Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat vaivaava Yhdysvallat miehillä. Useimmat hoidot tasalla metastasoineeseen PCa sisältävät androgeenipuutteen terapia ja toisen sukupolven antiandrogeenit kuten abirateronin asetaatti ja enzalutamide. Kuitenkin suurin osa potilaista lopulta kehittää resistenssin näille hoitojen ja uusiutumisen osaksi tappava, kastraatio kestävä muoto Eturauhassyövän johon ei ole riittävästi hoitovaihtoehto edelleen. Näin ollen on olemassa välitön tarve kehittää tehokkaita terapeuttisia aineita kohtaan tässä potilasryhmässä. Imidazopyridines on äskettäin osoitettu olevan Akt kinaasia inhiboiva aktiivisuus; Näin tässä tutkimuksessa tutkimme estävää vaikutusta uusien imidatsopyridiinin johdannaisten HIMP, M-Mel, OMP, ja EtOP eri ihmisen kastraatio kestävä PCa soluissa. Näistä yhdisteistä HIMP ja M-Mel havaittiin olevan selektiivisiä ja ajasta riippuva kasvun estäminen: ne vähennetään kastraatio kestävä PCa soluproliferaatiota ja säästynyt hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen. Käyttämällä LNCaP C-81 solujen mallina järjestelmä, nämä yhdisteet vähensi myös pesäkkeen muodostumista sekä soluadheesiota ja muuttoliike sekä M-Mel oli voimakkain kaikissa tutkimuksissa. Edelleen tutkimus osoitti, että vaikka HIMP ensisijaisesti estää PCa solujen kasvua kautta tukahduttaminen PI3K /Akt-signalointireitin, M-Mel voi estää sekä PI3K /Akt ja androgeenireseptorin polkuja ja pidättää solujen kasvua G2 vaiheessa. Siten tuloksemme osoittavat uusi yhdiste M-Mel olevan lupaava ehdokas kastraatio vastustuskykyisten PCa terapia, ja tulevissa tutkimuksissa tutkii mekanismia imidatsopyridiiniä esto voi auttaa kehittämään tehokas anti-PCa aineina.

Citation: Ingersoll MA, Lyons AS, Muniyan S, D’Cunha N, Robinson T, Hoelting K, et al. (2015) Novel imidatsopyridiiniä johdannaisilla on anti-kasvain vaikutus ihmisten kastraatio hylkivät syöpäsolujen. PLoS ONE 10 (6): e0131811. doi: 10,1371 /journal.pone.0131811

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 10 helmikuu 2015; Hyväksytty: 7 kesäkuu 2015; Julkaistu: 29 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Ingersoll et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain National Cancer Institute, National Institutes of Health [CA88184 (MFL), CA138791 (SKB)], Department of Defense PCa koulutusapurahat [PC094594 (MFL), PC121645 (MFL)], ja University of Nebraska Medical Center Bridge Fund (MFL). Solusyklin analyysi suoritetaan UNMC virtaussytometria Core Facility osittain tukee UNMC Eppley Cancer Center avustus [CA036727] (Ken Cowan). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on edelleen yleisimmin diagnosoitu kiinteä kasvain ja toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa miehillä, säilyttäen tarvitaan uusia tehokkaita hoitovaihtoehtoja [1]. Tällä hetkellä androgeenipuutteen terapia (ADT) on standardi hoidon metastasoineeseen PCa kuitenkin useimmat PCa potilaat relapsi 1-3 vuotta kehittää kastraatio kestävä (CR) PCa joka ei reagoi ADT [2,3,4 ]. Vuonna 2004 yhdistelmä dosetakselin ja prednisonin havaittiin lisäävän potilaiden mediaanielinajassa 2-3 kuukautta, joten se standardi-of-care hoito CR PCa [5]. Äskettäin FDA on hyväksynyt uusia yhdisteitä, kuten uusi taksaani kemoterapia-kabatsitakseli [6], androgeenisynteesin estäjä abirateronin asetaatti [7], AR signalointi estäjä enzalutamide [8], immunoterapeuttiset sipuleucel-T [9], ja luun mikro-ympäristö kohdistettuja radioaktiivista lääkettä alpharadin (radium-223) hoitoon CR PCa [10]. Nämä hoitovaihtoehdot ovat vain voi pidentää elinaikaa muutamalla kuukaudella ja sillä keskimääräinen CR PCa elossaololuku pysyy alle kaksi vuotta [11]. Huolimatta edistysaskeleista jälkeisessä ADT hoitostrategioiden, CR PCa edelleen parantumaton sairaus; Näin on olemassa suuri tarve vaihtoehtoisille hoitovaihtoehtojen.

Vaikka androgeenireseptorin sieto voivat ilmetä monin eri tavoin; yksi ehdotettu vaihtoehtoinen mekanismi on aktivoitunut Akt signaloinnin mukaisesti androgen riistää olosuhteissa. Akt tiedetään säännellä solusykliä, aineenvaihduntaa, angiogeneesi, ja solujen eloonjäämistä PCA ja sen aktivointi voi edistää kasvainten vastustuskyvyn ADT ja antiandrogeenit [12,13]. Eräs mekanismi, jonka avulla Akt voivat edistää PCa selviytymiskykyä on kautta modulaatio androgeenireseptorin (AR) signalointi. Lisäksi indusoimaan solukasvu, AR on myös rooli apoptoosin säätelyyn. Kun fosforylaatiota AR at Ser-210 ja Ser-790 by Akt, AR-välitteistä apoptoosia tukahdutetaan. Tällä mekanismilla, tehostetut Akt-aktiivisuutta PCA voi edistää PCa selviytymiskykyä kun ADT [13]. Todellakin, geneettinen menetys ja /tai mutaatioita fosfatidyyli-3 kinaasi (PI3K) /Akt-reitin, joka johtaa signaalin vapauttamisen voi esittää ajan 42% ensisijainen eturauhasen kasvaimia ja yli 90% etäpesäkkeitä, että ensisijaisena seuraava in-line terapeuttinen tavoite [14]. Viime aikoina tutkimukset imidazopyridines, uuden luokan yhdisteitä, jotka sisältävät aromaattisia aldehydejä ja pyridiini- ryhmä, ovat osoittaneet nämä yhdisteet on voimakkaat Akt kinaasia inhiboiva aktiivisuus [15-17]. Tiedot osoittavat, näillä yhdisteillä on anti-proliferatiivinen vaikutus vastaan ​​CR PCa-soluja, joilla on kyky samanaikaisesti estää AR ja PI3K /Akt /mTOR signalointireittien, mikä tekee niistä lupaavia terapeuttisia aineita, [18].

tutkimiseksi imidazopyridines ”tehoa PCA hoito, LNCaP progressiivinen solumallin, alun perin tunnettu Lin et. al.

JBC

1998 käytettiin ensisijaisena solumallin tässä tutkimuksessa. LNCaP C-81-solut ovat androgen riippumaton (AI), ilmaista eturauhasen antigeenin (PSA) puuttuessa androgeenien, ja saada kyky syntetisoida testosteronin kolesterolin steroidi-vähennetty (SR) olosuhteet [19-22]. C-81-solut myös hallussaan parannettu lisääntymistä, kyky muodostaa pesäkkeitä, ja muuttavien potentiaali [21,23]. Tärkeintä on, LNCaP C-81-solut säilyttävät AR ilmaisun ja vastaavat ilmentymistä AR useimmissa PCa sekä pitkälle CR PCa [19]. Tämä tekee niistä ylivoimainen solumallin terapeuttista tutkimuksiin verrattuna moniin muihin PCa solulinjat. Muut solulinjat valittiin tähän tutkimukseen kuuluvat MDA PCa2b-AI, PC-3, ja RWPE1. Kulkiessaan, MDA PCa2b solut käyttäytyvät kuten LNCaP ja siirtymään androgen-herkkien (AS) matalissa kulku AI korkeissa kulkua. MDA PCa2b-AI (MDA-AI) solut säilyttävät myös AR ilmaisun ja niillä parannettu tumorgenicity; tämä tekee MDA-AI ja LNCaP C-81 parempi solumalleja tutkimiseen eturauhasen adenokarsinooma. Edelleen, koska kyky imidatsopyridiinin johdannaisten kohdistaa sekä Akt ja AR polkuja, on järkevää tutkia yhdisteiden vaikutusta AR-negatiivinen PC-3-solujen määrittää niiden tehoa soluissa, joista puuttuu klassinen androgen viestinvälitystekniikoita. Lisäksi PC-3-solulinjojen ovat paremmin edustettuina pienisoluinen neuroendokriini karsinooma kuin kliinisesti hallitseva adenokarsinooma [24]; Siksi tämä solulinjan tulisi käyttää yhdessä mallien, kuten LNCaP ja MDA PCa2b solulinjoja laajentaa kliinistä hyötyä. Lopuksi, kuolemattomiksi hyvänlaatuinen eturauhasen epiteeli RWPE1 solut toimivat kontrollina mitata selektiivisyys imidatsopyridiinin johdannaisen yhdisteitä. Niinpä meidän solumalleja selvästi suurin osa on molekyyli tapahtumia kliinisissä toteutuksissa modernin PCa hoitoja.

Tuloksemme osoittavat nämä imidatsopyridiiniä johdannaiset pystyvät tukahduttaa ihmisen PCa soluproliferaatiota annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Tärkeää on, yhdiste M-Mel näytteillä selektiivinen tehoa vs. CR PCa soluproliferaatiota verrattuna hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen. Lisäksi tämä yhdiste havaittiin myös estävän solujen vaeltamiseen, tarttuvuus, ja

in vitro

kasvainten muodostumiseen. Meidän data on ensimmäinen osoittaa kasvaimen vastaisen vaikutuksen uusien imi- johdannaisten HIMP, M-Mel, OMP, ja EtOP CR PCa soluissa ja osoittaa M-Mel olevan lupaava johtaa terapeuttisen aineen tuleville tutkimuksille.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

RPMI 1640-väliaine, Keratinosyyttien SFM medium, gentamisiini, ja L-glutamiini hankittiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Naudan sikiön seerumia (FBS) ja hiili-FBS: ää saatiin Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Molecular biology grade agaroosia hankittiin Fisher Biotech (Fair Lawn, NJ). Proteiinimolekyylipainostandardeja standardin markkereita, akryyliamidi, ja Bradfordin proteiinimäärityksellä kit ostettiin Bio-Rad (Hercules, CA). Polyklonaalisia vasta-aineita (Ab: t) tunnustetaan kaikki kolme isoformia Shc-proteiinin (# 29807, 1: 4000) ostettiin Upstate (Lake Placid, NY). Anti-AR (# C1411, 1: 400), anti-sykliini B

1 (# K1907, 1: 1000), anti-sykliini D

1 (# A2712, 1: 1000), anti-Bcl

XL (# F111, 1: 1000), anti-Bax (# G241, 1: 1000), anti-PCNA (# G261, 1: 3000), anti-p53: n (# K2607, 1: 1000), anti- PSA (# E1812, 1: 2000), anti-surviviini (# C271, 1: 2000), ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri (# C2011, 1: 5000), anti-kani (# D2910, 1: 5000) , anti-vuohi (# J0608, 1: 5000) IgG Abs saatiin kaikki Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-fosfo-Akt (Ser473) (# GA160, 1: 1000), anti-Akt (# C1411, 1: 2000), anti-fosfo-Stat5: n (Y694) (# 9351S, 1: 4000), ja anti-Stat5: n (# 9363, 1: 2000) Abs olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-β-aktiini (# 99H4842, 1: 10000) Abs ja 5α-dihydrotestosteronin (DHT) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Imidatsopyridiiniä johdannaiset HIMP (3-fenyyli-1- (pyridiini-2-yyli) imidatso [1,5

] pyridiini), M-Mel (1- (pyridiini-2-yyli) -3- (

m

tolyyli) imidatso [1,5

] pyridiini), OMP (1- (pyridiini-2-yyli) -3 – (

o

-tolyyli) imidatso [1,5

] pyridiini), ja EtOP (3- (4-etoksifenyyli) -1- (pyridiini-2-yyli) imidatso [1,5

] pyridiini) syntetisoitiin ja Dr. Xiu Bu kuten aikaisemmin on kuvattu [18,25] ja niiden rakenteet on esitetty kuvassa 1. lukemisen helpottamiseksi, kemiallisia lyhenteitä käytetään kaikkialla tekstissä.

HIMP, 3-fenyyli-1- (pyridiini-2-yyli) imidatso [1,5

] pyridiini; M-Mel, 1- (pyridiini-2-yyli) -3 – (

m

tolyyli) imidatso [1,5

] pyridiini; OMP, 1- (pyridiini-2-yyli) -3 – (

o

tolyyli) imidatso [1,5

] pyridiini; EtOP, 3- (4-etoksifenyyli) -1- (pyridiini-2-yyli) imidatso [1,5

] pyridiini.

Cell Culture

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP, MDA PCa2b, PC-3, ja kuolemattomaksi hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen RWPE1 solut on alun perin saatu American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). LNCaP-ja PC-3-soluja ylläpidettiin rutiinisti RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 5% FBS: ää, 2 mM glutamiinia ja 50 ug /ml gentamysiini [19,21]. MDA PCa2b soluja pidettiin BRFF-HPC1 alustassa, joka sisälsi 20% FBS: ää, 2 mM glutamiinia ja 50 ug /ml gentamysiini [26,27]. Kuten raportoitu aiemmin, LNCaP progressiivinen solumallin perustettiin jossa LNCaP tai sen alapuolella passage 33 on määritelty C-33 ja ne, tai sen yli passage 81 C-81. Vaikka C-33-solut ovat herkkiä androgeenin indusoimaa kasvua, C-81-solut ovat AI, ilmaista korkeampi pohjapinta tasoilla PSA, ja saada kyky syntetisoida testosteronin kolesterolista [19-22]. Samanlainen LNCaP mallin kulkiessaan, MDAPCa2b solut muuttuvat AI ja on monia biokemiallisia ominaisuuksia kliinisten CR PCA sisältyy ilmaisu toiminnallisten AR, PSA eritystä, ja nopea solujen lisääntymistä androgeeni-riistää olosuhteissa [19,21,22,27 , 28]. RWPE1 soluja viljeltiin Keratinosyyttien-SFM täydennetty naudan aivolisäkeuutetta (25 ug /ml) ja rekombinantti-epidermaalinen kasvutekijä (0,15 ng /ml) yhdessä 50 ug /ml gentamisiiniä.

jäljittelemiseksi kliinisessä ADT , soluja pidettiin SR olosuhteissa, toisin sanoen, ilman fenolipunaista RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 5% hiili /dekstraani-FBS: ää, 2 mM glutamiinia ja 50 ug /ml gentamysiini plus 1 nM DHT. Imidatsopyridiini johdannaiset HIMP, M-Mel, OMP, ja EtOP liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) 20 mM: n varastoliuos pitoisuudet, säilytettiin -20 ° C: ssa ja laimennettiin tarpeen mukaan koeolosuhteissa vastaavassa elatusalustassa.

Soluproliferaatiomäärityksiä

soluproliferaation kokeissa säännöllisesti olosuhteissa, LNCaP C-81 ja MDA PCa2b-AI-soluja ympättiin tavanomaisessa viljelyväliaineessa, ja annettiin kasvaa 3 päivää, sitten vaihdettiin väliaineeseen, joka sisälsi vastaavan yhdisteen ja viljeltiin vielä 3 päivää. Määrittämiseksi solujen lisääntymisen mukaisesti SR olosuhteissa, LNCaP C-81, MDA PCa2b-AI, PC-3, ja RWPE1 solut ympättiin säännöllisesti olosuhteissa ja annettiin kasvaa 3 päivää. Sitten soluja steroidi nälässä 48 tunnin ajan SR keskipitkällä ja vaihdetaan tuoreeseen SR alustalla, joka sisälsi vastaavat yhdistettä, sitten viljeltiin vielä 3 päivää. Ohjaus ryhmät saivat liuottimella DMSO yksin. Tällä määritettyä ajankohtaa, solut trypsinoitiin ja elävien solujen määrä laskettiin kautta trypaanisiniekskluusiolla määritys käyttäen Cellometer Auto T4 Image-pohjainen solu laskuri (Nexcelom, MA, USA).

Cell Growth Kinetic ja Annostus määritykset

Annoksesta riippuvaa määritykset suoritettiin LNCaP C-81-soluja samalla tavalla kuin soluproliferaatiomääritykset ja käytetään alustaa, joka sisälsi 0, 1, 5 tai 10 uM määritellyn yhdisteen. Määrittää kineettinen vaikutus HIMP ja M-Mel kasvuun LNCaP C-81-soluja, solut ympättiin kuuteen viljelylevyille tiheydellä 2 x 10

3 solua /cm

2 ja ylläpidetään säännöllisesti viljelyolosuhteet 3 päivää. Solut vaihdetaan sitten SR keskipitkän ja pidettiin 2 päivää. Yksi levy on kiinnitetty solut kerättiin ja lasketaan päiväksi 0, ja loput solut muutettiin niiden kasvatusväliaineessa: ohjaus (DMSO), HIMP, ja M-Mel (10 uM). Kullakin ajanhetkellä, solut kerättiin solujen lukumäärän laskenta ja loput solut ruokittiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi vastaavan hoidon yhdistettä. Sen jälkeen, kun solujen määrä laskenta, solulysaatteja valmistettiin Western blot -analyysiä varten.

virtaussytometria-analyysi

määrittämiseksi yhdisteiden vaikutus solusyklin, LNCaP C-81-soluja ympättiin T25-pulloihin tiheyteen 2 x 10

3 solua /cm

2 varsinaisella väliaineessa 3 päivää, vaihdetaan SR keskipitkällä 48 tuntia, ja sitten syötettiin tuoretta SR alustalla, joka sisälsi 10 uM määritellyn yhdisteen. Yhdet solujen kerättiin jälkeen 3, 5, ja 7 päivän hoidon vastaavasti trypsinaation. Sen jälkeen, kun solujen määrä laskenta, alikvootti soluja pelletoitiin sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen 70% etanolia, ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuuttia, sitten ne pestiin PBS: llä ja pyöritettiin alas sentrifugoimalla. DNA etanoli-kiinnitettyjä soluja värjättiin käyttäen Telford reagenssia (PBS, pH 7,4, joka sisälsi 0,1% Triton X-100, 0,1 mM EDTA dinatriumsuola, 0,05 mg /ml RNaasi A: ta (50 U /mg), ja 50 mg /ml propidiumjodidin) 4 ° C: ssa 4 tunnin ajan [29]. Määrittämiseksi solukierron jakelu suoritettiin käyttäen Becton-Dickinson fluoresenssi-solulajittelijaa (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) on UNMC Flow Cytometry Core Facility.

Soluadheesiokoe

vaikutuksen määrittämiseksi imidatsopyridiiniä johdannaisten PCa soluadheesiota muovi-ware pinnat, LNCaP C-81-solut suspendoitiin 5% FBS 1640 RPMI, joka sisälsi 10 uM vastaavien yhdisteiden ja inkuboitiin 30 minuuttia. Sitten solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille kolmena rinnakkaisena tiheydellä 3×10

3 solua /cm

2 vastaaviin hoitoa väliaineessa ja inkuboitiin vielä tunti. Sitoutumattomat solut pestään huolellisesti pois ja jäljelle jääneet kiinnittyneet solut värjättiin 0,2% kristalliviolettia, joka sisälsi 50% metanolia. Kokonaismäärä solujen viidellä at 40x suurennos kuoppaa kohti laskettiin.

klonogeeninen ja Soft Agar Colony Formation Analyysit

klonogeeniset solukasvumäärityksessä pinnalla muovi-tavarat toteutettiin kuvattu aiemmin [23,26]. Lyhyesti, LNCaP C-81-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille säännöllisesti viljelyolosuhteissa kolme tiheydet: 20, 200, ja 2000 solua per kuoppa. Soluja inkuboitiin yön yli, minkä jälkeen irrallinen solut poistettiin ja kiinni olevat solut ruokittiin tuoreella säännöllisesti, joka sisälsi 10 uM hoidon yhdistettä. Soluja kasvatettiin 9 päivää vaihtaen tuoretta elatusainetta joka kolmas päivä. On 10

päivänä, väliaine poistettiin ja solut pestiin jääkylmällä HEPES-puskuroitu suolaliuos, liitetään sitten solut värjättiin 0,2% kristalliviolettia, joka sisälsi 50% metanolia. Koe suoritettiin kahtena kappaleena.

vaikutus imidatsopyridiiniä johdannaisten kiinnittymisestä riippumaton kasvu LNCaP C-81-soluissa arvioitiin pehmeässä agarissa määrityksen. Lyhyesti, 5×10

4-solut ympättiin 0,25% agaroosi pintakerros, jossa on pohja, joka sisältää 0,3% agaroosia 6-kuoppaisille levyille. Päivänä ymppäyksen jälkeen, soluklusterien jotka sisältävät enemmän kuin yhden solun jätettiin pois tutkimuksesta. Solut syötettiin sitten 0,5 ml: lla tuoretta säännöllisesti alustaa, joka sisälsi vastaavan yhdisteen 3 päivän välein 4 viikon ajan. Jälkeen koejakson, pesäkkeet värjättiin 0,2% kristalliviolettia, joka sisälsi 50% metanolia ja laskettiin.

Cell Migration määritys

vaikutuksen määrittämiseksi imidatsopyridiiniä johdannaisten PCa solun liikkuvuuden, LNCaP C-81 solumigraatio arvioitiin kautta Boyden kammion määrityksessä. Solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

4 solut ylempään kammioon 24-kuoppaisen levyn Transwell-irto. Joka sisälsi 10 uM hoidon yhdistettä (liuotin yksinään hallinnasta) pantiin sekä ylä kammioihin siirtoaltaat. Soluja inkuboitiin sitten 24 tuntia, minkä jälkeen ne värjättiin 0,2% kristallivioletilla liuos 50% metanolia, ja jäljellä oleviin soluihin ylempään kammioon poistettiin kautta pumpulipuikolla. Solut, jotka olivat vaeltaneet läpi alempaan kammioon laskettiin 40x suurennoksella mikroskoopilla.

immunoblot-analyysi

Kaikki solut huuhdeltiin jääkylmällä HEPES-puskuroitu suolaliuos, pH 7,0, otettiin talteen kautta kaavinta, ja hajotettiin jääkylmässä hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi ja fosfataasiestäjät. Yhteensä solulysaatit valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [19,30]. Proteiinipitoisuus supernatantissa määritettiin käyttämällä Bio-Rad Bradford-proteiinin määrityksen. Immunoblottausta, alikvootti kokosolulysaattia elektroforeesi SDS-polyakryyliamidigeeleillä (7,5% -12%). Sen jälkeen, kun siirretään nitroselluloosakalvolle, kalvot estettiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 0,1% Tween-20: ssa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Membraanit inkuboitiin vastaavan ensisijaisen Ab yön yli 4 ° C: ssa. Membraanit huuhdottiin sitten ja inkuboitiin sopivan sekundaarisen Ab: n 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kiinnostavia proteiineja havaittiin parannetun kemiluminesenssi (ECL) reagenssipakkauksen ja β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Tilastollinen analyysi

Jokainen koesarja suoritettiin kahtena tai kolmena kappaleena niin kuviossa spesifioitu legendoja, ja kokeet toistettiin toisistaan ​​riippumatta vähintään kaksi tai kolme kertaa. Keskiarvo ja keskivirhe arvot kaikkien tulokset laskettiin ja kaksisuuntainen opiskelija-t testiä käytettiin määrittämään merkitystä tuloksia.

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

annosriippuvainen vaikutus imidatsopyridiiniä johdannaisten CR PCa solujen leviämisen

LNCaP C-81 soluilla monet biokemialliset ominaisuudet kuin kliinisissä CR PCa, mukaan lukien toiminnalliset AR ilme, AI PSA eritystä, ja leviämisen kanssa intracrine kasvun säätelyssä [19,21-23] ja siten käytettiin ensisijaisena solumallin testaus- imidatsopyridiiniä yhdisteitä. Aluksi annoksesta riippuvaa vaikutusta HIMP, M-Mel, OMP, ja EtOP LNCaP C-81-solut testattiin säännöllisesti viljelyolosuhteissa. Soluja käsiteltiin 0-10 uM kutakin yhdistettä 72 tunnin ajan, ja solujen kasvu analysoitiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Säännöllisesti viljelyolosuhteet, annoksesta riippuvainen inhibitio soluproliferaatiota havaittiin kaikkien yhdisteiden arvioitu IC

50-arvot 6,1 pM (M-Mel), 6,6 uM (EtOP), 7,3 uM (OMP), ja 9,3 uM ( HIMP) (kuvio 2A).

(A) Annostus vaikutus imidatsopyridiiniä johdannaisten LNCaP C-81-soluissa. Solut maljattiin kuuden kuoppalevyillä 2 x 10

3 solua /cm

2 säännöllisesti ja sitä kasvatettiin 72 tunnin ajan. Yhdet solujen syötettiin sitten tuoreella säännöllisesti alustalla, joka sisälsi 0,1,5, tai 10 uM imidatsopyridiini- johdannaiset liuotinta yksin ohjaus ja kasvatettiin vielä 72 tuntia. Toinen joukko soluja oli ensimmäinen steroidi nälässä SR väliaineessa 48 tuntia sitten käsiteltiin vastaavien yhdisteiden tuoreen SR väliainetta, joka sisälsi 1 nM DHT 72 tuntia. Kaikki solut trypsinoitiin ja elävien solujen määrä laskettiin. Koe suoritettiin kahtena rinnakkaisena kuoppiin 3 sarjaa riippumattomassa kokeessa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE; n = 2×3. *

p

0,05 **

p

0,005 ***

p

0,0005. (B) Vaikutukset imidatsopyridiiniä johdannaisten kasvuun eri PCa solujen ja kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen. Kaikki solut maljattiin kuuden kuoppalevyille huomattava tiheys niiden väliaineessa kolme päivää, steroidi-ruokittu kaksi päivää, sitten syötettiin tuoretta SR väliaineessa 1 nM DHT, joka sisälsi 10 uM imidatsopyridiiniä johdannaiset ja kasvatettiin kolme päivää. Solut trypsinoitiin ja elävien solujen määrä laskettiin. LNCaP C-81-2 x 10

3 solua /cm

2, MDA PCab2b AI-3 x 10

3 solua /cm

2, PC-3-2 x 10

3 solua /cm

2, RWPEI- 7,5 x10

3 solua /cm

2. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena 3 sarjaa riippumattomassa kokeessa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE; n = 3×3. *

p

0,05; **

p

0,001; ***

p

0,0001.

tutki vaikutusta yhdisteiden SR olosuhteissa, matkien ADT olosuhteissa. Yhdisteet estivät solujen kasvun jälkeen annostusta vastauksen arvioitu IC

50-arvot 10,2 uM (M-Mel), 10,5 uM (OMP), 11,6 uM (HIMP), ja 16,0 uM (EtOP) (kuvio 2A). Mielenkiintoista, M-Mel oli suurin estävä aktiivisuus molemmissa kasvuolosuhteissa. Vaikka EtOP oli verrattavissa esto M-Mel säännöllisesti olosuhteissa, se oli vähiten vaikutusta alle SR olosuhteissa. HIMP ja OMP osoitettiin myös olevan vähemmän tehokas kuin M-Mel molemmissa hoito olosuhteissa.

valikoiva antiproliferatiivista Yhdisteiden vaikutuksen PCa vs. ikuistettu Normaali eturauhanen epiteelisolujen

estävä vaikutus kunkin inhibiittorin proliferaatioon tutkittiin käyttäen paneelia syöpä- ja hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen linjat. AI PCa soluihin, kuten AR-positiivisia LNCaP C-81 ja MDA PCa2b-AI sekä AR-negatiivinen PC-3-soluja valittiin edustajat kehittyneitä CR PCa. RWPE1 solujen kuolemattomaksi hyvänlaatuinen eturauhasen epiteeli- solulinjan, käytettiin määrittämään yhdisteiden selektiivisyys. Kolmen päivän 10 uM kohtelun SR olosuhteissa, HIMP, M-Mel, ja EtOP kaikki näkyvät selektiivinen proliferaation inhibitiota syöpäsolujen merkittävästi vähemmän vaikutusta ei-syöpä RWPE1-soluissa (kuvio 2B). Vaikka OMP oli tehokas C-81 ja PC-3-solut, se oli verrattain voimakas vastaan ​​RWPE1 soluja. Kaiken kaikkiaan tulokset osoittavat HIMP ja M-Mel olivat valikoivia, estämällä PCa solun kasvua huomattavasti enemmän kuin RWPE1 solujen M-Mel näyttämällä suurempi esto kaikissa solulinjoissa analysoitiin.

Suppression Eturauhassyövän tuumorigeenisyyden by imidatsopyridiiniä Johdannaiset

yhdisteillä kyky estää pesäkkeenmuodostusta LNCaP C-81-soluissa oli aluksi käsiksi in vitro klonogeeniset määrityksissä ankkurista riippuva solujen kasvua. LNCaP C-81-solut ympättiin 20, 200, ja 2000 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille, ja sitten käsiteltiin 10 uM kunkin yhdisteen. Kun 10-päivän hoidon, kaikki yhdisteet estivät merkittävästi klonogeenisten kasvua 2000 solua kuoppaa kohti, kuten kuviossa 3A 2000 solua per kuoppa. Vaikka M-Mel ja EtOP esti voimakkaasti pesäkekasvun, HIMP ja OMP oli suhteellisesti vähemmän voimakas. Vähäinen pesäkkeenmuodostus havaittiin tiheydet 20 ja 200 solua kuoppaa kohti.

(A) klonogeeninen määritys muoville tavarat. LNCaP C-81-solut maljattiin kuuden kuoppalevyille tiheyksinä 20, 200, ja 2000 solua /kuoppa. 24 tunnin kuluttua, joka on kiinnitetty solut käsiteltiin vastaavien yhdisteiden 10 uM pitoisuuksina imidatsopyridiiniä johdannaisia ​​tai pelkkää liuotinta kontrollina. Solut syötettiin päivinä 3, 6, ja 9 tuoretta elatusaineet sisältävät inhibiittoreilla. Päivänä 10 solut värjättiin ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin. Kuvat edustavista pesäkkeen levyt otettiin levyt ympättiin 2,000cells /hyvin, ja pesäkkeiden määrä esitetään laskettiin myös levyt ympättiin 2,000cells /kuoppa. Minimaalinen pesäkkeen muodostumista havaittu tiheydet 20 ja 200 solua /kuoppa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE; n = 2×3. ***

p

0,0001. (B) Anchorage riippumaton pehmytagar määrityksessä. LNCaP C-81-solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /35 mm: n malja 0,25% pehmeä agar-maljoille. Seuraavana päivänä solut dupleteiksi tai suurempi merkittiin ja suljettiin pois tutkimuksesta. Media lisättiin kolmen päivän välein, ja lopussa 5 viikkoa, muodostuneiden pesäkkeiden värjättiin ja laskettiin. Edustavat kuvat pesäkkeet näkyvät (yllä) ja pesäkkeiden määrä laskettiin (alla). Kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena 3 sarjaa riippumattomassa kokeessa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE; n = 2×3. *** P 0,0001. (C). Soluadheesioanalyysi muoville tavarat. Solut suspendoitiin käsittelyväliainetta 30 minuuttia ennenkuin se levitettiin 6-kuoppaisille levyille 3 x10

3 solua /cm

2 käyttäen samaa hoitoa mediaa. Solujen annettiin kiinnittyä yhden tunnin ajan, kiinnitettiin ja värjättiin 0,2% kristallivioletilla liuosta (50:50, vesi: MeOH). Kokonaismäärä solujen viidellä 40-kertaisella suurennoksella kunkin hyvin laskettiin. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena 3 sarjaa riippumattomassa kokeessa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE; n = 3×3. *

p

0,05; **

p

0,01. (D). Solujen vaeltamiseen Transwell määritys. Solumigraation arvioitiin kautta Boyden kammioon. Alikvoottia 5 x 10

4 C-81-solut ympättiin insertti 24-kuoppalevyille jotka sisälsivät 10 uM vastaavien yhdisteiden kanssa liuottimen yksin valvonnan sekä ylä- kammiot. Sen jälkeen kun 24-tunnin inkubaation siirtynyt solut värjättiin ja niitä soluja jäljellä ylemmässä kammiossa poistettiin kautta pumpulipuikolla. Solut, jotka olivat vaeltaneet läpi alempaan kammioon laskettiin. Kuvat ovat näkyvät 40x suurennuksella. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena 3 sarjaa riippumattomasta kokeesta ja tulokset esitetään ovat keskiarvo ± SE; n = 3×3, *

p

0,05; **

p

0,005.

Pehmeä agar pesäkemuodostusta Sitten suoritettiin määrittämään yhdisteiden vaikutusta ankkurista riippumaton kasvu on 3-dimentional ympäristössä. Kuten on esitetty kuviossa 3B, soluja viljeltiin tiheydellä 5000 solua per 35 mm malja neljän viikon ajan paljon vähemmän pesäkkeitä pienempien pesäkkeen koko, kun käsiteltiin imidatsopyridiiniä johdannaisia. Verrattuna kontrolli käsitellyissä soluissa pelkän liuottimen, M-Mel tukahdutetaan pesäkkeen kasvua suuressa määrin, mikä vähentää pesäkkeiden lukumäärä 90 prosenttia ja tuskin näkyvä pesäkkeen koko (kuvio 3B). Vertailun vuoksi EtOP ja OMP vähentänyt pesäkkeiden kasvu 80 ja 70 prosentin esto, vastaavasti, ja HIMP oli vähiten vaikutusta noin 50 prosentin eston.

selvittämään, näiden yhdisteiden ”vaikutus pesäkkeen muodostumiseen johtuu osittain inhibitioon soluadheesion kapasiteetti HIMP, M-Mel, OMP, ja EtOP vaikuttaa PCa soluadheesion päälle muovipinnan 6-kuoppalevyillä jälkeen tutkittiin. Vaikka nämä yhdisteet oli eriasteisia tukahduttaminen kykyyn LNCaP C-81-solujen kiinni tiheydellä 50000 solua per kuoppa, samanlainen inhiboiva suuntaus havaittiin, että klonogeenisten ja pehmeä agar määrityksissä (kuvio 3C vs 3A 3B). M-Mel oli suurin vaikutus ja pystyi vähentämään solujen kiinnittymistä noin 40 prosenttia. Vaikka HIMP ja EtOP pystyivät myös merkitsevästi estävät solujen kiinnittyminen, he tekivät niin vähäisemmässä määrin; OMP havaittiin ainoastaan ​​minimaalinen vaikutus C-81-solujen kykyä kiinnittyä muovin pintaan. Siten vaikka kaikki yhdisteet kuuluvat samaan luokkaan molekyylien, ne vaikuttavat PCa solujen pesäkkeiden muodostumista ja tarttumista eri tavalla.

tutkimiseksi estävä kyky näiden yhdisteiden kasvainten etäpesäkkeitä, niiden aktiivisuus solujen muuttoliikettä analysoitiin transwell migraatiokokeessa. Mielenkiintoista, nämä yhdisteet havaittiin eriasteista tukahduttaminen on PCa solujen vaeltamiseen. Kuvio 3D osoitti, että sekä M-Mel ja EtOP pystyivät merkittävästi vähentämään LNCaP C-81 solumigraatio kautta Boyden Chamber määrityksessä yli 24 tunnin ajan noin 30 prosenttia. Verraten, HIMP ja OMP jättänyt merkittävästi vähentää solujen vaeltamiseen. Kaiken kaikkiaan M-Mel havaittiin olevan tehokkain estävä aktiivisuus CR PCa solun tumorgenicity.

vaikutus imidatsopyridiinin yhdisteitä Proliferative ja Apoptotic Signaling CR PCa Solut

On hyvin tunnettua, että suurin osa CR PCa solujen ilmentävät funktionaalista AR joka edelleen tarvitaan niiden kasvua ja selviytymistä [22,31,32]. Selvittää, miten yhdisteet tukahduttaa PCa solujen lisääntymistä, analysoimme niiden vaikutuksia proliferatiivinen ja apoptoottisten signalointia AR-positiivisten LNCaP C-81 ja MDA PCa2b-AI soluja SR olosuhteissa. Kuvio 4A ja 4B osoittavat, että, kun 3 päivän hoitoa, 10 uM kutakin yhdistettä suppressoi merkittävästi LNCaP C-81 ja MDA PCa2b-AI-solujen proliferaatiota.

(A) LNCaP C-81-solut maljattiin kolmena kappaleena T25-pulloihin 4 x 10

3 solua /cm

2 varsinaisella väliaineessa, kasvatetaan 72 tuntia sitten steroidi ravintoa 48 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin 10 uM imidatsopyridiiniä johdannaisia ​​tai DMSO kontrollina vielä 72 tuntia SR olosuhteissa. Solut trypsinoitiin ja elävien solujen määrä laskettiin kautta trypaanisineä määrityksessä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena 3 sarjaa riippumattomassa kokeessa. ***

p

0,0005. (B) MDA PCa2b-AI-soluja kasvatettiin, käsiteltiin, ja laskettiin olosuhteissa, kuten edellä on kuvattu (A) LNCaP C-81-soluissa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE; n = 3×3. *

p

0,05; **

p

0,005; ***

p

0,0005. (C) LNCaP C-81 kokosolulysaattia proteiinit kerättiin (A) sen jälkeen, kun solujen määrä laskentaa.