Krooninen sairaus

tiivistelmä

LNCaP ja C4-2B solulinjat muodostavat erinomaisen prekliinisissä malli tutkia kehittämiseen metastaattisen kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä, koska C4-2B solut peräisin luumetastaasipotilailla joka kasvoi nude-hiirissä istuttamisen jälkeen LNCaP-johdettu, kastraatio kestävä C4-2 soluissa. Exome sekvensointi havaittu 2188 ja 3840 mutaatiot LNCaP ja C4-2B solut, vastaavasti, joista 1784 havaittiin molemmissa solulinjoissa. Yllättäen, vanhempien LNCaP-solut ovat yli 400 mutaatiota, joita ei löydy C4-2B genomissa. Yli puolet mutaatioiden löytyy exomes vahvistettiin analysoimalla RNA-seq tietoja, ja havaitsimme, että ilmaistu geenit ovat alttiimpia mutaatioita kuin ei-ilmentyvien geenien. Transcriptomes paljasti myös, että 457 geenit osoittavat lisääntynyt ilmentyminen ja 246 geenit osoittavat vähentynyt ilmentyminen C4-2B verrattuna LNCaP. Yhdistämällä luettelo C4-2B mutaatioiden kanssa luettelon differentiaalisesti ilmentyvien geenien, me havaittiin merkittäviä muutoksia polttovälin tarttuvuus ja ECM-reseptorin vuorovaikutus reittejä. Integraatio näistä reiteistä konvergoi myosiinikevytketjun kinaasigeenissä (MLCK), jotka saattavat edistää metastaattisen potentiaalin C4-2B soluja. Lopuksi voimme tarjota laaja tietokantoja mutatoituja geenejä ja ilmennetty eri geenien LNCaP ja C4-2B eturauhassyövän solulinjoissa. Nämä voivat olla hyödyllisiä muille tutkijoille näiden solumalleja.

Citation: Jännevälit L, Helsen C, Clinckemalie L, Van den Broeck T, Prekovic S, Joniau S, et al. (2014) Comparative Perimän ja Transcriptomic analysointi LNCaP ja C4-2B eturauhassyöpäsolulinjoissa. PLoS ONE 9 (2): e90002. doi: 10,1371 /journal.pone.0090002

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2013 Hyväksytty: 24 tammikuu 2014; Julkaistu: 28 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Jännevälit et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli mahdollista ansiosta tutkimusmäärärahat päässä FWO-Vlaanderen (G.0684.12N), Belgian liittohallitus (National Cancer Plan KPC_29_023) ja KU Leuven (OT /11/081). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä ja kolmanneksi yleisin kuolinsyy miehillä Euroopassa [1]. Huolimatta esiintyvyys, suurin osa miehistä on diagnosoitu paikallinen alhaisen riskin PCa ja koskaan kuole, koska niiden syöpä, kun se jätetään hoitamatta [2]. Kuitenkin potilailla, joilla on korkean riskin ja erityisesti etäpesäkkeitä on paljon suurempi riski kuolla PCA raportoitu PCa kuolleisuutta hinnat jopa 28,8% korkean riskin taudin ja 66,1% metastaattista sairautta 10-vuoden seurannassa [ ,,,0],3]. Viimeaikaiset epidemiologiset tiedot ovat osoittaneet, että lähes 10% kaikista PCa potilaat ovat metastasoitunut aikaan diagnoosi, korostetaan kliininen tärkeää kehittää paremman käsityksen, että taustalla olevien mekanismien metastaattisen PCa [4]. Genomisen ja transcriptomic muutokset, jotka seuraavat muutos paikallinen taudin metastaattinen kastraatio kestäviä PCa on löydetty, mutta haittaa vaikeuksia saada kudos- eri vaiheissa taudin [5], [6].

Vaihtoehtoisesti solulinjoja voidaan käyttää malleja tutkia siirtymistä metastaattisen kastraatio kestävät PCa [7]. Yksi parhaista tutkittu PCa solulinjoissa epäilemättä on LNCaP-solulinja. Tämä solulinja on peräisin neulabiopsian otettu vasemmalta supraclavicular imusolmuke 50-vuotias valkoihoinen mies [8]. Tämä potilas kärsi nopeasti etenevät PCa minimaalisella ja lyhyt vastaus hormonihoidon ja mitään vastausta kemoterapiaa. Sen jälkeen C4-2-alalinja oli peräisin kasvain, joka on kehitetty kastroitu nude-hiirissä injektoitiin LNCaP-soluja. Lopuksi C4-2B solulinja oli peräisin luumetastaasipotilailla jälkeen potilaalle tehdä transplantaation C4-2 soluja nude-hiirissä [9], [10]. Toisin sanoen, C4-2B on metastaattinen johdannainen LNCaP. LNCaP ja C4-2B etenemisen malli siis jäljittelee sairauden etenee huonosti tuumorigeenisia, androgen-herkkien ja ei-metastasoituneen LNCaP, metastaattinen ja androgeenista epäherkkä (tai kastraatio kestävä) in C4-2B.

näistä kahta solulinjaa, muutokset karyotyyppi ja genomin kopio numeroita, jotkut pistemutaatioita, insertioita ja deleetioita on kuvattu, mutta vertailu exome sekvenssit ei ole raportoitu vielä [9], [11]. Ensimmäinen tavoite Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli hankkia siten kattavaa exome tietoja LNCaP ja C4-2B soluja. Tietenkin, vertailemaan mutaatiostatuksesta maisemien järkevää vain, kun läsnä on tietoa aktiivisuudesta vaikuttaa geenien. Jälkimmäinen saatiin transcriptome analyysejä.

Ensimmäinen askel kuvastoon pistemutaatioita, insertioita ja deleetioita LNCaP ilmoitettiin jännevälit

et al.

[12]. Täällä raportoida vertailevaa koko exome ja transcriptome sekvensointi tutkimus sekä LNCaP ja C4-2B solulinjoissa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen suora ja perusteellinen vertailu tällaista. Lisäksi nämä tietokannat voivat olla hyvin informatiivisia prekliinisissä tutkimuksissa, joiden osalta sekä LNCaP ja C4-2B soluja käytetään. Niitä voidaan myös käyttää tuottamaan hypoteeseja metastaattisen prosessin, esimerkkeinä mainitut MLCK reitin.

Materiaalit ja menetelmät

DNA: n eristä-

LNCaP-solulinja saatiin American Type Culture Collection, kun taas C4-2B solut olivat ystävällinen lahja tri M. Stallcup (Norris Kattava Cancer Center, University of Southern California, USA) [9]. Molemmat solulinjat kasvatettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI, Gibco, Invitrogen), joka sisälsi 2 g /l glukoosia, johon on lisätty 10% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS). Kulku numero LNCaP ja C4-2B soluissa oli 48 ja 42 vastaavasti. Korkean molekyylipainon DNA eristettiin viljellyistä soluista käyttäen GenElute Mammalian Genominen DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich). Puhdistamisen jälkeen käyttäen etanolisaostus ammoniumasetaatin, pitoisuus kvantitoitiin käyttäen Nanodrop ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific) ja Bioanalyzer (Agilent).

Koko exome sekvensointi

Koko-exome kaapata n LNCaP-solujen suoritettiin käyttäen SureSelect Human Kaikki eksoni System (Agilent) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Parilliset-end, 100 emäsparia pitkä sekvensointi lukee luotiin käyttäen GAIIx sekvensseri (Illumina). Exome pyydystäminen C4-2B solujen suoritettiin käyttäen SeqCap EZ Exome versio 2 kit (Roche Nimblegen) ja pariksi lopussa 100 bp: n pituisia lukee luotiin käyttäen HiSeq2000 (Illumina).

Laadunvalvonta suoritettiin käyttämällä FastQC (versio 0.10.1) (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) ja Picard (versio 1.22) (https://picard.sourceforge.net/). Sekvensointi lukee rinnastettiin ihmisen viite genomin (hg19, NCBI Build 37) käyttämällä BWA, jossa lukee karsittiin kun laatu oli alle 15 (versio 0.5.9) [13]. Tasaus tiedostot jatkokäsitellä kanssa Genome Analysis Toolkit (GATK) ennen muunnos kutsuvan ja mukana kahtena poisto, paikallinen uudelleenlinjaus noin tunnetaan indeleitä ja pohjan laatu uudelleenkalibroinnin (versio 1.0.5777) [14]. Näytteet ladattiin yksitellen GATK UnifiedGenotyper ohjelmisto. Pistemutaatiot ja ilmaisun tiedot piirrettiin käyttämällä Circos ohjelmistoa (versio 0.52) [15]. Vertailu pistemutaatioiden suoritettiin käyttäen Venny (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html).

RNA: n eristys

LNCaP ja C4-2B solujen , jossa kanavan numerot 30 ja 43 vastaavasti, maljattiin 6-kuoppaisille levyille (1750000 solua /kuoppa) ja käsiteltiin yön yli (18 h), 1 nM R1881 (Perkin Elmer). Solut otettiin talteen ja pestiin PBS: llä. Solupelletti käytetään erottamaan kokonais-RNA käyttämällä RNeasy Mini Kit Qiagen. Laatu ja puhtaus RNA tarkastaa laite Nanodrop ND-1000 Spektrofotometri. Eheyden RNA tarkastettiin Bioanalyzer klo Genomics ytimessä UZ Leuven.

RNA sekvensoinnilla

valinnan jälkeen polyA + RNA, RNA muunnettiin cDNA-kirjastoja käyttäen TruSeq RNA Sample kittiä (Illumina). Sekvenssointia pariksi lopussa lyhyt lukee 100 emäsparin kanssa HiSeq2000 (Illumina), normalisoitu geenin laskee (Fragments Per kiloemästä miljoonasosaa kartoitettu lukee, FPKM) laskettiin kautta Tuxedo putkilinjan (Tophat – Kalvosinnapit – cummerbund) [16]. Lyhyesti, RNA-seq data linjattu viitteen genomiin käyttäen Tophat (versio 2.0.6), joka hyödyntää Bowtie kuin algoritmeihin ydin. Kalvosinnapit paketti (versio 2.0.2) kootut selostukset ja havaittujen differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja selostukset. Cummerbund (versio 2.0.0), on käytetty havainnollistamaan geeniekspression data. Variant soittamalla käyttäen RNA-seq data suoritettiin GATK (versio 2.2), kun yhdenmukaistaminen Tophat [14]. RNA-seq sekä solulinjoja suoritettiin kolmena rinnakkaisena, jolloin tunnistaminen differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Muunnokseen nimittelyä, ei kolmena rinnakkaisena ryhmitelty saada korkeamman kattavuutta. Pathway-Express määrittämiseen käytettiin, luettelosta geenien, onko tietyn reitin enemmän geenejä mukana kuin olisi sattumalta odotettua [17].

kvantitatiivinen RT-PCR

cDNA synnytettiin RNA (1 ug), jossa Random heksameerialukkeita ja RevertAid käänteistranskriptaasia (Thermo Scientific). Kvantitatiivinen Real Time PCR suoritettiin käyttäen Platinum SYBR Green QPCR Supermix-UDG (Invitrogen). Tulokset normalisoitiin housekeeping-geeni β-aktiini ja jokainen näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena. Sekvenssi käytetyt alukkeet ovat: β-aktiini eteenpäin 5′-ACCCAAGGCCAACCG-3 ’ja reverse 5′-TGTACGTTGCTATCCAGGCTGT-3′, TMPRSS2 eteenpäin 5’-CCTGCATCAACCCCTCTAACTG-3 ’ja reverse 5′-AGGCGAACACACCGATTCTC-3′, IGF1 eteenpäin 5’-TGGATGCTCTTCAGTTCGTG-3 ’ja reverse 5′- TCATCCACGATGCCTGTCT-3′, IGF1 R eteenpäin 5’-GTACAACTACCGCTGCTGGA-3 ’ja reverse 5′- TGGCAGCACTCATTGTTCTC-3’.

Liittyminen numerot

binäärisekvenssillä linjaus /kartta (BAM) tiedostoja koko exome sekvensointi tietoja sekä RNA-seq tietoja talletetaan tietokantaan Euroopan nukleotidi- Archive kanssa tallennusnumero PRJEB4877 ja pääsee https://www.ebi.ac.uk /ena /data /view /PRJEB4877. Näyte liittyminen numerot ovat ERS363578 ja ERS363580 kokonaisille exome sekvenointitulosten LNCaP ja C4-2B vastaavasti. RNA-sekvensointi, näyte liittymisen numerot ovat ERS363579 ja ERS363581 varten LNCaP ja C4-2B soluissa.

Vahvistus ei-synonyymejä variantteja

vaihtoehdot kiinnostava varmistettiin Sangerin sekvensoinnilla monistettujen PCR-tuotteiden. Spesifisten alukkeiden alueelle, joka sisältää variantin testataan suunniteltiin käyttäen NCBI Primer-Blast (https://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) ja saatu Integrated DNA Technologies. Polymeraasiketjureaktiot suoritettiin seuraavan standardin protokollia käyttäen Taq DNA -polymeraasia (Thermo Scientific). Monistuminen PCR-fragmenttien varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Sanger sekvensointi suoritettiin LGC Genomics. Sequence jäljitystiedostot analysoitiin täyteläisyyden Lite.

Tulokset

pistemutaatioiden havaitsemiseksi kokonaisilla exome sekvensoimalla

suorittaa koko-exome uudelleenjärjestely-tutkimuksessa sekä LNCaP ja C4 2B soluihin käyttäen 100 emäsparin, pariksi lopussa lukee sen Illumina alustalla. Tästä saatu 49 ja 80 miljoonaa lukee varten LNCaP ja C4-2B (taulukko S1); for LNCaP, 74% exome peitettiin vähintään 20x, versus 88% varten C4-2B soluista. Sekvensointi ominaisuudet ja laadunvalvonta tiedot ovat samanlaiset sekä aineistoja (Taulukko S1 ja kuvio S1).

pistemutaatioiden exomes havaittiin käyttäen GATK putki, johon Lisäsuodatusta sovellettiin: vain mutaatioita, jotka oli vähintään 12 × kattavuus ja mutaation taajuus yli 30% otettiin huomioon. Tiedot olivat myös suodatetaan puuttuminen emäsparin muutos dbSNP130. Lisäksi säie bias putosi manuaalisesti (taulukko S2). Tämä johti luetteloihin 2188 ja 3840 ei-synonyymejä pistemutaatioita LNCaP ja C4-2B soluja, vastaavasti (taulukko S3-4). Vain 1784 mutaatiot olivat yleisiä molempien solulinjojen, mikä osoittaa selvästi kertyminen yli 2000 ylimääräistä mutaatioita C4-2B genomissa. Tämä suuri ero mutaatio kuormitusta ei voida selittää hieman pienempi kattavuus LNCaP exome. Todennäköisesti nämä ylimääräiset C4-2B mutaatiot ovat tulleet esiin kasvaimen etenemisen ja luun etäpesäkkeitä.

pistemutaatioiden havaitsemiseksi transcriptome sekvensointi

transcriptome sekvensointi suoritettiin aluksi määrittää ero geenin ilmentymistä. RNA eristettiin LNCaP ja C4-2B-soluja, jotka oli käsitelty 18 tunnin ajan synteettisen androgeenin metyylitrienolonia. Saimme 157 ja 131 miljoonaa 100 emäsparin, pariksi-end lukee varten LNCaP ja C4-2B soluja. Näissä lukee, prosenttiosuus ribosomaalisen, introni ja geenien välinen emäkset oli hyvin alhainen (1,6% kokonaismäärästä), mikä johtaa suuren kattavuuden mRNA emäkset (taulukko S1). Mittana laadun transcriptome tietojen vaihtelu kattavuuden kummallakin transkripti on esitetty kuviossa S2. Tämä ei osoita 5 ’tai 3’ bias vaikka on jonkin verran pienempi kattavuus lähellä päitä selostukset.

työnkulku havaitsemiseksi ja myöhempi suodatus pistemutaatioiden oli samanlainen kuin käytetty exome sekvensointia kuvataan korkeampi. Löysimme 1505 ja 1882 mutaatiot LNCaP ja C4-2B soluissa, joista 1054 havaittiin molemmissa solulinjoissa (taulukko S5); 451 olivat spesifisiä LNCaP ja 828 varten C4-2B.

Vertaamalla exome kanssa transcriptome sekvenointitulosten

vertailu alleelispesifinen lukea laskee genomin ja transcriptome sekvenointitulosten kaikkien havaittujen pistemutaatioiden voidaan käyttää mittana sekvensointi laatua. Suurin osa mutaatioiden on samanlainen alleeli usein sekä DNA: n ja RNA: n sekvensointi (kuvio 1A-B). Jopa muutamat homotsygoottinen mutaatioiden kanssa alleelin taajuus lähes 1. exome data, on samanlainen alleeli taajuus RNA sekvenointitulosten.

A-B. Vertailu variantin alleelifrekvenssi mutaatioita havaittiin käyttäen koko exome ja transcriptome sekvensoinnilla. Mustat pisteet ovat mutaatioita, jotka on havaittu sekä exome sekvensointi ja transcriptome sekvensointi; punaisia ​​pisteitä vasta havaita exome sekvensointi ja vihreitä pisteitä vain RNA sekvensoinnilla. Muunnokseen calling, cut-off 30% variantin alleelifrekvenssi sovellettiin. Vieressä kuvaajan luku näyttää, kuinka monta mutaatiot exome sekvensointi, transcriptome sekvensointi ja numero saapuvat molempia menetelmiä. Kuvaajat on esitetty LNCaP (A) ja C4-2B soluja (B) vastaavasti. C. päällekkäisyys kaikkien mutaatioiden havaita exome ja transcriptome sekvensointi LNCaP ja C4-2B soluja.

Yhdistelmä Sekä exome ja transcriptome sekvensointi johti yhteensä 2244 mutaatioiden yhteinen molemmille solulinjoja (kuvio 1C). Lisäksi määrä LNCaP-mutaatioiden (546) on paljon pienempi kuin C4-2B-erityisiä muutoksia (2129), jälleen osoittaen, että mutaatiot ovat aikana kertynyt etenemisen C4-2B. RNA-sekvensointi vahvisti ainoastaan ​​41 ja 35%: n eksoni varianttien tunnistaa koko exome sekvensoinnilla LNCaP ja C4-2B. Lukumäärä oli 52%, kun me vain otti ilmaisi geenien huomioon (FPKM 1). Sitä vastoin 60 ja 71%: n LNCaP ja C4-2B variantit tunnistetaan transcriptome sekvensoinnilla vastaavasti varmistettiin exome sekvensoimalla.

Nukleotidisubstituutiot

Eri siirtymiä ja transversioita että exomes ja transcriptomes LNCaP ja C4-2B solulinjoissa voisi antaa käsityksen, että mutaatioprosesseja aikana tapahtunut kehitystä näiden solujen. Havaitsimme, että vallitseva mutaatiot (40-42%) sekä solulinjoja G-to-A: n ja C-to-T siirtymiä (kuvio 2).

prosenttiosuudet mutaatioiden kunkin kuudesta mahdollisesta mutaatio luokat ovat edustettuina varten exome sekvensointi ja transcriptome sekvenointitulosten sekä LNCaP ja C4-2B soluja.

yleisimpiä tyyppi RNA editointia korkeammissa eukaryooteissa on muuntaminen adenosiini inosiini. Kuten inosiini luetaan guaniini jälkeen sekvensointi, tämä muokkaamisen ilmenee RNA-sekvensointi kuin A-to-G korvaaminen [18]. Kuitenkin meidän tietokokonaisuuksia määrä A-to-G siirtymiä exome ja transcriptome sekvensointi vertailukelpoisuuden vastaan ​​puhuu tärkeä rooli RNA editointi (kuva 2).

Validation pistemutaatioiden

yhteensä 80 mutaatiot exome tietoja LNCaP (47) ja C4-2B (33) on vahvistettu käsin Sangerin uudelleen sekvensoinnilla (kuvio 3). Geenit, jotka valittiin validointi rankattiin korkealle toimiva priorisointi kaikkien mutatoitujen geenien C4-2B solulinjassa (laskettu kuten [12]). Yhdeksän näistä mutaatioista (in PIK3R1, TP53BP1, PRKCQ, CHEK2, RIPK2 ja KLK3) havaittiin DNA: n ja RNA: n sekvensointi molemmissa solulinjoissa, ja nämä varmistettiin Sangerin sekvensoinnilla genomista ja komplementaarisen DNA: n LNCaP-ja C4-2B. Kun testasimme seitsemän C4-2B exome mutaatiot (PIAS1 P216S ja K380M, MKNK2 L229M ja T244N, STAT5A I85N ja MYO18A A1571T ja Q646 *), niitä ei havaittu LNCaP exome sekvensoinnilla, mutta niiden läsnäolo LNCaP genomissa oli ilmeinen RNA sekvensointi tiedot ja vahvistetaan myös Sangerin sekvensoinnilla genomista ja täydentäviä DNA.

validointi suoritettiin käyttäen PCR molemmilla genomi-DNA- ja kopioi-DNA, seuraa tavanomainen Sangerin sekvensoinnilla. Ensimmäinen ja toinen sarake edustaa nimi geenin ja aminohapposubstituution vastaavasti. Kolmas, neljäs, seitsemäs ja kahdeksas sarake edustaa seuraavan sukupolven sekvensoinnin tulokset koko exome ja transcriptome sekvensointi, jotka sitten validoitu Sangerin sekvensoinnin viidennessä, kuudennessa, yhdeksännessä ja kymmenennessä sarakkeessa. A + tarkoittaa, että mutaatio havaittiin, a – merkitsee, että mutaatio ei havaittu, kun taas 0 tarkoittaa, ettei PCR-tuotetta voidaan monistaa ja /että tämä asema ei ole peitetty seuraavan sukupolven sekvensointi.

myös havaita ja vahvistaa C4-2B mutaatioiden CASP9, FLNB, POLR2A ja STAT5A genomisessa DNA: ssa ja cDNA C4-2B-solujen, mutta ei LNCaP-soluissa. Lopuksi mutaatiot geenejä, joita ei ilmaistu LNCaP tai C4-2B (KIT ja Grap) voi vain vahvisti genomista DNA.

Yhteenvetona GATK UnifiedGenotyper muunnokseen kutsuvan jota yhdistettynä laajan suodatus syntyy muutamia vääriä positiivisia. Samanlaisia ​​tuloksia on esitetty viime aikoina Liu

et al.

Vertaamalla GATK kanssa SAMtools, Atlas 2 ja glftools [19]. Lisäksi on huomattava, että vahvistusten osoitti, että exome analyysit ei paljastanut kaikki mutaatiot, mutta vaihtelut, jotka on löydetty todennäköisimmin ovat aitoja mutaatioita.

Differential geenin ilmentymisen välillä LNCaP ja C4-2B solut

halusimme seuraavaksi etsi differentiaalisesti ilmentyvien geenien kahden solulinjojen, sillä ne saattavat antaa vihjeitä taustalla olevia mekanismeja kehitystä LNCaP solujen C4-2B soluihin. Differentiaalikaavojen kutsui Tuxedo algoritmi perustuu RNA-seq tiedot kolmen rinnakkaisen kunkin solulinjan, ylimääräisiä suodatus log2-kertainen muutos 2 ja q-arvo 0,001. Kaikki rinnakkaisnäytettä olivat hyvin samankaltaisia, kuten voidaan nähdä kuviosta S3. Lisäksi neliöllinen variaatiokerroin, joka on normalisoitu mitta rajat rinnakkaisten vaihtelevuus, on alle 0,05 ilmaistuna geenejä.

analyysi johti tunnistamiseen 703 erilaisesti ilmaistuna geenejä (taulukko S6), joista 457 geenit korkeampi ilmaistu C4-2B ja 246 suurempi ilmaistu LNCaP (kuva S2). Yleiskatsaus sijainnin differentiaalisesti ilmentyvien geenien koko genomin löytyy kuviosta 4, yhdessä taajuuden pistemutaatioiden havaittiin molemmissa solulinjoissa, on C4-2B soluissa vain, tai LNCaP-soluissa vain. Kvantitatiivinen RT-PCR viiteen differentiaalisesti ilmentyvien geenien vahvisti RNA-seq data (tuloksia ei ole esitetty).

kromosomipreparaatit ideogrammien näkyvät ympärille ulkorengas ja suuntautunut pter-qter myötäpäivään kanssa sentromeerien merkitty punaisella. Ulkorengas edustaa ilmentyvät eri geenit: 457 geenit korkeammat ilmaisua C4-2B (punaiset pisteet) ja 246 geenien korkeampi ilmentyminen LNCaP (siniset pisteet). Muut kappaleet sisältävät (ulkoa sisälle): 2244 mutaatioita yhteistä on LNCaP ja C4-2B soluja, 2129 mutaatioita spesifinen C4-2B soluja ja 546 mutaatioiden spesifisiä LNCaP osoittama tiheys per 10 megabases.

Fu

et al.

jo kuvattu joitakin differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä LNCaP ja C4-2B, mutta mikään geenien ne havaitaan ilmentyvät differentiaalisesti tietomme [20]. Ehdotamme, että viljelyolosuhteet ja erot detektiotasot todennäköisesti selittää tätä eroa. Toisaalta, on olemassa huomattavaa päällekkäisyyttä meidän aineistojen kanssa muiden tutkimusten, joissa verrattiin LNCaP ja C4-2 transcriptomes [21] – [25].

Pathway genomi ja transcriptomic aineistoja

LNCaP ja C4-2B soluja käytetään edelleen perus- ja prekliinisen tutkimuksen. Ehdotamme tietokantoihimme mutaatioiden ja differentiaalisesti ilmentyvien geenien tärkeitä inspiraation lähteitä edelleen tutkimushankkeita. Lisäksi nämä tietokannat voivat nyt tarkistaa tiettyjä mutaatioita ennen kuin alkaa käyttää näitä soluja tutkia mitään erityistä PCa liittyviä reitin.

Tämä kohta antaa esimerkin hypoteesi perustuu

in silico

analyysi kaikesta datasta. Pathway-Express analyysi C4-2B spesifisiä mutaatioita yhdistettynä 703 geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä LNCaP ja C4-2B solut osoittivat, että merkittävimmät muutokset löytyivät ECM-reseptorin vuorovaikutus reitin ja polttovälin tarttuvuus. Molemmat polut yhtyvät ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymisen myosiinikevytketjun kinaasi (MLCK) geeni (kuvio 5).

muutostyöt on määritelty, jolla on lisääntynyt (punainen) tai pienentää (sininen) ilmentyminen C4-2B verrattuna LNCaP tai somaattiset mutaatiot C4-2B soluihin (lihavoitu mustat viivat). Yliekspressio myosiinikevytketjua kinaasia C4-2B soluissa voisi erottaa ne LNCaP-solujen solujen vaeltamiseen ja polttovälin tarttuvuus.

Keskustelu

korkea mutaationopeutta LNCaP ja C4- 2B-soluja

C4-2B solut ovat peräisin luun etäpesäke nude-hiirissä inokuloitiin solut, jotka ovat peräisin LNCaP-johdettu, kastraatio kestävä ksenografteissa kutsutaan C4-2. Niitä pidetään hyödyllisenä prekliinisissä malli metastasoineeseen, kastraatio kestävä ja androgeenireseptorin positiivinen PCa. Täällä tarjoamme ensimmäistä kertaa vertaileva karttoja pistemutaatioita havaitaan LNCaP ja C4-2B soluja. Lisäksi, vaikka transcriptome analyysit LNCaP ja C4-2 on raportoitu, tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen transcriptome analyysi C4-2B soluja.

C4-2B-soluja samoin kuin LNCaP-solut ovat yllättävän suuri määrä pistemutaatioiden: 4373 ja 2790 mutaatioita vastaavasti. Kuten ensisijainen PCa ja kastraatio kestävä PCa näytteitä, mutaatioprosessiin spektriä hallitsevat G-to-A- ja C-to-T siirtymät [26] – [28]. On tunnettua, että yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä viat aiheuttavat siirtymisen mutaatioita, erityisesti G-to-A: n ja C-to-T vaihdot [29]. Näin ollen useimmat mutaatiot saattavat johtua siitä, että viallisen yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä LNCaP-soluissa, koska homotsygoottinen deleetio 3 ’päähän MSH2 geenin [30]. Chen

et al.

Jo kuvattu korreloivan korkea epävakaus satelliitin DNA LNCaP [31].

määrä pistemutaatioiden meidän solulinjoissa on paljon suurempi kuin keskimäärin 16-33 mutaatioita havaittiin koko exomes Eturauhassyövän näytteiden [26], [32] – [34]. Nämä solulinjat ovat siis epätyypillinen, mutta voidaan harkita mallina tapauksissa PCA joka mismatch korjaus on viallinen kuvatulla esimerkiksi Barbieri

et al.

, Jossa yksi PCa kasvain kanna kehyksenvaihdon mutaatio MSH6 geenin joukossa 996 muiden mutaatioiden [32]. On selvää, että korkeampi mutaationopeudet selittäisi vielä suurempi määrä mutaatioita löysimme C4-2B verrattuna LNCaP. Valitettavasti tämä myös hämärtää kuljettaja mutaatioita, jotka ovat saattaneet koitui selviytymisen etu aikana metastaattisen prosessin.

Yhteys mutaationopeudet ja ilmaisun

Sekä LNCaP ja C4-2B solulinja, näemme, että erittäin ilmaisi geenit useammin sisältää pistemutaatioita kuin ei-kopioidut geenit (p 0,0001, Chi Square testi, korkein vs. alin ilmaistuna tertile). Tämä on ristiriidassa yleisen yhteyden heterochromatin organisaatio ja Oberlandesgerichte mutaationopeudet ihmisen syöpäsoluissa [35]. Mahdollisesti näissä solulinjoissa, avoin chromatin ja liitetty transkription indusoi enemmän epäsuhta jotka normaalisti tehokkaasti korjata, mutta ei siinä tapauksessa, puutteellinen yhteensopimattomuuden korjauksen.

vertailu LNCaP ja C4-2B mutaatiot

Olemme havainneet, 1784 jaettu mutaatioita exomes LNCaP ja C4-2B, ja 2056 C4-2B-erityisiä muutoksia, mikä on järkevää, koska C4-2B solut ovat peräisin LNCaP-soluja. Olemme kuitenkin myös havainneet 404 LNCaP-erityisiä muutoksia, joista monet vahvistettiin meidän transcriptome sekvenssit. On selvää, että LNCaP-solut analysoitiin poikennut LNCaP-solut, joita käytettiin alun perin kehittää C4-2B solut [9]. Todellakin, olemme osoittaneet aikaisemmin, että jopa LNCaP eri labs ovat geneettisesti erilaisia ​​ja vaikka meidän solut hankittiin ATCC (passage 48) käytetään, C4-2B Todennäköisimmin johdettu paljon aikaisemmin kulkua LNCaP vuonna 1994 [9] , [12].

ehdotuksesta roolin MLCK metastasoituneessa prosessissa

tiedot voidaan selvästi johtaa oletuksilla, metastaattinen prosessi, joka tapahtui konversio LNCaP ja C4- 2B-soluja. Tämä on esimerkkinä lähentyminen useita vaikuttaa väyliä säätelyyn ylöspäin of MLCK. Itse asiassa on olemassa useita julkaistu yhteyksiä MLCK ja metastaattinen prosessi. Erotteluanalyysi mikrosirujen tunnisti MLCK geeni kaikkein informatiivinen geeni PCA Genesis prosessi [36], ja esto MLCK rotan PCa soluissa johtaa vähentämiseen invasiivisuus, mikä johtui lähinnä heikentynyt solujen liikkuvuutta [37]. Inhiboiva MLCK in fibrosarcoma, haimasyövän ja rintasyövän soluja johtaa myös vähentynyt tarttuvuus, muuttoliike ja invaasion ja nousi apoptoosin [38] – [41]. Toisaalta, aktivoimalla MLCK johtaa lisääntymiseen hyökkäyksen rintasyöpäsoluissa ja lisääntynyt metastaattinen potentiaali ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [42], [43]. Tasauspyörästön ilmentymistä MLCK geenin kahdessa solulinjassa tutkittiin tässä saattaisi näin ollen korreloi korkeamman metastaattinen kapasiteetti C4-2B solujen.

Johtopäätös

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat selvästi, että on suuria eroja lukumäärä ja jakauma mutaatioiden ja geenin ilmentymisen välillä LNCaP ja C4-2B soluja. Koska nämä solulinjat yleisesti käytetään tutkimaan etenemistä ei-metastasoituneen metastaattinen PCa, nämä tiedot ovat ratkaisevan tärkeitä tutkijoita oikein tulkita niiden tuloksia käytettäessä näitä solulinjoja. Lisäksi meidän tietokantojen on erittäin hyödyllistä kehittää uusia tutkimuslääkkeiden ideoita.

tukeminen Information

Kuva S1.

FastQC laadunvalvonnan tulokset kohti pohjan ominaisuuksia. Tuotos tulokset FastQC laadunvalvonta (versio 0.10.1) Tässä näytetään exome ja transcriptome sekvensointi LNCaP ja C4-2B soluja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s001

(TIF)

Kuva S2.

Normalized kattavuus asentoon. Keskimääräinen suhteellinen kattavuus näkyy jokaisessa suhteellisessa asennossa pitkin transkriptio pituudesta. LNCaP on esitetty vihreällä, kun taas C4-2B on kuvattu punaisella. X-akseli edustaa geenin pituus normalisoitu 100%, jossa 0 on 5 ’jokaisen transkriptin ja 100 on 3’-päässä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s002

(TIF )

Kuva S3.

Heatmap 703 differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Heatmap esittää kolme toistoa kunkin solulinjan, jotka ovat hyvin samankaltaisia. Kaikki differentiaalisesti ilmentyvien geenien havaittiin käyttämällä Tuxedo algoritmia, jossa q 0,001 ja log2-kertainen muutos 2 cut-off. On selvää, että suurin osa geeneistä on yliaktiivista C4-2B verrattuna LNCaP, kun taas pienempi joukko geenejä on vaimentua on C4-2B.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s003

(TIF )

Taulukko S1.

Sekvensointi ominaisuudet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s004

(XLSX) B Taulukko S2.

Suodattimet käytetään tunnistamaan pistemutaatioiden exomes LNCaP ja C4-2B soluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s005

(XLSX)

Taulukko S3.

Luettelo pistemutaatioita yksilöidyt exome LNCaP-solujen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s006

(XLSX) B Taulukko S4.

Luettelo pistemutaatioita yksilöidyt exome on C4-2B soluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s007

(XLSX) B Taulukko S5.

Suodattimet käytetään tunnistamaan pistemutaatioiden transcriptomes LNCaP ja C4-2B soluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s008

(XLSX)

Taulukko S6.

Luettelo 703 geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä LNCaP ja C4-2B soluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090002.s009

(XLSX) B

Kiitokset

Olemme erittäin kiitollisia Rita Bollen ja Hilde De Bruyn erinomaisesta teknisestä avusta. Kiitämme kollegoidemme Molecular Endocrinology laboratorio hyödyllisiä keskusteluja.