Krooninen sairaus

tiivistelmä

biomarkkerit peräisin geeniekspressioprofilointi data voi olla korkea väärien positiivisten ja pitää tiukasti validoitu käyttäen riippumattomia kliinisiä aineistoja, jotka eivät aina ole käytettävissä. Vaikka eläinmallijärjestelmiä voisi tarjota vaihtoehtoisia aineistoja muotoilla hypoteeseja ja rajoittaa määrän allekirjoituksia testattavien kliinisissä näytteissä ennusteita Tällaisen lähestymistavan ei ole vielä todistettu. Tässä tutkimuksessa pyritään analysoimaan molekyyli allekirjoitukset maksasyövän c-MET-siirtogeenisen hiiren mallia ja tutkia sen prognostiset merkitystä ihmisen maksasolusyövän (HCC). Kudosnäytteet saatiin kasvaimen (TU), vieressä olevaan ei-kasvain (AN) ja kaukana normaali (DN) maksan Tet-operaattorin säännelty (TRE) ihmisen c-MET siirtogeenisiä hiiriä (n = 21) samoin kuin Kiinan kohortin 272 HBV ja 9 HCV-liittyvän HCC potilaille. Koko genomin microarray ilmaisun profilointi tehtiin Affymetrix geeniekspression siruja, sekä varoituksia merkitykset geeniekspression allekirjoitusten arvioitiin yli kaksi lajia. Meidän tiedot paljastivat rinnastuksia hiiren ja ihmisen välillä maksakasvaimia, kuten Down-regulation metaboliareitit ja ylös-säätely solukierron prosesseja. Hiiren kasvaimia muistuttaa eniten osajoukko potilaan näytteistä tunnettu siitä, että aktivointi Wnt-reitin, mutta selvästi erottuva p53-reitin signaalit. Mahdollisten kliinisen hyödyn, olemme tunnistaneet joukon geenejä, jotka alas säännelty kummassakin hiiren kasvaimia ja ihmisen HCC olevan merkittävässä ennusteita yleiseen ja tautivapaan elinajan, jotka erittäin runsaasti aineenvaihdunnan toimintoihin. Johtopäätöksissään tämä tutkimus tarjoaa näyttöä siitä, että tauti malli voi toimia mahdollisena alustana tuottaa testattavia hypoteeseja ihmisen kudoksissa ja korostaa tehokas menetelmä tuottaa biomarker allekirjoituksia ennen laajoja kliiniset tutkimukset on aloitettu.

Citation : Ivanovska I, Zhang C, Liu AM, Wong KF, Lee NP, Lewis P, et ai. (2011) Gene allekirjoitukset Johdettu c-MET-Driven Maksasyöpä Mouse Model Ennakoi Survival of Potilaat, joilla maksasyövän. PLoS ONE 6 (9): e24582. doi: 10,1371 /journal.pone.0024582

Editor: Wanjin Hong, Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

vastaanotettu: 09 toukokuu 2011; Hyväksytty: 14 elokuu 2011; Julkaistu: 16 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Ivanovska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: II, CZ, PL, UP, DB, CB, MS, MM, MAC, ja HD mukana tässä työssä työntekijöinä Merck Co., Inc., johtava lääkeyhtiö; muuta kuin, että kaikki muut kirjoittajat paljastaa ole kilpailevia intressejä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on viidenneksi yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti yli 300.000 uudella tapausta vuodessa Kiinassa ja nousevalla esiintyvyys länsimaissa [1]. Kirurginen resektio tai maksansiirto ovat ensisijainen hoitovaihtoehtoja HCC potilaille, joilla on 5-vuoden pysyvyys 50-60% [2]. Valitettavasti noin 80% potilaista diagnosoidaan edenneessä vaiheessa klo esittelystä ja ovat olennaisesti käyttökelvottomaksi ja tehonnut useimmat tavanomaisen kemoterapian [3]. Sinänsä on kiireellinen tarve tunnistaa ennustetekijöitä merkkiaineiden HCC [4], [5], [6], [7], [8], [9] ja kohdennettuja hoitomuotojen perinteisiä pienmolekyylisalpaajien ja /tai RNAi terapeuttiset [10], [11], [12], [13], [14].

Useat monivaiheinen siirtogeenisen hiiren mallia ihmisen syövän on ehdotettu tarkasti matkimaan patofysiologian ja molekyylitason ominaisuuksia ihmisen maligniteettien [15], mutta rajat lajien geeni-ilmentymisen vertailuja eläinmalleissa ja ihmisten sairauksien eivät ole käytettävissä validointi [16]. HCC kehittyy ihmisissä kuin etenevä sairaus peräisin maksakirroosi alttius aiheuttama hepatiitti B tai C virusinfektio, krooninen alkoholismi, tai aflatoksiini altistumista. Tämän seurauksena ihmisen HCC kasvainkudosta ympäröi esiaste, kirroottinen kudoksen [17]. Siirtogeeninen hiirimallissa HCC on kehittänyt Bishop ja kollegoiden kasvaimia indusoivat maksan-specific, tetrasykliinillä säädellyn (TRE) ilmentyminen ihmisen c-MET-kinaasin siirtogeenin, joka on geneettisen vaurion liittyy yleisesti ihmisen maksan kasvaimissa [18 ]. Kasvaimet, jotka johtuvat c-MET over-ilmentyminen hiiren muistuttavat ihmisen HCC tasolla histologia [19]. Aktivoivat mutaatiot β-kateniinin, joka johtaa säätelyä Wnt-signalointireitin, toinen yhteinen piirre ihmisen HCC, havaittiin usein näissä kasvaimissa. Kuitenkin, tiedot tuumorisuppressorigeeniä TP53, joka on yleisesti mutatoitunut ihmisen HCC [20], ja muiden mahdollisten geenikohteet tässä mallissa järjestelmä ei ole käytettävissä. Lisäksi molekyyli luonne viereisen ei-pahanlaatuista kudosta ympäröivä kasvaimia ei ole hyvin tutkittu ja tunnettu [21]. Parempi käsitys siitä, miten hiiren malli vertaa ihmisen sairauden molekyylitasolla vuoksi on tärkeää suunnittelun ja tulkinta tehoa koskevien tutkimusten hoitomuotojen.

biomarkkerit johdettu microarray ilmaisun profilointitiedot voidaan kohdistaa korkea väärien positiivisten määrä johtuu useista hypoteesin testaamiseen luontainen työskentelemään paljon geenejä ja geenien yhdistelmiä. Ennakoiva biomarkkereiden allekirjoitus tai geeniperimä määrittää määrätylle näytteiden (harjoitussarjassa) tulee vahvistaa tietojen kanssa riippumattomien näytteistä (testi /validointi set) [22], [23]. Tavoitteen saavuttamisessa voi olla haastavaa itsenäisinä aineistoja, erityisesti niitä kliinisistä näytteistä käsitellään samalla tavalla, ovat niukka tai vaativat merkittäviä ajankäytöstä kerääntyä. Yksi toimiva vaihtoehto tähän rajoitus on muotoilla ja testata hypoteeseja tietojen avulla mallin järjestelmään.

Tässä tutkimuksessa, suoritimme molekyyli- profilointiin normaali maksan ja kasvaimen kudokset c-MET ajettu hiirimallissa, jotta ymmärtää molekyylitason muutokset näissä hiirissä. Olemme päättäneet, kuinka hyvin malli lähennetään ihmisten sairauksien ja vahvisti spesifisten syövän tavoitteita. Käytimme saatujen tietojen c-MET malli tuottaa allekirjoituksia erottaa kasvain (TU) viereisistä kuin kasvain (AN) ja villin tyypin (WT) normaaleista kudoksista, ja testasi ennustetekijöiden voima allekirjoituksista on tietue ihmisen HCC.

Methods

Ethics

Institutional Review Board of University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB) hyväksyi tutkimuksen , ja jokainen potilas piti /hänen kirjallinen lupa sen käytöstä kliinisistä näytteistä tutkimukseen. Kaikki tutkimukset, joissa eläimet täysin hyväksynyt Merckin Boston Institutional Animal Care ja Käytä komitea (protokolla numero: # 07-08-044 ja # 08-08-041) ja tehtiin mukaan institutionaalisten eläimen eettisen ohjeita.

c-MET hiiren HCC mallin

käytetyt hiiret tässä tutkimuksessa on kuvattu (taulukko 1) [18], [24]. Kaikki hiiret olivat koskevasta FVB geneettistä taustaa. Hiiret yli-ilmentävät ihmisen c-MET suorittaa yhden kopion LAP tTA siirtogeeni (maksa-erityistä LAP promoottori ajo Tet-VP16 transaktivaattoria) ja yksi kopio TRE-c-MET siirtogeenin (Tet-operaattorin säännelty ihmisen c-MET-geenin ). Läsnäolo molempien siirtogeenien johtaa ilmentyminen ihmisen c-MET-geenin erityisesti ja koko maksassa (viitataan tästä lähtien kun TRE-c-MET-kanta). Seitsemän hiiriä kutakin kantaa tapettiin kuusi (TRE-c-MET), seitsemän (LAP tTA) tai 14 (TRE-c-MET) viikon iässä. Maksan normaali tai maksan kasvain kudoksen (kaksi per hiiri) kerättiin ja prosessoitiin geeniekspressioprofilointi klo Rosetta Gene Expression Laboratory. Lisäksi vierekkäiset maksakudosta kerättiin ei-mukana kudoksen vieressä rajalle kasvain kasvain, maksan lohko. Kaukaiset maksakudosta oli ei-kasvain lohko tai alueilta vähintään 1 cm: n päässä kasvain. Eläinten työt tehtiin AALAC-akkreditoitu laboratorio mukaan institutionaalisten eläimen eettisen ohjeita.

Patient kohortteja ja kliinisissä näytteissä

Kaikki potilaat, jotka olivat tähän tutkimukseen rekisteröidyt tehtiin parantava hepatektomiaa varten HCC Queen Mary sairaalassa, Pokfulam, Hongkong välillä 1993 ja 2007 [3], [25]. Tutkimus hyväksyi Institutional Review Board for Human Ethics ja kullekin potilaalle piti /hänen kirjallinen lupa sen käytöstä kliinisistä näytteistä tutkimukseen. Maksakudosta, joka saatiin potilailta aikaan parantava leikkaus välittömästi pikajäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvittiin.

Microarray ja analyysi

Kokonais-RNA oli uutetaan ja puhdistetaan kliinistä maksan näytteet (n = 272 HBV-HCC kasvain (TU), 257 HBV-HCC kasvaimen vieressä normaali (AN), 9 HCV-HCC kasvain (TU).

9 HCV HCC kasvaimen vieressä normaali (AN)) käyttäen SV96 Total RNA Isolation System (Promega) mukaan mukautetun automatisoitu protokollaa. Uutettu RNA kvantitoitiin käyttäen RiboGreen RNA kvantitointi Reagent (Invitrogen) ja sen laatu arvioitiin käyttäen Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent, Santa Clara, CA) vuonna Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Vain näitä näytteitä siirsivät vähimmäistason määrän ja laadun (RIN 6) monistettiin ja leimattiin käyttäen Ovation WB-protokollan (NuGEN Technologies, San Carlos, CA), mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 50 ng kokonais-RNA: ta monistettiin käyttäen Ribo-SPIA tekniikka (NuGEN Technologies), hajanaista ja biotiinilla leimattu käyttäen FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 (NuGEN Technologies). Tuloksena monistettu cRNA hybridisoitiin Affymetrix geeniekspression pelimerkkejä (Human Rosetta Custom Affymetrix 1,0, Affymetrix, Santa Clara, CA) [26]. Kuvat analysoitiin käyttämällä standardia paketin Affymetrix GeneChip- Operating Software (GCOS) (www.affymetrix.com/products/software/specific/gcos.affx) ja olivat edelleen normalisoituneet ja käsitellään hyödyntämään sekvenssi-pohjainen intensiteettien RMA-algoritmia toteutettuna Affymetrix Power Tools (https://www.affymetrix.com/support/developer/powertools). Käytetyt tiedot Tämän analyysin kulunut kaksi tasoa laadunvalvonta (QCS) (matriisitaso käyttäen Affymetrix suositeltavat parametrit, ja projektin tasolla ilman harha paneelit ja taulukot tärkeimpien kuvioita, joiden tiedetään liittyvän prosessin parametrit). Log10 (suhde) kunkin geenin kussakin näytteessä laskettiin vähentämällä keskiarvo log10 (intensiteetti) tämän geenin kaikkien viereisten ei-kasvain näytteet, jotta ne verrattavissa c-MET hiirimallissa, kun tietojen viitteet ovat altaan villityypin hiiren maksan kudoksissa. Raaka geeniekspressioprofilointi tiedot talletettiin Geo kanssa liittymisen jälkeen numerot: GSE25142 (peräisin c-Met hiirimallissa) ja GSE25097 (johdettu ihmisen HCC).

Kasvain allekirjoitusta hiiren profiileista

Käytimme yksisuuntaista ANOVA määritellä kasvaimen allekirjoitus hiirillä c-MET kokeilu vaikkapa verrata keskenään WT Vs. kasvain, tunnistimme 6277 hiiri probesets kanssa ANOVA P-arvo 0,001. Väärä löytö määrä (FDR) tässä arvioidaan olevan 0,62% 1000 permutaatiot. Niistä allekirjoitus probesets, 3114 osoitti kasvain alas- ja 3163 kasvain up-asetukset verrattuna WT. Hiiren kasvain allekirjoituksen jälkeen kartoitettiin ihmisen probesets vuonna Affymetrix ihmisen siru. Havaitsimme myös hiiren kasvain allekirjoituksen vertailua viereisten ei-kasvain vs. kasvain ja etäinen kuin kasvain vs. kasvain, jonka ANOVA.

Biologiset huomautusta ja geneset rikastamiseen test

koottu monia tietokannat sisältävät geenin sarjaa, joiden tiedetään biologisia toimintoja tai ominaisuuksia erilaisia ​​julkisia (GO solukomponenttien, molekyyli- toiminto, biologisia prosesseja, Kegg kulkuväylillä SwissP- Keywoards jne), lisensoitu (GeneGo, kekseliäisyyttä, NextBio biosets jne), ja oma lähteistä (sisäinen yhdiste, siRNA, body atlas profilointi, jne.). Nämä selityksin geeni sarjaa käytettiin rikastamiseen testissä. Rikastamista P-arvot (mahdollisuus havaitsemisen todennäköisyys päällekkäisten geenien välillä tulo geneset ja geneset tietokannassa) on laskettu käyttämällä hypergeometrisen jakelu [27].

Prognostic voima allekirjoitusten

arvioida ennustetekijöiden teho kunkin hiiren allekirjoitusten allekirjoitus kartoitettiin ihmisen probesets ja sitten käsitellään metageeni [28], [29]. Nimittäin ilmentymistaso metageeni ihmisen HCC näytteissä laskettiin keskiarvo log (suhde) kaikkien geenien kartoitettu hiirestä ylä- tai alas-säännellyn allekirjoituksia. Ihmisen HCC Näytteet paremmuusjärjestykseen ilmentymistason metageeni ja sitten jaetaan kahteen yhtä suureen ryhmään, jonka mediaani (välttää yli-asentamisesta, emme optimoida kynnys). Log-rank p-arvot näiden kahden ryhmän laskettiin log-rank-testiä käyttäen aika kokonaiselinaika ja taudin elinaika vastaavasti.

Tulokset

Global geeniekspression muutoksia hiiri ja ihmisen HCC

määrittämiseksi kasvain-spesifisen geenin ilmentymisen c-MET hiirimallissa HCC, vertasimme kudosta kasvaimen kantavien hiirten useita ohjaus kudoksissa, kuten vieressä ja kaukana normaalissa maksassa kudosta kasvaimen kantavissa hiirissä, villi -tyyppinen maksakudosta ja maksan kudosta kaksi yhden siirtogeenin vanhempien linjat (taulukko S1). Käytimme villityypin maksakudosta (virtuaalinen altaan 7 hiiret) kuin lähtötilanteessa ja suoritetaan ilman valvontaa klusterointi erilaisesti-ilmaistuna geenejä. Olemme havainneet, että kasvaimia oli selvä ilmentymiskuvio (kuvio 1A). Luonnehtia molekyyli luonne differentiaalisesti ilmentyvien geenien, suoritimme Gene ontologia biologinen huomautus [30] (ks myös Täydentäviä tietoja) jokaiseen geeniperimä ja totesi, että alas geenien rikastettiin aineenvaihduntaan, kun taas ylös geenien rikastettiin solusyklin ja solun tukirangan liittyviä termejä (taulukko S2). Geenien ilmentyminen muutoksia ihmisen HCC osoitti samanlaista GO merkinnät (taulukko S3), mikä osoittaa, että maailmanlaajuisesti geeniekspressiotason, c-MET hiirimallissa suunnilleen ihmisen HCC.

(A) Global geeniekspressioanalyysissä paljasti kasvain- erityisten geenien ilmentymisen muutoksia ominaista geenit alassäädetty kasvaimissa, jotka rikastettiin aineenvaihduntaan (valkoinen laatikko) ja geenit säädellään ylöspäin kasvaimia, jotka rikastettiin solusyklin ja aktiinisytoskeletonin (keltainen). Non-tuumorikudoksista vieressä tai kaukana kasvaimista havaittiin samankaltaista ilmaisua kuviot olivat lomassa lämpöä kartan tuottama valvomattoman klusterointia, näytteitä samasta eläimestä klusterointi yhdessä. Pystysuorat palkit oikealle kunkin lämmön kartta edustavat värikoodeja näytteiden joka vastaa legenda kussakin paneelissa. (FVB-WT, violetti) Maksakudos kontrollieläimistä; (LAP-tTA, tummansininen ja TRE-c-MET, oranssi) maksakudosta yksinkertaisesta siirtogeenin vanhempien kantoja; (C-MET TU, vihreä) kasvainkudoksen kaksinkertaisesta siirtogeenin, kasvain omaavilla eläimillä; (C-MET AN, vaaleansininen) ei-kasvain maksakudosta kaksinkertaisesta siirtogeenin, kasvain eläimiä vieressä kasvain; (C-MET DN, punainen) ei-kasvain maksakudosta kaksinkertaisesta siirtogeenin, kasvain eläimet kaukana kasvain. Lämpö kartta kuvaa ilman valvontaa klusterointi differentiaalisesti ilmentyvien geenien (fold muutos ≥1.25, p 0,01, Cluster Algoritmi: Agglomerative, samankaltaisuus Toimenpide: Kosini korrelaatio). (B) Suurin osa Maksan rikastetun geenejä säädellä vähentävästi c-MET kasvaimia, sopusoinnussa menetys maksan toiminta. Tätä analyysiä varten valitsimme alkuun 400 geenejä, joilla on suurimmat kertamuutosta maksasta rikastettu geenien tunnistaa Su ja työtovereiden [18]. Pieni alijoukko geenejä, jotka olivat sääteli (keltainen laatikot) saattaa sisältää hyödyllisiä biomarkkerit kasvaimen läsnäolon. Väri legenda -0,5 log

10 (suhde) 0,5. (C) Vertailu hiiren c-MET ja ihmisen HCC kasvain profiileja. Ihmisen ja hiiren kasvain näytteet yhteistyössä klusteroitu osoittaa samanlaisia ​​geeniekspressiomalleja (punainen laatikko). Differentiaalisesti ilmaisi geenejä voidaan jakaa kolmeen ryhmään sen perusteella, niiden erityistä sääntelyä kuviot (keltainen laatikot) ja GO huomautusta. (HCC Adj) Ihmisen viereisen ei-kasvain; (HCC TU) ihmisen kasvain; (C-MET TU) hiiren kasvain; (C-MET Adj /Dis) hiiri vieressä ja kaukana normaalista. Lämpö kartta kuvaa ilman valvontaa klusterointi differentiaalisesti ilmentyvien geenien (fold muutos ≥1.25, p 0,01, Cluster Algoritmi: Agglomerative, samankaltaisuus Toimenpide: Kosini korrelaatio).

suoritetaan ilman valvontaa klustereiden ja totesi, että ilmentymisen profiilit vieressä ja kaukana normaali kudosnäytteet välissä, jaoteltuna eläin, josta ne otetaan ja erillinen kasvaimen profiilien (kuvio 1A). Tämä tulos osoittaa, että kasvaimen läheisyyteen ei merkittävästi muuta geenin ilmentymisen normaalissa maksakudoksessa. Kuitenkin hienoisia eroja vierekkäisten ja kaukana näytteet voivat esiintyä.

Vaikka sekä HCV- ja HBV-infektio on osoitettu aiheuttavan HCC, HBV-infektioita vastaan ​​oli hallitseva Kohortin (272 HBV-HCC kasvaimia ja 9 HCV -HCC kasvaimet). Tunnistaa mahdolliset molekyylien väliset erot HCV- ja HBV-tartunnan HCC, analysoimme kaikki saatavilla HCV näytteet tässä kohortissa (yhdeksän) ja verrattiin niitä on yhtä monta satunnaisesti valittua HBV näytettä (yhdeksän). HBV Näytteet jaettiin satunnaisesti valvomattoman ryhmän kaikkien kasvainnäytteet (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että ne eivät painottua tietyn molekyylipainon profiili. Emme havainneet mitään johdonmukaista molekyyli- eroa näistä näytteistä (tuloksia ei ole esitetty).

Voit selvittää yhtäläisyyksiä ihmisen ja hiiren HCC olemassa geenin tasolla, suoritimme suora vertailu hiiren ja ihmisen HCC profiileja. Hiiren näytteet normalisoitiin vastaan ​​villityypin maksakudosta (virtuaalinen allas 7-hiiret) ja ihmisen näytteet normalisoitiin vastaan ​​keskimäärin kaikkien viereisten ei-kasvain näytteitä. Valvomaton ryhmittely ihmisen ja hiiren näytteet osoittivat, että molekyyliprofiilien kahden kasvaimen sarjaa olivat läheisempää sukua toisilleen kuin niiden samankaltaisiin viereiseen ei-tuumorikudoksista (kuvio 1 B, punainen laatikko), paljastaen kasvainspesifistä molekyyli allekirjoitus.

Niistä geenit ilmentyvät differentiaalisesti useimmissa hiiren ja ihmisen kasvaimista, tunnistimme kolme geeniä subsets Tunnusomaista (kuvio 1 B, keltainen laatikot). Kaksi ryhmää osoittivat samanlaisia ​​ekspressiokuvioita molemmissa kasvainten tyyppiä: geenien alassäädetty kummassakin kasvaintyypin rikastettiin aineenvaihduntaan, kun taas geenejä säädellään ylöspäin molemmat kasvaintyypin rikastettiin solusyklin prosesseihin. Geenit alassäädetty nimenomaan ihmisen kasvaimissa rikastettiin immuunivasteen prosesseja, mikä molekyyli ero, joka voi viitata eroja kasvaimen etenemistä mekanismeja. Yhteenvetona verrattuna molekyyli profiilit ihmisen ja hiiren HCC paljasti laajan yhtäläisyyksiä geeni- ilmentymisen tasolla. Kuitenkin jokaisen sarjan kasvainten myös ominaista tietty geeniekspressiomalleja.

Down-regulation liittyvien geenien aineenvaihduntaan kasvaimissa viittaa siihen, että maksan toimintoja vähene tai vahingoitu. Tutkitaan maksa identiteettiä näissä kasvaimissa edelleen, tutkimme ilmentymistä maksassa rikastetun geenejä [31], [32], [33] ja totesi, että he olivat alassäädetty kasvain näytteissä (kuvio 1 C), sopusoinnussa menetys maksan ja tehtävänsä kanssa syövän etenemiseen.

toiminta onkologian koulutusjaksojen HCC

ymmärtää paremmin aktiivisuuden signalointipolkujen merkitystä onkologian in c-MET malli HCC, me suoritettu kohdennettu analyysi ilmaisun muutokset käyttämällä koulutusjakson allekirjoituksia aiemmin määritelty. Wnt /β-kateniinin allekirjoitus koostuu geenien ylä- ja alas-säätelee β-kateniinin siRNA DLD-1 koolonikarsinoomasoluille [34]. Löysimme kohonnut Wnt signalointia (kuvio 2A), sopusoinnussa aktivoivat mutaatiot β-kateniinin usein havaittu näissä kasvaimissa ja aktivoitumisen Wnt väylän kolmasosa HCCs [35]. Valvomaton klusterointi hiiren ja ihmisen näytteet osoittivat suhdetta osajoukko ihmisen HCC profiilit ja hiiren kasvain näytteissä (kuvio 2B), mikä osoittaa, että c-MET hiiri voi olla hyödyllinen malli tutkimiseen HCC potilaalla on aktivoitu Wnt signalointia. Mielenkiintoista, genominlaajuisten profiilit hiiren kasvaimia ja alaryhmässä ihmisen HCC kanssa sääteli Wnt koulutusjakson ilmaisua ei korreloi (korrelaatio = 0,07). Tämä on päinvastoin kuin merkittävä korrelaatio havaittiin kohdennettua Wnt-signalointireitin geeniperimä, mikä osoittaa, että yhtäläisyyksiä on rajattu tiettyyn polkuja.

(EN) Wnt /β-kateniinin koulutusjakso on up-säännellään hiiren kasvaimia mitattuna Wnt /β-kateniinin geenin allekirjoitus [34]. Geenit Kunkin allekirjoitus on merkitty yläreunassa kunkin lämmön kartan. Näytteet ovat Y-akselilla ja niiden kudoksen alkuperä on merkitty pystysuoralla värikoodattu palkkia oikealle kunkin lämmön kartan. Värikoodit legenda paneelien A ja C on levyjen välissä. Kaikki lyhenteet ovat kuten kuviossa 1. (B) Wnt /β-kateniinin polku oli säädelty alaryhmässä ihmisen HCC potilaita on osoituksena kolmen ihmisen näytettä (HCC TU, violetti) että yhteistyössä klusterin hiirellä HCC näytteet (c-MET TU, keltainen). Värikoodit legenda paneelien B ja D on levyjen välissä. (C) tp53 polku oli säädellään ylöspäin hiiren kasvaimia (c-MET TU, vihreä). (D) Up-sääntely tp53 polku oli spesifinen hiirimallissa (c-MET TU, keltainen) ja ei havaittu ihmisen HCC (HCC TU, violetti).

p53-reitin aktiivisuus hiiren HCC malli on kiinnostava, koska

TP53

mutaatiot ovat yleisiä (in ~27% tapauksista) ihmisen HCC [20]. Käytimme p53-reitin allekirjoitusta [36] ja noudatetaan säätely ylöspäin p53-reitin hiirellä HCC kasvaimia, jotka osoittavat ero ihmisen HCC (kuvio 2C). Sen sijaan ihmisen HCC näytteet eivät osoittaneet p53-reitin ylössäätöä (kuvio 2D), mikä johtuu oletettavasti mutaatioiden tai muiden p53-inaktivoivan mekanismeja. Nämä tulokset osoittavat, että vaikka hiiren c-MET malli voidaan toistaa osajoukko ihmisen HCCs monessa suhteessa, molekyyli- eroja on olemassa, ja on otettava huomioon, kun tietoja on saatu tämän mallin analysoidaan, erityisesti tavoitteet p53-reitin. Tämä johtuu suurelta osin villityypin tilan p53-geenin hiirimallissa. Täten erityistä huomiota ja harkintaa olisi kiinnitettävä vertailtaessa rajat lajien ihmisen sairauksien malli. Wnt signalointireitin ja p53-reitin ovat hyvin yleisiä syövän kehittymisessä. Geenien ilmentyminen allekirjoitukset sekä reittejä hiiren kasvain malli ja ihmisen HCC esiteltiin kuvassa S2.

Hiiri-johdettu geeni allekirjoitukset ovat ennusteita selviytymisen ihmisen HCC potilaiden

tunnistettu geeni allekirjoitukset hiiren kasvaimissa vertaamalla kasvaimen geeniekspressiomalli kolmen ei-tuumorikudoksista taulukossa S1 (villityypin (WT), vierekkäiset nontumor (AN) ja kaukainen normaali (DN) maksa). Käytimme viereisen vs. kasvaimen allekirjoituksen, koska se on kaikkein analoginen vertailun kliiniset näytteet tutkimuksessamme. Kaukainen vs. kasvain allekirjoitus sisältää lisätietoja sellaisia ​​vaikutuksia, että kasvaimen läheisyys voinut käyttää viereiseen kudokseen. Lopuksi, kun otetaan huomioon, että sekä viereiset ja kaukaisten kudosten ilmaisee myös c-MET siirtogeenin, me mukana villityypin vs. kasvain allekirjoituksen tunnistaa mahdolliset c-MET perustuva geenien ilmentymisen muutoksia.

Kunkin parin tavoin kudos vertailun tunnistimme sarjaa geenejä, jotka olivat alas- tai ylöspäin säädeltyjä kasvain ja tuotettu lämpö karttoja käyttämällä näitä geenejä ja hiiren c-MET kasvain ja FVB-WT villityypin näytteitä kuvassa 3A ja kuvio S1 . Sitten arvioidaan ne allekirjoituksia ihmisen HCC tiedot ja määrittää niiden selviytyminen ennusteita ja niiden ilme kuvio. Koko Potilaskohortti käytettiin tässä analyysissä ja ihmisen näytteet jaettiin kahteen ryhmään sen perusteella, keskimääräisen log (suhde) kaikkien geenien allekirjoitus kuvatulla Materiaalit ja menetelmät.

(A) hiiren kasvaimen geeniekspression allekirjoituksia. Lämmön kartoissa geenien ilmentymistä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä kasvainkudoksen ja villityypin tai vierekkäisten normaaleista kudoksista hiirellä. (B) Hiiren kasvain allekirjoitukset jaettiin säädelty ja alassäädetty sarjaa ja Kaplan-Meier käyrät laadittiin jokaiselle geenin asettaa testata ennusteita yleisen elossaololuku.

Mielenkiintoista, huomasimme, että kaikki vertailut, geenit alassäädetty kasvaimissa oli erittäin ennusteita potilaan eloonjäämisen (taulukko 1) ja taudista vapaan eloonjäämisen (taulukko S4). Kuten on esitetty aikaisemmin, nämä geenit rikastettiin aineenvaihduntaan sekä ihmisten ja hiiri. Sen sijaan säädelty allekirjoitusta, rikastettu solusyklin prosesseja, ei ole kovin korkea ennusteita hengissä (taulukko 1) tai sairauden elinaika (taulukko S4). Kuva 3B ja kuvio S1 esittävät Kaplan-Meier -käyrät näitä tietoja. Ehdotamme, että säädelty solukierron prosesseja puuttuu ennusteita, koska ne edustavat yleistä kasvain tapahtumia, kun taas tappio aineenvaihduntaominaisuudet viittaa erityisiin menetyksen toiminnallisia ominaisuuksia maksan soluja, jotka voivat olla haitallisia potilaalle säilymiseen.

onko ennusteita hiiren johdettujen allekirjoituksia on spesifinen c-MET malli, olemme analysoineet ennusteita allekirjoituksen johdettu riippumaton hiiren malleissa [37] ja totesi, että huomattava osa geeneistä oli ennusteita (kuva S3). Nämä tulokset osoittavat, että ennusteita hiiren peräisin olevien geenien tulee tuumorin ominaisuudet hiiren näytteiden ja ehdottaa yleisen hyödyllisyys hiiren kasvaimen mallien tunnistamiseen geenin allekirjoitusten ennustavia tuloksista ihmisen kasvaimissa.

Seuraava kartoitettiin ekspressiokuviota hiiren geeni allekirjoitukset ihmisen näytteitä ja havaittu, että geenit tunnistettu hiirimallissa havaittiin huomattavia ilmentymisen muutoksia ihmisen kasvaimissa (edustaja lämpö kartat kuviossa 4.) Sen määrittämiseksi, ilmaisu muutokset olivat samaan suuntaan hiiren ja ihmisen, laskimme keskimääräinen ekspressio kunkin geenin ihmisen kasvaimissa verrattuna viereisiin ei-kasvain. Olemme havainneet, että kunkin kuuden hiiren sisältämien allekirjoitusten geenejä, joiden ilmentyminen muuttui ihmisen kasvaimissa sekä samaan ja vastakkaiseen suuntaan. Esimerkiksi joukossa geenit alassäädetty hiiren kasvaimissa vs. WT kudoksen (kuva 4A-B), alaryhmä oli myös alassäädetty ihmisen kasvaimissa (kuvio 4A), kun taas alaryhmä oli säädelty ihmisen kasvaimissa verrattuna viereisiin ei-tuumorikudoksissa (kuvio 4B). Samoin joukossa geenit, jotka olivat säädellään ylöspäin hiiren kasvaimissa vs. WT kudosta, osajoukko geenien oli alassäädetty ihmisen kasvaimia ja alijoukko oli säädelty (tuloksia ei ole esitetty).

Gene allekirjoitukset luotu hiiren kudoksista projisoidaan ihmisen HKU HCC tietokokonaisuutta. Väriskaala on kuten kuviossa 1 (-0,5-0,5). Mean ekspressiotasot piirretään oikealle kunkin lämpökartalla havainnollistamaan yhdistyksen välillä ilmaisun ja ennustetta. KM käyrät esitetään jäljempänä kunkin lämpöä kartalla.

ymmärtää ero geenien säädellään samalla tai päinvastaiseen suuntaan hiiren ja ihmisen kasvaimista, analysoimme kustakin seikasta erikseen niiden teho ennustaa selviytymisen (taulukko 2), tautivapaan elinajan (taulukko S5) ja väkevöimiseen biologinen väyliä (taulukko 2). Huomasimme, että geenit alassäädetty sekä hiiren ja ihmisen kasvaimista (taulukko S6) säilytti erittäin merkittävä ennusteita selviytymisen ja rikastamiseen varten aineenvaihduntaan. Sen sijaan osajoukko geenien, jotka alassäädetty hiiren kasvaimissa mutta säädelty ihmisen kasvaimissa ei ollut ennusteita ja merkittävä rikastamiseen mitään biologisia prosesseja. Niistä geenit säädellään ylöspäin hiiren kasvaimia, jotka olivat alassäädetty ihmisen kasvaimissa ei ollut ennusteita selviytymisen tai merkittäviä biologisia merkintä (merkittävä rikastuminen biologisia polkuja, mitattuna hypergeometrisen P-arvo). Mielenkiintoista, kun taas koko joukko geenejä säädellään ylöspäin hiiren kasvaimissa ei ollut ennusteita (katso edellä oleva taulukko 1 ja taulukko S4), osajoukko geenien, jotka olivat säädellään ylöspäin sekä hiiren ja ihmisen kasvaimissa näytti marginaalisesti merkitsevä ennusteita (taulukko 2, taulukko S7). Tämä tulos osoittaa, että suodattaminen pois discordantly geenien kautta malli järjestelmän ja kliinisissä näytteissä ja säilyttää vain ne, jotka ovat samalla tavoin säännelty kummassakin voi paljastaa, joissa on ennusteita, joita ei voida havaita, kun joko globaalin allekirjoitukset joko järjestelmän katsotaan erikseen.

Koska hiiren HCCs indusoitiin c-MET, me toisti edellä esitetyn analyysin ihmisen HCC keskittymällä niihin potilaalla on korkea c-MET (potilailla, joilla on HCC c-MET ilmaisun mediaani ilme väestöstä) määritellä allekirjoitusten samaan tai vastakkaiseen suuntaan hiiren ja ihmisen välillä. Kuviota 4 vastaava A B tunnistimme 775 geenejä sekä säädeltiin hiiren ja ihmisen c-MET-korkea HCC, ja 612 geenit vastakkaiseen suuntaan. Näistä 749 päällekkäin 800 samaan suuntaan geenit käyttäen kaikkia HCC näytettä (96,7% limityksellä, hypergeometrisen P-arvo 0) ja 562 limittyvät 587 vastakkaiseen suuntaan geenejä käyttäen kaikkia HCC näytettä (95,7% limityksellä, hypergeometrisen P-arvo 0). Analogit kuvioon 4 ja taulukko 2, myös tarkistanut ennustetekijöiden voima näiden kahden allekirjoitusta, log-rank p-arvot eloonjäämiseen ovat 2,2 × 10-6 ja 0,78 vastaavasti, hyvin samankaltainen ennusteita kuin tapauksessa, jossa koko HCC potilaat käytettiin kartoittamaan päällekkäisyys allekirjoituksia (taulukko 2). Gene ontologia näistä päällekkäisten geenien tehtiin paljastaa biologinen reitit liittyvät eri geenin sarjaa verrattaessa hiiren c-MET ajettu maksakasvaimia ja ihmisen c-MET-korkea HCC (taulukko S8).

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että hiiren c-MET kasvain mallissa on yhtäläisyyksiä ihmisen HCC molekyylitasolla mukaan lukien säätely alaspäin aineenvaihduntaan ja ylös-säätely solusyklin geenejä. Kasvain-geenistä allekirjoituksia johdettu hiiren malli voi erottaa kasvain ei-kasvainkudoksessa ihmisen HCC. Geenit säädellä vähentävästi kasvain verrattuna viereisen ei-kasvainkudoksen sekä hiiren ja ihmisen näytteillä oli merkittävää ennusteita eloonjäämiseen ja taudista vapaan eloonjäämisen HCC potilailla.