Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on usein kohtalokas heterogeeninen sairaus. Beyond rooli ihmisen papilloomaviruksen (HPV), yksikään vahvistettu molekulaarinen tauti on vahvistettu. Sisäisen genomisen analyysin ja validointimenettelyissä vahvistamme neljä molekyyli- luokkaa HNSCC (pohjapinta, mesenkymaaliset, epätyypillinen, ja klassinen) vastasi allekirjoitukset perustettu squamous keuhkon, kuten vapauttaminen KEAP1 /NFE2L2 oksidatiivisen stressin koulutusjakson, ero hyödyntäminen perintölinja markkereita Sox2 ja TP63, ja parempana onkogeenien PIK3CA ja EGFR. Jotta mahdollinen kliininen käyttö allekirjoitukset ovat ilmaisia ​​luokittelu HPV-infektion tilaa sekä oletetun suuren riskin markkeri CCND1 kopiomäärä voitto. Molekyyli- etiologia alatyypeistä on ehdottanut tilastollisesti merkitsevä kromosomi voittoja ja tappioita ja ero alkuperä- solunsa ekspressiokuvioiden. Malli järjestelmät edustavat kutakin neljää alatyyppiä on myös esitetty.

Citation: Walter V, Yin X, Wilkerson MD, CABANSKI CR, Zhao N, Du Y, et ai. (2013) Molecular alatyypit pään ja kaulan alueen syöpä näytteille Erilliset mallit Kromosomi Gain ja menetys Canonical Cancer Genes. PLoS ONE 8 (2): e56823. doi: 10,1371 /journal.pone.0056823

Editor: Muy-Teck Teh, Barts London School of Medicine ja hammaslääketieteen, Queen Mary University of London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 01 lokakuu 2012; Hyväksytty: 15 tammikuu 2013; Julkaistu: 22 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Walter et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Clinical /translaation palkinnon UNC Lineberger Kattava Cancer Center; https://unclineberger.org/research/research/research/developmental-research-awards K12-RR-023248; https://www.nih.gov. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on heterogeeninen sairaus, joka edustaa seitsemäs yleisin syöpä Yhdysvalloissa. Beyond rooli ihmisen papilloomaviruksen (HPV), yksikään vahvistettu molekulaarinen tauti on vahvistettu [1] – [4]. Edelleen karakterisoimiseksi monimuotoisuus HNSCC sekä muita kasvaimia, ryhmämme ja muut ovat ehdottaneet geenien ilmentyminen (GE) alatyyppeihin keinona priorisoida hallitseva genomista kuviot tietyssä kasvain ryhmä [5] – [11]. Validoitu alatyyppiä perustuu ensisijaisesti GE profilointia rintasyövän, glioblastooma, keuhkosyöpä, ja muut ovat keränneet laajaa kiinnostusta [5] – [7], [9] – [11]. Alustava työ on ehdottanut, että kliinisesti merkittävää alatyyppejä esiintyy myös pään ja kaulan alueen syöpä [8], mutta havainnot eivät ole toistettu, ei mallia on esitelty järjestelmiä, ja etiologia alatyypeistä on epäselvä. Vuonna muissa elimissä validointi molekyyli allekirjoitusten on vahvistettu seuraavaa lähestymistapaa: (i) alatyypit osoitettiin olevan tilastollisesti pätevä, (ii) genomista muutoksia taustalla alatyyppejä dokumentoitiin, ja (iii) malli järjestelmät edustaja ilmaisun alatyyppejä tunnistettiin. Nykyinen tutkimus suunniteltiin käsittelemään kutakin edellä mainitut kohdat. Koska tavoitteena oli selvittää havaita geeniekspressiomalleja ja taustalla genomista tapahtumia, jotka ovat läsnä HNSCC, tutkimusasetelma ei sisällä mitään molekyylitason alatyyppejä, jotka määriteltiin a priori – esim. alatyyppejä luokiteltu HPV- statuksesta.

Tulokset

valvomaton Discovery of HNSCC Expression Alatyypit

Jotta kysymystä siitä tilastollisesti merkitsevä geeniekspressiota alatyyppejä voidaan havaita HNSCC, suoritimme hierarkkinen klusterointi käytettäessä ilman valvontaa ja puolueettomasti käyttämällä vakiintuneita ja tavoite tekniikat [7]. Kuten edeltävästä työstä Chung et al. [8], me dokumentoitu läsnäolo neljän geenin ilmentymisen alatyyppiä. Geenien ilmentyminen lämpökarttoja (kuvio 1A) ja koealojen tuotettu ConsensusClusterPlus [12] (kuvio S1 A – C) eivät tue on muita tilastollisesti merkitsevä klustereita tässä aineisto. Edustava joukko geenejä tiedetään tai epäillään olevan merkitystä pään ja kaulan alueen syöpä esitetään kuviossa 1B, ja testi tilastot yhdistyksen kaikkien geenien aineisto kasvaimen alatyypin esitetään taulukossa S1. SigClust [13] osoitti, että p-arvot kaikille pairwise vertailu ilmaisun alatyyppejä oli merkitsevä the.05 tasolla levittämisen jälkeen Bonferroni korjauksen monivertailuja (kuvio S1D). Viittaamme ilmaisun alatyyppiä pohjapinta (BA), mesenkymaaliset (MS), epätyypillinen (AT), ja klassisen (CL), joka perustuu biologisiin ominaisuuksiin geenien erittäin ilmaistaan ​​kunkin alatyypin.

Heatmaps ilmaisun arvojen on 840 luokittimen geenit (A) ja valitse liittyvien geenien HNSCC (B) kunkin ilmaisun alatyyppejä. Validointi lämpökarttoja sentroidisen-pohjainen etäisyydet centroids ilmaisun alatyyppien olevassa tutkimuksessa ja jotka tulevat Chung et al. (C) ja LUSC alatyypit Wilkerson et al. (D).

Kliininen Ominaisuudet

kliininen potilaiden ominaisuuksiin kuuluvat nykyiseen tutkimuksessa edustavat läpileikkauksen sairastavien potilaiden HNSCC joka on erittäin edustava otos nähty tyypillisessä kliinisessä käytännössä (taulukko 1). Ei ollut korrelaatiota kasvaimen alatyypin iän, sukupuolen, rodun, alkoholin käyttö, pakkaus vuotta tai kasvaimen kokoa. Kasvaimen alatyyppejä olivat tilastollisesti liittyy sivuston, vaikka kaikki sivustot olivat kasvaimet kussakin ilmaisun alatyypeistä, yhtä poikkeusta lukuun ottamatta (hypopharynx ei osoittanut BA). Lisäksi ei sivuston osallistunut yli 58% sen näytteiden yhteen ilmaisun alatyyppi. Ei ilmentyminen alatyyppi koostui yli 68% kasvaimista yhdestä päällä. Siksi toisin kuin muut molekyyli- markkereita, kuten HPV tai p16, voimme päätellä, että ilmaisu alatyyppejä kaapattu ulottuvuus biologian, jota ei rajoitu yhteen anatominen sivustolla [14]. Oli lisäksi tilastollisesti merkitseviä assosiaatioita kasvain alatyypin ja HPV- statuksesta, hoito, solmu tila, ja yleinen vaiheessa. On huomattava, että enemmän BA tiettyjä kehityssuuntia kohti ovat hyvin eriytetty, kun taas 13 16 huonosti eriytetty kasvaimet olivat joko MS tai CL, vaikka tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä.

validointi Alatyypit

sitten kääntyi huomiomme kysymykseen siitä ilmaisun alatyyppejä havaitaan nykyisessä aineisto vastasi aiemmin raportoineet Chung et al. [8]. Wilkerson et ai. [7] esitti vertailemiseksi geeniekspressiomalleja löytyy ilmaisun alatyyppeihin useisiin tutkimuksiin. Käytämme samaa menettelyä, joka on kuvattu täydellisemmin Menetelmät jaksossa. Lyhyesti, centroids ilmaisun alatyyppejä mitata keskimääräinen geenien ilmentyminen arvoja, ja alatyyppejä kanssa yhdenmukaisten ilme kuvioita tuottaa centroids jotka ovat pidemmälle korreloivat kuin alatyyppejä kanssa ristiriitainen ilme kuvioita. Selvä kirjeenvaihto havaittiin (kuvio 1 C), BA, MS, AT, ja CL osoittaa samaa ilmaisua kuvioita kuin Chung alatyyppien 1, 2, 3, ja 4, vastaavasti. Todettu- neljä alatyyppiä käyttämällä riippumatonta ja puolueetonta aineistoja ja menetelmiä, pidämme nämä neljä ilmaisua alatyypeistä varmennettavat.

Erilliset biologiset prosessit ja samankaltaisuudet Lung Okasolusyöpä

Ilmaisu malleja löytyy alatyyppejä ehdottaa läsnäolo olennaisia ​​eroja taustalla biologiaan liittyviä kasvaimia (taulukko S2). Geeniekspression BA oli hyvin samankaltainen kuin allekirjoituksen löytyy tyvisoluissa ihmisen hengitysteiden epiteelin, mukaan lukien korkean geenien ilmentymistä, kuten

COL17A1,

joka liittyy soluväliaineen, kasvutekijä ja reseptorin

TGFa

ja

EGFR

, ja transkriptiotekijä

TP63

[14]. Kasvaimia MS oli esimerkkinä kohonnut geenien ilmentymistä, jotka liittyvät epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), mukaan lukien mesenkymaaliset markkereita

VIM

ja

DES

, transkriptiotekijä

TWIST1

, ja kasvutekijä

HGF

[15], [16]. AT kasvaimia oli vahva HPV allekirjoitus, mistä on osoituksena kohonnut ilmentyminen

CDKN2A, LIG1

, ja transkriptiotekijä

RPA2

[17]. Kasvaimet CL, alatyypin kanssa raskain tupakoinnin historiaa, osoitti korkea liittyvien geenien ilmentymistä altistuminen tupakansavulle, mukaan lukien ksenobioottisen aineenvaihdunta geenit

AKR1C1 /3

ja

GPX2

[7], [18], [19] ja transkriptiotekijä

NFE2L2

[10].

okasolusyöpää eri sivustoja kehon osuutta useiden molekyylitason ominaisuudet – esimerkiksi menetys kromosomin 3p ja kromosomin 3q [20], [21] – niin me arveltu, että vastaavuus välillä ilmaisun alatyyppejä ja raportoi hiljattain keuhkojen okasolusyöpä (LUSC) lauseke alatyyppeihin [7] olisi noudatettava. Tutkia laajempaa fenotyypin okasolusyöpää ylemmän aerodigestive suolikanavan, jatkoimme painopisteen ennustaja menetelmät ja arvioidaan vastaavuus centroids peräisin LUSC ja HNSCC (kuvio 1 D). Huomattavan selkeä malli korrelaatiota ei havaittu, jossa BA, MS, ja CL alatyypit HNSCC vastasi LUSC pohjapinta, eritys- ja klassisen alatyyppejä, vastaavasti, Wilkerson et al. [7]. Tutkiminen TCGA LUSC data [10] antoi lisätietoja vakuuttavia todisteita taustalla yhteyksiä ilmaisu alatyyppejä kahdessa tuumorikohdat (kuva S2). Välinen kirjeenvaihto pohjapinta alatyyppien on merkittävä, koska Wilkerson et al. [7] kuvattu kokeet, joihin liittyy viljellyissä ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen jossa geeniekspressiomalleja varhaisessa ajankohtina osoitti vahvaa muistuta asian nähdään pohjapinta-alatyypin LUSC. Samoin kuten taulukossa S3, havaitsimme, että pohjapinta alatyypin HNSCC muistuttaa eniten päivästä 3 ajankohtana aika kurssin tiedot ilmasta neste rajapinta (ALI) malli [22].

DNA copy Analyysi alatyyppi

kääntyi huomiomme genomiseen korjauksilla HNSCC mitattuna kopioluvun (CN) paneelit. Ensin vahvisti monilla alueilla aikaisemmin raportoitu muuttunut HNSCC, mukaan lukien voitto kromosomien 3q, 7p, ja 11q (tilastollisesti merkittäviä voittoja nähdään sekä 11q13 ja 11q22) ja menetys kromosomien 3p, 9P, ja 14 q (taulukko S4). Kuten on nähty muissa kasvaimissa [11], on sekä yhdenmukaisia ​​ja ristiriitainen geenien kopioluvun muutos keskeisillä alueilla genomin funktiona kasvain alatyypin (kuvio 2, taulukko S5). Esimerkiksi, voittoja 3q vaihdella ilmaisu alatyypin (p = 0,01), kun taas mitään merkittävää CN eroja alatyyppejä havaittiin 11q13, joka sisältää

CCND1

(p = 1). Kanoninen HNSCC 7p voitto tapahtui sisältävän alueen

EGFR

, mutta nämä muutokset löytyivät BA, MS, ja CL, eikä AT (p = 0,01). CN arvot 3p eivät olleet merkittävästi erilaiset eri puolilla alatyyppejä (p = 0,47). Tappiot 9p alue, joka sisältää

CDKN2A

löydettiin BA ja CL vain, ja CN erot olivat merkittäviä (p = 0,01). Focal CN menetys todettiin 14q32 MS, CL, ja on erityisen korostunut AT, mutta vaikka tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Tämä alue sisältää miR203, joka on merkittävä, koska se kohdistuu ΔNp63 [23], yksi kuudesta proteiinituotteiden

TP63

. Kromosominen epävakautta myös vaihteli huomattavasti alatyypin (p = 2.2e-4), kuten kuvassa S3.

Tontit keskimääräisen kopioluvun arvot HNSCC ilmaisun alatyyppejä tasoituksen jälkeen ja harha poisto, sekä genominlaajuisten (A) ja tiettyjen kromosomien tai kiinnostavat alueet (B).

Kopioi numero muutokset ja Differential geenien ilmentymistä kromosomi 3q Expression alatyyppi

Yksi pohjimmainen genomista muutokset liittyvä okasolukarsinoomia on voitto 3q [20], [21], ja edellisessä osiossa huomata, että CN-arvot tällä alueella vaihteli ilme alatyyppi. Kiinnostavaa oli selvä ero suhteessa käyttö kolmen geenien tyypillisesti keskusteltiin tavoitteiden amplikonin:

TP63, PIK3CA,

ja

Sox2

(kuva 3). CL ja AT alatyyppejä osoittanut suhteellisesti korkeampi ilmentyminen

Sox2

suhteessa MS ja BA, joka itse asiassa näytti ilmaista vähemmän

Sox2

normaalia nielurisojen valvontaa. Sitä vastoin BA alatyypin ilmaistu huomattavasti korkeampia

TP63

kuin muut ryhmät. Samoin, vaikka MS alatyypin esillä kopioluvun voittoja 3q, yksikään oletetun kohdegeenien näytti ilmaistaan ​​korkeammalle tasolle kuin normaali nielurisojen. Kruskal-Wallis testit osoittivat, että ilmentyminen kunkin

TP63, PIK3CA,

ja

Sox2

oli ekspressioon liittyviä alatyypin jälkeen Bonferronin säädön useita testaus (taulukko S6). Tämä havainto herättää mahdollisuuden, että heterogeenisuus HNSCC saattaa osittain selittyä ero käyttö transkriptiotekijät (

Sox2

ja

TP63

) ja onkogeenin (

PIK3CA

) 3q amplikoni, joka on monimutkaisempi kuin mitä on aiemmin raportoitu [24]. Se viittaa myös siihen, että ero käyttö transkriptiotekijöiden ja onkogeenien edistetään osittain erilliset kopioluku muutoksia, voi edistää geenin ilmentymisen allekirjoitukset määritellä käsitettä alatyyppejä.

Mean geenispesifiseen kopioluku ja geenien ilmentymisen arvot että HNSCC ilmaisun alatyyppejä ja normaali nielurisojen näytettä (NL) varten geenien 3q amplikonin.

Kopioi numero Tapahtumat Ottamalla Canonical Cancer Genes

Aiemmin totesimme, että kopiomäärä arvojen voitto ja tappio alueet liittyivät ilme alatyyppiä. Nyt kuvaamme samanlaisia ​​havaintoja, jotka saatiin, kun geenispesifiseen kopioluvun arvot geenien tiedetään rooli HNSCC –

CCND1, CDKN2A,

ja

EGFR

– katsottiin, ei laajempaa alueet edellä. Yllä keskustelussa totesimme, että voitot 11q13 eivät eronneet merkittävästi koko alatyyppejä, ja Taulukko 2 osoittaa, että samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun huomio oli rajoitettu voitot

CCND1

. Sen sijaan, taajuus

EGFR

voitot vaihteli 0%: AT 31% CL (p = 0,069), kun taas taajuus

CDKN2A

tappiot vaihteli 10%: MS 63% vuonna CL (p = 0,004). Molemmat havainnot ovat yhtäpitäviä havaintojen kanssa laajemmassa alueilla 7p ja 9p, vastaavasti, on kuvattu edellä.

Aikaisemmat tutkimukset ovat havainneet assosiaatioita erillisen genomisen tapahtumia, ja nämä löydökset saatiin tietoa joko taustalla biologian tai kliinisen hoidon syöpäpotilaiden [25], [26]. Vuonna HNSCC, samanaikainen

CCND1

voitot ja

CDKN2A

tappiot on tutkittu Okami et al. [27] ja Namazie et ai. [28], jossa Namazie et al. välisen assosiaation tunnistamiseksi näiden genomista tapahtumia. Huomasimme, että

CCND1

CN voitot olivat yhteydessä

CDNK2A

tappioita kaikissa alatyyppejä (taulukko S7), ja että yhteinen tapahtuma liittyi ilmaisun alatyyppejä (taulukko 2), mikä vahvistaa ja laajentamalla tulokset Namazie ym.

Kliiniset tulokset Expression alatyyppi ja Focal Perimän Muutokset

Kun jäsentää joukko lähes 140 HNSCC kasvaimia osaksi ilmaisun alatyyppeihin, ja valossa tunnettuja riskitekijöitä kuten HPV, tupakointi ja alkoholin käyttö, me tutki ylimääräisiä ositusta hoitotuloksia voitaisiin ehdottaa. Ensin tutkitaan, onko säilyä raportoimat Chung et al. for ”alatyypin 1” voidaan jäljentää nykyisessä kohortti. Emme pystyneet vahvistamaan tätä tulosta, ja nykyisessä tutkimuksessa ei todettu yhdistyksen välillä uusiutumista elinaika ja kasvaimen alatyyppi, joko yleinen (kuvio 4A) tai kun Rajoita myöhäisessä vaiheessa potilaille (ei kuvassa). Nämä erot voidaan selittää kliinisen heterogeenisyys sairauden yhdistettynä siihen, että kasvain sivusto jakaumat kahdessa tutkimukset ovat huomattavan erilaiset.

Kaplan-Meier tontteja ja Log-Rank Test p-vertailu- uusiutumista ilmaiseksi selviytyminen kertaa kaikkiaan ilme alatyyppejä (A), HPV + vs. HPV aiheista (B), kaikki ilmaus alatyyppien HPV koehenkilöillä (C), ja AT vs. ei-AT HPV koehenkilöillä (D). Tilastollinen merkittävyys arvioitiin käyttäen Log Rank Test.

Sen selventämiseksi, onko tiedetään tai epäillään sekoittavat tekijät ovat saattaneet vaikuttaa meidän kyky havaita alatyypin liittyviä eroja potilaiden hoitotuloksiin, arvioimme vaikutus HPV- statuksesta kokonaiselinaikaan. Havaitsimme suhteellisen suuri, mutta epätarkkoja vaikutus johtuu yleisestä pieni määrä HPV + potilaista (kuvio 4B). Siksi katsoi kohtuulliseksi arvioida uudelleen kohortti HPV + potilaiden ulkopuolelle. Poissulkeminen HPV + potilaista ilmeni, että AT alaryhmä osoitti erityisen epäsuotuisat lopputulokset (kuvio 4C), ja tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä verrattuna kaikkiin muihin alatyyppeihin yhdistettynä (kuvio 4D). Sitten näytetty riippumaton sarja 122 kudos microarray (TMA) näytteet pyrkimyksenä vahvistaa tätä päätelmää. Koska array-pohjainen GE ja immunohistokemia (IHC) värjäys arvot eivät ole vertailukelpoisia, ei ollut mahdollista ennustaa kasvaimen alatyypin kunkin TMA näytteestä. Sen sijaan käytimme alhainen EGFR ja korkea p16 värjäys joka ilmaisee AT tila. Ero eloonjäämisajasta ei ollut tilastollisesti merkitsevä, mutta saadut tulokset ovat samankaltaisia ​​kuin edellä kuvatut (kuva S4).

Tutkimme myös, onko polttoväli kopiomäärä tapauksista liittyi kliinisten tutkimusten tulosten kanssa. Aikaisemmat tutkimukset ovat havainneet korrelaatiota CCND1 voittoja ja laski uusiutumista elinaika kertaa HNSCC [29]. Saimme samanlaisia ​​havaintoja, kun selvitimme CN-arvot kaikille kasvain näytteissä (kuvio S5), vaikka tuloksemme ovat marginaalisesti merkitsevä (p = 0,07). Hyvin harvat jäsenvaltiot AT tutkittavalla oli

CCND1

voitot (taulukko 2), ja tämä viittaa siihen, että käytössä on kaksi laajalti eri ryhmään joilla on huono kliinisiä tuloksia: ne, joilla on

CCND1

voitot ja ne, jotka ovat HPV – ja AT. Kuva S6 tukee tätä päätelmää.

Expression alatyypit Model Systems

Cancer Cell Line Encyclopedia [30] sisältää genomista tietoa yli 900 ihmisen syövän solulinjoissa, mukaan lukien sekä GE ja CN tietoja 19 ruokatorven ja 18 ylempi aerodigestive suolikanavan solulinjoissa. Käytimme meidän Guldinin ennustaja GE tiedot näistä solulinjoista ja totesi, että kaikki neljä ilmaisu alatyyppiä olivat läsnä (taulukko S8). Nämä havainnot ovat erityisen vaikeita valossa kliinistä merkitystä ilmaisun alatyypeistä, koska ne tarjoavat perustan tuleville tutkimuksia mallijärjestelmiin. Kuva S7 antaa esimerkkiä siitä, että alatyyppi-erityisiä CN tapahtumia esiintyy myös solulinjoissa.

Keskustelu

Tärkein tulos oli havaita neljän geenin ilmentymisen alatyyppejä HNSCC – pohjapinta, mesenkymaaliset , epätyypillinen, ja klassinen. Osoitimme myös, että nämä alatyyppejä ovat biologiset ja kliinistä merkitystä, ja siksi ne tarjoavat hyödyllistä ja informatiivinen mekanismi luokitella HNSCC kasvaimia, joka täydentää olemassa olevia menetelmiä, jotka perustuvat histologian ja kasvainpaikkaa. Analyysi julkisesti saatavilla ilmaisun aineistoja paljastui, että nämä alatyypit ovat toistettavissa HNSCC [8] ja ovat hämmästyttävän samanlaisia ​​kuin vuonna LUSC [7], [10]. Vaikka geeniekspressiomalleja erityksen LUSC alatyypin ovat samanlaisia ​​kuin vuonna mesenkymaaliset alatyypin HNSCC suosimme vaihtoehtoinen nimistö. Vahvistavia tietoja rauhas alkuperä HNSCC on vähemmän vakuuttava kuin että keuhkojen, ja näyttöä mesenkymaalisten allekirjoitus on runsas [7]. Vaikka olisi mahdollista käyttää olemassa olevia tietoja tuottaa geeni ennustaja HPV tila, emme yritä tehdä sitä, koska tulokset tämänkaltainen esittivät Martinez et al. [31]. Alueet toistuvia DNA kopioluvun voitto ja tappio havaittiin, joista jotkut sisältävät tunnettujen onkogeenien ja tuumorisuppressoreilla. Kopiomäärä arvot tietyillä poikkeavaan alueilla liittyi kasvain alatyypin, joka viittaa siihen, että kopiomäärä tapahtumat voivat edistää ilmaisun alatyyppejä. Kaikki ilmaisun alatyyppejä havaittiin HNSCC solulinjoissa, päätelmä tarjoaa perustan tuleville tutkimuksille.

Nyt lyhyesti keskustella määritelmät ilmaisua alatyyppejä. Basal ja klassisen valittiin, koska ilmaisu kuviot näissä alatyyppeihin osoittivat paljon yhtymäkohtia pohjapinta ja klassisen alatyyppejä LUSC. Wilkerson et ai. verrataan ilmaisun kuviot LUSC alatyyppeihin ajoin kurssin tietoja inhimillisten keuhkoputken epiteelisoluissa, ja he huomasivat, että pohjapinta alatyyppi oli samanlainen ilme kuvioita ilmaantunut kuin varhaisessa ajankohtina, jolloin tyvi solut ovat yleisimpiä. Samoin kuten taulukossa S2, havaitsimme, että pohjapinta alatyypin HNSCC muistuttaa eniten päivästä 3 ajankohtana aika kurssin tietoja ALI malli [22]. Klassisen alatyyppi esittelee kanoninen genomista muutoksiin liittyy okasolusyöpä – esim. poistetaan 3p ja 9p, monistamiseen 3Q, ja polttoväli vahvistus sekä

EGFR

ja

CCND1

. Mesenkymaaliset valittiin perustuen reittiin analyysi osoittaa epiteelin ja mesenkymaalitransitioon. Lopuksi, epätyypillinen valittiin, koska niillä ei ole joko

EGFR

vahvistusta tai poistaa 9p.

Erot ilmaisua malleja löytyy alatyyppejä ovat kliinisesti merkittäviä.

TP63

tuottaa kuusi erilaista proteiineja, ja ΔNp63 on yleisin isoformi HNSCC [32]. Yang et ai. [33] osoittavat, että ΔNp63 edistää solujen lisääntymistä. Chatterjee et ai. [32] totesi, että altistuminen sisplatiini vähensivät tasoja ΔNp63, joten tämä hoito voi olla erityisen tehokkaita potilaille BA. Barbieri et ai. [34] osoitti, että menetys

TP63

vuonna HNSCC solulinjoissa johti hankinta mesenkymaalisten fenotyypin, joka on vakuuttava, kun otetaan huomioon alhainen ekspressiotasot

TP63

nähdään MS. Martin ja Cano [35] osoitti, että kohonnut ilmentyminen

TWIST1

tai

BMI1

vuonna HNSCC solulinjoissa voisi lisätä todennäköisyyttä invasiivisuus ja muuttoliike. Koska MS kasvaimet näytteillä EMT fenotyyppi ja lisääntynyt ilmentyminen sekä

TWIST1

ja

BMI1

, nämä aiheet voivat olla todennäköisesti kehittää kaukaisia ​​etäpesäkkeitä. Se, että

EGFR

yliekspressoituu valtaosa HNSCC kasvaimista [36] tekee

EGFR

estäjät houkutteleva hoitovaihtoehto tähän sairauteen. Nämä hoidot ovat vähemmän todennäköisesti olevan tehokas AT kasvaimissa koska

EGFR

ilmentyminen oli matalampi kuin muissa ilmaisua alatyyppeihin.

Sox2

ja

ALDH1

olivat erittäin ilmaistaan ​​AT ja CL, ja molemmat näistä geeneistä ovat otaksuttu syövän kantasoluja markkereita, koska heidän panostaan ​​itseuudistumiseen ja pleuripotent fenotyyppi [37], [38]. Proteiinituote

PIK3CA

on p110α, joka fosforyloi AKT. Aktivoitu AKT edistää eloonjäämistä kasvainsolujen, ja näin ollen syövän syntyyn [39]. West et ai. [40] osoitti, että altistamalla normaali keuhkojen epiteelisolujen nikotiini helpottaa aktivointi AKT tekemällä siitä riippuvainen PI3K yksin. Tämä havainto yhdistettynä korkea tupakoinnin nähty CL, viittaa siihen, että PI3 estäjät tarjoavat houkuttelevan hoitovaihtoehto CL kasvaimia.

Oli useita rajoituksia tämän tutkimuksen. Ensinnäkin, meillä ei ollut GE, CN, ja kliiniset tiedot kaikista koehenkilöistä, mikä rajoitti kykyämme yhdessä analysoida näitä muuttujia. Lisäksi vaikka alatyypin etikettejä objektiivisesti määritelty klusterointialgoritmi ja geeniekspressiomalleja olivat itsenäisesti validoitu, kliiniset yhdistysten eivät olleet. Kopioi numero paneelit kertyi kaikilla näytteillä riittävän laadun ja määrän DNA: ta. Valitettavasti yli 20%: n paneelit eivät täyttäneet standardoitu laadun mittareita. Lisäksi ei ollut selvää, mikä isoformin (t)

TP63

analysoitiin meidän geenien ilmentyminen paneelit, ja valitettavasti roolia, joka

TP63

pelaa pohjapinta alatyypin ei voida täysin arvostaa ilman tietoa näiden isoformeja. Koska HPV + näytteet poistettiin tehtäessä meidän toissijainen selviytyminen analyysi, nämä tulokset tulisi nähdä tutkivan ja näin on itsenäisesti validoitu. Lopuksi HPV tilan kaikki potilaat eivät olleet käytettävissä.

Yhteenvetona olemme vahvistaneet neljä molekyyli- luokkaa HNSCC (pohjapinta, mesenkymaaliset, epätyypillinen, ja klassinen), sopusoinnussa allekirjoitukset perustettu squamous keuhkon. Sisäisen genomista analyysiä ja validointimenettelyissä, me dokumentoitu alatyyppejä tunnistaa kanoninen kasvain ja onkogeeneihin, kuten vapauttaminen

KEAP1 /NFE2L2

oksidatiivisen stressin koulutusjakson, ero hyödyntäminen sukua merkkiaineiden

Sox2

ja

TP63

, ja parempana onkogeenien

PIK3CA

ja

EGFR

. Jotta mahdollinen kliininen käyttö, allekirjoitukset ovat ilmaisia ​​luokittelu HPV-infektion tilaa sekä oletetun suuren riskin markkeri

CCND1

kopioluvun voitto. Molekyyli- etiologia alatyypeistä on ehdottanut tilastollisesti merkitsevä kromosomi voittoja ja tappioita ja ero alkuperä- solunsa ekspressiokuvioiden. Malli järjestelmät edustaja kustakin neljästä alatyyppejä esiteltiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvain kerääminen ja Geneettiset Analyysit

Saatuaan kirjallinen lupa, jäädytetty, poistaa kirurgisesti, macrodissected pään ja kaulan kasvaimet kerättiin University of North Carolina alle Institutional Review Board protokollan # 01-1283. Kasvaimen RNA uutettiin ja mRNA: n ilmentymisen analysoitiin käyttämällä Agilent 44K mikrosiruja. Kasvaimen DNA uutettiin ja DNA kopioluku määritettiin käyttäen Affymetrix GenomeWide SNP 6,0 pelimerkkejä. Yhteenveto kaikista geneettisen tiedon Tässä tutkimuksessa käytetty löytyy taulukosta S9.

mRNA Expression Analysis

Laadunvalvontamenettelyt levitettiin microarray koetin tason intensiteetin tiedostoja. Kaikkiaan 138 kasvaimen paneelit pysyi poistamisen jälkeen huonolaatuisia paneelit päällekkäisiä taulukot, ja taulukot ei-HNSCC näytteitä. Normexp taustakorjausta ja lössi normalisointi menettelyt [41] levitettiin koetin-tason tietoja. Sen jälkeen loki

2 muutosta, Koettimet sovitetaan yhteiseen geeni tietokanta tuottaa ilmaisun arvoja 15597 geenejä.

valvomaton Expression alatyyppi Discovery

Tässä kuvattu toimenpide on samanlainen kuin joka ilmestyi in Wilkerson et al. [7]. Sen jälkeen ilmaisu arvot olivat geenin mediaani keskitetty, geeni vaihtelu laskettiin käyttäen mediaani synninpäästön poikkeama. 2500 eniten muuttuva geenit valittiin. ConsensusClusterPlus [12] on käytetty suorittamaan ilman valvontaa klusterointia näiden geenien 138 matriisia. Tämä menettely suoritettiin 1000 satunnaisesti valittua sarjaa microarray näytteitä näytteenotto osuus 80% ja etäisyys metrinen yhtä suuri kuin yksi miinus Pearsonin korrelaatiokerroin.

Tilastollinen merkitys geeniekspressiomalleja Expression Alatyypit

vahvista tilastollista merkitystä neljän ryhmän, SigClust [13] sovellettiin käyttäen joukkoa 2500 kaikkein muuttuja yllä kuvatuista geeneistä. Kaikki pareittain vertailut alatyypeistä tutkittiin käyttäen 1000 simuloitua näytettä ja alkuperäinen kovarianssi arviointimenetelmää.

ilmentyvät eri geenien ja metaboliareitteihin

Differentially ilmentyvien geenien havaittiin kanssa R paketti SAMR [42] käyttämällä mediaani FDR kynnys of.01. Kunkin UNC alatyyppejä vertasimme geenin ilmentymisen arvot alatyypin kaikkiin muihin alatyyppeihin yhdistettynä. DAVID [43] käytettiin sitten löytää Kegg polkuja, jotka osoitti rikastumista korkeasti ilmaistuna geenejä kussakin alatyyppi. Lisäksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien kanssa tunnettua toiminnallista luokkia, esim. transkriptiotekijät, löydettiin vertaamalla alatyypin-geenistä luetteloiden tunnetun geenin ontologian ryhmiin [44].

Julkaistu Expression Data

microarray koetin tason intensiteetin tiedostoja tuottaman Chung et al. [8] tehtiin tausta korjaus, normalisointi ja geeni-tason yhteenvetoa samanlaisia ​​menetelmiä kuin edellä on kuvattu. Tämä tuotti geenien ilmentyminen arvot 60 aiheita ja 8224 geenejä. Alatyypin etiketit näistä 60 taulukot, joka ilmestyi [8] kutsutaan Chung alatyyppien 1, 2, 3, ja 4.

Yhteenveto RPKM arvot 20502 geenien ja 178 aiheita saatiin perusteella RNASeq data esitetään [10]. RPKM arvot olivat log

2 transformoitu, ja mikä tahansa geeni, joka sisältää vähintään yhtä puuttuva arvo poistettiin analyysistä. Tämä tuotti geenien ilmentyminen vastinetta 15314 geenejä.

Validation of Expression Alatyypit

konsensus klusterointi osoittaa alatyyppi etiketti jokaiseen array. Tämän seurauksena jotkut matriisia ei välttämättä kuvaa niiden alatyyppi. Käyttämällä siluetti leveydet [45], tunnistimme joukko 125 ”ydin” näytteet, joiden ilmentymistä kuviot olivat samanlaisia ​​kuin heidän oma alatyyppiä kuin muihin alatyyppeihin. ClaNC [46], luokittelua perustuva menetelmä lähimpään centroids, levitettiin sitten UNC ekspressiotietojen ytimestä näytteistä pyritään luomaan joukon luokittelija geenejä, joiden ilmentyminen allekirjoitusta voitaisiin käyttää luokitella uusia näytteitä. Minimointi ristivalidointi virhemäärä tuottanut listan 840 luokittelijan geenien (210 geenit per alatyyppi).

tunnistaneet luokittelija geenejä, joiden ilmentyminen arvot ovat myös läsnä Chung ilmaisun aineisto, ja sitten rajoittanut UNC ja Chung ilmaus aineistoja näitä geenejä. Sen jälkeen geeni mediaani keskitys kukin aineisto erikseen, löysimme painopisteen kullekin UNC ja Chung alatyyppeihin laskemalla mediaani lauseke arvon kullekin geeni yli kaikki ryhmät, joiden sopiva alatyyppi etiketti. Kuten [7], etäisyydet UNC ja Chung centroids laskettiin käyttäen etäisyyttä metrinen yhtä suuri kuin yksi miinus Pearsonin korrelaatiokerroin. Tämä validointi prosessi toistettiin käyttäen LUSC tietojen Wilkerson et al. [7]. RNASeq tiedot [10] käsiteltiin samalla tavalla seuraavin poikkeuksin: (i) geenien ilmentyminen arvot UNC ja log

2 (RPKM) arvot TCGA aineistot olivat erikseen mediaani keskitetty ja standardoima geeni, (ii)