ja että niiden solujen kasvua ja anti-apoptoottiset signaalit edistää ei vain syövän kasvua vaan myös taudin etenemisen syöpäpotilailla [2], [22] – [25]. Tässä raportissa todettiin, että MRGD mRNA ilmentyy kliinisistä ihmisen syövän näytteitä joillakin potilailla keuhko-, rinta-, ruokatorvi-, munuais- tai mahasyöpä. Lisäksi olemme huomanneet, että jotkut näistä syövän näytteiden ilmentävät MRGD mRNA oli suhteellisen suurempi MRGD proteiinin ilmentyminen verrattuna ei-syöpä osia samasta potilaista, vaikka mitään yleistä tilastollista merkittävyyttä nähtiin kunkin kasvaimen tyypin (kuvio 4). Saat keuhkosyövässä, meidän RT-PCR-analyysit osoittivat korkea ja usein MRGD mRNA: n ilmentymisen, ja meidän IHC analyysit paljastivat, että korkein taso, jota havaitaan MRGD proteiinin ekspressiota, havaittiin usein ihmisen keuhkosyövässä (taulukko 2), erityisesti keuhkoissa adenokarsinoomat (kuvio 3). Vaikka edelleen analyysejä MRGD toimintojen ihmisen syöpäsoluja ja kudoksia tarvitaan, ilmaus profiilia MRGD kliinisissä syöpiä paljasti tässä tutkimuksessa viittaa vahvasti siihen mahdolliseen osallistumiseen kasvaimia synnyttävän toiminnon MRGD itse ja /tai liittyvä signaalireitin joissakin kiinteitä kasvaimia kuten keuhkosyövässä. GPCR: t voivat olla hyvä tavoitteita pienmolekyylisalpaajien sekä vasta-aineita, ja siksi MRGD, GPCR, voisi toimia uutena kohteena syövän hoidossa. Lung adenokarsinomia saattaa olla erityisen kiinnostava syöpätyypin mahdollisia syövän hoitoon kohdistamista MRGD.

mekanismeja, joilla MRGD edistää kasvaimia synnyttävän signaalit eivät ole tiedossa. Kuitenkin meidän tulokset osoittavat, että MRGD ilmaisun edistää onkogeeninen fenotyyppejä normaaleissa soluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

(kuvio 1, taulukko 1), ja toisaalta, että ligandi, beeta-alaniini, aktivoi MRGD riippuvaa solukasvua

in vitro

(kuva 2). Kerrottiin, että normaalin beeta-alaniini oli noin 3,8 uM terveillä ihmisen plasmassa [26]. Myös raportoitu, oli se, että beeta-alaniinia pitoisuudet hermo liittyvää kudosta on esitetty olevan noin 50 uM rotalla lonkkahermossa ja 60 uM kissan aivoissa [27], [28]. Meidän tiedot osoittavat, että beeta-alaniini edistää pallomainen kasvua 2 uM 2000 uM annoksesta riippuvaisella tavalla, ja 50% kasvun edistämiseen havaittiin 20 uM (kuvio 2). Näin ollen, beeta-alaniinia terveen ihmisen plasmassa on riittävän suuri edistämään pallomainen kasvun kautta MRGD. Raportti on tähän mennessä osoittanut, että korkea beta-alaniinia pitoisuus liittyy syöpään; yksityiskohtaisesti, nisäkasvaimia rotan tai hiiren sisältää korkean tason beeta-alaniinia joita ei koskaan ole löydetty normaalissa rintarauhaskudoksessa rotan tai hiiren [29]. Näin ollen, beeta-alaniini plasmassa tai kasvainten syöpäpotilaiden voi olla suurempi kuin normaaleilla henkilöillä. Voisi olla mahdollista, että beta-alaniini aktivoi kasvaimen kasvua ja selviytymistä signaaleja syöpäpotilaiden MRGD jossain määrin. Lisäksi syövän kudoksissa, korkea MRGD ilmentyminen voi aiheuttaa konstitutiivista transduktio onkogeenis- signaaleja, tai se voi aiheuttaa suurempia ligandi reagointikykyä kuin normaaleissa kudoksissa, mikä johtaa edistämiseen syövän kasvua. Toisaalta, ei ole raportti on osoittanut, että beeta-alaniini edistää syövän kehitystä, ja sen vuoksi on mahdollista, että saattaa olla toinen MRGD ligandi edistää syövän kehitystä MRGD. Ne olisi selvitetty tulevaisuudessa.

Tässä tutkimuksessa osoitimme; 1) tuumorigeenistä aktiivisuus MRGD

in vivo

ja

in vitro

, 2) MRGD ilmentymistä kliinisissä syövän kudoksissa, 3) edistäminen sferoidiviljelmiä kasvua beeta-alaniini, The MRGD ligandi, ja 4 ) fibrosarkooma kaltainen morfologia oksastetun kudosten hiirten ihon alle implantoidun MRGD-ilmentäviä soluja. Nämä viittaavat siihen, että MRGD on voimakas tavoite syövän hoidossa ja että pienimolekyylisiä antagonisteja, vasta-aineita tai RNAi varten MRGD tarjoaisi lupaavan syöpähoidon.

Materiaalit ja menetelmät

Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osallistujiksi saimme kaikkien kliinisten kudoksista, ja kaikki kokeet kliinisten kudosten suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksymien Daiichi Sankyo tutkimuksen eettinen komitea. Kaikki eläin työ on tehty mukaan asiaa valtakunnallinen ohjeistus vuonna 2005, kun eläin teoksia tutkittiin.

Nämä eläinkoetta pöytäkirjat hyväksyttiin Sankyo eläimen tutkimus eettinen komitea, vuonna Sankyo Co., Ltd., joka oli edeltäjä on Daiichi Sankyo Co., Ltd.

Materiaalit ja soluviljelmissä

FBS hankittiin Hyclone (South Logan, UT). DMEM, RPMI1640, Opti-MEM, genetisiiniä ja Lipofectamine 2000 hankittiin Life Technologies (Carlsbad, CA). Retrovirus pakkaus solulinja, 293-10A1, perustettiin vuonna laboratoriossamme 293 solulinjasta (ATCC, CRL-1573) transfektoimalla PCL-10A1 (IMGENEX, Sorrento Valley, CA). 293-10A1 solulinjaa ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 3 ug /ml blastisidiini (Wako, Osaka, Japani) olosuhteissa 5% CO

2 37 ° C: ssa. NIH3T3-solulinja saatiin ATCC: ltä (CRL-1658) ja sopeutettiin RPMI1640-elatusalustassa täydennettynä 10% FBS: ää. Heksadimetriinibromidi ostettiin Sigma-Aldrich (Tokio, Japani). HEK293 /a vp 3-solulinja perustettiin 293-soluista (ATCC, CRL-1573) vakaa transfektoimalla integriini a v ja β3 ekspressiovektorit, ja viljeltiin DMEM 10% FBS: ää.

Generation NIH3T3-MRGD solut

cDNA, joka koodaa täyspitkää ihmisen MRGD, RASV12 tai GFP kloonattiin pLNCX vektoriin (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). Infektion, NIH3T3-solut ympättiin 10 cm: n maljalla, ja viljeltiin 1-3 päivää. 293-10A1 solut maljattiin 10 cm: n kollageeni I-pinnoitettu astia (AGC Techno Glass, Chiba, Japani), ja niitä viljeltiin yön yli. pLNCX-MRGD, pLNCX-RASV12 tai pLNCX-Mock transfektoitiin 293-10A1 soluihin Lipofectamine 2000 supernatantti transfektoitujen 293-10A1 solut kerättiin, sitten tuoretta alustaa lisättiin seuraavan jakson. Kerätty supernatantti suodatettiin 0,45 um PVDF-kalvolle (Millipore, Billerica, MA), ja yhtä suuri tilavuus RPMI 1640 väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 16 ug /ml heksadimetriinibromidi lisättiin. Tämä virus liuos lisättiin NIH3T3-soluihin infektion. Sarja näistä infektion menettelyt toistettiin kolme kertaa 12 tunnin välein. 12 tunnin kuluttua viimeisestä infektio, soluja viljeltiin 500 ug /ml Geneticin viikon kerääntyä soluihin, jotka ilmentävät kohdegeenin.

Focus muodostumista määrityksessä

Solut maljattiin 1 × 10

5 solua /kuoppa on 6-hyvin soluviljelylevy (Corning Japani, Tokio, Japani) ja viljeltiin viikon. Viljellyt solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (Wako, Osaka, Japani) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla (Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japani).

sferoidi kasvua määritys

NIH3T3-MRGD solut suspendoitiin RPMI1640-elatusalustassa täydennettynä 10% FBS: ää tai 0,1% BSA: ta ja maljattiin 5000 solua /kuoppa 100 ul: ssa on 96-kuoppaisen pallomainen levyn (Sumitomo Bakelite, Tokio, Japani) . Siinä tapauksessa, että beta-alaniinia lisättiin, solut maljattiin 5000 solua /kuoppa 80 ul: ssa ja sitten 20 ui beta-alaniinia lisättiin samana päivänä. Sferoidiviljelmiä kasvu mitattiin jotakin seuraavista menetelmistä. 1) Mittaus sferoidiviljelmiä halkaisija: Sferoidiviljelmiä halkaisija mitattiin silmän mikrometriä. Jokainen halkaisija laskettiin suurennos objektiivi ja okulaari. 2) mittaaminen sferoidiviljelmiä ATP määrä: Cell Titer-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega KK, Tokio, Japani) käytettiin mukaan valmistajan ohjeiden. Sitten pallojakaantuminen 100 ui reagenssia oli hyvin pipetoitavat ja siirrettiin valkoinen tasainen pohjalevy (Corning Japani, Tokio, Japani). 1 s luminesenssin levyn mitattiin Mithras LB940 (Berthold Technologies, Wildbad, Saksa).

analyysi in vivo aiheuttavan kasvaimia MRGD-transfektoitujen NIH3T3-solujen

Kateenkorvattomia nude-hiirten (BALB /cAJcl-nu /nu-hiiriä, CLEA Japan, 5 viikkoa vanha, naaras) inokuloitiin subkutaanisesti 3 x 10

6 NIH3T3-MRGD soluissa (n = 3) tai NIH3T3-Mock-solut (n = 3), negatiivisena ohjaus. Kasvaimen tilavuus mitattiin 3 kertaa viikossa. Kasvain tilavuudet laskettiin seuraavalla kaavalla: Asiaa valtakunnallinen ohjeistus, kaikki hiiret olivat lopetettiin, jos merkkejä myrkyllisyydestä kuten vähentynyt aktiivisuus, vähentynyt ruokahalu, vähentää juomista, nuolee, vartijat raajat, lisääntynyt aggressiivisuus, ääntely, vastenmielisyys kohti con-yksityiskohtia, kuivuminen, puuttuu anatomia, epänormaali asento, murtunut lisäke ja esiinluiskahdus, ripuli, progressiivinen ihottuma, kyyryssä ryhti, uneliaisuus tai pysyviä makaamista, yskä, hengityksen, nenän vuotamista, keltaisuus ja /tai anemiaa, neurologisia oireita, verenvuoto mistä tahansa aukon, itseaiheutettu trauma, vaikeuksia liikkuminen, liiallinen tai pitkittynyt hypertermia tai hypotermia, tai laihtumisen ylitti 10% koko kehon painosta negatiivisen kontrollin hiiriä, nähtiin. Mitään merkkiä toksisuudesta nähtiin hiirissä tämän kokeen aikana.

valmistaminen kanin anti-humaani MRGD polyklonaalista vasta-ainetta

Seosta, jossa 2 eri peptidejä, GTVESALNYSRGSTVH (16 mer) ja ELEGGETPTVGTNEMGA ( 17-meerinen), käytettiin antigeeninä. Seerumit saatiin kanit immunisoidaan valmistettu epätäydellistä Freundin adjuvanttia (DIFCO, Detroit, MI), lukuun ottamatta ensimmäistä immunisaatiota, joka sisälsi täydellistä Freundin adjuvanttia (DIFCO, Detroit, MI). Lopuksi, polyklonaaliset IgG vasta-aineet puhdistettiin seerumit jonka affiniteettipylvää- kanssa antigeenipeptidit.

immunohistokemia (IHC) B

spesifisyys anti-MRGD vasta todensi värjäämällä HEK293 /a vp 3-soluissa transfektoitu MRGD ilmentävien tai tyhjän vektorin. Nämä transfektantteja kiinnitettiin 20% formaliinilla neutraali puskuriliuos (Wako, Osaka, Japani) ja parafiiniin tehdä Aikasolujen. Solun leikattiin pois ohuita osioita mikrotomissa ja asetetaan APS-pinnoitettu objektilasille. Leikkeet kuivattiin, de-parafinized ja esikäsitellään Biotiini Blocking (Dako Japani, Tokio, Japani). Leikkeet estettiin sitten proteiini lohkon seerumitonta (Dako Japan, Tokyo, Japani) ja käsiteltiin polyklonaalisella anti-ihmis-MRGD vasta-aineella (1/200) vasta-laimentimeen (Dako Japan, Tokyo, Japani). Vasta-aine-käsitelty osat käsiteltiin biotinyloidulla anti-kani-IgG, käsiteltiin sitten ABC-AP Vectastain ABC alkalisen fosfataasin kit kani-IgG (CliniScience, Montrouge, Ranska). AP punaisen Alkaline fosfataasisubstraattikäyttöpakkausta I käytettiin väritys alustaan. Cancer kudosleikkeet valmistettiin parafiiniin lohkot ja immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin ABC-menetelmällä.

mittaus MRGD geeniekspression kliinisissä kudoksessa

Kokonais-RNA kasvaimen tai ei-kasvain kliinisissä kudosten samalta luovuttajalta ostettiin BioChain (Hayward, CA). Nämä RNA pari näytteitä käsiteltiin ATP-Dependent DNaasia (Toyobo, Osaka, Japani) 10 yksikköä RNaasi-inhibiittoria (Toyobo, Osaka, Japani) 15 minuuttia jäillä. DNaasi poistettiin kokonais-RNA miniprep järjestelmä (VIOGENE, Taipei County, Taiwan). CDNA: n saamiseksi, seosta mallin kokonais-RNA (2 ng), random-alukkeita (9 mer, 50 pmol), ReverTra Ace (10 yksikköä, Toyobo, Osaka, Japani) ja reaktio-puskuria (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 75 mM KCI, 6 mM MgCl

2, 1 mM DTT: tä, 1 mM dNTP-puskuri), inkuboitiin 25 ° C: ssa 15 minuutin ajan, 42 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten 95 ° C: ssa 3 minuuttia. Reaaliaikainen-PCR-reaktio suoritettiin TaqMaq One-Step RT-PCR Master Mix (Life Technologies Japan, Tokio, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden käyttäen seuraavia koetin ja alukkeet.

MRGD

-2 (TaqMan koetinsekvenssi): TGTGTGCCACCATGCCTGGCTAATT

MRGD

-F2 (Forward alukesekvenssi): GCTCACTACAACCTCAATGTGCC

MRGD

-R2 (Käänteisaluke sekvenssi): GCCACATAGCAAGATCTCATCTCTAC

Data normalisoitiin TaqMan β-aktiini ohjaus reagenssia (Life Technologies Japan, Tokio, Japani). Nämä geeniekspressioiden mitattiin Mx3000P QPCR System (Agilent Technology, Santa Clara, CA).

TILASTOANALYYSI

Kaikki

vitro

kokeissa analysoitiin Mann-Whitneyn U -testaukset, paitsi kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi kliinisissä näytteissä, jotka analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA: lla. Raportoitu p-arvot ovat kaksi hännät ja pidetään tilastollisesti merkittävä p 0,05.

tukeminen Information

Kuva S1.

agaroosigeelielektroforeesi PCR-monistetun cDNA-insertit. Nukleiinihapposekvenssit PCR-tuotteiden vektori inserttien todennettiin. Kaista 1 ja 3: RT-PCR-monistettiin GFP kokonais-RNA: NIH3T3-GFP; kaista 2: Amplified GFP GFP plasmidista (positiivinen kontrolli); kaista 4 ja 6: RT-PCR-monistettiin MRGD kokonais-RNA: NIH-3T3-MRGD; kaista 5: Amplified MRGD alkaen MRGD plasmidista (positiivinen kontrolli).

doi: 10,1371 /journal.pone.0038618.s001

(TIF) B Kuva S2.

Cell leviämisen NIN3T3-MRGD sferoidiviljelmiä mitattuna [

3H] tymidiinista. [

3H] tymidiinista osaksi pallojen mitattiin 6 vuorokauden kuluttua pinnoitus. * Osoittaa p 0,005 (U-testi, 2 hännät).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0038618.s002

(TIF) B Kuva S3.

HE NIH3T3-MRGD siirretty kudos in nude mouse. NIH3T3-MRGD möhkäleitä 7 päivää inokulaation jälkeen kateenkorvattomissa hiirissä (A, × 40, B, × 800) osoittivat solujen edustaja kara kasvain kudoksen tyyppi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0038618.s003

(TIF) B Kuva S4.

HE ja IHC värjäykset keuhkojen adenokarsinooma näytteiden anti-MRGD vasta-aine. HE värjäystä (A, C, E) ja IHC värjäys (B, D, F) suoritettiin. Nämä ovat esimerkkejä kolme riippumatonta sairastavien potilaiden keuhkojen adenokarsinooma. Potilas 1, A, B; Potilas 2, C, D; Potilas 3, E, F

doi: 10,1371 /journal.pone.0038618.s004

(TIF)

Tiedoston S1.

Materiaali ja menetelmät kuvion S2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0038618.s005

(DOC) B

Kiitokset

Haluamme kiittää jäseniä R N. Maeda ja N. Abe tehdä solun lohkot, M. Yamada värjäystä HE ja IHC näytteitä, S. Endo tilastollista analyysia, ja tohtori M. Ono, Dr. P. Rodley ja Dr. Y. Abe neuvonnasta vuonna kirjallisesti tämän raportin.