PLoS ONE: Micro-Environmental Mekaaninen rasitus Controls Kasvain Sferoidiviljelmiä koko ja morfologia tukahduttamalla leviämisen ja aiheuttamaan apoptoosin syöpäsoluissa
tiivistelmä
Background
Puristuslujuus mekaanista rasitusta tuotettu kasvu tällä rajoittavan matriisin rajoittaa koko kasvain pallosia, mutta tiedetään vain vähän dynamiikkaa stressiä kertymistä, miten stressi vaikuttaa syöpä solun fenotyypin tai molekyylien reittejä mukana.
Menetelmät /Principal havainnot
yhteistyössä upotettu single syöpäsolujen loisteputki mikro-helmiä agaroosigeeleillä ja käyttäen konfokaalimikroskopialla, kirjataan 3D jakelu mikro-helmiä ympäröivän kasvaa pallosia. Muutos mikro-helmi tiheys muutettiin sitten rasitusta geeli, josta arvioimme tasaisempaa jakautumista puristusjännityksen ympärille pallosia. Löysimme vahvan korrelaation peri-pallomainen kiinteä jännitysjakautuma ja pallomainen muoto, tuloksena solujen proliferaatio ja induktion apoptoottisen solukuoleman alueilla suuri mekaaninen rasitus. Puristamalla pallosia koostuu syöpäsolujen yli-ilmentävät anti-apoptoottiset geenit, osoitamme, että mekaaninen stressin aiheuttama apoptoosin kautta tapahtuvaa mitokondrio-reitin.
Johtopäätökset /merkitys
Tuloksemme antaa yksityiskohtaisia, määrällisiä käsityksen roolia mikro-ympäristön mekaanisen rasituksen kasvaimen pallomainen kasvudynamiikkaa, ja ehdottaa miten kasvaimet kasvavat suljetuissa tiloissa, joissa esiintyy kiinteiden stressiä tulee suureksi. Tärkeä seuraus on, että apoptoosin kautta mitokondrioiden reitin, aiheuttama puristusjännitys, voi olla osallisena kasvainten lepokauden, jossa kasvaimen kasvua pidetään kurissa tasapaino apoptoosin ja leviämisen.
Citation: Cheng G, tse J, Jain RK, Munn LL (2009) Micro-Environmental Mekaaninen rasitus Controls Kasvain Sferoidiviljelmiä koko ja morfologia tukahduttamalla leviämisen ja aiheuttamaan apoptoosin syöpäsoluissa. PLoS ONE 4 (2): e4632. doi: 10,1371 /journal.pone.0004632
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat
vastaanotettu: 21 joulukuu 2008; Hyväksytty: 02 tammikuu 2009; Julkaistu: 27 helmikuu 2009
Copyright: © 2009 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH avustuksia P01CA80124, R01CA085140 ja R01CA126642. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
kiinteiden kasvainten kasvun on pitkälti sen microenvironment. Paitsi hyvin tutkittu microenvironmental parametreja, kuten hypoksia [1], [2] ja angiogeneesissä [3] – [5], mekaaniset rasitukset myös tärkeä rooli. Jotta kiinteä kasvain kasvaa suljetussa tilassa määritelty ympäröivään kudokseen, se täytyy voittaa tuloksena puristuksiin. On osoitettu, että kasvaimia ja niihin liittyvät strooman ovat mekaanisesti jäykempiä kuin vastaavat isännän normaalin kudoksen [6], ja että mekaaninen puristus tällaisessa ympäristössä voi romahtaa veren ja imusuonten [7]. Kuitenkin meidän ymmärtää, miten tämä puristus vaikuttaa suoraan kasvaimen kasvua on rajoitettu. Eri hypoteeseja on ehdotettu ottamiseksi mukaan mekaanisten jännitysten kasvainten kehittymiseen [8] – [11], ja Helmlinger et al. [12] johti ensimmäisen kvantifiointiin sferoidiviljelmiä kasvun hidastumisen agaroosigeeleillä. He havaitsivat, että ihmisen paksusuolen karsinooman palloset voivat kasvaa kooltaan enintään 400 pm (halkaisija) 0,5% (paino /tilavuus) agaroosigeelissä, mutta vain 50 um 1,0% agaroosi (joka on vähemmän yhteensopiva). Tämä liittyi lisäys solujen pakkaus ja väheneminen solujen lisääntymisen. He osoittivat myös, että tällaisia kasvaimen kasvun inhibitiota voidaan kääntää vapauttamalla palloset geelistä. Silti useat keskeiset kysymykset jäävät vastausta, mukaan lukien: (1) Mitä luonne jännitystilan ympärillä kasvava kasvain pallosia? (2) Voidaan paikallinen kiinteä jännitysjakauma vaikuttaa muotoon kasvain pallosia? (3) Onko kiinteä jännitysjakautuman myös vaikuttaa solujen fenotyyppi eri alueilla yksittäisten pallosia? (4) Mikä on solunsisäinen, joka säätelee kiinteä stressin aiheuttama fenotyypin muutos (s)? Nämä kysymykset ovat kriittisiä perusteellisen ymmärtämisen kiinteän kasvaimen kasvun dynamiikkaa.
Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että kokoavien kiinteä jännitys agaroosigeeleillä ympärillä kasvava kasvain pallosia (ei-metastasoituneen hiiren rintasyöpä 67NR solujen ellei toisin mainita ) voidaan mitata käyttämällä yhdessä upotettu fluoresoiva mikro-helmiä (halkaisija = 1 um) markkereina kannan geelin: agaroosigeeleillä ovat resistenttejä hajoamiselle syöpäsolu proteinaasit [13], ja siten mahdollistaa tutkimusten kiinteää stressin kertymistä riippumattomia soluinvaasiota. Me osoitamme, että muoto kiinteän jännitystilan sanelee muodon kasvaimen sferoidien ja että tämä vaikutus johtuu solujen proliferaatio ja induktion apoptoosin alueilla on korkea kiinteiden stressiä. Lopuksi selvittämiseksi molekyylimekanismiksi kiinteän stressin indusoiman apoptoosin.
Tulokset
kasvava kasvain pallosia asteittain puristaa ympäröivän matriisin
Fig. 1
osoittaa kasvua tyypillinen kasvain sferoidin (vihreä) yhdessä upotettu mikro-helmiä (punainen) 0,5% agaroosigeelissä 30 päivää (ks kokeellinen setup täydennyskuvio. S1
). Analyysi kautta 3D konfokaalimikroskopialla paljasti, että agaroosigeeli asteittain puristetaan kasvava sferoidi (Fig. 1
B
). Varhaisessa ajankohtina, oli paljon vaihtelua mikro-helmi tiheys (
ρ
helmet), lähinnä siksi, että pallomainen oli vielä melko pieni ja sen seurauksena, näytteenotto volyymi mittaamiseen
ρ
helmiä rajoittui. Merkittävä nousu
ρ
helmiä alkoi ilmestyä päivänä 17, jolloin pallomainen halkaisija (
D
sphd) oli vain ~150 um. Päivällä 30,
D
sphd oli saavuttanut ~250 um ja
ρ
helmiä ensimmäisen 10 pm paksu kuori agaroosigeelistä (
ρ
helmet, 1) oli -1,6 kertaa suurempi kuin jännittämättömässä geelit, mikä vastaa 37,5% rasituksella (
ε
geeli, 1). Merkittävät kanta rajattiin välittömässä läheisyydessä pallomainen:
ρ
helmiä laski sen valvontaan tasolle -50 um päässä pallomainen pinta (Fig. 1
B
, päivä 30 käyrä). Suhde pallomainen kasvun ja tuloksena rasitusta agrose geeli on lineaarinen alueella
D
sphd mitattiin tutkimuksessamme (Fig. 1
C
). Julkaistuista mekaaniset ominaisuudet 0,5% agaroosigeelissä [14], arvioimme, että sferoidi kuvassa. 1
käyttöön noin 28 mmHg kiinteiden stressiä välittömästi vieressä matriisin päivänä 30, on samanlainen kuin arvioitu arvo teoreettisesti Helmlinger et al. [12]. Sillä sferoidit kasvanut 1,0% geeliä, näytteenotto tilavuus kvantifiointiin mikro-helmi tiheys oli liian pieni, koska useimmat pallosia ei kasva yli 50 um.
(
) kasvava pallonen (vihreä) ja sitä ympäröivä mikro-helmiä (punainen). Asteikko bar = 100 pm. (
B
) kvantifiointi suhteellinen mikro-helmi tiheys (
ρ
helmi) 10-um kuoret agaroosigeelistä ympärille kasvava sferoidi esitetty
funktiona etäisyyden kuoren pallomainen keskustasta (
dist
). (
C
) välinen korrelaatio sferoidiviljelmiä halkaisija (
D
sphd
) ja muodonmuutoksen ensimmäisen 10-um kuori agaroosigeelistä (
ε
geeli, 1) noin pallosia.
R
on lineaarinen regressio kerroin; kulmakerroin regressiosuoran on huomattavasti suurempi kuin nolla (
p
0,0001).
Kasvain sferoidiviljelmiä muoto korreloi voimakkaasti muoto paikallisten kiinteiden jännitystilan
läheisyydessä joidenkin pallosia, geeli ei ole alle jännityksen tuottamaa pallomainen kasvua. Tämä johti mikro-asteikko tasomainen halkeamia geelin (Fig. 2
, nuolenpäät). Vaikka pallojen valittu analysoitavaksi kuvassa. 1 ei oleskella niin halkeamia ja olivat kaikki lähes pallomainen, pallosia, että oli olemassa sisällä halkeamia hyväksyi litistynyt muotoja (eli litistetty aloilla, Fig. 2
; katso myös Movie S1 3d). Kvantifiointi mikro-helmi tiheys noin tyypillisen pallomaisen ja litistynyt pallosia paljasti vahvan korrelaation pallomainen muoto ja muoto paikallisen mekaanisen jännitystilan (Fig. 2
B, 2C
). Tämä varmistettiin edelleen tulosten samanlainen analyysi z25 pallosia eri muotoja (kuviot. 2
D
). Helmlinger et ai. havaittiin samanlainen ilmiö kasvattamalla rakeita 1 mm kapillaari lasiputki: pallojen pitkänomainen pitkin putken akselia, oletettavasti vastauksena paikallisen jännitystilan [12].
(
) Agaroosigeeli- voi epäonnistua jännityksessä kasvamasta kasvain palloset (vihreä). Punainen arrowheads osoittavat reuna tasomaisen halkeamia agaroosigeelissä (BF: kirkas-kentän kuva otettu Nomarski tilassa). Mittakaava = 50 pm. (
B
) Pallot (vihreä) eri muotoisia ja niitä ympäröivän stressi kentät näkyviksi mikro-helmiä (punainen). Asteikko bar = 150 pm. (
C
) suhde paikallisten kannan agaroosigeelissä (
ε
geeli, 1, paikallinen) ja paikalliset sferoidiviljelmiä muodonmuutos (
λ
sphd, paikallinen) varten palloset (vihreä, upotus) esitetään
.
dist
seg on etäisyys pallomaisten segmenttien sferoidiviljelmiä keskustasta normalisoitu pituudelta pääakselin. (
D
) Korrelaatio epäsymmetria sferoidi muotoon ja vastaavaan kannan ympäröivissä agaroosigeelissä, joka osoittaa, että steroideja enemmän epämuodostuneita suuntaisina korkeampi stressiä. Kukin mittauspiste on yksi pallomainen.
R
on lineaarinen regressio kerroin; kulmakerroin regressiosuoran on huomattavasti suurempi kuin nolla (
p
0,0001). Menetelmät kuva-analyysin
C
ja
D
kuvataan täydentävillä menetelmillä S1, täydennyskuvio. S2, Elokuva S2 ja elokuva S3.
korkea kiinteä stressi tukahduttaa solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoottista solukuolemaa kasvaimen pallosia
Tutkitaan mahdollisia ilmiasumuutokset että kiinteitä stressi indusoi syöpäsoluissa, arvioimme soluproliferaatiota ja apoptoosin palloset. Solunjakautumisen kohteen alueiden korkeamman jännityksen (ts suunnassa pienempi akseli on litistynyt pallosia) väheni verrattuna alueisiin alemman jännityksen (Fig. 3). Voit tarkistaa, kuinka puristusjännitys vaikuttaa solujen elinkykyä, tutkimme apoptoosin ja nekroosin elävien sferoideja viljeltiin 0,5% (Fig. 4) tai 1,0% agaroosigeeleillä (täydennyskuvio. S3). Vuonna 0,5% geeliä, apoptoosin ja nekroosin esiin, kun pallosia oli vain -50 pm halkaisijaltaan (Fig. 4
, päivä 12) ja jatkoi kasvuaan, tulee laaja päivällä 28. Tämän jälkeen apoptoottinen alueet vähitellen korvattiin kuolion asti, päivällä 45, kuolion oli melkein saavuttanut pinnan pallomainen. 1,0% agaroosigeelillä, Rakeiden ei kyennyt kasvamaan suuremmaksi kuin -30 pm halkaisijaltaan ja apoptoosin ja nekroosia havaittiin jopa nämä pienet palloset (täydennyskuvio. S3). Nämä havainnot elävien sferoidit vahvistettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä kiinteiden näytteiden (Fig. 4
B
). Lisäksi oli vahva korrelaatio paikallisen osa solukuolemaa pallosia ja paikallinen rasitusta agaroosigeelissä (Fig. 5).
Arrowheads osoittavat alueet, joissa on enemmän solujen lisääntymistä. Asteikko bar = 50 pm.
(
) kehittäminen apoptoosin (vihreä) ja toissijainen kuolio (punainen) kasvavilla sferoidin upotettu 0,5% agaroosigeelissä. Asteikko bar = 100 pm. (
B
) immunohistokemiallinen värjäys (TUNEL ja hematoksyliinillä) vahvistaen tulokset
. Kuva alemmassa paneelissa esitetään yksityiskohtaisesti alueen sisällä katkoviiva kuvan ylemmässä paneelissa. Asteikko bar = 50 pm.
(
) Elävät sferoidit (vihreä) eri muotoja, sisäisiä solukuolemaa (punainen), ja niitä ympäröivän stressi kentät näkyväksi mikro- helmet (harmaa). Vihreä viiva oikeassa sarakkeessa esitetään reunan pallosia. Asteikko bar = 100 pm. (
B
) suhde paikallisten kannan agaroosigeelissä (
ε
geeli, 1, paikallinen) ja paikalliset nekroottinen jae pallosia (
δ
sphd, paikallinen) kahden sferoidit esitetty
. (
C
) Korrelaatio epäsymmetria pallomainen nekroottisen murto ja vastaavassa kannan ympäröivissä agaroosigeelissä, osoittaa, että on olemassa enemmän solukuolemaa suuntaisina korkeamman puristusjännityksen. Kukin mittauspiste on yksi pallomainen.
R
on lineaarinen regressio kerroin; kulmakerroin regressiosuoran on huomattavasti suurempi kuin nolla (
p
0,0001). Menetelmät kuva-analyysin
B
ja
C
kuvataan täydentävillä menetelmillä, täydennyskuvio. S2, Elokuva S3 ja elokuva S4.
Jos haluat varmistaa, että rajoitukset ravinteiden, kasvutekijöiden tai happi eivät olleet vastuussa apoptoottista solukuolemaa kuvassa. 4, arvioimme apoptoosin pallosia kasvanut samankokoiset vapaassa jousitus (roikkuu pisaroita). Vapaan suspension viljelmät ollut ulkoista rajoitus- matriisi ja pikku apoptoosin (Fig. 6
, Ehto 1). Voit tarkistaa, onko solu-agaroosia vuorovaikutuksia osaltaan solukuoleman, siirsimme vapaa jousitus pallosia osaksi 0,5% agaroosigeeleillä jossa ne annettiin sopeutua 3 päivää. Toisin kuin pallosia kasvanut yksittäisistä soluista agaroosigeelissä (Fig. 6
, kunto 3), siirrettyyn sferoidit ei ehdi kertyä merkittäviä määriä kiinteitä stressiä, ja heillä oli paljon vähemmän solukuolemaa ( Fig. 6
, Ehto 2). Näin ollen on epätodennäköistä, että geeli myrkyllisyys tai rajoituksia ravinteiden, kasvutekijöiden tai hapen olivat vastuussa apoptoosin havaittu korosti pallosia.
(
) kaspaasi-3-aktiivisuus (vihreä) kasvaimen sferoidia (punainen) viljeltiin vapaa jousitus (Ehto 1), siirretään 0,5% agaroosigeelissä 3 päivää saavutettuaan tasanne-vaihe vapaassa jousitus (Ehto 2), ja viljellyt yksittäisistä soluista 0,5% agaroosigeelissä (kunto 3 ). Asteikko bar = 100 pm. (
B
) kvantifiointi osa apoptoottisten solujen kasvain pallosia viljelty 3 olosuhteissa
.
Ulkoisesti sovellettu puristus jäljittelee kasvua aiheuttamaa stressi
Jos puristusjännitys aiheuttaa apoptoottista solukuolemaa kasvain palloset, sillä pitäisi olla väliä, onko kasvu aiheuttama tai ulkoisesti sovellettu. Siksi määrällisesti vaikutusta kiinteiden stressiä apoptoosia valvotuissa olosuhteissa, meidän ensimmäinen pakattu yksikerroksiset syöpäsolujen 17 tuntia paineilla välillä 0 mmHg 60 mmHg (katso kokeellinen setup täydennyskuvio. S1
B
) ja havaitaan lisääntynyttä apoptoosia lisääntynyt stressi taso (Fig. 7
). Sitten siirretään pallosia noin 300 um halkaisijaltaan free suspension 1% agaroosigeelillä ja viljellään niitä kolmen olosuhteissa: normaali väliaine ilman ulkoista pakkausta, nälkiinnityskasvatusaine (ei glukoosia, ei seerumia ja 1% happea) ilman pakkausta tai normaali väliaine ulkoisten puristus (katso kokeellinen setup täydennyskuvio. S1
C
). Kaspaasi-3-aktiivisuus arvioitiin 1 h, 3 h, 5 h ja 7 h (Fig. 7
B, 7C
, suhteellisen lyhyet puristus kertaa valittiin minimoimaan mahdollisten komplikaatio ravinteiden /kasvutekijä /happi rajoituksia 3D kulttuuri). Puristus kasvanut dramaattisesti kaspaasi-3: n aktiivisuuden, joka tasaantui jälkeen 5 tuntia. Sferoidit jotka nälkään mutta un-korosti oli paljon vähemmän apoptoosin kuin puristetun näytteissä, jälleen osoittaa, että rajoitukset glukoosin, seerumin ja happi eivät yksinään selittää tasot solukuoleman osoitettu kuvassa. 4.
(
) kaspaasi-3: n aktiivisuuden nousu yksikerrosviljelmiin syöpäsolujen vastauksena korkeampia ulkoisiin stressiä. Solut puristettiin 17 tuntia. (
B
) kaspaasi-3-vaikutuksen pallosia tehty kahdesta eri syöpäsolulinjasta vastauksena eri ulkoisiin stressi (0 mmHg tai 15 mmHg) ja ravinteiden olosuhteissa (Normaali: normaali tiedotusväline nälkään: no glukoosia, no seerumia ja 1% happea). (
C
) Tyypillinen kaspaasi-3: n aktiivisuuden (vihreä) in sferoidit (punainen) viljeltiin 3 olosuhteita
B
. Asteikko bar = 100 um. (
D
) Bcl-2 yli-ilmentyminen estää stressin aiheuttama apoptoosin, mutta crmA transduktio ei. Sferoidit pakattuja 15 mmHg 7 tunnin aikana, jolle toimitetaan normaali keski.
Mitokondrio koulutusjakson säätelee mekaanista stressistä johtuvaa apoptoosia kasvainsoluissa pallosia
Lopuksi tutkimme mitkä kaksi suurta apoptoottisten reittien [15] säännellään kiinteän stressin aiheuttama apoptoosin. Olemme transdusoidut syöpäsolut yli-ilmentävät crmA, joka estää initiaattori kaspaasit, kuten kaspaasi-1 ja kaspaasi-8 kuolemaan-reseptorin reaktiotien [16], tai Bcl-2, tunnettu estäjä useiden kaspaasien mitokondrion reitin [17]. Free suspension sferoideja villityypin tai transdusoidut solut kasvatetaan -300 um, siirrettiin 1%: agrose geeliä ja puristetaan edellä kuvatulla tavalla. Kuva. 7
D
osoittaa, että Bcl-2: n yliekspressio vähentää merkittävästi puristus-indusoituvaa solukuolemaa palloset, kun crmA yli-ilmentyminen on vain vähäinen vaikutus. Samoin, yliekspressio crmA on erittäin metastaattinen hiiren rinsyöpäsolulinja EMT6, jolla on korkea endogeenisen Bcl-2: n ilmentymisen [18], ei ole vielä suojata puristus-indusoidun kaspaasi-3: n aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että mitokondrioiden polku säätelee solid stressin aiheuttama apoptoosin.
keskustelu
Tässä tutkimuksessa käsiteltiin useita jäljellä oleviin kysymyksiin, jotka koskevat vaikutusta puristusjännityksen kasvudynamiikkaa kiinteiden kasvainten. Vaikka empiirinen matemaattisia malleja, kuten tunnettua Gompertzian kasvukäyrä [19] ja uudempi ”universaali kasvun laki” [20] – [22] voidaan ennustaa laajentumisen monien kiinteiden kasvainten hyvällä tarkkuudella, ne eivät yksiselitteisesti harkita solu dynamiikka sisällä kasvaimia. Erityisesti muuttumaton syntyminen tasannevaiheen jälkeen kasvaimet ovat saavuttaneet tietyn koon ei ole koskaan selitetty tyydyttävästi. Kuten useimpien kiinteiden kasvainten suurempi kuin 1 mm halkaisijaltaan indusoivat angiogeneesiä [3], ravintoaineen tai hapen ehtymisestä pitäisi rajoittaa kasvaimen kasvua. Tutkimuksemme osoittaa, että kasvu aiheuttama kiinteä stressi voi vaikuttaa solujen fenotyyppi, ja ehdottaa, että siellä voi olla ”dynaaminen tasapaino” leviämisen ja apoptoosin, joka ylläpitää kasvaimen kokoa tasannevaiheen ehdottama Holmgren et al [23].
apoptoottisen solukuoleman aiheuttama tällainen stressi on erityisen kiinnostava. Apoptosis aikana kehitys on yleisesti ajatellaan laukaista kasvutekijöitä ja muita ympäristön ärsykkeille [24], [25], ja rooli mekaanisen rasituksen tässä prosessissa on vasta äskettäin otettu huomioon [26], [27]. Tuloksemme viittaavat siihen, että epähomogeenisuuksia mekaaniset ominaisuudet rajoituskerroksen kudos voi ohjata morfologisia muutoksia kasvaimen kasvua, riippumaton solumigraation, indusoimalla apoptoosin alueilla korkean puristuspaineen ja mahdollistaa leviämisen alueilla pieni stressi. Lisäksi puristus aiheuttama apoptoosin kautta tapahtuvaa mitokondrion koulutusjakson sääntely valvontamekanismi että syöpäsolut, joilla on kohonnut Bcl-2 aktiivisuus saattaa paeta tuottaa enemmän pahanlaatuisia kasvaimia.
Materiaalit ja menetelmät
Cell kulttuuri
Ei-metastaattinen hiiren rintasyöpä solut 67NR saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja niitä käytettiin useimmissa kokeissa tässä tutkimuksessa. Metastaattinen jyrsijän rintasyöpä solut EMT6 olivat lähes täynnä tarjota tohtori James Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM). 67NR soluja pidettiin korkean glukoosin (4,5 mg /ml) Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, Sigma, St. Louis, MO), jota oli täydennetty 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS). EMT6-soluja pidettiin alfa-minimal essential medium (Mediatech, Manassas, VA), johon oli lisätty 10% FBS: ää. Kokeille vaativat glukoosi-vapaa, seerumitonta ja hapenpuuteympäristössä (merkitään ”nälkään medium”), sferoidit viljeltiin glukoosi-DMEM (Invitrogen) ei täydennetty FBS ja 5% CO
2-1% O
2-N
2 biolääketieteen ilmaa (Airgas East, Salem, NH).
Anti-apoptoottista transduktion Bcl-2 ja crmA
miljoona syöpäsoluja ympättiin osaksi 10 cm halkaisijaltaan petrimaljaan ja transfektoidaan kautta lisäämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ja plasmidi-DNA, joka sisältää täyspitkän hiiren Bcl-2 (ATCC) tai sytokiinin vasteen modifioija A (crmA, antelias lahja tri Brian Seed Massachusetts General Hospital, Boston, MA), cDNA: n ja puromysiinin selektiomarkkeri. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut siirrostettiin ja valinta-alustassa, joka sisälsi 20,0 ug /ml lisättiin puromysiiniä. 7-10 päivän viljelyn tässä alustassa, vain muutamia pesäkkeitä jäi; nämä yhdistettiin yhteen ja lisättiin läsnäollessa valinta tason puromysiini. Bcl-2 ja crmA transfektoiduista soluista määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (Bcl-2) tai PCR (crmA) ja sopivia alukkeita. Kun stabiili transfektoitu solulinja perustettiin, soluja pidettiin läsnä valinnan tason puromysiini.
PCR-määrityksissä
Quantitative real-time PCR (ABI Prism 7300, Applied Biosystems, Foster city, CA) käytettiin määrittämään mRNA-tasolla ja Bcl-2-geenin transfektoitiin syöpäsoluja. Lämpötilasyklit olosuhteet koostuivat 35 sykliä PCR-monistusta (denaturaatio: 95 ° C 30 s, pariutuminen /pidennys: 68 ° C, 1 min). MRNA taso crmA geeni arvioitiin käyttämällä tavanomaista PCR. Seuraavia sense- ja antisense-alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer2 ohjelmistoa (Applied Biosystems): Bcl-2: 5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTATATG ja CTGAGCAGGGTCTTCAGAGACA-3 ’; crmA: 5’-AAGCTTATGGATATCTTCAG ja GCCTGCCGCTTAATTAGTTGT-3 ’; ja GAPDH: 5’-ACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG ja GGCCTTGACTGTGCCGTTGAATTT-3 ’.
Culture kasvaimen pallosia yhteistyössä upotettu mikro-helmiä agaroosigeeleillä
Seurata sferoidiviljelmiä kasvun ja stressi kertyminen, sopivat määrät GFP- tai RFP-leimatun yhden syöpäsoluja, 1 pm (läpimitta) karboksylaatti-modifioitu fluoresoivia helmiä (Molecular Probes, Eugene, OR), 2,0% (paino /tilavuus) agaroosigeelissä (tyyppi VII, alhainen lämpötilassa hyy-, Sigma, St. Louis , MO) kantaliuosta (1 x PBS) ja solujen viljelyalustassa sekoitettiin siten, että lopullinen pitoisuus on solujen, mikro-helmiä ja agaroosi oli 3,5 x 10
3 solua /ml, 4,5 x 10
5 helmiä /ml ja 0,5% tai 1,0%, vastaavasti. Pohjassa 10 mm x 2 mm (halkaisija x syvyys) lieriön hyvin 5 mm paksu lasi dia (mittatilaustyönä) ensin päällystettiin 50 ui 1,0% soluttoman agaroosigeelillä estää solujen kiinnittymistä. 300 ui solu /mikro-helmiä /agaroosi seokseen lisättiin sitten hyvin ja annettiin polymeroitua 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lasi Sitten levy laitettiin 100 mm x 25 mm petrimaljaan täynnä 40 ml soluviljelyelatusainetta (katso kokeellinen setup täydennyskuvio. S1
). Väliaine täydennettiin 5 päivän välein.
Imaging ja kvantifiointiin matriisin puristus noin kasvava pallosia
mitataan tilavuus kasvaa pallosia ja 3D-jakelun niitä ympäröivien mikro-helmiä joka 5-7 päivää käyttäen Olympus FlouView 500 -konfokaalimikroskoopilla järjestelmä (Olympus, Center Valley, PA). Kunakin ajankohtana, jonka tilavuus oli 638 um x 638 um x 250 um kuvattiin niin, että päiväntasaajan ja sferoidi on keskitetty tilavuus alapinnan; askeleen koko Z oli 1 um. Kolme ohjaus kuvapinot mikro-helmiä olivat sitten hankittu käyttämällä samaa menettelyä, mutta lähellä sferoidiviljelmiä-vapaita alueita vähintään 500 mikrometriä kaukana kaikista sferoidiviljelmiä (niin, että helmi tiheys ei vaikuttanut kasvun aiheuttama puristus). Voit selvittää paikallisen mikro-helmi tiheys funktiona etäisyyden sferoidi, Matlab (Mathworks, Natick, MA) rutiini laskettu pienin etäisyys kustakin mikro-helmi on pallomainen pinta ja myöhemmin suhteellinen tiheys mikro- helmet 10 pm paksu ”kuoret” ympärille pallomainen (
ρ
helmet, normalisoitu mikro-helmi tiheys kontrolliryhmässä kuvapinot). Kanta Agaroosigeelielektrofo- näissä kuoret lasketaan sitten
ε
geeli = 1-1 /
ρ
helmiä. Tämä menettely säilynyt vaikutusta mikroskooppisen vaihtelu sferoidiviljelmiä pinnan muodon matriisi muodonmuutos.
Culture kasvaimen rakeita roikkuu pisaroita
Jos haluat luoda kasvain pallosia varten ulkoisesti sovellettu puristus kokeissa käytimme roikkuu pisaran menetelmää. Lyhyesti, 20 ui pisaroita syövän solususpensiota (3,0 x 10
5 solua /ml 67NR ja 2,0 x 10
5 solua /ml EMT6) lisättiin sisäpuolelle 10 cm halkaisijaltaan petrimaljan kansi . Asettamisen jälkeen kansi takaisin astiaan 10 ml kasvatusliuosta, astia pantiin inkubaattoriin (5% CO
2, 37 ° C), jotta sferoidiviljelmiä kasvua kussakin pisaran. Sferoidit saavutetaan yleensä noin 300 um, kun 3 päivää viljelyn.
Compression yksikerroksia syöpäsolujen ja kasvaimen pallosia
puristus yksisolukerrokset syövän, solut ympättiin kalvon 6-hyvin siirtokuoppaan lisätä 0,4 um huokosia (Corning, Lowell, MA). 1,5 ml: n ja 2,5 ml: lla soluviljelyalustaa lisättiin ylemmän ja alemman kammiot hyvin, vastaavasti. Yön yli inkuboinnin jälkeen (solun tarttumisen kalvon), kerros 2 mm paksun 1% agaroosigeelillä päälle pantiin solujen ja mäntien haluttu paino sitten levitettiin agaroosigeelillä pakkaus (katso kokeellinen setup Täydentävä kuva S1
B
). Puristusvaiheen aikana, huokosten transwell lisätä kalvon annettiin konvektion nesteen ulos geelistä ja myös ravinteiden diffuusiosta, kasvutekijöiden ja happea pallosia. Puristus kasvaimen pallosia, palloset kasvanut roikkuu pisaroita kerättiin ja suspendoitiin uudelleen 1,0%: isessa liuoksessa. 1 ml liuosta lisättiin sitten osaksi 6-kuoppaisille transwell-insertin 0,4 um huokosia sen kalvon, jolloin geelin paksuus ~ 2 mm. Rakeiden-agaroosi seoksen annettiin geeliytyä 20 minuutin ajan huoneenlämmössä, jonka jälkeen 1,5 ml ja 2,5 ml soluviljelyalustaa lisättiin ylemmän ja alemman kammiot hyvin, vastaavasti. Rakeiden-geeli konstruktia sitten puristettiin mäntä haluttu paino (katso kokeellinen setup täydennyskuvio. S1
C
).
Värjäys ja kuvantaminen leviämisen, kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja kuolion kasvaimen sferoidia
Lisääntyvät solut sferoidit tunnistettiin Cell Proliferation Fluoresenssi Kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, sferoidit leimattiin BrdU-leimausreagenssia, kiinteä (1% formaliinia, 0,1% Triton PBS: ssä), inkuboitiin anti-BrdU /nukleaasi reagenssia ja inkuboitiin lopuksi Cy5 leimatun vuohen anti-hiiri-IgG. Kaspaasi-3-aktiivisuus ja kuolion syöpäsoluissa tai sferoidit ei havaittu Nucview 488 kaspaasi-3 Assay Kit elävien solujen (Biotium, Hayward, CA) ja propidiumjodidilla (PI, Molecular Probes, Eugene, OR), tässä järjestyksessä. Yksikerroksiset solut värjättiin 15 minuutin ajan ja pallomainen-geeli konstruktit värjättiin 45 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja huuhdeltiin kahdesti tuoreella elatusaineella. Leimatut solut kuvattiin käyttäen Olympus FlouView 500 konfokaalimikroskoopilla järjestelmä (Olympus, Center Valley, PA). Tulokset määrällisesti prosenttiosuutena kaspaasi-3 /PI-positiivisia soluja väestössä.
immunohistokemiallinen määrityksiä apoptoottinen kasvainten pallosia
Pallot fiksoitiin 4% paraformaldehydi 4 tuntia ja sitten upotettiin parafiiniin. 5 um: n leikkeitä leikattiin parafiiniblokit ja syövän solut värjättiin apoptoosin ApopTag® (Chemicon International, Temecula, CA). Solut counter-värjättiin hematoksyliinillä.
Tilastot
Arvot leimasi aritmeettinen keskiarvo ja keskivirhe keskiarvon (SEM). Merkittävät erot eri populaatioissa tietojen testattiin Student
t
-testi parittomalle havaintoja.
tukeminen Information
Täydentävä Methods S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s001
(0,05 MB DOC) B Kuva S1.
Experimental asetelmia. (A) viljellään kasvain pallosia yhteistyössä upotettu mikro-helmiä agaroosigeelissä. (B) hakeminen eksogeenisen, hyvin määritelty puristusjännitys on yksikerroksista syöpäsoluja. (C) hakeminen eksogeenisen, hyvin määritelty puristusjännitys kasvaimen pallosia kasvanut haluttuun kokoon roikkuu pisaroita.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s002
(14,63 MB TIF) B Kuva S2 .
analyysi 2D-kuvia. (A-G) Määritellään paikallisia muodonmuutoksia kasvaimen sferoidi (vihreä, GFP transduktio) ja vastaava paikallinen rasitusta agaroosigeelistä käyttämällä mikro-helmiä (punainen). (H-K) Määritellään paikallinen osa nekroottisen alueella (punainen, propidiumjodidivärjäys) on pallomainen (vihreä, GFP transduktio). (L) Korreloidaan epäsymmetriaa sferoidi muoto ja geelin rasitusta. (M) Korreloidaan epäsymmetriaa sferoidi kuolion ja geeli rasitusta.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s003
(5,25 MB TIF) B Kuva S3.
kehittäminen kaspaasi-3: n aktiivisuuden (vihreä, vasen sarake) ja kuolion (punainen, keskeinen pylväs) kasvavilla kasvain pallosia (lähettämää kuvaa päällekkäin kaspaasin 3 ja kuolion kuvia, oikea palsta) 1% agaroosia. Asteikko bar = 20 pm.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s004
(7,48 MB TIF) -iin Movie S1.
3d litistynyt kasvaimen sferoidiviljelmiä viljeltiin 0,5% agaroosigeelissä.
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s005
(3,13 MB MOV) B Elokuva S2.
Kuva-analyysi määrällisesti paikallisen kasvaimen sferoidiviljelmiä muodonmuutos
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s006
(0,45 MB MOV) B Elokuva S3.
Kuva-analyysi määrällisesti paikallisia rasitukselle agaroosigeelissä aiheuttamasta kasvaimen sferoidiviljelmiä kasvua.
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s007
(0,56 MB MOV) B Elokuva S4.
Kuva-analyysi määrällisesti paikallisia solukuolemaa kasvain sferoidiviljelmiä.
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s008
(0,31 MB MOV) B
Kiitokset
kiitos Drs. Patrick Au, Yves Boucher, Emmanuelle di Tomaso, Igor Garkavtsev, Shan Liao, Tim Padera, ja Lei Xu (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) ja edistää asiantuntemusta tässä tutkimuksessa, tohtori Brian Seed (Massachusetts General Hospital, Boston, MA ) varten crmA plasmidit ja tohtori James Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) varten EMT6 soluja.