Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) tyypillisesti on kyky välttää kemoterapiaa ja saattavat olla pääasiallinen lähde etäpesäkkeitä. CSCS ihmisen haiman duktaalikarsinooma (PDAC) on tunnistettu, mutta kumpikaan metastaattista potentiaalia eikä chemoresistance näiden solujen on arvioitu riittävästi. Olemme käsitelleet näitä kysymyksiä tarkastelemalla side-populaatio (SP) solut eristetään Pancin-1 ja BxPC3 riviä ihmisen PDAC solujen oncogenotypes joista eroavat. SP-soluja voidaan eristää yksikerroksiset Panc-1, mutta ainoastaan ​​pallosia ja BxPC3. Käyttämällä potilaalle tehdä ksenografteissa osaksi vakavasti immuunipuutteisilla NSG hiiri, huomasimme, että SP-solut eristettiin molemmissa solulinjoissa kasvaimia, jotka olivat hyvin metastaattinen, toisin kuin aiemmat kokemukset PDAC solulinjoilla. SP-soluja, jotka ovat peräisin sekä solulinjat ilmensivät ABCG2 kuljettaja, joka on todistettavasti vastuussa SP fenotyyppi. SP-soluissa johti kuin SP (NSP) solut

in vitro

ja

in vivo

, siirtymä, joka johtui ilmeisesti posttranslational estämällä ABCG2 kuljettajaan. Kaksikymmentäkaksi muuta riviä PDAC solujen ilmaisi myös ABCG2. Herkkyys PDAC SP solujen alkaloidi vinkristiini voitaisiin suuresti lisätä verapamiili, yleisesti estäjä kuljettajat. Sen sijaan, verapamiili ei ollut vaikutusta tappaminen PDAC solujen gemsitabiini, nykyinen ensilinjan hoitona PDAC. Olemme päätellä, että eristäminen SP solut voivat olla kätevä ja tehokas työkalu tutkittaessa PDAC CSCS; että CSCS voi olla pääasiallinen progenitorisolujen etäpesäkkeiden ihmisen PDAC; että ABCG2 kuljettaja on vastuussa SP fenotyyppi ihmisen PDAC soluissa, ja ne voivat olla läsnä lähde lääkeresistenssideterminantit in PDAC, mutta ei resistenssiä gemsitabiinin; ja että esto ABCG2 voisi tarjota hyödyllinen lisä terapeuttisessa hyökkäys CSCS on PDAC.

Citation: Bhagwandin VJ, Bishop JM, Wright WE, Shay JW (2016) metastaattista Mahdolliset ja Chemoresistance of Human Haiman syöpä Kantasolut. PLoS ONE 11 (2): e0148807. doi: 10,1371 /journal.pone.0148807

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 23 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 22 tammikuu 2016; Julkaistu: 09 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Bhagwandin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Osuvimmat tiedot ovat paperin. Microarray tietoja käytettiin päässä Gysin tutkimuksen, jonka kirjoittajat voivat ottaa yhteyttä [email protected].

Rahoitus: Tätä työtä tukivat: 1. National Aeronautics and Space Administration-Erikoistunut Center of Research: NNJ05HD36G (VJB, WEW, JWS) ja 2. National Institute of Health, Ruth L. Kirschstein National Research Service Award, Institutional Training Grant (T32) ja GW Hooper Research Foundation: CA09043 (VJB, JMB).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) riveissä joukossa kaikkein vaarallisin ihmisen syöpäsairauksia. Huolimatta aggressiivinen leikkaus ja käyttämään nykyaikaista neoadjuvant ja adjuvanttihoitoa, yleinen 5 vuoden pysyvyys on noin 10-26% riippuen vakavuudesta levittämistä (cancer.org ja cancer.net). Kemoterapeuttiset aineet, kuten gemsitabiini vähentää primäärikasvain taakka, mutta ei poistaa metastaattisen maksasairaus, suuret kuolinsyy PDAC. Syöpä kantasolujen hypoteesi ehdottaa, että pieni väestö kantasolujen kaltaisia ​​soluja on vastuussa jatkuva tuumorin kasvuun ja kestävyys kemoterapeuttisia [1]. Lisäksi on ehdotettu, että CSCS voi olla välittömästi lähde metastaattisen soluja, jotka luonnostaan ​​kestävät kemoterapiaa [1,2]. Useat ryhmät ovat eristäneet ja ominaista haiman CSCS käyttämällä yhdistelmiä solunpintamarkkereiden [joko CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ [3], tai CD133

+ /CXCR4

+ [4]], tai SP fraktioimalla [5-8]. CSCS ilmentävät CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ saatujen potilasnäytteistä tai CD133

+ /CXCR4

+ solulinjoista ovat osoittautuneet erittäin tuumorigeenisia NOD /SCID hiirillä [3,4]. Kuitenkin metastaattisen potentiaalin kasvainten johdettu CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ CSCS ei ole raportoitu, ja kasvaimet esiin kanssa CD133

+ /CXCR4

+ CSCS olivat vain heikosti metastaattinen [4]. Vaihtoehtoisesti menettely SP fraktiointi on käytetty rikastamiseksi haiman CSCS, mutta kasvaimet aloitetaan näiden CSCS myös etäpesäkkeitä huonosti [5,6]. Olemme käyttäneet potilaalle tehdä injektio vakavasti immuunivajaisiin hiiriin parantaa arviointia SP peräisin olevien solujen PDAC solulinjoista. Tuloksemme viittaavat siihen, että CSCS sisältyvät PDAC SP jakeet voivat olla esiasteita etäpesäkkeiden, ja osoittaa, että kuljettaja ABCG2 on laajalle levinnyt, jos ei esiinny kaikkialla lähde mahdollisten lääkeresistenssin PDAC, mutta ei vastaa vastustuskykyä ensilinjan terapeuttinen gemsitabiinia. SP peräisin olevia soluja ihmisen PDAC solulinjoista ovat kätevä keino, jolla voidaan tutkia tuumorigeneesiprosessin etäpesäkkeiden ja lääkeresistenssi.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Haiman syövän solulinjat saatiin ATCC: stä (Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin DMEM Panc-1-soluissa, tai RPMI varten BxPC3 soluja oli täydennetty 10% FBS: ää. BxPC3 solulinja oli myös kasvanut palloset, käyttäen päällystämätöntä bakteeri- petrimaljoille (ei TC) ja seerumivapaata DMEM: ää, johon oli lisätty B27 (Invitrogen), joka on patentoitu reagenssi, jonka tiedetään kasvun edistämiseksi CD133

+ /CXCR4

+ CSCS [9]. Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooman solulinjassa H295 kasvatettiin DMEM insuliinia, transferriiniä ja seleeni (ITS), ja 10% FBS.

In vitro

farmakologian

annos vaste tutkimuksissa gemsitabiinin, 1500 SP soluja Pancin-1 tai 10000 SP soluja BxPC3 maljattiin 96-kuopan astioihin ja käsiteltiin 24 tunnin kuluttua kaksi kertaa sarjalaimennoksia gemsitabiinin kanssa tai ilman 20 uM verapamiilia. Sillä vinkristiini tutkimukset, Panc-1, BxPC3 tai H295 SP-soluja maljattiin 96-kuoppalevyille. Kukin solulinja käsiteltiin kaksinkertaisia ​​sarjalaimennoksia vinkristiinin kanssa tai ilman 50 uM verapamiilia. Viikon kuluttua solut värjättiin käyttäen MTT-määritystä. Kussakin kokeessa BxPC3 soluja kasvatettiin sferoideina ei-TC 96-kuopan astioihin seerumittomassa DMEM: B27.

MTT-määritys

MTT-määritystä käytettiin määrittämään aste chemoresistance SP ja NSP soluja. Median lääkkeellä käsiteltyjen solujen korvattiin 100 ui MTT: alustan (5 ug /ml) laimennettuna määrityksessä media (fenoli-DMEM:, 25 mM HEPES, 1 mM Na-pyruvaattia) ja laitettiin kudosviljelyinkubaattorissa 4 tuntia. Substraatti korvattiin 100 ui liukenemisen liuosta (10% Triton X-100, 0,1 N HCl: lla, 80% isopropanolia) ja ravisteltiin varovasti 5 minuuttia. Levyt luettiin Tecan2 levynlukijalla havaitseminen 570 nm, ja viitenumero 690 nm.

immunovärjäys ABC kuljettajat

Panc-1, BxPC3 tai H295-solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa PBS: llä, kiinnitettiin 0,1% PFA: ssa 10 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 0,3% saponiinia FACS-puskurissa. Molemmat solutyypit värjättiin BXP-53 (ABCG2, Santa Cruz) tai G-1 (ABCB1 /MDR-1, Santa Cruz) vasta-aine laimennettiin 1: 100 FACS-puskurissa 30 minuuttia jäillä, pestiin kahdesti PBS: llä, värjättiin FITC 1: 1000 FACS-puskurissa 30 minuutin ajan jään päällä, pestiin PBS: llä, ja analysoitiin FACSAria. Immunohistokemia: 5 uM leikkeitä leikattiin parafiiniin kudoksista primaarikasvainten, parafiini poistettiin kanssa ksyleenit, sammutettua kautta lajitellut alkoholien PBS. Leikkeet altistettiin lämmön epitooppisup- haku, ja jäljellä Peroksidaasiaktiivisuuden sammutettiin PBS /3% vetyperoksidia sekoitetaan. Värjäys suoritettiin käyttäen Vectastain ABC eliitin Rabbit IgG Kit (cat # PK-6101, Vectorlabs) kanssa ABCG2 primaarisen vasta-aineen 1: 100 laimennus yön yli (kissa # GTX100436, Genetex) ja vastavärjättiin Meyerin hematoksyliinillä.

Side väestön määritys

SP-määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [7,10]. Lyhyesti, 1 x 10

6 solut värjättiin Hoechst 33342 (HOE), jonka lopullinen konsentraatio on 5 ug /ml ja verapamiili kontrollit esikäsitelty 100 uM verapamiilia 10 min. Kaikki näytteet inkuboitiin 37 ° C: ssa asteessa 60 minuuttia ajoittain sekoittaen 15 minuutin välein. Solut kerättiin ja suspendoitiin PBS: ään 3% BSA, 0,01% DNaasi I, ja 1 ug /ml propidiumjodidia ja suodatettiin 40 uM solusiivilän. BxPC3 sferoidit dissosoitiin normaali trypsinoimalla ennen HOE värjäystä. Immuno-inhibitiotesti: ennen HOE värjäystä, Panc-1, BxPC3 ja H295-soluja esikäsiteltiin 5 ug joko ABCG2 vasta-aineen, 5D3 (R ja BxPC3 solut, jotka sisältävät toiminnan menetys mutaation

Smad4

ja

CDKN2A

geenejä (jotka molemmat ovat suhteellisen harvinaisia ​​PDAC) [12]. SP jae määritettiin havaitsemalla poissulkeminen DNA: ta sitovaa väriaine Hoechst 33342 (HOE) soluista, maininta kuljettajan toimintaa [4,10]. Portti SP määritettiin verapamiili esto, laajasti aktiivinen kuljettaja antagonisti. 10% SP jae havaittiin Pancin-1-soluissa (kuvio 1A), mutta toisin kuin aiemman raportin [5], SP murto ei voitu havaita BxPC3 soluissa tuotettu tavanomainen alusta 2D yksikerroksia (kuvio 1A). SP jae aiemmin raportoitu BxPC3 soluissa ei testattu biologisessa määrityksessä, ja siksi voi olla kysymys virtaussytometrialla instrumentin tyyppi, laitteen asetukset tai värjäystä menetelmällä. Pyrkiessään paljastaa CSCS että BxPC3 solulinjassa, fraktioimatonta soluja kasvatettiin kuten palloset olosuhteissa joiden tavoitteena on edistää selviytymistä ja lisääntymistä normaalien kantasolujen (katso materiaalit ja menetelmät). Tämä tuotti SP osa 5% kulttuureihin BxPC3 pallosia (kuvio 1 B). Sen sijaan, Panc-1-soluissa ei menesty, kun viljellään olosuhteissa käytetään BxPC3, eikä sitä voitu käyttää SP fraktiointiin. Kyky pallosia paljastaa SP fenotyyppi BxPC3 on yhdenmukainen aikaisempien raporttien kanssa, jotka CSCS ovat rikastuneet pallosia [13-15]. On huomattava, että kaksi PDAC solulinjaa on selvästi erilainen oncogenotypes, mikä voi selittää erot niiden SP sisällön ja vastaus erikoistunut keskipitkällä.

(A) Pancin-1 ja BxPC3 solut värjättiin Hoechst 33342 väriainetta (5 ug /ml) ja analysoitiin FACSAria virtaussytometria, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Portti SP-soluissa määritettiin käsittelemällä verapamiili (100gM). Osa solujen SP portti on esitetty kussakin paneelissa. Kavereita Pancin-1-soluissa, ylärivissä; ja BxPC3 solut, alarivissä; verapamiili ohjaus (VP), oikea paneelit. (B) Ylärivi: BxPC3 soluja kasvatettiin joko vakiona väliaineen kudosviljelymaljoille (TC), seerumittomassa DMEM B27 (SFDB) TC ruokia, tai rakeita SFDB päällystämättömän bakteriologisten (non-TC) petri tiskit. Alarivi: kvantifiointiin SP FACS lajittelemalla kunkin viljelyolosuhdetta, verapamiili ohjaus (VP), oikeassa reunassa paneeli.

Kasvain aloittamista potentiaali SP ja NSP solujen

Koska meillä tulkinta julkaistut tiedot [3,5,6,8], CSCS rikastettu selektoimalla solunpintamarkkereiden ovat oleellisesti tehokkaampia kuin SP CSCS kasvainten synnyssä määrityksissä. Kun pyritään parantamaan SP CSCS määrityksissä kasvaimien synnyn, käytimme potilaalle tehdä injektiona haimasta ja NSG hiiriä, joiden vaikea immuunipuutos tekee niistä poikkeuksellisen herkkä kasvaimien syntyyn mukaan ksenografteissa [16]. Me ortotooppisesti pistetään 500, 5000, tai 50000 SP tai NSP soluja fraktioitu lusiferaasi-merkitty Pancin-1 monolayers tai BxPC3 sferoideina. Lusiferaasi saamiseksi käytettiin kuvien injektoidaan hiiriin. Olemme havainneet, että 500 SP solut olivat riittäviä tuottamaan kasvaimia kahden viikon kuluessa koko kohortin Viiden hiiren, kun taas 500 NSP solujen teki niin vain yhdellä hiiren viidestä (kuvio 2A ja 2B). Kolme kuukautta, kuitenkin, kaikki eläimet olivat kehittäneet haiman kasvaimia (katso alla, kuvio 3A). Nämä tulokset ovat päättäneet parannus aikaisempaa kokemusta SP soluja, joissa vähintään 10000 solujen aloitettava kasvaimien syntyyn, joka oli havaittavissa sisällä 4-5 viikkoa [5,6]. Olemme päätellä, että protokolla on parantanut tehokkuutta tumorigeneesin mukaan CSCS sisältämien SP jae PDAC solulinjoista.

SP ja NSP-solut saatiin fraktioimalla käyttäen portit kuvassa 1. kasvain aloittamista potentiaalia SP ja NSP testattiin ortotooppisesti injektoimalla 500, 5000, tai 50000-solujen lusiferaasin-leimattujen solujen kunkin populaation, käyttäen kohortin viiden NSG hiirtä kutakin annosta soluja. Kahden viikon jälkeen, suhteellinen määrä kasvaimen havaittiin käyttäen reaaliaikaista

in vivo

bioluminesenssin kuvantamiseen. (A) Panc-1 yksikerrossoluissa (B) BxPC3 sferoidit soluja. (C) Histogrammi kasvaimen esiintymistiheys kutakin kohortin viidestä NSG hiiriä, Opiskelijan

t

testi =

P

0,002.

SP ja NSP soluja eristetty Pancin-1 monokerrokset ja BxPC3 pallosia, sitten ortotooppisesti injektoida 500 solueriä osaksi kohortin kolmen NSG hiirillä. Eläimiä pidettiin kolme kuukautta ja sitten tutkitaan ensisijaisesti ja etäpesäkkeitä. (A) vertailu primaarikasvainten ja etäpesäkkeitä syntyy SP, oikea sarake ja NSP soluja, vasen sarake eristetty Pancin-1 monokerrokset ja etäpesäkkeitä eristää BxPC3 pallosia. Ylempi rivi kuvaa ensisijaisen kasvaimia ja toisella rivillä havainnollistaa etäpesäkkeitä molemmille solulinjoissa. (B) Kasvaimen solut eristettiin primaariset ja metastaattiset kasvaimet ja analysoitiin SP sisällön. Primaarikasvaimen sivusto, top paneelit; metastaattinen päällä, pohja-paneelit. (C-D) SP ja NSP fraktiot eristettiin Pancin-1 ja BxPC3 soluihin ja maljattiin takaisin kulttuuriin, tavallisilla väline solujen Pancin-1 normaalein kudosviljelymaljoihin ja pallomainen väline BxPC3 solujen ei-TC ruokia. Viikon kuluttua ilman kulun, kukin päällystetty jae analysoitiin FACS. Prosenttiosuus solujen SP portti on esitetty kussakin paneelissa.

Metastaattinen potentiaali SP CSCS

Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että CSCS voi olla peräisin metastaattisen sairauden [17,18 ]. Kuitenkin aikaisemmat yritykset eivät saaneet voimakasta etäpesäkkeitä kanssa CSCS rikastaa käyttämällä joko solunpintamarkkereiden tai SP fraktiointi. Tämä oli totta solujen edustavat joko PDAC tai muun maligniteetin [3,4,19-24]. Kun pyritään lisäämään etäpesäkkeiden kasvaimia muodostettu SP soluista, me taas käytetään potilaalle tehdä injektio NSG hiiriin. Me eristetty SP ja NSP fraktioita Pancin-1 yksikerrossoluissa ja BxPC3 pallomainen soluja, sitten ruiskutetaan 500 näiden solujen osaksi haimoissa kolmen NSG hiirtä kussakin kohortissa. Kolmella kuukaudella, sekä SP ja NSP soluja kustakin solulinjasta oli tuottanut ensisijainen kasvaimia noin 1 cm kokoisia (kuvio 3A). Lisäksi oli vaikea metastaattisen maksasairauden hiiriin ruiskutettiin SP soluja, lähes vaatimattomasta normaali maksaparenkyymi (kuvio 3A, oikea paneeli). Eläimet, jotka olivat saaneet NSP solut sisälsivät myös maksan etäpesäkkeiden, mutta etäpesäkkeitä olivat molemmat vähän ja huomattavasti pienempiä (kuvio 3A, vasen paneeli). Voimme päätellä, että kasvaimia valmistettu SP-soluja, jotka ovat peräisin joko yksisolukerrokset tai sferoideina ovat aggressiivisesti metastaattinen.

Ensisijainen kasvaimia aloitetaan SP-soluja joko Panc-1 tai BxPC3 sisälsi SP osa suunnilleen samankokoisia kuin löytyy solulinjat (kuvio 3B). Lisäksi koko SP osa oli jopa pienempi etäpesäkkeitä (kuvio 3B), kanssa aikaisempien raporttien [8,25]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CSCS tai muiden komponenttien SP osa väestöstä poiki lukuisia NSP solujen aikana kasvaimen ja metastaasin. Lisänäyttöä tällaisen tapahtuman havaittiin, kun SP ja NSP solut fraktioitu Pancin-1 monokerrokset ja BxPC3 palloset, ja sitten viljeltiin

in vitro

ilman kulkua. Viikon kuluttua vain 2,5 kaksinkertaistunut, suuri enemmistö viljellyistä SP solut molemmista linjat nyt fraktioitiin kuten NSP soluja (kuvio 3C ja 3D), mikä näennäisestä jäljittelemään tapahtumista

in vivo

aikana tietenkin kasvaimen. Sen sijaan, viljellyt NSP soluja molemmat linjat sisälsivät vähäisten määrien SP-soluissa (kuvio 3C ja 3D). Tämä havainto saattaa merkitä joko jälkeäkään saastuminen NSP fraktion tai alhainen konversio NSP solujen SP fenotyypin. Säteilyn lähteestä riippumatta, kun läsnä on SP solujen NSP osa on potentiaalinen selitys kasvaimen käynnistämän NSP osa kuviossa 2A, näennäinen kyky NSP-solujen tuottamiseksi kasvainten viivästetyllä tavalla (kuvio 3A), ja etäpesäkkeitä joka tapahtui hiirillä, jotka saivat NSP soluja (kuvio 3A).

ABCG2 vastaa SP fenotyyppi PDAC solulinjoissa

ATP: n sitoutuminen kasetti (ABC) kuljettajat ovat tärkeä lähde huumeiden resistenssin ihmisen kasvaimissa [26,27]. Kaksi näistä kuljettajat, ABCG2 /BCRP ja ABCB1 /MDR-1, ilmoitetaan olevan pääasiallisia lähteitä SP fenotyypin ihmisen kasvainten solulinjoissa [19,20]. On raportoitu aikaisemmin, että PDAC solut ilmentävät ABCG2, mutta ei MDR-1 [5,6,28,29]. Kuitenkin ABCG2 toiminta on riippuvainen ekspressio solun pinnalla, mikä säätelee posttranslationaalinen modifikaatio ja eristämisen [30]. Siksi me värjättiin kahden kuljettajat pinnalla Panc-1 ja BxPC3 soluja. Kontrollina käytimme H295-soluja, lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma solut, jotka ilmentävät MDR-1 [31,32]. Huomasimme, että Panc-1 ja BxPC3 solut ilmensivät vain ABCG2 pinnallaan, kun taas H295 solut ilmensivät ainoastaan ​​MDR-1 (kuvio 4A). FACS-tulokset osoittavat, että koko väestön Panc-1 ja BxPC3 solut ilmensivät ABCG2 (kuvio 4A), ja saatu samanlaisia ​​tuloksia käyttämällä immunohistokemian tutkia primaaristen kasvainten tuotetaan SP ja NSP-solut ja ihmisen neljän PDAC potilaan näytteissä (kuvio 4B ja 4C).

(A) Cell pinta värjäys ABCG2 (5D3-vasta-aine) ja ABCB1 /MDR-1 (MRK-16-vasta-aine) on Pancin-1 yksikerrossoluissa, BxPC3 pallojakaantuminen solut ja H295-soluissa. (B) immunohistokemia värjäys ABCG2 SP ja NSP syntyy ensisijainen kasvaimia (positiivinen DAB tahra, ruskea). (C) immunohistokemia värjäys ABCG2 Ensisijaiseen PDAC kasvaimia neljästä potilaista (positiivinen DAB tahra, ruskea).

Kattavuus ABCG2 että solupopulaatioiden esiin epäsovinnainen mahdollisuuden, että kuljettaja ei ole vastuussa SP fenotyyppi. Tavoitteena testata tätä mahdollisuutta, käsittelimme solut estäviä vasta-aineita varten ABCG2 [33] ja MDR-1 [34] ennen suorittamista SP fraktiointi. Esto ABCG2 vähensi SP osa Panc-1-soluja ja BxPC3 pallosia 1,04% (9,5-kertainen lasku) ja 0,01% (400-kertainen pieneneminen), vastaavasti (kuvio 5). Sen sijaan, inhibitio MDR-1 ei ollut mitään vaikutusta SP sisällön kahden PDAC solulinjoissa, mutta vähensi SP jae H295-soluissa yli yhdeksän-kertaisesti (kuvio 5). Olemme päätellä, että ABCG2 kuljettaja on vastuussa SP fenotyyppi Pancin-1 ja BxPC3 soluja. Huolimatta siis paikasta riippumaton kuljettimen solussa populaatioiden, sen on toimittava vain rajallinen osa soluista että sellainen kuin SP. On raportoitu aiemmin, että aktiivisuus ABCG2 edellyttää translaation jälkeisistä valvontaa Akt [30], mikä saattaa selittää olemassaolon NSP soluja.

esto SP fenotyypin. Soluja käsiteltiin estäviä vasta-aineita varten ABCG2 (5D3) ja MDR-1 (MRK-16), ja sitten fraktioitiin FACS, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. H295, ylärivi; Pancin-1 yksikerroksista, keskirivin; ja BxPC3 pallosia, alarivissä. Pylväät 1-4 ovat otsikoitu kuviossa: käsittelemätön, verapamiili (VP), 5D3-vasta-aineen, ja MRK-16-vasta-ainetta.

Sen määrittämiseksi, kuinka laajaa ilmaus ABCG2 saattaa olla PDAC, saimme aiemmin julkaistu microarray tietoja 22 haimasyövän solulinjoissa [35] ja verrattiin ilmaus ABCG2 kuin MDR-1. Kolme normaalia haiman epiteelisolujen linjojen analysoitiin myös array tutkimuksessa ja käytettiin tässä normalisoimaan tasyöpäsolulinja tiedot. Silmiinpistävän, joka haimasyöpä solulinja ilmaistuna ABCG2 2-5-kertaisesti yli normaalin haiman epiteelisolujen linjat, kun taas yksikään solut ekspressoivat MDR-1 (kuvio 6). Voimme päätellä, että ilmentyminen ABCG2 voi olla läsnä ominaisuus PDAC solujen, ehkä edustaa atavismi normaalista varren kaltainen solu, joka synnyttää CSCS, ja siten, että kasvaimia.

Microarray-analyysi ABCG2 ja MDR -1 22 haimasyövän solulinjoissa [36]. Tukin

2 lauseke tiedot ABCG2 ja MDR-1 kolmesta hyvänlaatuisen ihmisen haimatiehyen epiteelisolujen solulinjoissa (hPDEC; # 904, # 916, # 515) laskettiin keskiarvo ja vähennettiin log

2 kustakin haimasyövän solulinja ja piirrettävä vesiputous ja Manhattan juoni, Opiskelijan

t

testi =

P

0,001.

Euroopan ABCG2 kuljettaja ei resistenssiä gemsitabiiniannokseen

gemsitabiini on yleensä ensilinjan hoitoon potilailla, joilla on PDAC, mutta synkkä eloonjäämisaste taudin heijastaa suhteellisen rajallinen vastaus huumetta. Vastus PDAC SP solujen gemsitabiinin syyksi on ulosvirtaus ABCG2 [5]. Jos tämä olisi oikea, niin esto kuljettajaa että laajasti aktiivinen verapamiilia tulisi lisätä herkkyyttä PDAC solujen gemsitabiiniannokseen [27]. Ensin varmisti kuljettajan välittämän resistenssin PDAC solulinjoissa käsittelemällä SP soluja Panc-1, BxPC3 ja H295 joko vinkristiinin tai yhdistelmä vinkristiinin ja verapamiili (kuvio 7A, 7C ja 7E ja taulukko 1). Verapamiili lisää suuresti tappaminen vinkristiinin SP solujen kaikista kolmesta riviä. Sen sijaan, verapamiili ei ollut vaikutusta tappaminen Pancin-1 ja BxPC3 SP-soluissa gemsitabiini (kuvio 7B, 7D ja 7E ja taulukko 1), mikä osoittaa, että läsnäolo ABCG2 tai MDR-1 ei resistenssin gemsitabiiniannokseen joko solulinjassa. Olemme päätellä, että kuljettaja tavallisesti asuu PDAC soluissa ei edistä rajoitukset gemsitabiinin terapeuttisena taudin.

annosvaste SP soluja (A) H295, (C) Pancin-1 yksikerroksisen solut, ja (E) BxPC3 pallomainen solujen vinkristiini (VCR) ja seos vinkristiinin verapamiilin (VCR-VP) määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Vastaavasti annos-vaste-SP-solujen (B) H295, (D) Panc-1 yksikerrossoluissa ja (E) BxPC3 pallomainen solujen gemsitabiini (Gem) ja yhdistelmä gemsitabiinin kanssa verapamiilin (Gem-VP) määritettiin käyttämällä MTT-analyysi. Kaikki datapisteet luotiin yhdestä kokeen ja edustavat keskiarvoa kuusi kuoppaa kohden hoito-pitoisuus, normalisoitu keskiarvo kuuden sisäisen käsittelemätön kontrolli kuoppiin, transformoitiin sitten luonnollinen logaritmi ja näytetään neljän parametrin muuttujan juoni funktiona log ( lääkettä) verrattuna vasteen. Virhepylväät edustavat keskivirhettä (SEM) yli kuuden kuoppiin yhdessä kokeessa, kaikki kuvaajat luotiin käyttäen Prism tilastollisen analyysin ohjelmisto, Opiskelijan

t

testi =

P

0,0002 .

keskustelu

SP solut PDAC

Perustettu riviä ihmisen syöpäsolut ovat pitkään käytetty kokeellinen korvikkeita otettujen näytteiden suoraan kasvaimista , sekä tutkimus tumorigeneesin ja seulomalla uusia terapeuttisia. Hyödyllisyys solulinjat peräisin ihmisen PDAC kuitenkin on vaarantunut epäonnistuminen kasvainten tuotettu tällaisia ​​soluja näyttää vankka etäpesäke, joka on niin tyypillistä kliinistä sairauden. Tässä osoitamme ratkaisun tähän ongelmaan. Kun ortotooppisesti ruiskutetaan vakavasti immunosuppressoiduilla NSG hiiriä, SP soluja PDAC solulinjoista synnytti kasvaimia, jotka olivat aggressiivisesti metastaattinen. Sen sijaan, NSP-solut olivat vähemmän tuumorigeeninen, ja tuloksena kasvaimet olivat huonosti metastaattinen. Koska SP jae rikastetaan CSCS nämä havainnot mukaisia, että CSCS voi olla pääasiallinen esisoluja etäpesäke [2,17,18]. Neoplastiset organoids johdettu sekä hiiren ja ihmisen PDAC myös aiheuttaa etäpesäkkeitä, kun oksastetut ortotooppisesti immuunipuolustus hiiriin [16]. Jää nähtäväksi, onko etäpesäkkeitä tässä järjestelmässä peräisin erottuva osajoukko solujen kasvaimia, ja jos on, ovatko ne ovat CSCS kasvain.

Tuoreessa raportissa on kuvattu erottaminen CSCS alkaen SP osa useiden kasvaintyypeille käyttämällä autofluoresenssia [15]. Sen sijaan, SP osa, että meillä on johdettu PDAC solulinjojen näytetään rikastetun kyky tuottaa erittäin etäpesäkkeitä, ominaisuuksia sopusoinnussa läsnä CSCS. Toteamme, että oli merkittävä ero siinä, miten kahden tutkimuksen valmistettu solujen FACS lajittelua. Muutoin emme voi selittää ristiriita kahden tuloksia.

Saadakseen SP jae BxPC3 solulinjasta, meidän piti levittää soluja olosuhteissa, jotka edistäneet kasvua pallosia. Voimme ajatella kaksi mahdollista selitystä tälle havainnolle. Ensinnäkin, SP solut voivat olla läsnä linjalla, mutta numerot liian matala tunnistamista varten SP fraktioimalla. Koska kasvuolosuhteet suunniteltiin suosia kantasolujen kaltaisia ​​soluja, ne voisivat tarjota valikoivaa etua selviytymiselle ja leviämistä SP soluja, mukaan lukien osan näistä soluista, jotka käyttäytyvät CSCS kasvainten synnyssä määrityksissä. On huomattava, että steroideja väitetty olevan luonnostaan ​​rikastaa CSCS [9,13,14]. Vaihtoehtoisesti, soluviljelyalustaan ​​voitaisiin edistää muuntaminen NSP SP-soluja, samanlainen muuntaminen ei-CSCS CSC aiemmin kuvattu ihmisen melanooma ja rintasyöpä [37,38]. Saimme vihjeen tällaisen muuntamisen läsnäolosta SP solujen viljelmissä NSP soluja, vaikka SP solut olisi saattanut aiheuttaa sen sijaan valikoivaa etua tarjotaan kontaminoiville SP solujen eteneminen

in vitro

. Riippumatta selitys käyttäytymistä BxPC3 soluja, tulokset viittaavat siihen, että viljely solujen pallosia voisi olla yleinen keino paljastaa SP fenotyypin kasvainsolulinjoissa, jotka muuten eivät näy, että fenotyyppi.

Aiemmat raportit ovat kuvattu kyky SP-solujen kutemaan NSP soluihin [21-25,39-41], jopa CSCS toimivat lähteenä kypsempiä soluja, jotka muodostavat suurimman osan kasvaimista. Sopusoinnussa näiden havaintojen oli runsaasti NSP solujen PDAC kasvaimissa aloittaman SP solujen meidän kokeita, ja viljelemällä SP solujen

in vitro

johti NSP soluissa nopeasti tulossa suurin osa väestöstä. Koska koko solujen populaatio sisältää ABCG2, mahdollinen selitys siirtymisestä NSP fenotyyppi on aiemmin kuvattu translaation jälkeisen estäminen kuljettajan aktiivisuuden Akt [30].

Euroopan ABCG2 kuljettaja välittäjän SP fenotyyppi ja chemoresistance

tunnistaneet ABCG2 kuljettaja välittäjäksi SP fenotyypin Pancin-1 ja BxPC3 soluja, ja löysi ilmentymä että kuljettaja kahdessakymmenessäkahdessa muuta PDAC solulinjat. Näennäinen Kattavuus ABCG2 vuonna PDAC soluissa viittaa siihen, että ilmaus kuljettimen saattaa olla paluuta evoluution esi samantyyppisiä normaali varteen tai kantasolujen joka synnyttää kantasolujen varten PDAC. On edelleen epäselvää, missä määrin ABCG2 vastaa tulenkestävä luonne PDAC. Toisaalta, havaitsimme, että ABCG2 ei pumpata gemsitabiini, lyijy huume hoidossa PDAC.