Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSC) tai syövän kantasolun kaltaisia ​​soluja (CSC-LC) on havaittu monissa pahanlaatuisia kasvaimia. CSCS ehdotetaan liittyvät lääkeresistenssi, uusiutunut, ja etäpesäkkeitä ja pidetään uutena kohteena syövän hoitoon; on kuitenkin olemassa vain muutamia raportteja CSCS tai CSC-LC: in munuaissolukarsinooma (RCC). Erilaisia ​​lähestymistapoja on raportoitu CSC tunnistamista, mutta ei ole olemassa yleistä merkkiaineita CSC. Käytimme kaksi erilaista lähestymistapaa, perinteiset puolella väestöstä (SP) lähestymistapa, ja entsymaattinen (aldehydidehydrogenaasille 1 (ALDH1)) lähestymistapa tunnistamiseen CSC-LC väestön kaksi RCC solulinjoissa, ACHN ja KRC /Y. Huomasimme, että ACHN ja KRC /Y sisältävät 1,4% ja 1,7% SP-soluissa, vastaavasti. ACHN SP solut osoittivat suurempaa pallo muodostava kyky, lääkeresistenssin ja hieman korkeampaa tuumorigeenisia kyky NOD /SCID-hiirissä kuin Non-SP (NSP) soluja, mikä viittaa siihen, että solut CSC-LC ominaisuudet sisältyvät ACHN SP-soluissa. KRC /Y SP ja NSP soluista osoitti eroa tällaiset ominaisuudet. ALDH1 toiminta-analyysi paljasti, että ACHN SP solut ilmaisivat korkeampaa aktiivisuutta kuin NSP soluja (SP vs. NSP: 32,7% vs. 14,6%). Analyysi ALDH1-positiivisten ACHN solut paljasti, että heillä on suurempi pallo muodostava kyky, itseuudistumisen kyky, tuumorigeenisyyteen ja ilmaista korkeammat mRNA tasoja CSC-LC kiinteistöihin liittyviä geenejä (esim ABC transporter geenit, itsereplikaation geenejä, anti- apoptoosin geenejä, ja niin edelleen) kuin ALDH1-negatiivisia soluja. Huumehoito tai altistuminen hypoksinen ehto aiheuttama 2- 3-kertainen määrä ALDH1-positiivisten solujen. Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että ALDH1-positiivisten solujen populaatio sijaan SP solut näyttävät CSC-LC ominaisuudet on RCC solulinjassa, ACHN.

Citation: Ueda K, Ogasawara S, Akiba J, Nakayama M, Todoroki K, Ueda K, et ai. (2013) aldehydidehydrogenaasi 1 Osoittaa Solut syöpä Stem Cell-Like Properties in Human munuaissyöpää Cell Line. PLoS ONE 8 (10): e75463. doi: 10,1371 /journal.pone.0075463

Editor: Masaharu Seno, Okayama yliopistossa Japanissa

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2013 Hyväksytty: 14 elokuu 2013; Julkaistu: 08 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Ueda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole rahoitusta tai tukea raportti.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munuaissolukarsinooma (RCC) on yksi yleisin pahanlaatuisten urogenitaaliseen osuus 116500 kuolemantapausta vuonna 2008 mukaan Maailman terveysjärjestön [1]. Ilmaantuvuus RCC on noussut tasaisesti 30 viime vuoden aikana [2]. Lisäksi, koska metastaattisen RCC on tunnetusti kestää useimpia tavanomaisia ​​hoitoja, kuten kemoterapiaa ja sädehoitoa, ennuste potilaiden RCC on köyhä kuin kolmasosa potilaista jo etäpesäkkeitä klo alustavan diagnoosin ja 30-40% heistä kehittyy etäinen etäpesäkkeet sen jälkeen, kun resektio primaarikasvaimen [3]. Viime vuosina molekyyli kohdennettuja hoitoja, joita on kehitetty ovat osoittaneet merkittäviä objektiivisia vasteita [4] – [6], ja ne ovat nyt tunnustettu nykyinen standardi hoitojen metastaattisen RCC. Teho kuitenkin näiden molekyylikohteena hoitoja on riittämätön.

Kaksi hallitseva mallia syövän ovat satunnaismalli (klonaalinen kehitys) ja hierarkkinen organisaatio kasvain (syöpä kantasolujen (CSC)) malli. Perinteisellä klonaalisia evoluutiomalli, kasvaimen muodostumisen on seurausta kasaantua satunnainen geneettisiä tapahtumia normaaleissa erilaistuneita soluja, kun taas CSC malli oletetaan, että yksi CSC synnyttää hierarkkinen organisaatio kasvain [7], [8]. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että CSCS voi olla vastuussa kasvaimen kehittymisen ja edistävät jotkut yksilöt sietävät syöpähoidon, mikä johti syövän uusiutumisen ja etäpesäkkeiden [9], [10]. Siksi uskotaan laajasti, että tunnistamiseen ja CSC tai syövän kantasolun kaltainen solu (CSC-LC) voivat edistää merkittävästi kehittää tehokkaita hoitoja. Bussolati et ai. tunnistettu populaatio CD105 positiivisia kasvaimen aloittamista solujen RCC, ja kirjallisuudesta roolista kantasolujen ihmisen RCC [11], [12]. Kim et ai. raportoitu, että ilmaisu kantasolujen markkereita, Oct4 ja CD133, voi palvella vastaavasti köyhänä ja suotuisa ennustetekijöiden merkki, vuonna papillaarinen RCC [13]. Lisäksi he ehdottivat, että ilmaus CD133 on suotuisa prognostinen markkeri selkeä munuaissyöpää [14].

On monia raportteja, jotka CSC-LC on joitakin kiinteitä kasvaimia ovat läsnä puolella väestöstä (SP) solut [15], [16], mutta on olemassa vain muutamia raportteja roolista SP solujen ihmisen RCC [17], [18]. SP solut tunnistettiin alun perin virtaussytometristen analysoidaan niiden kyky pumpata elintärkeitä DNA väriaine Hoechst 33342, jolloin Hoechst-negatiivisten SP-soluissa ja Hoechst-positiivisia kuin SP (NSP) soluja. Aiemmat tutkimukset syöpien in vitro ja primaarikasvaimille in vivo ovat osoittaneet, että SP-solut ovat ainutlaatuisen pystyy tuottamaan sekä SP ja NSP solupopulaatioiden, joilla ominaisuuksia sopusoinnussa kantasoluja tai CSC. SP-solut ilmentävät korkeita ATP-sitoutumisen kasetin (ABC) transporter perheenjäseniin, erityisesti ABCG2, ja niillä on enemmän kemoterapeuttista lääkeresistenssin kuin NSP solu- linjat, jotka ovat peräisin joidenkin ihmisen pahanlaatuisia kiinteitä kasvaimia, kuten rinta- syöpä, keuhkosyöpä, munasarjasyöpä ja okasolusyöpä [19] – [21].

Viime aikoina on raportoitu, että aldehydidehydrogenaasin 1 (ALDH1) vastaa hapetus retinolin ja retinoiinihappo ja sillä keskeinen rooli alkion kehitykseen homeostaasia useissa elimissä [22]. Jotkut tutkijat ovat raportoineet, että korkea ilmentyminen ALDH1 liittyi lääkeresistenssin ja huono ennuste, ja että ALDH1 on CSC merkki [23], [24]. Ozbek et ai. raportoitu että ALDH1 ilmentyminen korreloi kasvaimen RCC [25], mutta biologinen ominaisuudet ALDH1-positiivisten solujen RCC ovat yhä suurelta osin tuntemattomia.

Tässä tutkimuksessa olemme eristetty SP soluja kahdesta ihmisen RCC solu linjat ja systemaattisesti tutkittu CSC ominaisuudet SP solujen ja ALDH1-positiivisten solujen, ja suhde SP solujen ja ALDH1-positiivisten solujen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja eläimet

käytetään kaksi RCC solulinjat: joka on peräisin pahanlaatuisen keuhkopussieffuusio potilaan RCC (ACHN) ja muut johdetut vaurion potilaan RCC (KRC /Y). Nämä 2 RCC solulinjoilla on korkeat proliferatiivisia ja pesäkkeitä muodostavat kyvyt

in vitro

ja omaavat korkean tuumorigeenisyystesti vieläkin nude-hiirissä

in vivo

. ACHN hankittiin American Type Culture Collection. KRC /Y perustettiin laboratoriossamme [26]. Viljelyväliaine ACHN koostui modifioidussa Eaglen väliaineessa (EMEM) (Gibco, BRL /Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Viljelyväliaine KRC /Y koostui Dulbeccon modifioitu väliaine (DMEM) (Nissui Seiyaku Co., Tokio, Japani), johon oli lisätty lämmöllä inaktivoitua (56 ° C, 30 min) 5% naudan sikiön seerumia (FBS, Bioserum, Vic, Australia ), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug streptomysiiniä (Gibco BRL /Life Technologies Inc.). Soluja viljeltiin ilmapiirissä 5% CO

2 ilmassa 37 ° C: ssa. Nainen ei-lihavilla diabeetikko /sekamuotoinen immuunipuutos (NOD /SCID) hiiriä (5 viikon ikäisiä) hankittiin (Clea Japan, Inc., Osaka, Japani), ja sijaitsee laminaarivirtaus- kaapit erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa. Kaikki toimenpiteet hyväksynyt eettinen Review Committee for Animal kokeilu Kurume University School of Medicine.

Expression CSC Markers RCC Cell Lines

Analysoimme ilmaus oletetun CSC markkereita ABCG2, CD90, CD105, CD133 ja epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM) in ACHN ja KRC /Y. Soluja inkuboitiin pimeässä 4 ° C: ssa 30 minuuttia fluoresenssi-konjugoidulla monoklonaalisia vasta-aineita, mukaan lukien fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu hiiren anti-ihmisen CD90-vasta-ainetta (5E10, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja hiiren anti -ihmisen CD105-vasta-aine (MEM-226, EXBIO, Praha, Tsekin) ja fykoerytriini (PE) konjugoitua CD133 /2-vasta-aineita (293C3, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Saksa) ja anti-EpCAM vasta-aineella (EBA-1, BD Biosciences ). Solut hiiren anti-BCRP monoklonaalinen vasta-aine (ABCG2) (BXP-21, Chemicon, Temecula, CA, USA) inkuboitiin 30 minuutin ajan ja edelleen inkuboitiin pimeässä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri- Ig (FITC-GAM) (BD Biosciences). Solut pestiin, suspendoitiin uudelleen ja analysoitiin FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

SP Cell Identification ja CSC Marker ilmentäminen SP ja NSP solujen

Viljellyt solut 80 % konfluenssiin irrotettiin Accutasella (Innovative Cell Technologies, Inc., San Diego, USA) ja suspendoitiin 1 x 10

6 solua /ml fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), jota oli täydennetty 2% FBS: ää ja inkuboitiin sitten Hoechest 33342 väriainetta yksinään (5 ug /ml ACHN ja 10 ug /ml KRC /Y) (SIGMA-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) tai 20 ug /ml reserpiini (SIGMA-Aldrich) 37 ° C: ssa 60 min. Näytteet pestiin, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 2 ml: lla kylmää PBS: ää, jota oli täydennetty 2% FBS: ää, sitten 1 ug /ml propidiumjodidia (PI) (BD Biosciences) lisättiin ja solut suodatettiin 40 um: n solusiivilän (BD Biosciences). Virtaussytometria-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Reserpiini käytetään tavanomaisesti ohjaava parametri määrittää rajan SP ja NSP-soluja. Analyysit suoritettiin FACSAria II (BD Biosciences). Ilmentyminen CD90 ja EpCAM vuonna ACHN, ja että CD105 ja EpCAM in KRC /Y, SP ja NSP solut tutkittiin tarkemmin. Solut värjättiin käyttämällä edellä kuvattua menetelmää.

Cell Growth määritys SP ja NSP-solujen

yhteensä 2000 SP-solujen ja NSP-soluja maljattiin 96-kuoppalevyille ja viljeltiin CO

2-inkubaattorissa. Solut kerättiin 24, 48, 72, 96, 120 tai 144 tuntia ja proliferaatiota tutkittiin kolorimetrisiä määrityksiä käyttäen 3- (4,5-di- metyylitiatsol-2-yyli-yyli -) – 2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT ) solukasvumäärityksessä sarjat (Chemicon, Temecula, CA, USA) edellä kuvatulla muualla [28].

pesäkemuodostusta SP ja NSP Cells

pehmytagar ankkurointi riippumaton klonogeeniset kasvu määrityksessä oli suoritetaan. Lyhyesti, 2 x 10

4 solut suspendoitiin 2 ml: aan EMEM tai DMEM, joka sisältää 0,36% pehmeään agariin (Gibco BRL /Life Technologies Inc.) ja 10% FBS: ää 35 mm: n malja. Solususpensio sitten päälle on presolidified 0,72% kovaa agar. Väliaine, joka sisälsi 0,36% pehmeään agariin täydennettiin kerran viikossa. Pesäkkeet ( 10 solua), joka syntyi 3 viikon kuluessa esitettiin kyky muodostaa klooneja. Viiden maljan tutkittiin kunkin solun tyyppi ja sokeasti laskettiin mikroskoopin alla (x 200) kaikilla aloilla.

Sphere muodostumisen määritys SP ja NSP Solut

yksittäisiä SP ja NSP solut kaksi solulinjat (4000 solua /malja) viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa, kuten 10 ng /ml epidermaalinen kasvutekijä (EGF) (Sankojunyaku, Tokio, Japani) ja 20 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) (Sankojunyaku) käyttäen ultra -matala-kiinnitys 6-kuoppaisille levyille (Corning Inc., Corning, NY, USA) ja 1 viikko, minkä jälkeen pallo muodostumista arvioitiin laskemalla pallojen ( 3-solut) mikroskoopilla (x 200).

Drug Resistance Pitoisuus

eristetty SP ja NSP soluja istutettiin 2000 solua kuoppaa kohti 96-kuoppalevyille, ja vaikutus multikinaasi estäjän Sorafenibi (2 uM) (Cell Signaling Technology. Inc. , Danvers, MA, USA) ja IFNa (4000 IU /ml) (OIF, Otsuka Pharma Co., Ltd., Tokio, Japani) tutkittiin. Lääkeaineresistenssi määritettiin käsittelyn jälkeen 72, 96 tai 144 tuntia MTT: llä.

tuumorigeenisyystesti määritykset SP ja NSP solut in vivo

tutkia tuumorigeenistä kapasiteettia, SP ja NSP soluja (1, 10 tai 100 x 10

3) eristettiin kaksi RCC solulinjat, sijoitetaan 100 ui väliaineessa, ja erikseen ruiskutetaan ihon alle tilaa kylkeen viisi viikkoa vanhoja naaraspuolisia NOD /SCID-hiirten nukutuksen. Tuumorigeenistä kapasiteettia arvioitiin 8 viikkoa injektion jälkeen.

cDNA valmistelu ja Quantitative Reaaliaikainen RT-PCR Gene Expression Assay

Kun SP ja NSP solujen ACHN ja KRC /Y eristettiin, yhteensä RNA uutettiin käyttäen RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), ja komplementaarisen DNA: n (cDNA) syntetisoitiin käyttäen Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (qRT-PCR) suoritettiin ekspression tutkimiseksi CSC-LC ominaisuus liittyvät geenit (esim ABC transporter geenit (ABCB1 ja ABCG2), itse-replikaation geenien (BMI1 ja c-MYC), anti-apoptoosi-geenien (BCL2 ja CFLAR), hypoksia liittyvät geenit (hypoksian indusoima tekijä 1α (HIF1α) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä-A (VEGFA)), ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) liittyvien geenien (Snail ja Twist) ) ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Geenien ilmentyminen määrityksiä ja pohja- ja koetin seokset käytettiin ABCB1, ABCG2, ALDH1A1, BMI1, c-MYC, BCL2, CFLAR, HIF1α, VEGFA, Snail, Twist, ja β-aktiini (määritys tunnukset (Hs 00184500_m1, Hs00184979_ml, Hs00946916_m1, Hs00180411_ml, Hs00153408_ml, Hs00608023_m1, Hs00153439_m1, Hs00153153_ml, Hs00900055_ml, Hs00195591_m1, Hs01675818_s1, ja Hs99999903_m1, vastaavasti; Applied Biosystems), ja lämpökäsittelyn olosuhteet olivat seuraavat: aluksi inkuboitu 95 ° C: ssa 10 min, sitten 40 sykliä vuorottelevat vuorotellen 95 ° C: ssa 10 s, 60 ° C: ssa 20 s, ja 72 ° C: ssa 15 s, ja sitten pidettiin 72 ° C: ssa 10 min.

Vertaileva geenin ilmentymisen analyysi suoritettiin käyttäen 2

(- ΔΔCt) menetelmät normalisoituivat tasolle sisäisen valvonnan geenin, β-aktiini.

ALDH1 ilmentäminen SP ja NSP solut ja solut alle Patologiset olosuhteet

ALDH1 ilmentymistä tutkittiin näytteet valmistettiin SP ja NSP-solut, lääke-käsiteltyjä soluja, ja soluja viljellään hypoksisissa olosuhteissa. Lyhyesti, SP ja NSP solut eristettiin ACHN ja KRC /Y-soluja viljeltiin 72 tunnin ajan käyttäen edellä kuvattua menetelmää. Vanhempien solut ja eristyksissä SP ja NSP soluja käytettiin näytteinä. ACHN-soluja viljeltiin EMEM, joka sisälsi Sorafenibi (1 uM) tai IFNa (4000 IU /m) 48, 72 tai 96 tuntia ja solut viljellään hypoksisissa (1% O

2) edellytykset 48, 72 tai 96 tuntia oli käytetään myös näytteitä. Näytteet suspendoitiin ALDEFLUOR määrityspuskuriin, joka sisälsi ALDH substraattia, BAAA (BODIPY-aminoasetaldehydi) (50 ug kuiva reagenssi) kanssa tai ilman sitä 5 ui spesifisen ALDH-inhibiittoria diethylaminobenzaldehyde (DEAB 1,5 mM 95% etanolissa kantaliuoksesta), negatiivisena ohjaus, ja inkuboitiin 60 min 37 ° C: ssa (ALDEFLOUR KIT, kantasolut tekniikoita, Vancouver, BC, Kanada), ja analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä (FCM).

Biologinen ominaisuudet ALDH1-positiivisia ja ALDH1- negatiivinen solut

Sphere muodostumisen määritys suoritettiin ACHN ja KRC /Y-soluissa. Tuumorigeenisyyteen määritys ja geeni-ilmentymisen määritys suoritettiin tutkia biologisten ominaisuuksien ALDH1-positiivisia ja ALDH1-negatiivisia ACHN-soluja. Vertaamaan kyky uusiutua välillä ALDH1-positiivisia ja ALDH1-negatiivisia ACHN-soluja, tutkimme pallo muodostava kyky kolmen peräkkäisen järjestysnumero kohtia yhden erottaa solut menetelmän mukaisesti ja Lim et ai. [29]. Lyhyesti, sen jälkeen erottamalla ensimmäinen kanava Pallon ja 0,25% trypsiiniä, yhden erottaa solut ALDH1-positiivisia ja ALDH1-negatiivisia soluja ACHN maljattiin 6-kuoppaisille levyille. Yksi viikko myöhemmin, pallojen lukumäärä laskettiin ja sama menettely toistettiin vielä kerran. Tuumorigeenisyyteen määritys ja geeni-ilmentymisen määritys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, paitsi vertailu 1 x 10

3-soluja ei suoritettu tuumorigeenisyyden määrityksessä.

Tilastollinen analyysi

vertailu solukasvumäärityksessä suoritettiin käyttämällä kahden tekijän factorial ANOVA, ja niille pesäkemuodostusta, pallo muodostumisen määritys, ja lääkeresistenssin määritys tehtiin käyttäen Studentin

t

-testi. Muut tiedot vertailut suoritettiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä. Arvo

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Expression CSC Markers

ACHN ilmaistaan ​​CD90 (96,9%) ja EpCAM ( 87,7%), mutta ekspressio CD105 (1,5%), CD133 (1,3%) ja ABCG2 (0,9%) pysyi hyvin alhaisilla tasoilla. Toisaalta, KRC /Y ilmaistuna CD105 (28,9%) ja EpCAM (93,0%), mutta ilmentymistä CD90 (1,7%), CD133 (1,7%), ja ABCG2 (2,9%), oli hyvin alhainen.

SP Solut analysointi ja ilmentäminen CSC merkkiaineet SP ja NSP Cells

SP solujen murto ACHN ja KRC /Y oli 1,4% ja 1,7%, tässä järjestyksessä (Kuva. 1A). Seuraavaksi tutkimme ilmaus CSC markkereita, kuten CD90 ja EpCAM vuonna ACHN, ja CD105 ja EpCAM in KRC /Y, SP ja NSP soluja. Ei havaittu selvää eroa CD90 ja EpCAM ilmaisun välillä SP ja NSP solujen ACHN. Vaikka ei ollut eroa EpCAM ilmaisun välillä SP ja NSP soluja KRC /Y, CD105 ilmentyminen SP-soluissa (24,6%) oli huomattavasti korkeampi kuin vuonna NSP soluissa (4,6%) (Fig. 1 B).

(A) ACHN ja KRC /Y leimattiin Hoechst 33342, ja sitten analysoitiin FCM. SP solu hinnat ACHN ja KRC /Y oli 1,4% (A-a) ja 1,7% (A-c), vastaavasti, mikä vähensi merkittävästi läsnä ollessa reserpiini (A-b, A-d). Koe toistettiin vähintään kolme kertaa kunkin solulinjan ja lähes identtiset tulokset saatiin. Edustava meidän kokeesta. (B) ei ollut ilmeisiä eroja CD90 ja EpCAM ilmaisun välillä SP ja NSP solujen ACHN. Vuonna KRC /Y solulinja, vaikka ei ollut eroa EpCAM ilmaisua, SP solut ilmensivät suurempaa CD105-positiivinen solu nopeudella kuin NSP soluja (SP vs NSP: 24,6% vs. 4,6%). Kokeet toistettiin kahdesti, ja lähes samat tulokset saatiin. Edustava meidän kokeesta.

Biologiset ominaisuudet SP ja NSP solut ACHN ja KRC /Y in vitro

ei ollut merkitsevää eroa soluproliferatiivi- kyky ja kyky muodostaa klooneja välillä SP ja NSP solujen ACHN. Toisaalta, sen jälkeen kun oli viljelty 48 tuntia, SP solut KRC /Y oli huomattavasti suurempi proliferatiivinen kyky kuin NSP-solut (

P

0,0001) (Fig. 2A). Vaikka SP solut KRC /Y oli huomattavasti korkeampi kyky muodostaa klooneja kuin NSP solut (

P

0,01) (Fig. 2B), ei ollut merkitsevää eroa alalla muodostavan kyvyn välillä SP ja NSP soluja KRC /Y. Kääntäen, SP solujen ACHN oli huomattavasti korkeampi pallo muodostavat kyky kuin NSP soluja (Fig. 2C). 72., 96 tai 144 tuntia sorafenibihoidon tai IFNa, herkkyyttä kunkin lääkkeen arvioitiin MTT-määrityksellä. Ei ollut eroa herkkyydessä SP solujen ja NSP soluja KRC /Y vastaan ​​Sorafenibi tai IFNa hoitoon. Kuitenkin SP solut ACHN oli huomattavasti korkeampi IFNa vastus (

P

0,0001) (Fig. 2D).

(A) kasvukäyrät SP ja NSP soluja. SP solut KRC /Y oli suurempi proliferatiivinen kyky verrattuna NSP soluihin (*

P

0,0001). (B) toinen clonogenity lisääntyi merkitsevästi SP solujen KRC /Y (*

P

0,01). (C) Sphere muodostava kyky oli merkitsevästi suurempi SP soluissa ACHN (*

P

0,05). (D) Lääkeaineresistenssi SP ja NSP soluja käsiteltiin Sorafenibi tai IFNa. SP solut ACHN oli korkeampi IFNa vastus (*

P

0,0001). Kokeet toistettiin kahdesti, ja lähes identtiset tulokset saatiin.

tuumorigeenisyystesti Analyysit in vivo SP ja NSP Cells

Sekä SP ja NSP solut osoittivat kasvaimen muodostavien kyky kussakin kaksi RCC solulinjat. Suhde kasvaimien välillä SP ja NSP solujen ACHN ja KRC /Y ei ollut merkittävästi erilainen, mutta tuumorigeenisyyteen SP solujen oli hieman korkeampi kuin NSP solujen ACHN (taulukko 1).

analyysi CSC-LC Property liittyvät Gene Expression SP ja NSP-soluihin qRT-PCR

ei ollut merkittäviä eroja mRNA ilmauksia ABC transporter geenien (ABCB1 ja ABCG2), itsestään replikaatiogeenit (BMI- 1 ja c-MYC), anti-apoptoosi-geenien (BCL2 ja CFLAR), hypoksia liittyvät geenit (VEGFA ja HIF1α), ja EMT liittyvät geenit (Snail ja Twist) välillä SP ja NSP solut 2 solulinjoissa. SP solujen ACHN ilmaissut hieman korkeampi ALDH1A1 mRNA kuin NSP soluja, mutta ilman näkyvää eroa ei havaittu KRC /Y (Fig. 3).

ei ollut merkittäviä eroja mRNA ilmauksia ABC transporter geenien (ABCB1 ja ABCG2), itse-replikaation geenien (BMI-1 ja c-MYC), anti-apoptoosi-geenien (BCL2 ja CFLAR), hypoksia liittyvät geenit (VEGFA ja HIF1α), ja EMT liittyvät geenit (Snail ja Twist) välillä SP ja NSP solujen 2 solulinjoissa. SP solujen ACHN ilmaissut hieman korkeampi ALDH1A1 mRNA kuin NSP soluja, mutta ilman näkyvää eroa ei havaittu KRC /Y. Koe toistettiin ainakin neljä kertaa kunkin solulinjan ja lähes identtiset tulokset saatiin.

ALDH1 Expression, ja biologinen ominaisuudet ALDH1-positiivisia ja ALDH1-negatiivinen RCC Cells

ALDH1-positiivisten solujen korko KRC /Y-soluissa oli 6,5%. Ei ollut eroa ALDH1 ilmaisun välillä SP ja NSP soluja. Vuonna ACHN soluissa ALDH1-positiivinen solu oli 15,3%. Lisäksi määrä ALDH1-positiivisia SP-soluja (32,7%) oli suurempi kuin NSP-soluja (14,6%) (Fig. 4A). Solujen kasvua merkittävästi tukahdutti käsitellyissä soluissa Sorafenibi tai IFNa ja solut altistetaan hypoksia, verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 4B). Mitä tulee ALDH1 ilmaisun, ei havaittu selvää eroa ALDH1-positiivinen solu keskuudessa ohjaus soluja, käsiteltiin Sorafenibi tai IFNa, ja solut altistettiin hypoksinen ehto 48 tuntia. Kuitenkin prosenttiosuus ALDH1-positiivisten solujen lisääntynyt kronologisesti, erityisesti soluissa, joita käsiteltiin Sorafenibi tai altistunut hypoksisissa olosuhteissa. Erityisesti sen jälkeen, kun altistus Sorafenibi tai IFNa tai hypoksia 96 tunnin ajan, prosenttiosuudet ALDH1-positiiviset solut olivat 40,0%, 19,2% ja 37,1%, vastaavasti (Fig. 4C).

(EN) ilmaus ALDH1 SP-soluissa ja NSP solujen ACHN ja KRC /Y. ALDH1-positiivinen solu hintojamme ACHN ja KRC /Y oli 15,3% ja 6,5%, tässä järjestyksessä. (B) Vertailu solujen kasvun keskuudessa ohjaus soluja, käsiteltiin Sorafenibi tai IFNa, ja solut altistettiin hypoksian ACHN. Solujen kasvua mitattiin 48, 72 tai 96 tunnin kuluttua lääkehoidon tai altistuminen hypoksia. Solujen kasvun jälkeen lääkehoitoa tai altistuminen hypoksia oli merkittävästi tukahdutetaan verrattuna kontrolli (*

P

0,005, **

P

0,0001 vs. kontrolli). (C) osuus ALDH1-positiivisten solujen käsitellyissä soluissa Sorafenibi tai IFNa, tai solut altistetaan hypoksia 48, 72 tai 96 tuntia. Prosenttiosuus ALDH1-positiivisten solujen käsitellyissä soluissa Sorafenibi tai IFNa, tai solut altistetaan hypoksia 96 tuntia oli korkeampi verrattuna normaaliin tilaan. Kokeet toistettiin kahdesti, ja lähes samat tulokset saatiin. Edustava meidän kokeesta. (D) Sphere muodostava kyky välillä ALDH1-positiivisten solujen ja ALDH1-negatiivisia soluja. Pallo muodostuminen ALDH1-positiivisten solujen ACHN ja KRC /Y oli korkeampi kuin ALDH1-negatiivisia soluja. Kokeet toistettiin kahdesti, ja lähes samat tulokset saatiin.

alalla muodostava kyky ALDH1-positiivisten solujen sekä ACHN ja KRC /Y oli korkeampi kuin ALDH1-negatiivisia soluja. Lisäksi ALDH1-positiivisten solujen ACHN syntyy huomattavasti suurempi pallo kokoja kuin ALDH1-negatiiviset solut (Fig. 4D). Lisäksi olemme huomanneet, että yhden liukenevat pallo solut maljattiin tiheydellä 4000 solua kuoppaa kohti aiheutti toisen ja kolmannen asteen aloilla 1 viikon kuluessa kylvö. Vaikka pallojen lukumäärä on osoitettu laskevan toisessa ja kolmannessa kohtia verrattuna ensimmäiseen kanavaan, alalla muodostavan kyky ALDH1-positiivisten solujen ACHN säilyi toisen ja kolmannen kohtia. Toisaalta, ALDH1-negatiiviset solut muodostivat muutama toissijainen aloilla (Fig. 5).

alalla muodostava kyky ALDH1-positiivisten solujen ACHN säilyi toisen ja kolmannen kanavien (*

P

0,0001).

Kasvaimen muodostuminen havaittiin kolmessa viidestä ja viisi viisi hiiriä, joihin injektoitiin 10 x 10

3 ja 100 x 10

3 ALDH1- positiiviset solut, vastaavasti, 8 viikkoa. Kuitenkin ALDH1-negatiivinen solu injektio ei kehittynyt näkyviä kasvaimia kaikissa hiirissä tähän mennessä (taulukko 2).

qRT-PCR: ALDH1-positiivisia ja ALDH1-negatiivinen ACHN Cells

suoritimme qRT-PCR-analyysi vertaamaan CSC-LC kiinteistöihin liittyviä geeniekspression ALDH1-positiivisten ja ALDH1-negatiivinen ACHN soluissa. ALDH1-positiiviset solut ilmensivät huomattavasti korkeampi mRNA: n kaikkien geenien, paitsi Snail kuin ALDH1-negatiivisia soluja. Tasojen nousu olivat seuraavat: ABCB1, 4,9-kertainen; ABCG2, 2,5-kertaiseksi, ALDH1A1, 4,8-kertainen; BCL2, 5,0-kertainen; CFLAR, 4,1-kertainen; BMI-1, 3,9-kertainen; c-MYC, 3,9-kertainen; HIF1α, 3,4-kertainen; VEGFA, 2,7-kertainen; Twist, 4,0-kertainen (Fig. 6).

ALDH1-positiivisten solujen osoitti merkittävästi suurempi mRNA ilmaus ALDH1A1, kuljettajaproteiiniin liittyviä geenejä (ABCB1 ja ABCG2), itsestään replikaatiogeenit (BMI-1 ja c- MYC), anti-apoptoosi-geenien (BCL2 ja CFLAR), hypoksia liittyvät geenit (HIF1α ja VEGFA) ja EMT liittyvät geenit (Twist) kuin ALDH1-negatiivisia soluja ACHN. Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa mRNA: n ilmentymisen Snail välillä ALDH1-positiivisia ja ALDH1-negatiivisia soluja. Kokeet toistettiin ainakin neljä kertaa, ja lähes samat tulokset saatiin.

Keskustelu

Koska CSC käsite esitettiin selittää heterogeenisuus kasvainsolujen, CSCS tai CSC- LC on havaittu monissa syöpien riskiä. Yleensä CSCS ole molempia itseuudistumiseen ja eriyttäminen ominaisuudet mahdollistavat CSC osittain uudestaan ​​solujen epäyhtenäisyyttä vanhempien kasvain. Useat tutkimukset ovat raportoineet, että kyvyttömyys perinteisiin hoitoihin toistumisen estämiseksi tai etäpesäkkeitä johtuu pienet subsets resistenttien solujen eli CSCS [8], [30]. Viime vuosina SP tekniikka on tullut yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä eristämiseksi CSC-LCS. Koska yksityiskohtaiset värjäys ja mittausmenetelmä Goodell et al. otettiin ensimmäisen kerran käyttöön, monet tutkijat ovat raportoineet, että SP-solut ovat osajoukko solujen korkeamman asteen maligniteetin, ja CSC-LC ominaisuudet [15], [16], [31]. Mitä RCC, Addla et al. raportoitu, että SP-soluissa oli 4-6% kaikista syöpäsoluja. Kuitenkin solun ominaisuudet SP soluja ei ymmärretä hyvin [17].

Meidän Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että SP jakeiden ACHN ja KRC /Y oli 1,4% ja 1,7%, tässä järjestyksessä. Ei ollut eroa KRC /Y SP ja NSP solujen aiheuttavan kasvaimia, pallo muodostavat kyky, tai vastustuskykyä Sorafenibi tai IFNa-, joita perinteisesti käytetään pitkälle edenneen RCC. Nämä havainnot osoittavat, että KRC /Y SP soluista puuttuu ominaisuuksia CSCS-LCS. Sen sijaan, kun taas ei ollut merkittäviä eroja ACHN SP ja NSP solujen in vitro solujen kasvuun tai pesäkkeen muodostumisen määritykset, SP solut eivät on korkeampi pallo muodostava kyky, korkeampi IFNa- vastus ja suurempi tuumorigeenisyystesti NOD /SCID-hiirissä kuin NSP soluja viittaavia solujen CSC-LC ominaisuudet sisältyvät ACHN SP-soluissa. Tällä hetkellä SP lähestymistapa on yleisimmin käytetty menetelmä tunnistaa CSC markkereita, mutta monet tutkijat edelleen kysymys suhde SP solujen ja CSCS [32] – [34]. Lisäksi Ibrahim et al. tutki suhdetta Hoechstin värjäystä pitoisuuden ja inkubointiaika ja kertoi, että Hoechst värjäys keskittymä vaikutti soluvaurioita [35]. Meidän olevassa tutkimuksessa, jotta voidaan tunnistaa SP solut ACHN ja KRC /Y käytimme Hoechst värjäystä pitoisuutena 5 ug /ml ja 10 ug /ml, vastaavasti. Hoechst-värjäys suoritetaan yleensä pitoisuutena 5 ug /ml, mutta esillä olevassa tutkimuksessa käytimme suurempi pitoisuus KRC /Y-soluja [36]. Näin ollen meidän ei voi täysin sulkea pois mahdollisuutta, että soluvauriot vuoksi Hoechst värjäystä vastasi eron biologisia ominaisuuksia havaittu KRC /Y-solujen in vivo ja in vitro nykyisissä tutkimuksessa.

Bussolati et al. aiemmin raportoitu ihmisen RCC solulinjaa että CD105-positiivisia soluja edustaa solun ryhmä korkea kyky muodostaa klooneja ja korkea kasvainten muodostumiseen; kuitenkin, meidän nykyinen tutkimuksessa todettiin, että vaikka KRC /Y SP solut sisälsivät noin viisi kertaa niin paljon CD105-positiivisia soluja kuin KRC /Y NSP soluja ei ollut eroja CSC-LC ominaisuuksien välillä KRC /Y SP ja NSP soluja. Lisäksi CD105 ekspressio havaittiin muutamia soluja ACHN. Siten nykyinen tulokset ristiriidassa havaintojen Bussolati et al., Ja viittaavat mahdollisuuteen, että CD105 ei voi olla universaali CSC markkeri RCC.

Monet viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että SP-soluissa on korkeampi ilmaus ABC kuljettajat, erityisesti ABCG2, kuin NSP solut monien kiinteiden kasvainten ja solulinjoissa, ja että tämä voi olla rooli lääkevuoto- ja lääkeresistenssin. Ilmaisu huumeiden eläinkuljetusten kautta ABCG2 on tärkeä merkki tunnistamisessa ja analysointi SP solujen [19], [20], [31], [37]. Meidän Tässä tutkimuksessa havaitsimme eroa ABCG2 ilmentymisen mRNA-tasolla välillä SP ja NSP solujen kummassakaan RCC solulinjoissa tutkittu. Kuitenkin viime vuosina useat tutkimukset ovat raportoineet, että SP-solut ilmentävät muut kuljettajat, kuten ABCB1 ja ABCB5 lisäksi ABCG2 [38], [39]. Näin ollen tämä tulos saattaa johtua siitä, että ilmentymisen muiden kuljettajat SP-soluissa, tai se voi johtua siitä, että toiminnot ABCB1 ja ABCG2 eivät heijastuu mRNA näiden geenien ilmentymistä. Tässä vaiheessa on vielä tutkittava.

Seuraavaksi, jotta voidaan tutkia muita CSC markkereita, teimme Aldefluor määritystä. ALDH1 entsyymiaktiivisuus on tunnustettu viime vuosina yleisenä merkki sekä normaalien kantasolujen ja CSCS [40], [41]. ALDH1-positiivisia soluja on CSC-LC ominaisuudet, kuten kyky itsereplikoitumaan ja muodostaa kasvaimia, niin että useat tutkijat ovat käyttäneet ALDH1 entsymaattisen aktiivisuuden kuin CSC: n merkki monissa eri syöpätyyppien, mukaan lukien keuhkot, maksa, haima , eturauhasen, virtsarakon, rinnan ja pahanlaatuinen melanooma [42] – [46]. On myös raportoitu rintasyövän ja useita muita syöpiä, että korkea ALDH1 ilmentyminen liittyy läheisesti huono kliinisen ennusteen [23]. Äskettäin pallo muodostuminen määrityksiä on käytetty laajalti arvioitaessa kyky uusiutua CSC-LCS.