Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lähdimme tutkimaan keskeiset efektoreina vastustuskyky ja herkkyys ErbB2 tyrosiinikinaasin estäjät, kuten lapatinibia in ErbB2-positiivisen rintasyövän ja keuhkosyövässä. Solu-pohjainen

in vitro

mutageneesillä lapatinib vastus mallin tunnistettu useita mutaatioita, kuten portinvartija ErbB2 mutaatio ErbB2-T798I, välittävinä vastus. ErbB2-T798I suunniteltu solumalleja todellakin vastustuskykyisiä lapatinibille mutta edelleen herkkiä peruuttamattomia EGFR /ErbB2 estäjä, PD168393, viittaavia mahdollisia vaihtoehtoisia hoitomuotoja voittaa vastus. Geeniekspressioprofilointi tutkimuksissa tunnistettu valitse ryhmä loppupään tavoitteiden säätelevät ErbB2 signalointi ja määritellä PHLDA1 kuin välittömästi vaimentua geeni kun kasvaimia synnyttävän ErbB2 signalointi esto. Löydämme merkittäviä alas-säätely PHLDA1 perusterveydenhuollossa rintasyöpä ja PHLDA1 tilastollisesti merkitsevästi vähemmän ilmaistuna ErbB2 negatiivinen verrattuna ErbB2 kasvaimia sopusoinnussa sen sääntelyä ErbB2. Lopuksi PHLDA1 yliekspressio estää AKT signalointi, estää solujen kasvua ja parantaa lapatinib herkkyyttä edelleen tukevan tärkeä negatiivinen kasvunsääde toiminto. Tulosten perusteella näyttää, että PHLDA1 voisi olla keskeinen estävä toiminnot ErbB2 ajettu keuhko- ja rintasyövän soluja ja ymmärtämään paremmin sen toiminnot eivät ehkä piste uusia hoitovaihtoehtoja. Yhteenvetona tutkimuksemme määritellä uudella tavalla modulaatioilmiötä herkkyys ja kestävyys ErbB2 inhibitiota ErbB2-riippuvaisten syöpien.

Citation: Li G, Wang X, Hibshoosh H, Jin C, Halmos B (2014) Modulation ErbB2 Blockade in ErbB2-positiivinen Syövät: The Role of ErbB2 mutaatioiden ja PHLDA1. PLoS ONE 9 (9): e106349. doi: 10,1371 /journal.pone.0106349

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 17 syyskuu 2013; Hyväksytty: 06 elokuu 2014; Julkaistu: 19 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat American Cancer Society (myöntää Ei RSG-08-303-01-TBE BH) ja NIH /National Cancer Institute erikoistunut tutkimus- Excellence in Human Lung Cancer avustus P50 CA90578-04 (BH). Histopatologia apu on annettu Molecular Pathology resurssin, Herbert Irving Kattava Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ErbB2 on solukalvon pinnalla sitoutuneen reseptorin tyrosiinikinaasin ja on mukana signaalitransduktioreaktioteihin johtaa solujen kasvua ja proliferaatiota. Tämä geeni monistetaan 10-20% rintasyövistä, ja vahvistus johtaa proteiinin yli-ilmentyminen, mikä merkitsee aggressiivinen fenotyyppi [1] – [4]. Yli-ilmentyminen, monistaminen ja joskus aktivoivia mutaatioita ErbB2 esiintyy myös muissa syövissä, mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [5], [6]. Humanisoitu vasta-aine trastutsumabi (Herceptin) vastaan ​​yli-ilmentynyt ErbB2 on osoittautunut tehokkaaksi hoidettaessa rintasyövän ja syöpien ErbB2 vahvistus [7]. Lisäksi, somaattinen mutaatioita kinaasidomeenissa ErbB2 havaittiin erilaisissa kiinteissä syövissä, mukaan lukien keuhko- ja rinta- karsinoomat [8] – [12]. Viime aikoina dual EGFR /ErbB2 tyrosiinikinaasiestäjiksi ovat myös vaikuttaneet lupaavilta kliinisissä tutkimuksissa. Dual, palautuva EGFR /ErbB2 estäjä, lapatinibi (Tykerb) erityisesti on osoittanut merkittävää aktiivisuutta ErbB2-positiivisten rintasyöpiä, ja nyt on hyväksytty käytettäväksi tässä indikaatiossa [13]. https://en.wikipedia.org/wiki/HER2/neu – cite_note-3Inhibition ErbB2 tyrosiinin autofosforylaation by lapatinib kumoaa alavirtaan Ras-Raf-ERK1 /2 ja PI3K-AKT kasvu /eloonjäämisen signalointia ErbB2 yliekspressoivat rintasyövän solulinjoissa ja potilailla, joilla on ErbB2-yliekspressoivassa rintasyöpiä [14].

yhtenäinen kehittäminen hankitun resistenssin lapatinibille valitettavasti rajoittaa sen kliinistä tehokkuutta. Vastaavalla asetukset, toissijainen mutaatioita, kuten KIT eksoni 17 mutaatiot Imatinibiresistenteillä GIST ja EGFR T790M EGFR-mutatoitunut keuhkosyövässä ovat yhteisiä resistenssin [8], [15]. Ei ole in vivo nykyisten tietojen mahdollisista resistenssimekanismeihin lapatinibille. In vitro malli järjestelmä, toisen mutaation, ErbB2 T798I aikaansaa vahvin lapatinibi vastuksen vaikutus Ba /F3-solut, ja se on analoginen epidermaalisen kasvutekijän reseptori T790M [16] – [18]. Tuoreen tutkimuksen mukaan in vitro mallissa järjestelmien kehittämistä yhteistyössä riippuvuus ER-signalointireitteihin ehkä toinen mahdollinen mekanismi lapatinibille vastus [19]. Joidenkin tietojen ehdottaa osallistumista AXL aktivaation lapatinibi-resistenssin ErbB2 rintasyövän [20]. On selvää, muita mekanismeja samoin. Ottaen huomioon vaikeudet saavuttaa ensisijainen potilaan näytteet, on tärkeää rakentaa kokeellista solukkojärjestelmissä seulomiseksi asiaan resistenssin mekanismi, joka sitten testauksen mahdollistamiseksi vaihtoehtoisia estäjien voittaa vastuksen. On hakkuun että AKT /PI3K ja ERK /MAPK reitit ovat keskeisiä välittömästi alavirtaan efektoreita ErbB2 onkogeenisten signalointi. Kuitenkin niiden kohdentaminen on vakavia puutteita myrkyllisyyden ja kapea terapeuttinen indeksi antaneet tärkeitä fysiologisia rooleja. Siksi ymmärtää paremmin koko ryhmän loppupään muutosten pitäisi pystyä tunnistamaan uusia käytännöllisiä tavoitteita ja kehittämään tehokkaampia ja kestävämpiä hoitostratetioigksi ErbB2-positiivisia syöpiä.

Tutkimuksessamme asetamme ulos kaksi tavoitetta edistää ymmärrystämme näillä molemmilla keskeinen alueilla onkogeenisten ErbB2 signalointi- hankittu resistenssi ja alavirtavaikuttajainhibiittorit ja modulaattori polkuja. Ensinnäkin, loimme herkkyys lapatinibille hoitoon ErbB2-positiivisten keuhko- ja rintasyöpä solulinjoissa, jonka tunnuksena joukko oletettuja hankittu resistenssi mutaatioita ja osoitti, että mutaatiot ErbB2-T798 lukemiin vastuksen että voidaan voittaa peruuttamatonta ErbB2 estäjä, PD168393. Seuraavaksi valmistunut geeniekspressioprofilointi tutkimus tunnistaa keskeinen ryhmä varhaisen ErbB2 kohdegeenien ja tunnistaa PHLDA1 uutena alavirran kohde ErbB2 signalointi toimiva rooli negatiivista palautetta mekanismeja hienosäätää lähtö ErbB2 signalointi ja näin merkittävästi parantaa herkkyys ErbB2-positiivisten rintasyövän soluja lapatinibille. Meidän tutkimukset antavat useita uusia mahdollisuuksia hyödyntää laajemmin ErbB2 esto hallinnassa ErbB2-riippuvaisten syöpien.

Materiaalit ja menetelmät

Patient Materiaali

Rintasyöpäkudoksen ja normaalin rintakudoksen ympäröivät kasvainta saatiin samasta potilaasta. Formaliinilla kiinnitys- kudoksia käytettiin immunohistokemiaa tutkimuksessa. Projektin hyväksyi eettinen komitea New York Presbyterian Hospital of Columbia University, ja potilaat kirjallisen suostumuksensa mukaisesti Helsingin julistuksen.

reagenssit

EGR hankittiin Sigma- Aldrich (St. Louis, MO), PD168393 ja CL387,785 ostettiin Calbiochem (Billerica, MA), lapatinibi hankittiin Selleck Chemicals (Houston, TX). Lääkeaineet liuotettiin DMSO: hon, jolloin saatiin 10 mmol /L-kantaliuosta ja lopullinen DMSO-pitoisuus kaikissa kokeissa oli 0,1%.

Cell Culture

Calu3, HCC827, H1975, HCC202, HCC1569, HCC1937 ja T47D-soluja ylläpidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, SKBR3-soluja ylläpidettiin McCoyn elatusaineessa, johon 10% FBS: ää. MDA-MB-468 ja MDA-MB-436-soluja ylläpidettiin Leibovitzin L-15-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, MCF-7-soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2, ja ne olivat logaritmisessa kasvuvaiheessa aloitettaessa kaikissa kokeissa. MCF-7, MDA-MB-468 ja MDA-MB-436-solujen tässä annetaan: Dr. Matthew Maurer (Columbia University). Kaikki solulinjat perin hankittiin ATCC (Manassas, VA).

ErbB2 mutageneesi, kirjasto sukupolvi, ja lääkeresistenssin näytön

Plasmidirakenne pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA oli tuotettu kuten aiemmin on kuvattu [8]. Otimme käyttöön uuden entsyymin sivustoihin AgeLllä asemassa 1457 on ErbB2-cDNA. Sitten sekoitetaan koko transmembraaninen ja tyrosiinikinaasi sitovan domeenin ErbB2 AgeLllä-AfeI ruoansulatus (AfeI sivusto- asema 3191). Käyttämällä mutatoitua pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA-plasmidin, teimme satunnaismutageneesi käyttäen alukkeita ulottuu 1457-3191 alueen läsnä ollessa 50 umol /l MnCI

2. Subkloonattu p-GEM-T-easy-vektoriin ja sekvensointiin yksittäisten pesäkkeiden osoitti, että olennaisesti kaikki PCR-tuotteita, jotka sisältyvät mutaatioita, 50%: n tuotteita, jotka sisältävät 1-emäsparin muutos. Allas monistettujen DNA-fragmenttien digestoitiin Agel: llä ja AfeI ja ligoitiin uudelleen runko- pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA vektori. Vanhempien SKBR3-solut transfektoitiin mutagenisoidun kirjastoissa. Solukloonit valittiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 500 ug /ml G418: aa ja 1 umol /l lapatinib jälkeen 24 tuntia transfektion jälkeen. Kuukautta myöhemmin solujen pesäkkeet eristettiin ja monistettiin edelleen läsnä sekä G418 ja lapatinibi ja sitten tyrosiinikinaasidomeeniin ErbB2 oli uudelleen sekventoituja. Sekvenssirinnastus ja analyysi tehtiin DNASTAR ja Mutaatio SURVEYOR ohjelmisto (SoftGenetics, State College, PA).

Generation ErbB2 T798I plasmidirakenteen

ErbB2 T798I ekspressiovektori tuotettiin sivusto- Kohdennettu mutageneesi (QuickChange -mutageneesitarvikkeissa, Stratagene, Santa Clara, CA), pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA-plasmidin konstruktin. Käytetyt alukkeet mutageneesin olivat T798I, 5′-CACGGTGCAGCTGGTGATACAGCTTATGCCCTATG-3 ’(sense) ja 5′-CATAGGGCATAAGCTGTATCACCAGCTGCACCGTG-3’ (antisense). Oikea sekvenssi generoidaan konstruktin vahvistettiin uudelleensekvensointipuskuriin. Olemme myös rakennettu ErbB2 villityypin ilmentämisrakenne kuin ohjaus transfektiokokeissa. Ohimenevä transfektio tutkimukset tehtiin käyttäen Cos-7-soluissa näillä rekonstruoitu plasmideilla. Western blot-analyysiä käytettiin vahvistamaan onnistumisen transfektio käyttämällä anti-hemagglutiniinimerkin-vasta-ainetta. G418 (500 ug /ml) käytetään valitsemaan stabiilisti transfektoitujen solujen ja eristetyt pesäkkeet poimittiin käyttäen kloonauksen renkaat ja edelleen viljeltiin G418: n läsnäollessa. Expression ErbB2 T798I mutantti proteiini vahvistettiin havaitsemiseen ilmentymisen hemagglutiniinimerkin kuten edellä.

Cell Growth Inhibition Analyysi

Solut maljattiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevyillä solujen elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. 24 tuntia maljaamisen jälkeen soluja käsiteltiin tietyn inhibiittorien pitoisuuksia. DMSO: n konsentraatio elatusaineessa säädettiin 0,1%. 72 tunnin inkubaation, elinkykyisten solujen määrä mitattiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2

H

-tetrazolium, sisäinen suola (MTS, imeytymistä formatsaanin 490 nm; CellTiter96, Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan protokollaa. Kukin määritys koostui kolmesta rinnakkaisten kuoppien saman lääkeaineen pitoisuus. IC50 määritettiin annos-vaste-käyrät.

immunoblottauksella

arvioimiseksi ErbB2 aktivaatiota solut ilman ravintoa 12 tuntia, ja sitten inkuboitiin lapatinib tai PD168393: ssa 3 tuntia ja sen jälkeen EGF: n ( 100 ng /ml) tai hereguliini (20 ng /ml) stimulaatio 15 minuuttia. Kokosolulysaateille erotettiin 8% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin nitroselluloosalle, ja proteiinin ilmentymistä havaittiin käyttämällä Western Salama Chemiluminescence Reagent (Perkin-Elmer Life Science, Wellesley, MA). Fosfo-Akt (Ser473), fosfori-ERK 1/2 (T202 /Y204), yhteensä-Akt yhteensä-ERK ja GAPDH vasta ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineita ErbB2 (C-18), PHLDA1 [21] – [23] ja hemagglutiniinimerkin (F-7) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vastaan ​​suunnattua vasta-fosfo-ErbB2 (Y1248) ostettiin R 24 tuntia maljauksen jälkeen elatusaine päivitetään määrätyn pitoisuuden estäjien, sitten inkuboitiin vielä 72 tuntia. Sitten solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä, suspendoitiin uudelleen anneksiini /propidiumjodidilla värjäyspuskurilla (Roche Applied Science), ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä. Aineisto analysoitiin FlowJo ohjelmisto (Puu Star, Ashland, OR). Bromi-deoksiuridiinin (BrdU) soluproliferaation määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (FITC BrdU Flow Kit, BD Pharmingen, San Diego, CA). Lyhyesti, Calu3 solut käsiteltiin lapatinib eri pitoisuuksina (lopullinen pitoisuus: 0, 0,1, 1, 3, ja 10 umol /l) ja 3 päivää, sitten pulssi leimattiin 60 minuutin ajan 10 uM BrdU, kerättiin trypsiinikäsittelyllä ja läpäiseviksi BD Cytoperm puskuri, värjättiin fluoresoivalla anti-BrdU-vasta, vastavärjättiin 7-amino-actinomycin D kokonais-DNA ja analysoitiin virtaussytometrialla. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Oligonukleotidi Array Analyysi

Calu3 ja SKBR3-soluja kasvatettiin 60% konfluenssiin kasvatusväliaineeseen ja sitten käsiteltiin lapatinib (1 pm), tai DMSO: ( 0,01%) kontrollina 6 tuntia. Solun kokonais-RNA eristettiin käyttäen RNAeasy mini -kittiä (Qiagen, Germantown, MD). RNA laatu arvioitiin käyttämällä Experion Automated Elektroforeesilaitteet Station (Bio-Rad) ja kvantifioidaan kuituoptinen spektrofotometrisesti käyttäen Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Inc., Wilmington, DE, USA). cDNA syntetisoitiin, merkitty ja hybridisoitiin Affymetrix HG-U133A mikrosiruja ja skannataan. Ilmaus arvo kullekin geeniä laskettiin käyttäen Affymetrix GeneChip- ohjelmistoja ja Robust Multichip keskiarvo (RMA) menetelmä signaalin uuttamalla.

esikäsittely, suodatus, ja tilastollinen analyysi

microarray tiedot analysoitiin ja väärä löytö laskettiin käyttäen SAM (Stanford University, CA). Array normalisoituminen ja laskenta ilmaisun arvojen sirun suoritettiin käyttäen DNA-Chip Analyzer (dchip). Sillä merkinnästä tuloksena geenien geeni ontologian selaimen NetAffymetrix (https://ww.affymetrix.com) käytettiin. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien kanssa ≥2 tai ≤0.5 kertainen muutos, q-arvo ≤1% analysoitiin t-testiä ja aihekokonaisuuksien kanssa ohjelmistopaketin klusterin 3.0 [24].

kvantitatiivinen PCR-määritys

Kokonais-RNA triplikaattinäytteet eristettiin käyttäen RNAeasy mini (Qiagen). cDNA syntetisoitiin M-MLV käänteistranskriptaasia (SuperScipt III käänteistranskriptaasi, Invitrogen, Grand Island, NY) käyttäen oligo (dT) alukkeita Invitrogen. Kaikki näytteet analysoitiin Roche LightCycler käyttämällä Syber vihreä koettimia. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1. Tasot GAPDH ilmaisun käytettiin sisäisenä viitteenä normalisoida cDNA: sta. Suhteet taso kunkin geenin GAPDH laskettiin sitten.

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta ensisijainen rintojen kasvainkudossektioista poistettiin parafiini ja rehydratoitiin ja inkuboitiin 0,6% vetyperoksidia metanolissa. Target haku, jonka pH on 9,0 (Dako, Carpinteria, CA) käytettiin antigeenin haku. Levyjä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa, mitä seurasi värjäys käyttäen R.T.U Vectastain Universal Lyhyt Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) hematoksyliinillä ydin- counterstaining. Lopuksi kalvot poistettiin vesi peräkkäin etanoliin, kuitattu ksyleenit. Anti-PHLDA1 vasta-ainetta käytettiin 1:50 (Santa Cruz Biotechnology). Intensiteetti värjäytymisen PHLDA1 teki hallituksen sertifioitu rintasyöpä patologi kuin 0 (ei lauseke), 1+ (heikko ilmaus), 2+ (kohtalainen lauseke) ja 3+ (voimakas ilmaus) ja prosenttiosuus (0-1,0 ) positiivisesti värjättyä kasvainsolujen tutkittiin myös tuottaa komposiitti H-pisteet (intensiteetti pisteet X prosenttia positiivinen, mahdollisten arvojen alueen 0-3,0). Hopea in situ -hybridisaatio (SISH) käytettiin määrittämään ErbB2 tilaansa ihmisen rintasyövän näytteitä [25]. Suhde ErbB2 /kromosomi 17 laskettiin jakamalla kokonaispistemäärä ErbB2 kokonaismäärällä pisteet kromosomi 17. Suhde 1,8 osoitti, että ErbB2-geeni ei ollut täydennetty, kun taas suhde 2,2 osoitti geenin monistus . Tapauksissa, joissa on suhde 1,8 ja 2,2, signaalit 20 lisää kasvainten tumat laskettiin kaikilta levyiltä ja uusi suhde laskettiin.

plasmidikonstrukteja ja solujen transfektio

täyspitkä cDNA-sekvenssi ihmisen PHLDA1 monistettiin genomisesta DNA: sta HCC827 soluja. PHLDA1 sitten modifioitu HA-tag: n C-päähän päällekkäin PCR erottaa johdettu plasmidi natiivin proteiinin ja subkloonattiin pcDNA3.1 (-) vektorin rungon. Tarkkuus konstrukti varmistettiin suoralla DNA-sekvensoinnilla. SKBR3-soluja transfektoitiin ohimenevästi tyhjä pcDNA3.1 (-) (pcDNA3.1 (-) – EV) tai PHLDA1 (pcDNA3.1 (-) – PHLDA1) ekspressiovektoreita käyttäen Fugene 6 (Roche Applied Science). Transfektoitu stabiilisti subkloonia valittu G418 pitoisuutena 500 ug /ml alkaen 48 h transfektion jälkeen.

Anchorage riippumattoman kasvun määrityksessä, ja migraatiokokeessa

kiinnityspisteen riippumattoman kasvun määrityksessä, pcDNA3.1 (- ) -EV ja pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 vakaa transfektoidut solut trypsinoitiin, laskettiin kahdesti hemosytometrillä, ja maljattiin 5000 solua /ml top tulpat koostuu 0,4% SeaPlaque agaroosia (FMC Bioproducts, Rockland, ME) McCoyn 5A välineellä. 25 vuorokauden kuluttua, pesäkkeet valokuvattiin ja laskettiin. Koe toistettiin kolme kertaa kolmen rinnakkaisen kukin. Keskimääräinen lukumäärä pesäkettä kustakin kokeen piirrettiin. Muuttoliikettä määrityksiä, konfluentteja yksisolukerrokset pcDNA3.1 (-) – EV ja pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 stabiileja transfektoituja soluja raaputettiin steriilillä 10 ui pipetin kärki. Tämän jälkeen levyt pestiin ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 10% FBS /McCoyn 5A-alustassa 48 tuntia.

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

Kaksi tuhatta pcDNA3.1 (-) – EV ja pcDNA3 0,1 (-) – PHLDA1 SKBR3-soluja maljattiin 6 cm: n maljoilla ja annettiin toipua 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin 0,1 uM tai 0,5 uM lapatinibi ja annettiin kasvaa 10 päivää. Seuraavaksi maljat värjättiin metyleenisinisellä 4 tuntia ja pesäkkeiden lukumäärä, joissa on enemmän kuin 50 solua määritettiin kunkin levyn. Joukko käsittelemättömän levyjä sisällytettiin kontrolleiksi määrittää maljaustehokkuus yksittäisten solulinjojen. Tehokas määrä solua /malja määritettiin perusteella maljaustehokkuus kunkin solulinjan ja solujen lukumäärä päällystetty levyä kohti. Näitä numeroita käytettiin sitten laskea prosenttiosuuden selviytymistä. Lisäksi jokainen käsittely suoritettiin kolmena rinnakkaisena, jotta voidaan määrittää SD datapisteen.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen chi-squared test tai kahden otoksen

t

-testaukset tarvittaessa kanssa

P

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tiedot edustavat kolmea erillistä koetta.

Tulokset

Lapatinibin ja PD168393 aiheuttaa kasvun hidastumisen ja apoptoosin ErbB2-positiivisten Calu3 ja SKBR3 solujen

ensimmäinen suoritettu MTS solujen kasvua määrityksiä tutkia estämällä ErbB2 lapatinibi palautuva dual EGFR /ErbB2-tyrosiinikinaasi-inhibiittorilla, tai PD168393, joka estää irreversiibelisti ErbB2, voi johtaa kasvun inhibition ErbB2-positiivisten syöpäsolujen, kuten ErbB2-positiiviset Calu3 keuhkosyövän ja SkBr -3 rintasyövän solulinjoissa. Huomasimme, että molemmat lapatinibi ja PD168393 estivät merkittävästi kasvua Calu3 ja SKBR3 soluja (Fig. 1A). Lisätutkimuksia käyttämällä anneksiini V värjäys osoitti, että sekä lapatinibi ja PD168393 aiheuttama näkyvä apoptoosia sekä Calu3 ja SKBR3 soluja (Fig. 1 B ja 1 C). BrdU-analyysi suoritettiin osoittamaan vähentää leviämisen näiden kahden solulinjojen lapatinibille hoitoon. Lapatinib käsitelty Calu3 solut osoittivat merkitsevästi korkeampi G

1 väestö vastaa G

1 pidätys verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 1 D) ja tämä vahvistettiin edelleen SKBr3 soluissa (kuvio S1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että lapatinib indusoi solukierron pysähtymisen G

1 vaihe ja myöhemmät apoptoosin Calu3 ja SKBR3 soluja. Jotta voidaan määrittää vaikutus alavirran signalointireittejä, fosforylaatio tasot MAP-kinaasin ja AKT reitit arvioitiin näiden kahden ErbB2-positiivinen solu malleja, ja kestävä salpaaminen sekä signalointireittien havaittiin (Fig. 1 E, kuva S2). Tämä havainto korreloi tulosten kasvun inhibitiomääritykset tehty, mikä viittaa siihen, että kasvun esto aiheuttamaa lapatinibi ja PD168393 voidaan säännellä tehokkaalla saarron MAP-kinaasin ja AKT polkuja.

. Cellular leviämisen Calu3 ja SKBR3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla lapatinibi ja PD168393 määritettynä MTS-määrityksellä. B. Lapatinibin ja PD168393 aiheuttaa solujen apoptoosin Calu3 ja SKBR3 soluja. Edustavia anneksiini V /propidiumjodidia virtaussytometrialla; luvut edustavat prosentteina solujen sopivan neljänneksessä. C. kvantifiointi apoptoosin. D. Lapatinibin indusoi solusyklin pysähtymisen Calu3 soluissa havaittuna BrdU ja 7-ADD määrityksessä. R1-G1 vaiheeseen; R2-G2 vaihe; R3-S-vaiheessa; R4-G0 vaihe. E. annosvaste Lapatinibin ja PD168393 fosforylaatiota ErbB2, AKT ja ERK vuonna Calu3 ja SKBR3 solujen vastauksena EGF hoitoon. p-ErbB2: fosforyloituu ErbB2; t-ErbB2: yhteensä-ErbB2; p-AKT: fosforyloituu AKT; t-AKT: yhteensä AKT; p-ERK: fosforyloituu ERK; t-ERK: yhteensä ERK.

karakterisointi resistenssin mutantti ErbB2-T798I

Seuraavaksi nähden satunnainen mutageneesistrategiasta arvioidakseen toissijainen mutaatioita ErbB2, jotka voivat aiheuttaa toiminnallisia resistenssin lapatinibille. Ensinnäkin koko transmembraani- ja tyrosiinikinaasin ErbB2 (asemat 1457-3191) oli satun- naisesti mutatoituja. Sitten mutagenisoidun ErbB2 oli uudelleen järjestetyt osaksi pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA selkäranka ja transfektoitiin SkBr-3-soluja. Olemme syntyy lääkeresistenttiä SkBr-3 solukloonien läsnä sekä 500 ug /ml G418: aa ja 1 umol /l lapatinibi ja tunnistetaan 9 erillisiä aminohapposubstituutioita, jotka vaikuttavat 5 jäännökset eristetty klonaalinen johdannaisia. Substituutioita viisi tointa: P944L (3 tapausta), T798I (2 tapausta), T798M (1 tapaus), C576S (1 tapaus), R487P (1 tapaus), ja E542G (1 tapaus). Kriittinen portinvartija treoniinitähteellä tapauksessa ErbB2 on T798- joka vastaa T790 EGFR sekä T315 ja ABL-kinaasin. Perustuen nukleotidisekvenssin ErbB2, se on merkittävästi enemmän todennäköistä, että mutaatio muuttaa sekvenssin T798I (vaatii yhden emäsparin muutos) verrattuna T798M (tarvitaan kaksi emäsparin muutokset). Näin ollen, T798I valittiin lisätutkimuksiin.

T798I regeneroitiin kohdennetulla mutageneesillä ja käytettiin väliaikaisen transfektion tutkimukset Cos-7-soluissa. PcDNA3.1 (-) – ErbB2-paino- Cos-7-soluissa, 1 umol /l lapatinib esti merkittävästi fosforylaatiota ErbB2. Sen sijaan pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I transfektantit, pysyviä ErbB2 fosforylaatio todettiin läsnäollessa Lapatinibin pitoisuuksina 0,1-10 umol /l, mikä vahvistaa muutos lääkeaineen herkkyys vastaa havaintoja MTS määritykset (Fig. 2A). Tämän havainnon varmistamiseksi, myös tuotti stabiilisti transfektoitu Calu3 solukloonin kanssa pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I-HA plasmidirakenteen ja sen on todettu hyvin johdonmukainen tulos (Fig. 2B). Arvioimme vastuksen tasoa että pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I siirrettävä lapatinibille tuottamalla annos-vaste käyrät MTS määrityksiä pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I vakaa transfektantit. Soluja viljeltiin, kun läsnä oli kasvavia pitoisuuksia lapatinibille vaihtelee 0-10 umol /l. pcDNA3.1 (-) – ErbB2-p- Calu3 solut voimakkaasti inhiboi lapatinib (IC

50, 2,3 mikromol /l). Calu3 solut, jotka ilmentävät pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I olivat vähemmän herkkiä lapatinibille kanssa IC

50, 6,5 mikromol /l (Fig. 2C).

. Annosvaste Lapatinibin ja PD168393 siitä fosforylaatiossa ErbB2 COS7-soluissa 24 tunnin kuluttua ohimenevän transfektion ErbB2-wt ja ErbB2-T798I vektoreita. Yhteensä ErbB2, HA ja GAPDH ekspressiotaso kontrollina. B. annosvaste Lapatinibin ja PD168393 fosforylaatiota ErbB2, AKT ja ERK in ErbB2-wt ja ErbB2-T798I vakaa Calu3 solukloonien. Yhteensä ErbB2 yhteensä AKT yhteensä ERK, HA ja GAPDH ekspressiotaso kontrollina. C. Annoksesta riippuvaa kasvun estämistä aiheuttama käsittelemällä lapatinibi ja PD168393 72 tunnin ajan ErbB2-wt ja ErbB2-T798I vakaa Calu3 solun kloonia havaitaan MTS-määrityksellä. D. Lapatinibin ja PD168393 aiheuttaa solujen apoptoosin ErbB2-wt ja ErbB2-T798I vakaa Calu3 solukloonien jälkeen 72 tunnin hoidon. E. kvantitointi apoptoosin.

analysoitava tarkemmin toiminnalliset seuraukset T798I arvioimalla solujen indusoiman apoptoosin lapatinib määrittelemien anneksiini /propidiumjodidia apoptoosin määrityksiä. Hoito pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt Calu3 solujen 1 umol /l lapatinibia johti näkyvästi korotus apoptoottisten solujen, kun taas saman pitoisuudet olisivat kannustaneet merkittävästi vähemmän apoptoosin pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I vakaa transfektanttien (Fig. 2D ja 2E). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​ohimeneviä transfektiotutkimuksissa harjoitetaan SKBR3 soluissa (kuvio S3, S4 ja S5).

Vaihtoehtoinen ErbB2 estäjä PD168393 voi voittaa vastustus

Seuraavaksi testasimme T798I Calu3 klooneja vastaan peruuttamatonta ErbB2 /EGFR estäjä PD168393. Suoritimme standardi MTS määrityksiä seuraavien 72 tunnin lääkehoidon avulla konsentraatioalueella 0-10 umol /l. Tuloksemme osoittivat, että PD168393 voisi voittaa T798I aiheuttamaa vastustusta lapatinibille (Fig. 2C). Tämä inhibiittori oli tehokas pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I vastaan ​​pcDNA3.1 (-) – ErbB2-paino- transfektantit. Signaaliproteiineja tutkimuksissa, huomasimme, että PD168393 täysin estää AKT ja ERK fosforylaatio niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 0,03 umol /L, jolloin voidakseen paremmin osoittaa loppupään signalointi muutos, käytimme konsentraatioalueella 0-0,1 umol /l. Signalointi tutkimukset osoittivat, että hoito PD168393 voi estävän tehokkaasti alavirran signalointia korreloi kuten fosfo-AKT ja ERK (Fig. 2B). ErbB2 fosforylaation taso solujen mutantti ErbB2 muutettiin mutta vähemmässä määrin PD168393 eston viittaavia estämällä osittain (Fig. 2B). Anneksiini /propidiumjodidia tutkimukset osoitti lisäksi, apoptoosin tämän yhdisteen sekä pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt ja pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I Calu3 solukloonien (Fig. 2D ja 2E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että T798I voisi olla tärkeä vastus mekanismin lapatinib saaneilla kasvaimia, mutta myös ehdottaa mahdollisia tehoa peruuttamatonta ErbB2 estäjien.

geeniekspressioprofilointi of Lapatinibin käsiteltyjä soluja

Seuraavaksi asetamme ulos tutkimaan kattavan valikoiman alavirran muutosten seurauksena tehokas ErbB2 eston. Aikaisemmin vastaavissa tutkimuksissa olemme osoittaneet, että jo 6 tunnin signaloinnin eston, peruuttamattomia EGFR estäjä, CL-387785 voisi aiheuttaa merkittävän muutoksen transkription pienessä ja edustava joukko keskeisiä alavirran efektorien onkogeenis- EGFR signalointi, mukaan lukien tärkeitä reitin osat, kuten sykliini D1, DUSPs jne EGFR mutantti keuhkosyövässä [1], [26], [27]. Vastaavalla tavalla, ryhdyimme tunnistamaan varhain efektoreina ErbB2 indusoi geenin ilmentymisen muutoksia ErbB2-positiivisten solujen. Tunnistaa keskeiset geenit ilmentyvät differentiaalisesti SKBr3 soluissa käsitelty lapatinib (1 umol /l) 6 tuntia, geeniekspressiovektoria profilointi Tutkimus tehtiin kolmena rinnakkaisena solujen kokonais-RNA käyttäen Affymetrix HG-U133A siruja. Raaka-ilmentyminen tietoja esikäsitellään, uudelleenskaalataan, suodatettiin ja analysoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Geenit muutettu lapatinib hoito on esitetty taulukossa S2. Tämä analyysi osoitti, että 110 markkerigeeni oli alassäädetty ja 73 geenejä säädellään ylöspäin kanssa tiukat kriteerit joukko ainakin 2 kertainen muutos ja Delta arvo 5, kun lapatinibia saaneilla näytteitä verrattiin vehikkelillä käsiteltyjen solujen (jäljempänä Delta-arvo on viritys parametri, joka voi dynaamisesti muuttaa kynnysarvoja merkityksen).

Vertailtaessa tämän geenin luettelon edellisessä tunnistetiedot geeni muuttuu, kun EGFR esto EGFR-riippuvaista keuhkosyövän soluihin [27], [28 ] oli merkittävä päällekkäisiä merkittävästi moduloidun geenien kahdessa riippumattomassa kokeessa (taulukko 1). Yli puolet geenien tunnistettu edellisessä tutkimuksessa geenin sääntelyä EGFR saarto merkittävästi moduloitu päälle ErbB2 esto in ErbB2-positiivisten syöpäsolujen sekä viittaa erittäin jaettu onkogeenisia reittejä. Kuusi alkuun ErbB2 /EGFR-geenien, DUSP6, DUSP4, PHLDA1, PHLDA2, CCNG2 ja DRE1 valittiin ja vahvistettiin voimakkaasti säännelty kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR-analyysi RNA saatujen lapatinib käsiteltyjä soluja (Fig. 3) .

kvantitatiivinen PCR-analyysi geenin sääntelyä lapatinib hoito 6 tuntia SKBr3 ja Calu3 soluja. Kertainen induktio suhteessa 0 tunti kontrolli piirrettiin normalisoinnin jälkeen by GAPDH. Δ: p 0,05; X: p 0,01; †: p 0,005; *: P 0,001.

PHLDA1 säätyy alas by EGFR /ErbB2 esto

päätti keskittyä uuden loppupään kohdegeenin, PHLDA1 proteiinina että ei ole aiemmin tunnistettu osallistumaan ErbB2 /EGFR ajettu reittejä. Tämä geeni kuuluu ryhmään pleckstrin-homologiadomeeni proteiinien ja on spekuloitu toiminnon kautta häiritsee toimintaa PI3-kinaasi siten estämään AKT aktivointi perustuu työhön toisen perheenjäsenen, PHLDA3 [29]. Esim.