Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

hedgehog-signalointia polku on tärkeä rooli EMT haimasyövän soluja, mutta tarkat mekanismit ovat edelleen epäselvää. Koska S100A4 keskeisenä EMT moleculer markkeri havaittiin voimistuvan kun Gli1 haiman syöpäsoluissa, keskityimme suhdetta Shh-Gli1 signaaleja ja S100 geenien perhe.

Methods

On base cDNA microarray data, tutkimme säätelevä mekanismi Gli1 joidenkin jäsenten S100A geenien perheen haimasyövän solulinjoissa ensiksi. Sitten sääntely Gli1 ja S100A4 geeniä tutkittiin molekyylibiologian määrityksiä ja pro-etäpesäke effection of Gli1 riippuvaisten S100A4 tutkittiin in vitro. Lopuksi ilmauksia Shh, Gli1, S100A4 ja E-kadheriinin haimasyövän kudoksissa tutkittiin käyttäen immunohistokemiallista määritystä määrityksiä.

Tulokset

viisi jäsentä S100 geenien perhe, S100A2, S100A4, S100A6, S100A11, ja S100A14 todettiin vaimentua merkittävästi kun Gli1 knockdown. Gli1 tehostajana ennustus yhdistämällä in vitro saadut tiedot osoittivat, että Gli1 ensisijaisesti säätelee S100A perheenjäsenten kautta cis-toimivia elementtejä. Itse asiassa tulokset osoittavat, S100A4 ja vimentiinin geenit voimistunut merkittävästi Shh /Gli1-ilmentyminen lisääntyy ja E-kadheriinin väheni merkittävästi samanaikaisesti. Migraatio PC-solujen lisääntynyt merkittävästi annoksesta riippuvalla tavalla Gli1 ilmentymisen (P 0,05) ja siS100A4 merkittävästi käänteinen vaste PC-solujen aiheuttama L-Shh transduktion (P 0,01).

Johtopäätös

data muodostaa uusi yhteys Shh-Gli1 signalointi ja S100A4 sääntely, jotka edellyttävät, että S100A4 voisi olla yksi tärkeimmistä tekijöistä EMT välittämä Shh-Gli1 signalointia haimasyövän.

Citation : Xu X, Su B, Xie C, Wei S, Zhou Y, Liu H, et al. (2014) Sonic Hedgehog-Gli1 signalointireitin Säätelee epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon (EMT) välittämällä uusi tavoite Gene, S100A4, haiman syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (7): e96441. doi: 10,1371 /journal.pone.0096441

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. maaliskuuta 2013. Hyväksytty: 08 huhtikuu 2014; Julkaistu: 29 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustusta National Natural Science Foundation of China (81072005, 81172312 ja 81101839). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi johtavista syistä syöpään liittyvää kuolleisuutta teollistuneissa maissa [1]. Huono prognoosi tämä tauti on lähinnä sen varhainen systeeminen etäpesäke [1] – [3]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) voi olla tärkeä mekanismi, haimasyövän soluja irtoamasta primaarikasvaimen päällä ja leviää kaukaisiin elimiin. Kuitenkin EMT-aloittavat signalointireittien jäädä hämäräksi nyt haiman syöpäsoluja. Äskettäin hedgehog (Hh) signalointireitin on osoitettu olevan tärkeä promoottori kasvaimen kasvun useita ruoansulatuskanavan syöpien [4], [5]. Kuten haimasyövän, on osoitettu, että poikkeava aktivaatio Hh-signalointireitin on seurausta sonic hedgehog (Shh) yli-ilmentymisen useimmissa tapauksissa [6] – [8]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että pääasiallinen mekanismit Hh-signalointireitin syöpäsoluissa oli edistää epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) prosessi, [9] – [11]. Lisäksi on osoitettu, että estää tämän reitin esti merkittävästi etäpesäkkeiden kasvainsolujen in vivo ja in ksenograftimalleissa [12], [13].

Koska kohdegeenien Gli1 olivat avain mekanismeja Hh-signalointireitin, yritimme ymmärtää sen pro-metastasoitunut mekanismien identifing tavoitteet Gli1 haiman syöpäsoluja. Keskeisenä pro-metastasoitunut kohdegeenin of Gli1 haimasyövän sillä on oltava seuraavat ominaisuudet: Ensinnäkin, on olemassa tehokkaita Gli1 cis-toimivia elementtejä sen geenin sekvenssi; Toiseksi, sen transkriptio oli säätelee positiivisesti Gli1; Kolmanneksi se upregulated useimmissa haimasyövän kudosten ja sen ekspressiotaso korreloi positiivisesti Hh signalointi; Neljänneksi, sen on oltava keskeinen pro-metastasoitunut toiminnallinen tekijä. Aiemmissa tutkimuksessa olemme suorittaneet systemaattista tutkimusta siitä kohdegeenin profiilien päälle Gli1 korkean metastasoituneen haimasyövän solulinja kautta cDNA microarray ja totesi, että 5 jäsentä tämän geenin perheensä voimistuvan Gli1. Erityisesti niitä S100A4 keskeisenä moleculer merkki edistää EMT prosessi haimasyövän havaittiin voimistuvan enemmän kuin 3 kertaa tässä tutkimuksessa. Pohjassa näistä tutkimuksista olemme keskittyneet suhdetta Shh-Gli1 signaaleja ja S100 geeniperheen.

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet Gli1 biding sivustot DNA-sekvenssit S100 geenien perheen bioinformatiikan työkaluja ja tietokantoja. Lisäksi olemme pyrkineet tunnistamaan uusia yhteyksiä Shh-Gli1 signalointireitistä S100 geenien perheen ja osoittaa pro-metastasoitunut toiminta S100A4 geenin välittämien Shh-Gli1 signaaleja haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

ihmisen PC solulinjat, BxPC3, AsPC-1 ja Panc-1, olivat kaikki kaupalliset solulinjojen ja saimme nämä solulinjat instituutista Sytologia Kiinan Academy of Science.These solun linjat käytetään laajasti haimasyövän tutkimuksen [14] – [18]. Kolme solulinjat olivat kaikki viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2 ilmassa.

Vektorit rakentaminen ja solujen infektio

Lentivirusvektorikonstruktit siosiirtovektoreita ihmisen Gli1 shRNA tai Shh cDNA konstruoitiin Genechem Co., Ltd, Shanghai, Kiina. Tämä järjestelmä sisältää lentivirusvektorilla pLVTHM, kääriä plasmidi pMD2G, ja pakkaus plasmidi pRSV-REV ja pMDlg-pRRE. Lentivirus-Shh (L-Shh) sisälsi 3,3 kb: n koodaava sekvenssi Shh ja lentivirus-Gli1i (L-Gli1i) sisälsi Gli1 pieni hiusneula-RNA (5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3 ’) on suunnattu sekvenssin shRNA kuin aikaisemmin kuvatulla tavalla [19]. Lentivirus-ohjaus (L-C), joka ei sisältänyt Gli1 häiriöitä sekvenssit tai Shh-cDNA-sekvenssien toimi kontrollina. Lopuksi lentiviruksen konstruktit todennettiin DNA- sekvensoinnilla tarkkuuden varmistamiseksi. Rekombinantti lentivirukselle tuotettiin lyhytaikaisella transfektiolla 293T-solujen seuraavista vakioprotokolla. Kun BxPC3, AsPC-1 ja Panc-1-solut olivat noin 50% konfluentteja RPMI-1640, joka sisälsi 2% FCS: ää, ne infektoitiin lentivirus konstruktien MOI 5. Solut kerättiin 72 tunnin jälkeen lisäkokeita varten. Tunnistaa toiminnallinen L-Shh ja L-Gli1i rakentaa, me rutiininomaisesti analysoidaan Shh ja Gli1 ilmentyminen qRT-PCR ja western-blottauksella.

S100A4 Ohimenevä Knockdown

Käytimme RNAi-sekvenssin (siS100A4 ) ja negtive kontrollisekvenssin (siS100A4 MIS), joka on osoittanut tehokkaan knockdovvn S100A4 ihmisen paksusuolen syövän HT29 aiemmassa raportissa [20]. S100A4 Knockdown seurattiin määrittämällä sen mRNA ja proteiini tasoilla kuluttua 48 h upon siRNA transfektion vastaavasti. Ja sitten soluja käytettiin Transwell määrityksissä. Solut lipofektio kanssa siRNA: t käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in mukaan valmistajan ohjeiden.

RNA uuttamisen ja reaaliaikainen RT-PCR-määrityksissä

Yhteensä RNA-näytteet uutettiin Trizol reagenssilla (Invitrogen ) mukaan valmistajan protokollan ja 100 ng kokonais-RNA: ta, tehtiin käänteistranskriptio 20 ul: n tilavuudessa ja 2 ui cDNA: ta käytettiin PCR mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. (Takara Biotechnology, Dalian, Kiina). Alukesekvenssejä nähtiin taulukossa 1. CT (sykli raja) arvot vakioidaan CT arvoja GAPDH.

Protein uuttamisen ja Länsi-blotting määrityksissä

Yhteensä proteiinia näytteistä uutettiin RIPA puskuri standardin menetelmällä ja näytteet normalisoitiin proteiinipitoisuus kaupallista kittiä (Bio-Rad Company). Yhtä suuret määrät proteiinia käytettiin western-blotting määrityksissä mukaan vakioprotokolla Shh, Gli1, S100A4, E-kadheriinin, VIM (vimentiinistä) ja GAPDH havaitsemiseen.

TranswellTM määrityksissä

Cell invaasiomääritys-24 näytettä sarjat (Chemicon, Bedford, MA) käytettiin tutkimaan hyökkäyksen /kulkeutuminen PC solulinjoissa. 24 tunnin kuluttua inkuboinnin maahanmuutto laskee PC-solut hankittiin valokuvaamalla kalvon läpi mikroskoopilla. Laskee otettiin 5 korkeimmalla soluissa alueilla suurella teho suurennus (x 200). Keskiarvon aloilla laskettiin pidettiin siirtyminen lasken PC soluja.

Euroopan Formaldehydi Ristisilloitetuista Kromatiini Immunosaostaminen (XChIP) määritykset

XChIP määritykset suoritettiin kuten aiemmat tutkimukset [21]. Lyhyesti, kromatiiniin AsPC-1-soluja (3 x 10

7) kerättiin 1 ml: IP-puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoria cocktailit. Chromatin leikattiin käyttämällä sonikaattorilla jää laatikkoon (6 kierrosta 10s pulssien, 350 W, 60 sekunnin välein) ja silloitus purettiin lisäämällä 20 ui 5 M NaCl yön yli 65 ° C: ssa. DNA uutettiin käyttäen fenoli /kloroformilla määrityksessä. 20 ui DNA: ta ajettiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeelillä, ja loput käytettiin INPUT DNA. ChIP-luokan vuohen polyklonaalinen Gli1 vasta-aineella (0,1 ug /ml) (Santa Cruz Company) käytettiin immunosaostukseen, hiiren IgG: tä (0,1 ug /ml) (Santa Cruz Company) lisättiin satunnainen ohjaus, RNA-polymeraasi II-vasta-aineen (0,1 ug /ml), positiivisena kontrollina, ja β-aktiini-vasta-ainetta (0,1 ug /ml) negatiivisena kontrollina. Alukkeen promoottorialueen GAPDH (Santa Cruz Company) käytettiin negatiivisena kontrollina. (Taulukko 2).

lusiferaasireporttiterilla vektorit määrityksissä

S100A4 promoottori lusiferaasireportterista vektorit rakennettiin Genechem Co., Ltd, Shanghai, Kiina. Lyhyesti, 1,5 kb: n cDNA-fragmentti (-766-734 ihmisen S100A4 geenin) XhoI: llä ja Hindlll-kohtien syntetisoitiin ja kloonattiin XhoI ja HindIII-kohtiin pGL3 perus sivektorissa tuottaa pGL3-1.5 S100A4, joka sisältää kolme Gli1 biding sivustoja [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) ja CTGGTGGGG (126~134)]. Vuonna mutageneesi vektorit, Gli1 mahdollisia sitoutumiskohtia sekvenssit otsakkeilla GATTCTTAA sekvenssi, joka ei ole tunnettuja sitoutumiskohtia tahansa transkriptiotekijöiden [22]. Yksittäinen Gli1 biding site mutageneesin vektorit sisältyvät pGL3-1.5 S100A4 Mut 1 [GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) ja CTGGTGGGG (126~134)], pGL3-1.5 S100A4 Mut 2 [ACCCACCAC ( -349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) ja CTGGTGGGG (126~134)] ja pGL3-1.5 S100A4 Mut 3 [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) ja GATTCTTAA (126~134)]. Moninkertainen Gli1 sitoutumiskohtia mutageneesi vektorit sisältyvät pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-2 [GATTCTTAA (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) ja CTGGTGGGG (126~134)], pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-3 [ ,,,0],GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) ja GATTCTTAA (126~134)] ja pGL3 1,5 S100A4 Mut 2-3 [ACCCACCAC (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235 ) ja GATTCTTAA (126~134)]. Lopulliset vektorikonstrukteja todennettiin DNA- sekvensoinnilla tarkkuuden varmistamiseksi. AsPC-1-solut transfektoitiin 5 ug: lla joko pGL3-1500 S100A4 tai pGL3-1500 S100A4 mutantti-rakenteet ja 2 ug Renilla lusiferaasin konstrukti (pGL4.75, Promega) sisäisenä kontrollina normalisoinnin käyttäen Lipofectin-reagenssia menetelmä protokollaa. 48 tuntia transfektion jälkeen, AsPC-1-soluja käytettiin Lusiferaasimäärityksiä mukaisen protokollan dual lusiferaasireportteri- kit (Promega) ja volues oli readed käyttäen luminometriä. Jokainen koe toistettiin ainakin 3 kertaa, joka kerta kolmena kappaleena.

Potilasnäytteet

Tässä työssä 102 kallisteta parafinoidut syövän kudoksissa eri PC potilasta (63 miestä ja 39 naista , keski-ikä 56,7 vuotta, vaihteluväli 44-75 vuotta) analysoitiin immunohistokemiallisesti. Kaikki potilaat ovat sopineet tätä tutkimusta. Kaikki näytteet on saatu kymmenes ihmisten sairaala Tongji yliopiston, Kiinan ja kaikki potilaat ovat allekirjoittaneet suostumuksen asiakirja, jossa ne sopivat, että kirurginen maligniteetin käytettäisiin lääketieteelliseen tutkimukseen ennen toimintaansa. Etiikka valiokunnat Tongji yliopistojen hyväksyi lupamenettelyssä ja tutkimukset.

immunohistokemia määrityksissä

parafinoidut PC kudoksia käytettiin tunnistamiseen Shh, Gli1, S100A4 ja E-kadheriinin. Shh polyklonaalinen vasta-aine hankittiin R 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Differential ilmentymistä S100 geeniperheen upon Gli1 in AsPC-1-soluissa

rajata geenin ilmentyminen indusoitiin Shh-Gli1 signaalit haiman syöpäsoluissa, AsPC-1 soluja käytettiin cDNA microarray määritykset vertaamalla lentivirus-ohjaus vs lentivirus-Gli1i soluja. Kun keskitytään EMT liittyvien geenien cDNA tiedot, löysimme positiivista suhdetta Shh signaaleja ja S100 geenien perhe [21]. Meidän näyttö (ekspressiosignaaleita mukana 23 jäsentä S100 geenien perheen paitsi S100A17 ja S100A18) 10 geenejä, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P ja TCHH, ilmennettiin ja 13 geenit, S100A1 , S100A12, S100A3, S100A5, S100A7, S100A15, S100A8, S100A9, S100B, S100G, S100Z, RPTN ja FLG ei ilmaistu AsPC-1-soluissa. Vertailu analyysi lentiviruksesta-kontrolliryhmän vs. lentivirusta-Gli1i ryhmä solut osoittivat, että S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 ja S100A14 oli voimistunut upon Gli1. (Kuvio 1A). Kymmenen geenit, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P ja TCHH, poimittiin validointi reaaliaikaisella RT-PCR. Kuten osoitti kuviossa 1B, S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 ja S100A14 todettiin voimistuvan, ilman merkittäviä muutoksia muissa viisi geeniä. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​että saatu cDNA mikrosiru.

V: cDNA mikrosiru tietoja S100 geeniperheessä; B: Ero ekspressiotasot osittaisen jäsenten S100-geenin perheen qRT-PCR. Ilmaus GAPDH on kontrollina. *

P

0,05, **

P

0,01.

Ennustettu Gli1 biding sivustoja ja otaksuttu Gli1 kohde- geenien S100A geeniperheessä

lisätutkimuksia mekanismia Shh-Gli1 signalointireitin sääntelystä S100 geeniperheen, me ladannut DNA-sekvenssit S100A geenien geenipankki ja analysoitiin homologisia jaksoja Gli1 biding sivuston (GACCACCCA) hyödyntämällä Blastz bioinformatiikka työkalu . Bioinformatiikan tiedot osoittivat, että lähes kaikki jäsenet S100A geeniperheen sisältää useita erittäin konservoituneita homologiset sekvenssit (ero ei ole enempää kuin yksi tukiasema) ja näiden oletettujen Gli1 biding sivustoja näytteillä ominaisuudet klusterin järjestely. Taulukossa 3 osoitti oletetun Gli1 biding sivustojen proksimaalisen säätelyalueen sisältävä intergeeniset alueita, geeninsisäiset alueet, untranscripted alueet ja transloimattomat alueet (enintään 5,0 kb päässä TSS). Tiedot luultavasti confered hieman korkeampi yleinen verran näyttöä siitä, että nämä ehdokkaat ovat itse asiassa ilmentyvät eri asettamisessa haimasyövän, mahdollisesti alavirtaan tavoitteiden olevan poikkeavasti uudelleen.

Uusi kohdegeenin ja sen tehokas Gli1 sitoutumiskohtia tunnistamisen AsPC-1

PCR alukkeet XChIP määritykset suunniteltiin mukaan 1,5 kb pituinen promoottori sekvenssit S100A2, A4 ja A6 geenejä, jotka sisältävät useita ennustettu Gli1 biding sivustoja (64~72 , 326~334, 418~426 varten S100A2, -349~-357, -227~-235, 126~134 varten S100A4, -246~-254, 786~794 varten S100A6. homologiaa kunkin sivuston on 89%. ). (Taulukko 3). Tulokset XChIP määritykset osoittivat, että transkriptiotekijän Gli1 sidottu promoottorit S100A2, 4 ja 6-geenien vastaavasti viljeltiin AsPC-1-soluja (kuvio 2).

M: DNA Marker; PC: RNA-polymeraasi II-vasta-aineen XChIP positiivisen kontrollin; IP: Gli1 XChIP; IGG: hiiri IgG XChIP pistokokeet NC: p-aktiini-vasta-aineen XChIP negatiivisena kontrollina.

tulokset Lusiferaasimäärityksiä osoittivat, että promoottorin toiminta pGL3-1500 S100A4 lisääntyi ekspressiotasojen Gli1 geenin annoksesta riippuvaisella tavalla (

P

0,05). PGL3-1.5 S100A4 Mut 2 tai 3 ei ollut merkittävää vaikutusta lusiferaasiaktiivisuuteen (

P

0,05), mutta pGL3-1.5 S100A4 Mut 1 pieneni lusiferaasivaikutusta merkittävästi verrattuna pGL3-1.5 S100A4 (

P

0,05), mikä viittaa siihen, että sivusto 1 voisi olla lisääjinä Gli1. Lusiferaasiaktiivisuutta Plasmidien sisältää sivuston 1 kasvoi merkittävästi (

P

0,01) ja plasmideja sisältävät sivuston 2 tai 3 ei muuttunut merkittävästi (

P

0,05). (Kuvio 3A, B, C). Sekvenssi sivuston 1, ACCCACCAC, oli myös osoitettu, on tunnustettava ja sis-aktivoidaan Gli1 proteiinit aiemmin [24], [25].

V: S100A4 lusiferaasivaikutusta suurenee ekspressiotason SHh AsPC-1-soluja. PGL3-1.5 S100A4 ja Renilla lusiferaasin vektorit transfektoitiin väliaikaisesti L-Gli1i tartunnan, L-C-tartunnan tai L-Shh tartunnan AsPC-1-soluissa. Tulokset normalisoitiin trans- fektiotehokkuuden käyttäen Renilla lusiferaasi ja L-C-tartunnan ryhmä mielivaltaisesti annetaan arvo 1. B: Suhteellinen lusiferaasin aktiivisuuden S100A4 promoottorin Gli1 sitoutumiskohdan mutanttien. AsPC-1-solut transfektoidaan L-Shh transfektoitiin lyhytaikaisesti 5 mg kunkin reportteri-konstrukti, kuten pGL3-1.5 S100A4, pGL3-1.5 S100A4 Mut1, Mut2 ja Mut3 vastaavasti. PGL3-1.5 S100A4 mielivaltaisesti annetaan arvo 1 ja toiminnan muiden transfektioista säädettiin suhteessa tähän toimintaan. C: Site 1 oli vastuussa Gli1 transkriptio. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus eri AsPC-1 solun ryhmiä, L-Gli1i infektio, L-Shh infektio tai LC infektio, transfektoitiin eri konstruktien, pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-2, Mut 2-3 ja Mut 1-3 Renilla lusiferaasin vektoreilla . Tulokset normalisoitiin transfektion tehokkuutta käyttämällä Renilla lusiferaasi ja LC tartunnan ryhmä mielivaltaisesti annetaan arvo 1. *

P

0,05, **

P

0,01.

asetukseen Shh-Gli1 signaaleja ilmaus S100A4 ja hyökkäys /kulkeutuminen PC solujen välittämällä S100A4 in vitro

lisätutkimuksia pro-etäpesäke funktio Gli1 johdettujen S100A4 haiman syöpäsolut, viisi ryhmää PC soluja, L-Gli1i, LC, L-Shh, L-Shh + siS100A4 MIS ja L-Shh + siS100A4, käytettiin analize sääntelyä Shh-Gli1 signaaleja S100A4, E-kadheriinin ja VIM geenit reaaliaikaisella RT-PCR ja western-blotting määrityksissä. Ja sitten sama viisi ryhmään soluja käytettiin arvioimaan invaasio /kulkeutuminen PC-solujen

in vitro

mukaan Transvvell- määrityksiä. Tulokset qRT-PCR ja western-blottauksella osoitti, että ekspressiotasot S100A4 ja VIM geenit nosti merkittävästi Shh /Gli1-ilmentyminen lisääntyy. Sitä vastoin ilmentymistasot E-kadheriinin vähensi merkittävästi samaan aikaan. (Kuvio 4A, C). Lisäksi S100A4 tippuu alas signifiantly päinvastaiseksi vaimentua E-kadheriinin ja voimistunut VIM aiheuttama L-Shh transduktio. (Kuvio 4B, D). Tulokset siirtokuoppaan määritysten osoitti muuttoa PC soluja merkitsevästi väheni L-Gli1i ryhmä ja kasvoivat L-Shh-ryhmässä verrattuna L-C-ryhmä (

P

0,05). (Kuvio 4E). Lisäksi siS100A4 merkittävästi käänteinen vaste PC solujen aiheuttama L-Shh transduktio (

P

0,01). (Kuva 4F). Näin ollen vaikuttaa siltä, ​​että S100A4 välittämä abnomal aktivoitu Shh-Gli1 signalointireitistä voisi olla yksi keskeinen pro-muuttoliikettä tekijät haiman syöpäsoluja.

V: Suhteellinen transkriptiotasoja Shh, Gli1, S100A4, E- kadheriinin ja vimentiinista säädeltiin L-Gli1i /L-Shh transduktio. B: Suhteellinen transkriptiotasoja S100A4, E-kadheriinin ja vimentiinista L-Shh transfektoidut solut päinvastaiseksi siS100A4 transduktion. C: Ilmaisu tasot Gli1, S100A4, E-kadheriinin ja vimentiinin proteiineja säätelee L-Gli1i /L-Shh transduktion. D: Ilmaisu tasot S100A4, E-kadheriinin ja vimentiinin proteiinit päinvastaiseksi siS100A4 transduktion. E: Invaasio /kulkeutuminen haimasyöpäsoluissa säätelee L-Gli1i /L-Shh transduktio analysoitiin Transvvell- määrityksiä. F: Invaasio /kulkeutuminen L-Shh transfektoidut solut päinvastaiseksi siS100A4 transduktion. *

P

0,05, **

P

0,01.

Korrelaatio ilmaisua Shh, Gli1, S100A4 ja E-kadheriinin proteiinien PC kudokset

tulokset immunohistokemian osoittivat, että positiivinen värjäykset Shh. Gli1 ja S100A4 proteiinit lokalisoitu lähes yksinomaan neoplastisten solujen vieressä heikosti positiivinen värjäytyminen Shh saarekesolujen ja krooninen pancreatitic kanavan monimutkainen ajoittain nähdään haiman kudoksista paitsi syöpään. Sitä vastoin proteiini ilmentymistä E-kadheriinin oli merkittävästi vaimentua PC kudoksissa verrattuna normaaliin kasvaimeen viereisiin kudoksiin. Värjäytymiskuvioissa Shh ja S100A4 oli diffuusi sytoplasman tyyppi, että E-kadheriinin oli diffuusi cytomembrane tyyppi ja että Gli1 näyttää perinuclear sytoplasmista ja tumavärjäystä. Koska Gli1 on aktivoitu vasta syöttämällä ytimen, näytteet vain sytoplasminen värjäys laskettiin, kuten negatiivinen ilmaus. (Kuva 5). Immunoreaktiivisuus suhteet olivat 78,43% ja Shh (80 102), 51.96% ja Gli1 (53 102), 81,37% ja S100A4 (83 102) ja 48.04% E-kadheriinin (49 102) PC näytteissä. Spearman rank testi osoitti, että merkittäviä myönteisiä korrelaatioita välillä ei havaittu Shh, Gli1 ja S100A4 proteiinitasolla PC (Shh vs Gli1: CC = 0,697,

P

0,01; Shh vs S100A4: CC = 0,476,

P

0,01; Gli1 vs S100A4: CC = 0,510,

P

0,01). Sitä vastoin merkittäviä kielteisiä väliset korrelaatiot kolmen proteiinin ja E-kadheriinin vahvistettiin (Shh vs E-kadheriinin: CC = -0,278,

P

0,01; Gli1 vs E-kadheriinin: CC = -0,207,

P

0,05; S100A4 vs E-kadheriinin: CC = -0,285,

P

0,01).

V: Vahva sytoplasmista värjäytymistä Shh haimasyövän solut (x 400); B: heikosti positiivinen värjäytymistä Shh duktaalisessa monimutkainen krooninen haimatulehdus kudosten (x 400); C: heikosti positiivinen värjäytymistä Shh saarekesolujen normaalin syövän puolen kudos (x 200); D: negtive värjäytymisen Shh normaaleissa duktaalisessa epiteelisolujen /asinussolut syövän puolen kudoksen (x 200); E: Syöpäsolut vahvana tumavärjäystä varten Gli1 ja normaaliin syövän puolella kudokset negtive (x 400); F: Voimakas positiivinen perinuclear soluliman ja osa tumavärjäystä varten Gli1 haiman syöpäsoluissa (x 400); G: Voimakas positiivinen sytoplasmista värjäytymistä S100A4 haiman syöpäsoluissa (x 400); H: Positiivinen sytoplasmista värjäytymistä E-kadheriinin haiman syöpäsoluja. Mustat nuolet osoittavat positiivista värjäytymistä alueen ja valkoiset nuolet osoittavat negtive värjäystä alueella.

välinen korrelaatio ilmaisu neljä proteiinien ja kliinis-PC potilaiden

tilastollinen analyysi tiedot osoittivat, että ekspressiotasot Shh (CC = 0,245,

P

0,05 ja CC = 0,254,

P

0,05) ja S100A4 (CC = 0,265,

P

0,01 ja CC = 0.220,

P

0,05) proteiinit korreloi positiivisesti kasvaimen koon ja imusolmukemetastaaseja ja että Gli1 proteiini korreloi positiivisesti imusolmukemetastaaseja (CC = -0,370, P 0,05). Kuitenkaan mitään merkittävää korrelaatiota ei havaittu näiden neljän proteiinien ja ikä, sukupuoli, kasvaimen sijainti ja erilaistumista.

Keskustelu

aikana kudosta morphogenesis aktivoinnin Hh-signalointireitin melkein mukana esiintyminen EMT ja tämän prosessi edellyttää muuttoa Hh-reagoivien solujen [26], [27]. Kerrottiin, että mekanismit Shh-Gli1 signalointireitin edistää pahanlaatuisia kasvaimia mukana monessa pahanlaatuisia biologista käyttäytymistä, mutta sen tärkein tehtävä kasvaimissa on edistää EMT ja ylläpitää kasvain kantasolujen [28]. Tässä tutkimuksessa, tarjoamme järjestelmällistä tutkimusta siitä mekanismi Gli1 high-etäpesäke haimasyövän solulinja, AsPC-1. AsPC-1 solulinja sisältää sekä Ki-ras-geenin mutaatio ja DPC4 geenideleetio-, jotka olivat tyypillisiä haimasyöpä molekyyli- patologinen muutos [29], [30]. Lisäksi ilmaisu taso Gli1 pudotettiin kohtuullisesti käyttämällä RNA-interferenssi-järjestelmän, joka oli sopusoinnussa todellinen molekyylitason patologinen muutos haimasyövän kuin keinotekoinen geeni tyrmäyksellä. Joten kohdegeenin spektri meidän seulonta oli sopusoinnussa todellisen tilanteen haiman syöpäsoluja.

Tähän mennessä ainakin 25 jäsentä on raportoitu kuuluvan S100 perheeseen ihmisillä. Kaksikymmentä yksi niistä on koodattu geenit ryhmittyneet kromosomissa lokukseen 1q21, joka tunnetaan nimellä epidermaalinen erilaistumista kompleksi (EDC), joissa epiteeli- johdettujen solun erilaistumista [31]. On raportoitu joitakin tämän perheen jäseniä oli yli-ilmentynyt eri syöpätyyppeihin ja niiden toiminnot saattavat mukana etäpesäke ja EMT [32] – [34]. EDC sisältää kaksi ryhmää peräkkäin jaetaan S100A geenejä. Yksi ryhmä sisältää S100A1, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2-S100A7, S100A15, S100A8, S100A12 ja S100A9 ja toinen sisältää FLG, HRNR (S100A18), RPTN, TCHH, TCHH1 (S100A17), S100A11 ja S100A10. Muut geenit kuuluvat alaryhmää S100B, S100P, S100Z ja S100G ovat, vastaavasti, joka sijaitsee kromosomissa loci 21q22, 4p16, 5q14 ja Xp22. Se oli raportoitu, että S100A geenit oli yhteinen alkuperä on molekyylievoluutio taas S100B, ja S100P, S100Z ja S100G oli eri alkuperää, joten S100A geenit saattavat olla universaali säilytetty säätelysekvenssejä [35]. Koska niiden hyvin säilyneitä Gli1 sitova homologisia sekvenssejä, on arveltu, että niillä samanlainen rooli liittyvä Gil1, mutta emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että niillä on erilaisia ​​tehtäviä, jotka eivät liity Gil1. Tuloksemme ehdotti, että ilmaus S100A geenien perheen PC-soluissa on kolmella tavalla: Ensinnäkin, jotka ilmentävät ja riippuen Gli1; Toinen, jotka ilmentävät mutta ei riippuen Gli1; Kolmas, eivät ilmennä. Yhdistäminenkin Gli1 tehostajana ennustus microarray data, me arveltu, että Gli1 säännelty S100A geenien kautta cis-toimivia elementtejä voisi olla keskeinen tila sääntelyä. Edellinen tutkimus oli ilmoittanut, että S100A7 ja S100A9 transkriptio indusoitiin GlI1 käsittely orvaskeden solujen [25]. Aikana evoluutioprosessin jotkut S100A geenejä ilmaisu saattaa olla pois päältä johtuen saada tuntemattomia repressorisekvenssiä ja sitten jotkut näistä geeneistä voi kytkeä uudelleen päälle, mutta ei enää säädeltiin Gli1 seurauksena saada lisää cis-toimivia elementtejä. Tämä hypoteesi saattaa osittain tulkita miksi ilmaisua S100A perhe on ominaista kudosselektiivisyyttä vaikka se on edelleen ollut riittävää näyttöä. Yksityiskohtainen vertaileva genomiikka tutkimusten välillä erillisten lajien sekä eri S100A geenien voisi auttaa kauemmas ymmärtämään tarkkaa mekanismia. Meidän mikrokoetta ja sitä seurannut real-time PCR tutkimuksissa useita S100A geenejä, mukaan lukien S100A2, S100A4, S100A6, S100A11, ja S100A14, ilmentyivät vastauksena Gil1. Useat näistä S100A geenejä, kuten S100A2, A4 ja A6 on osoitettu olevan mukana haimasyöpä. Tässä tutkimuksessa tiedot XChIP määritykset osoittivat, että transkriptiotekijän Gli1 sidottu säätelysekvenssien S100A2, A4 ja A6-geenien vastaavasti AsPC-1-soluissa, mikä viittasi siihen, että nämä geenit voivat olla cis-säätelevät Gli1.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että toiminnot S100 geeniperheen jäsenet olivat monimuotoiset ja toistaiseksi vain S100A4 todettiin tiiviisti EMT prosessiin. Lisäksi aikaisemmissa tutkimuksissa olemme ehdottaneet hypoteesia, jonka mukaan S100A4 geeni saattaa olla yksi avaintekijöistä EMT molekulaariverkosto säätelee Shh-Gli1 signalointireitistä haiman syöpäsoluissa [19]. Näin ollen, S100A4 geeniä käytettiin esimerkkinä tutkia suhdetta Shh-Gli1 signaaleja ja S100-geenin perhe. Koska itse asiassa, lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että S100A4 proteiini tasoilla syöpäkudoksessa, haiman mehu ja seerumin potilaiden haimasyöpä lisääntyivät merkitsevästi [36] – [38]. Jotkut tutkimukset ovat antaneet ymmärtää, että S100A4 voidaan käyttää mahdollisena biomarkkeri haimasyövän [39]. Miksi kuitenkin S100A4 geeni yliekspressoitui valikoidusti PC oli epävarmaa. Ehkä S100A4 geeni voitaisiin säädellä tiettyjen aktivoidaan selektiivisesti signalointireitin samalla haimasyövän. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensimmäisen kerran havaittiin, että ekspressiotasot S100A4 proteiinia korreloi positiivisesti aktiivisuutta Shh-Gli1 signaalit haimasyövän kudoksissa ja Gli1 proteiinin ilmentyminen lisääntyy S100A4 mRNA kautta cis-aktivaation tavalla PC-solut, jotka perustanut tarkka rakenteisen peräisin Shh-Gli1 signaaleja S100A4 PC soluissa.

Vaikka aktivoituminen Hh signaaleja lähes mukana esiintyminen EMT, tähän mennessä ei ollut näyttöä siitä, että Gli1 suoraan säännellä Snail /Slug transkriptio. On raportoitu, että S100A4 ja E-kadheriinin oli kääntäen säädellä monella lusysteemit ja S100A4 edistänyt ilmaisemaan olennaiset transkriptiotekijöiden, Twist ja Snail, että EMT prosessiin sekä mesenkymaaliset markkereita, kuten VIM ja MMP [40] – [42].