Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kondroitiinisulfaatti E (CS-E), joka on erittäin sulfatoidut glykosaminoglykaani, on tunnetusti kasvaimen invaasion ja metastaasin. Koska läsnä on CS-E havaitaan sekä kasvaimen ja strooman solut haiman adenokarsinooma (PDAC), monivaiheinen osallistuminen CS-E kehittämiseen PDAC on otettu huomioon. Kuitenkin sen osallistuminen alkuvaiheessa PDAC etenemisen ole vielä täysin ymmärretty. Tässä tutkimuksessa selventää suora rooli CS-E kasvaimen, mutta ei strooman solut ja PDAC, olemme keskittyneet hiilihydraatti sulfotransferaasien 15 (CHST15), erityinen entsyymi, joka biosynthesizes CS-E, ja tutkittiin vaikutukset CHST15 siRNA on kasvainsoluproliferaation

in vitro

ja kasvu

in vivo

. CHST15 mRNA ilmentyy voimakkaasti ihmisen haimasyövän solulinjoissa PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 ja Capan-2. CHST15 siRNA estivät merkittävästi ilmentymistä CHST15 mRNA näissä neljässä soluissa

in vitro

. Hiljentäminen CHST15 geenin soluissa liittyi merkittävästi vähentää lisääntymistä ja lisäävä säätely solusyklin estäjä liittyvä geeni p21

CIP1 /WAF1. Vuonna ihonalaisen ksenografti kasvain malli PANC-1 nude-hiirissä, yhden kasvaimeen injektion CHST15 siRNA lähes täysin tukahdutetaan kasvaimen kasvua. Alennettu CHST15 proteiini liittyvien signaalien tuumorinekroosi havaittiin hoidon CHST15 siRNA. Nämä tulokset saadaan näyttöä suorasta toiminnasta CHST15 proliferaatioon haimasyöpäkasvainsoluissa osittain p21

CIP1 /WAF1 reitin. Siten CHST15-CS-E-akseli-välitteistä kasvainsolun proliferaatiota voisi olla uusi terapeuttinen kohde varhaisessa vaiheessa PDAC etenemisen.

Citation: Takakura K, Shibazaki Y, Yoneyama H, Fujii M, Hashiguchi T, Ito Z, et al. (2015) soluproliferaation inhibointi ja kasvu Haimasyöpä mukaan vaiennettu Hiilihydraattien sulfotransferaasien 15

In vitro

ja ksenograftimallia. PLoS ONE 10 (12): e0142981. doi: 10,1371 /journal.pone.0142981

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 07 helmikuu 2015; Hyväksytty: 29 lokakuu 2015; Julkaistu: 7. joulukuuta 2015

Copyright: © 2015 Takakura et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tuki osittain Mitsui Life sosiaalihuoltolain Foundation myöntää numerolla N /A, SK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tämän lisäksi tarvittavat kulut maksetaan varoja meidän lääkärin toimistossa (Division of Gastroenterology ja Hepatology, sisätautien, The Jikei University School of Medicine). Stelic Institute Co., Inc. tuettiin muodossa palkkojen tekijöille (YS, HY, MF, TH), mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen . Erityinen roolit nämä kirjoittajat nivelletty ”kirjoittaja maksut” -osiossa.

Kilpailevat edut: Stelic Institute Co., Inc. tuettiin muodossa palkkojen tekijöille (YS, HY, MF, TH). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on lujasti perustettu yhtenä kaikkein vaarallisin kiinteitä ihmisen kasvaimia maailmanlaajuisesti [1]. PDAC liittyvää sairastuvuutta ja kuolleisuutta tapaukset ovat molemmat osoittaneet olevan kasvussa. Tutkiminen mekanismeista pahanlaatuinen ominaisuudet PDAC, kuten myöhäinen diagnosointi, aggressiivinen hyökkäys nopea levittäminen ja Chemo-vastus, tarvitaan kiireesti luomaan tehokasta hoitoa ja parantaa ennustetta. Kasvaimen eteneminen edellyttää monivaiheista prosessia, kuten leviämisen, invaasio, etäpesäke ja angiogeneesiä, mutta nämä prosessit ovat yhä puutteellisia in PDAC. Vuonna ensisijainen haimasyöpäsoluissa, proliferatiivinen signaaleja pidetään konstitutiivisesti aktiivisen mutantti geenejä, ja ääretön leviämisen geneettisesti erilaista osa-kloonien havaitaan ennen hyökkäystä prosessi. Geneettiset muutokset voivat esiintyä kaukaisiin kohtiin jälkeen etäpesäke [2-4]. Kaikissa syövän etenemisen vaikuttaa myös ympäröivä microenvironment jossa glykaani on keskeinen rooli muutettaessa kasvainsolujen ja geneettisiä mutaatioita. Kasvaimet sisältävät erilaisia ​​glykosaminoglykaanien (GAG), jotka säätelevät solujen käyttäytymistä vuorovaikutuksessa eri molekyylien kuten kasvutekijöitä, sytokiinejä, kemokiinien, proteinaasit ja niiden inhibiittorit [5]. GAG: t ovat kondroitiinisulfaatti (CS), hepariini, kerataanisulfaatti, ja hyaluronihappo. Sokeria selkäranka CS koostuu toistuvia disakkaridiyksiköistä D-glukuronihapon acidβ1-3

N

asetyyli-D-galaktosamiinin (GalNAc). Aikana ketjun pidentymisen biosynteesissä CS, disakkaridiyksiköistä on modifioitu erityisiä sulfotransferaasien C-2 GIcA ja C-4 ja /tai C-6 GalNAc eri yhdistelmiä ja näyttää valtava rakenteellista monimuotoisuutta, joka tuottaa ominaisuus sulfaatti kaavoja kriittinen sitoutumaan erilaisia ​​toiminnallisia proteiineja. Erittäin sulfatoitu disakkaridiyksiköt kuten E-yksikkö, GlcAβ1-3GalNAc (4S, 6S), jossa 4S ja 6S seistä 4-

O

– ja 6-

O

-sulfate vastaavasti ja E-yksikkö-rikas CS (CS-E) valmisteita syntetisoidaan tietyn entsyymin, hiilihydraatti sulfotransferaasien 15 (CHST15), ja osoittavat merkittävää biologista aktiivisuutta [6-12]. Kertyvät tulokset ovat osoittaneet osallistumista CS-E kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden keuhkoissa [6, 13], munasarja [7, 14], rintojen [15] ja iho [16]. Rooli CS-E aloittamisessa kasvainsolun invaasiota osoitettiin, mikä viittaa mahdollisuuksia CS-E on keskeinen molekyyli perustamisessa uusia hoitomuotoja vastaan ​​erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia kuten PDAC [17].

CS-E on ilmaistu sekä kasvainsoluissa ja stroomasoluja, jotka ympäröivät kasvainta PDAC potilaan kudoksissa [17, 18]. Koska jakautumiskuvion CS-E, monivaiheinen ja monisoluisten osallistumista CS-E PDAC etenemisessä on pidetty. Vaiheittainen tutkimus Siksi tarvitaan paljastaa hienomekanismin CS-E taustalla pahanlaatuinen ominaisuudet PDAC. Kuitenkin osallistuminen CS-E alustavissa PDAC eteneminen on vielä tutkittava. Tässä tutkimuksessa tutkia CS-E toimii suoraan leviämisen PDAC tai ei, teimme estää kokeet, joissa käytetään pieniä häiritseviä RNA on suunniteltu estämään ilmentymistä CHST15 (CHST15 siRNA), jotka inhiboivat selektiivisesti CS-E: n biosynteesiä. Yksinkertaisissa

in vitro

ja

in vivo

vierassiirrekokeissa osoitamme vaikutus CHST15 siRNA proliferaatioon PDAC ja keskustella mahdollisista CS-E terapeuttisena kohteena PDAC.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja reagenssit

CHST15 siRNA ostettiin Ambion, Inc. (TX, USA). CS-E saatiin SEIKAGAKU CORPORATION (Tokio, Japani), liuotetaan uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, jaettiin osiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa. WST-1 saatiin Roche Diagnostic GmbH (Mannheim, Saksa). Lipofectamine

™ RNAiMAX Reagent ja Invivofectamine

® 2,0 Reagent ostettiin Invitrogen (CA, USA).

Solulinjat ja hiirillä

PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 ja Capan-2, haimasyövän solulinjoissa, ostettiin ATCC: ltä (Rockville, MA, USA). Sen jälkeen tarkistamalla, että solut olivat vapaita mykoplasmatulehduksen käyttäen Mycoplasma PCR-ELISA-kittiä (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa), PANC-1 ja MIA PaCa-2, soluja viljeltiin DMEM: ssä (Sigma Aldrich, CA), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 1% antibiooteilla. Capan-1 ja Capan-2-soluja kasvatettiin IMDM: ssä (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japani) ja McCoyn 5A Medium Modified (Sigma-Aldrich, CA), joka sisälsi 10% FCS: ää ja 1% antibiootteja, vastaavasti. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2 /ilmaa.

transfektio siRNA

RNA-interferenssi (RNAi) suoritettiin käyttäen käänteisfaasi transfektiomenetelmä: ennen solujen maljaamista , siRNA (50 nmol), Lipofectamine 2000 ja Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) media sekoitettiin ja inkuboitiin mukaan valmistajan ohjeiden. Transfektion jälkeen 48 tuntia, solut kerättiin ja niitä käytettiin muita määrityksiä.

Reaaliaikainen semi-kvantitatiivinen RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä SV Total RNA Isolation System (Promega, WI, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA saanto ja puhtaus määritettiin spektrofotometrisesti. Käänteistranskriptio suoritettiin Moloney hiiren leukemiavirus käänteistranskriptaasi (Invitrogen) ja sattumanvaraisia ​​heksameerejä (Promega, WI). Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green käyttäen DICE lämpösyklilaite mukaisesti valmistajan ohjeiden (TAKARA BIO INC., Otsu, Japani). Kaikki PCR-alukkeet suunniteltiin ja syntetisoitiin TAKARA BIO INC., Gene ekspressiotasot normalisoitiin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja esitetään mielivaltaisina yksikköinä. Sense- ja antisense-alukkeita käytettiin esitetty taulukossa 1. Ja alukkeen sekvenssit on lueteltu taulukossa 2. Riippumattomat kokeet toistettiin kolme kertaa kullekin näytteelle, ja suhteellinen ekspressiotasoja geenien analysoitiin.

WST-1-solujen lisääntymisen määrityksessä

solulisäkasvumääritykselle, PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 ja Capan-2-solut, jotka on transfektoitu CHST15 siRNA tai negatiivinen kontrolli-siRNA ympättiin 96-kuoppalevylle konsentraatiossa 1 x 10

4 solua /kuoppa. Solujen lisääntyminen tutkittiin 60 minuutin kuluttua alusta kanssa inkuboinnin solujen lisääntymistä reagenssi WST-1 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Saksa).

Soluproliferaatiomääritys HGF ja CS-E

PANC-1-soluja (1000 solua) siirrostettiin elatusaineeseen 96-kuoppalevylle päivänä ennen HGF stimulaatiota. Soluja stimuloitiin 5 ng /ml HGF kanssa tai ilman 100 ug /ml CS-E, ja solujen lisääntyminen määritettiin käyttämällä WST-1-määritystä varten 120 min ajan 37 ° C: ssa.

CHST15 siRNA hoidon PANC-1 ksenograftimallissa

BALB /c-nude-hiiriä (6-9 viikkoa vanhoja) hankittiin CLEA Japani (Tokio, Japani), ja niitä pidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden The Jikei University School of Medicine (Luvan numero: 25-067). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. PANC-1-soluja (1 x 10

7-solut) in 100 ui BD Matrigel

™ Matrix (BD, NJ) injektoitiin ihonalaisesti molempiin kylkiin nude-hiirten [19]. Kasvaimensisäistä injektio joko 100 ui 250 nM ohjaus siRNA tai CHST15 siRNA kompleksoitu Invivofectamine

® 2,0 reagenssia (Life Technologies, CA) suoritettiin 7 päivää inokulaation jälkeen. Tuumorin koko mitattiin joka toinen päivä. Päivänä 9 ja 14. päivänä hiiret tapettiin ja tuumorit eristettiin, punnittiin ja niitä käytettiin geeniekspression tai histologisia analyysejä.

Histologinen analyysi

Kasvaimen kudokset kiinnitettiin 10% fosfaattia puskuroitua formaliinia. Kiinnityksen jälkeen kudokset valettiin parafiiniin, ja leikataan kalvot käytettiin hematoksyliini-eosiinilla (HE) värjäystä ja immunohistokemiallisella värjäyksellä, kuten aikaisemmin on kuvattu [20] ja CHST15 käyttäen anti-ihmisen CHST15-vasta-aineen (Sigma-Aldrich) laimennoksena 01:25. Koska sekundäärisen vasta-aineen, Dako EnVision

™ FLEX /HRP-detektioreagenssia (Dako, Tanska) käytettiin. Mitään positiivista signaalia ei havaittu, kun jätetään pois ensimmäisen vasta, tukemalla värjäytymisen spesifisyyden (tuloksia ei ole esitetty).

Tilastollinen

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA seurasi Bonferronin korjauksen tai Studentin t-testiä.

p

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Target-specific siRNA aiheuttama CHST15 knockdovvn haimasyövän solulinjassa

ensin vahvisti runsas ilmentyminen CHST15 mRNA: n haimasyövän solulinjoissa PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 ja Capan-2 käyttäen RT-PCR. Seuraavaksi nämä neljä solut transfektoitiin joko kohdespesifinen siRNA-dupleksit (CHST15 siRNA) tai ei-spesifinen siRNA ohjaus (kontrolli siRNA). Geenien mitattiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä, ja CHST15 ilmentyminen väheni PANC-1-solujen 1%, 85% ja 87% näytteistä käsiteltiin kohdespesifinen siRNA 24 h, 48 h ja 72 h, vastaavasti . 48 h transfektion jälkeen, annoksesta riippuvainen tukahduttaminen CHST15 mRNA: n ekspression tasojen havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Siksi peräkkäistä tutkimusta, tutkimme vaikutus CHST15 siRNA 48 h kuluttua siRNA transfektion. CHST15 ilmentyminen väheni MIA PaCa-2, Capan-1 ja Capan-2-soluissa 75%, 42% ja 36% näytteistä käsiteltiin kohdespesifinen siRNA 48 tuntia, vastaavasti.

esto haiman syöpäsolun proliferaatiota aiheuttama CHST15 siRNA

vaikutuksen arvioimiseksi CHST15 pudotus (kuvio 1A), solujen lisääntyminen tutkittiin 48 tunnin kuluttua alusta siRNA transfektio käyttämällä WST-1-määritystä. Tulokset osoittivat merkittävää tukahduttava vaikutus CHST15 siRNA soluproliferaatioon in PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 ja Capan-2 (kuvio 1 B). Lisääntyminen p21-geenin ekspressiotasot havaittiin CHST15 siRNA-käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolliin siRNA-käsiteltyjen solujen PANC-1 ja Capan-2 (kuvio 1C).

(A) suhteellinen määrä CHST15 mRNA: ohjaus siRNA käsitelty ja CHST15 siRNA käsiteltiin PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 ja Capan-2-soluissa (n = 3 kussakin) näytettiin normalisoinnin jälkeen käyttämällä GAPDH sisäisenä kontrollina. Kussakin solulinjoissa, oli merkittäviä eroja noin vähentäminen CHST15 ilmaisun käsitellyt näytteet kohdespesifinen siRNA: ssa 48 tuntia. Tähdellä (**, ***) p 0,01, P 0,001, vastaavasti välillä ohjaus siRNA ja CHST15 siRNA. (B) WST-1 määrityksessä. Keskimääräinen taso leviämisen hallinnassa siRNA käsitellyissä soluissa (musta pylväs) ilmaistiin standardin (1.0) ja tiedot on esitetty suhteessa standardia leviämisen indeksin. Keskiarvo ± SD (n = 3). Merkittäviä tukahduttava vaikutus CHST15 siRNA soluproliferaatioon havaittiin PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 ja Capan-2. Tähdellä (*, **) p 0,05, P 0,01, vastaavasti välillä ohjaus siRNA ja CHST15 siRNA. (C) Suhteellinen määriä p21 mRNA ohjaus siRNA käsitelty ja CHST15 siRNA käsiteltiin PANC-1-soluissa (n = 3-5 kussakin). Oli lievää kasvua ja merkittävää kasvua p21 mRNA CHST15 siRNA käsitelty PANC-1-soluissa ja Capan-2-soluissa verrattuna hallita siRNA, vastaavasti. Tähdellä (*) p 0,05 välillä CHST15 siRNA ja ohjaus siRNA.

vaikutus CHST15 siRNA haiman kasvaimen kasvua ksenograftimallia

Kun olet vahvistanut PANC-1 solujen kasvua nude-hiirissä päivänä 7 istuttamisen jälkeen, tutkimme tukahduttava vaikutus CHST15 siRNA on PANC-1 solujen lisääntymistä

in vivo

(kuvio 2). Pistämisen jälkeen PANC-1-soluja sekä paljaiden hiirien kylkiin, me annettiin CHST15 siRNA kuhunkin kasvaimeen päivänä 7. anti-proliferatiivista vaikutusta CHST15 siRNA todettiin, vastaan ​​siRNA jälkeen päivä 9. PANC-1-soluja käsiteltiin CHST15 siRNA kasvoi hitaammin kuin ohjata siRNA-käsiteltyjä soluja, ja ei-käsiteltyjen solujen (kuvio 2A). Nämä tulokset osoittavat, että leviämisen PANC-1-soluissa tukahdutettiin sen jälkeen pudotus on CHST15. Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin arvioimaan geeni-estävä vaikutus, mutta ei ollut merkittävää eroa geenin ilmentymisen välillä CHST15 siRNA-käsitellyn ja hallita siRNA-käsitellyissä hiirissä joko päivänä 9 (tuloksia ei ole esitetty) tai päivä 14 (kuvio 2B ).

(A) muutos kasvaimen tilavuuden. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD (Käsittelemätöntä; n = 6, ohjaus siRNA: n = 12, CHST15 siRNA; n = 10). Tähdellä (*, ***) p 0,05, P 0,001, vastaavasti välillä ohjaus siRNA ja CHST15 siRNA. (B) suhteelliset määrät CHST15 mRNA hoitamatta, määräysvalta siRNA käsitelty ja CHST15 siRNA käsitellään ksenografteissa päivänä 14. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD (Käsittelemätöntä; n = 6, ohjaus siRNA: n = 12, CHST15 siRNA; n = 10 ).

patologinen tutkimus haiman kasvain hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys ja immunohistokemia

jotta tehokkuuden osoittamiseksi CHST15 siRNA, haiman kasvaimia nude-hiirissä analysoitiin HE värjäys ja CHST15 immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio 3). HE-värjäys, laaja nekroosia havaittiin CHST15 siRNA ryhmä (kuvio 3A) verrattuna kontrolliryhmään siRNA ryhmä (kuvio 3B). Lokalisaatio CHST15 että ksenograftissa arvioitiin immunovärjäyksellä ihmisen CHST15 proteiinia. CHST15 oli erittäin ilmaisseet kasvainsolujen sijaitsee leviämisrintamassa (kuvio 3A ja 3C). Vahva CHST15-värjäytymistä havaittiin solujen sytoplasmassa mesenkymaalisten kaltainen morfologia (kuvio 3E). Keskellä kasvain, ilmentymisen CHST15 oli suhteellisesti pienempi verrattuna invasiivisen edessä (kuvio 3A ja 3C). Heikko lokalisointi CHST15 oli havaittavissa solujen johto-rakenne (kuvio 3F). Sitä vastoin selvästi menetys CHST15 värjäytymistä kasvaimen alueilla CHST15 siRNA ryhmä (kuvio 3D ja 3G) paljastui.

(A, B) Kasvaimet nude-hiirissä päivänä 19 värjättiin HE ( alkuperäinen suurennos x 100). Edustavia kuvia näytettiin. Laajalle levinnyt kuolion vauriot olivat näkyvästi esillä CHST15 siRNA hoidetut hiiret (A) verrattuna kontrolliryhmään siRNA hoidetut hiiret (B). (C, D, E, F, G) immunohistokemiallinen värjäys CHST15 (ruskea, alkuperäinen suurennokset x 100 C, D, X400 E, F, G) in ksenografteissa päivänä 19. Edustavia kuvia näytettiin. Vaikka lähes kaikki kasvainsolut vierassiirrekokeissa olivat positiivisia CHST15 hallinnassa siRNA käsitellyt hiiret (D), vahvan signaalin havaittiin leviämisrintamassa sijaan kasvaimen keskustasta. CHST15-erittäin positiivisia kasvainsoluja esillä mesenkymaaliset kaltainen morfologia (E), kun taas CHST15-low-positiiviset solut osoittivat johto kaltainen morfologia (F), sen sijaan, pieni määrä jäännöksen kasvainsolujen oli heikosti positiivinen CHST15 in CHST15 siRNA käsitellyissä hiirissä (C ).

CS-E edistänyt leviämisen PANC-1-solujen läsnä ollessa HGF

The effect of CS-E leviämisen PANC-1-soluissa arvioitiin

in vitro

(kuvio 4). Vaikka HGF tiedetään edistävän kasvainsolujen proliferaation, pienempi annos HGF käytettiin tässä tutkimuksessa ei aiheuttanut merkittävää kasvainsolujen proliferaatiota. Kuitenkin leviämisen indeksi PANC-1 lisääntyi merkitsevästi samalla annoksella HGF: n läsnä ollessa CS-E (kuvio 4).

WST-1-määritys suoritettiin käyttäen PANC-1-solu. Keskimääräinen taso proliferaation PANC-1-soluissa lisäämättä CS-E ja HGF (valkoinen pylväs) ilmaistiin standardin (1.0) ja tiedot on esitetty suhteessa standardia leviämisen indeksin. Lisääntyminen indeksi PANC-1-solut käsiteltiin pienellä annoksella HGF (musta pylväs) ei osoittanut tilastollista eroa kasvatusastiassa. Sen sijaan, leviämisen indeksi HGF-käsitelty PANC-1-soluissa lisäsi merkittävästi, kun lisätään CS-E (harmaa pylväs). Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD (n = 6 kussakin).

Keskustelu

Ennuste PDAC potilaille on edelleen synkkä, ja vallankumouksellinen hoitovaihtoehdot ovat vahvasti tarvita. On tunnettua, että on korkea kuolleisuus liittyy PDAC johtuu pääasiassa sen verraton aggressiivisuus johtuu sen varhainen hyökkäys ja kaukana etäpesäkkeitä. Nämä pahanlaatuinen ominaisuudet havaitaan muiden kehittyneiden kasvaimia kuten munasarjasyöpä. Munasarjasyövän, CS-E havaitaan sekä kasvaimen ja stroomasolujen ja osallistuu verraton aggressiivisuus syövän ja korreloi huonon ennusteen [21]. Perustuen niiden kaltaiset leviäminen, ajatellaan, että molemmat kasvainsolujen johdettuja sekä stroomasolulinja peräisin oleva CS-E elintärkeä tehtävä eri vaiheita syövän etenemisen kehittynyt kasvaimia.

roolin tutkimiseksi CS-E PDAC, käytimme CHST15 siRNA, joka estää selektiivisesti ilmentymisen CHST15 geenin ja synteesin CS-E. Valitsimme tämän menetelmän koska Selektiivisenä CS-E käyttämällä riittävä määrä kemiallisia estäjiä tai vasta on edelleen haaste

in vivo

. Keskityimme vaikutuksesta CHST15 suoraan kasvaimeen, mutta ei stroomasoluihin, soluproliferaatiota, ensisijainen vaihe syövän etenemisen, ihmisen haimasyövän solulinjaa PANC-1. Kasvaimen leviämisen, GAG: t on raportoitu toimimaan yhteistyössä reseptorit liukoisen kasvaimen kasvutekijöiden. GAG: t muodostamisen helpottamiseksi ligandi-reseptori-kompleksien ja aktivaation reseptori signaloinnin.

Koska HGF on yksi tärkeimmistä liukoisen tuottamista tekijöistä kasvainsolujen sekä strooman solujen PDAC, testasimme onko toiminta HGF voi lisätään, kun läsnä on CS-E. Jopa silloin, kun käytetään alempaa pitoisuutta HGF, joka ei onnistunut indusoimaan kasvainsolujen proliferaatiota, merkittävä kasvu proliferaation vahvistettiin läsnä CS-E (kuvio 4). CS-E yksinään ei indusoinut kasvainsoluproliferaation on testattu pitoisuus, mikä osoittaa, että CS-E täydentää reseptorin signalointia HGF.

Yllättäen CHST15 siRNA yksin suoraan inhiboivat PANC-1-solujen

vuonna vitro

. Selvä mekanismia koreseptorit Lisäksi ehdotettiin. Vaikka emme tutkia yksityiskohtaisesti kinetiikka aikana kulttuurin tasoilla solusyklin estäjä liittyvä geeni p21

CIP1 /WAF1 kasvoi PANC-1-soluissa [22], jotka osoittivat merkittävä väheneminen CHST15 mRNA 48 tuntia, mikä viittaa että CHST15 geenien modifioitu ylävirran polkuja p21. Tältä osin säätely ylöspäin p21 on raportoitu joissakin olosuhteissa haiman syöpäsoluja. Esimerkiksi estämällä Hedgehog signalointi aiheuttama säätely ylöspäin p21 [23, 24]. Koska CS-GAG-Hedgehog vuorovaikutus on raportoitu parantaa Hedgehog signalointi [25], yksi mahdollisuus on, että esto CS-E synteesi voitaisiin edistää estämällä Hedgehog signalointi, mikä johtaisi ylössäätöä p21. Lisätutkimuksia tarvitaan ymmärtää CHST15 välittämää sääntelymekanismeissa syöpäsolujen lisääntymistä liittyvät p21-reitin.

Testasimme myös vaikutusta CHST15 siRNA kasvaimen kasvuun kasvaimensisäisiä injektio ksenograftimallia. Todettuaan kasvain, kertainjektiona CHST15 siRNA merkittävästi tukahdutti edelleen kasvaimen kasvua (kuvio 2A). Emme havainneet merkittävää vähentämistä ihmisen CHST15 mRNA viikon kuluttua CHST15 siRNA injektion ajankohtana uhrata, verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA. Sen sijaan, histologinen tarkastelu ksenografti osoittivat selvästi vähentää ihmisten CHST15 proteiini-positiivisia kasvainsoluja CHST15 siRNA viikon kuluttua yksi injektio, mikä osoittaa, että estämisen CHST15 saatiin. Yksi mahdollinen selitys mRNA-proteiini epätasapaino on, että taso tuumorista peräisin ihmisen CHST15 mRNA saavutti huipun aikaisemmin pistettä ja laski sen jälkeen päivä 9, jonka jälkeen tehoa mRNA ei voitu havaita riittävästi. Toinen mahdollisuus on, että kriittisen tason CHST15 mRNA ei ole riittävästi havaitaan vasta PCR-menetelmällä. Koska CHST15-ilmentyy voimakkaasti tuumorisolujen voidaan havaita leviämisrintamassa, mutta ei keskellä ksenografti, katsotaan, että

in vivo

CHST15 siRNA pääasiassa vaikuttaa näihin kasvainsoluihin sijaitsee invasiivisia edessä. Näiden lukumäärää solujen rajoittuu joukossa koko kasvainsoluja ja mRNA-signaaleja ei ehkä riittävästi havaita PCR käytetty koko ksenograftin näyte. Kun aloittamisesta kasvaimen kasvua tukahdutti CHST15 siRNA, ja, sen jälkeen, tuotannon CHST15 proteiinin estyi, kasvua antamat signaalit CHST15-välitteisen kasvutekijöiden olisi voitu ehkäistä tehokkaasti. Lisätutkimukset arvioida ajan myötä ja /tai toistuva siRNA injektioita voisi selventää

in vivo

mekanismin taustalla mRNA-proteiinin suhteen.

Tämä tutkimus osoitti, ensimmäistä kertaa, että CHST15 siRNA voi tukahduttaa kasvaimen kasvua, jota pidetään ensisijaisena vaiheessa syövän etenemisen ensisijaisessa sivustolla. Oli kuitenkin useita rajoituksia esillä olevassa tutkimuksessa. Ensinnäkin, käytimme vain PANC-1-soluissa in vivo, vaikka käytimme kolmea eri solulinjojen in vitro ja havaitut kaltaiset vaikutukset CHST15 siRNA kasvainsoluproliferaation. Toinen, käytimme ihon ksenograftimallia yksinkertaisesti tutkia vaikutusta CHST15 siRNA proliferaatioon ja syöpäsolujen kasvua. Ortotrooppisia ksenograftimalleja antavat lisätietoja roolista CHST15 siRNA kasvainsoluproliferaation kasvaimen mikroympäristössä. Se on sen arvoista yrittää selkeyttää kokonaiskuvaa roolin CHST15 ja CS-E PDAC etenemisen analysoimalla soluspesifisestä ja vaiheen ominaispiirteet.

Reitti siRNA toimitus rajoittui kasvaimensisäistä injektio tässä tutkimuksessa. Katsomme kuitenkin, että paikallinen injektio on joitakin etuja käsiteltäessä hypovascular kasvaimia kuten PDAC ja siRNA joiden systeeminen toimitus on edelleen haaste. Oikeastaan ​​kasvaimeen injektio siRNA: iden on tällä hetkellä saatavilla hoitopaikassa. Endoskooppinen ultraääni (EUS) ei ole vain diagnostiikkatyökalun mutta myös interventionaalisen ja terapeuttinen menettely. Todisteet interventionaalisen EUS on käyttökelpoinen PDAC hoitoon injektiona hoitoa, kuten siRNA on jatkuvasti kertynyt [26-30]. Interventionaalinen EUS on olennainen osa monitieteistä lähestymistapaa syövän hoidossa lähitulevaisuudessa. Tämä tekniikka tarjoaa mahdollisuuden hoitaa PDAC suorassa ja suhteellisen vähän invasiiviset tavalla, jolla on hyvin alhainen esiintyvyys menettelyihin liittyviin komplikaatioihin. Katsomme, että kliininen soveltaminen CHST15 siRNA käyttäen EUS-ohuella neulalla injektio PDAC potilaille on toteutettavissa todellinen klinikalla.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoitti, että RNAi-välitteinen säätely alaspäin CHST15 estää tehokkaasti lisääntymistä ja kasvua haiman syöpäsoluja. CHST15 signalointireitin tärkeä rooli PDAC lisääntymistä ja kasvua ja voivat toimia mahdollisena terapeuttisena kohteena PDAC. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään vaikutus ja riski CHST15 geenien mukaan CHST15 siRNA PDAC kehitystä ja mahdollistaa sen käyttöä kliinisiin sovelluksiin.

tukeminen Information

S1 Database. Gene-tukahduttava vaikutus CHST15 siRNA päivänä-9 kasvaimen ksenograftimallia.

Suhteellinen määrä CHST15 mRNA ohjaus siRNA käsitelty ja CHST15 siRNA käsitellään ksenografteissa päivänä 9. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD (ohjaus siRNA: n = 7, CHST15 siRNA; n = 5).

doi: 10,1371 /journal.pone.0142981.s001

(DOCX)