Krooninen sairaus

tiivistelmä

Angiogeneesi esto on tärkeä terapeuttinen strategia pitkälle eturauhassyövän. Aikaisempi työ meidän laboratorio osoitti, että jatkuva stimulaatio Rap1 8-pCPT-2′-O-Me-cAMP (8CPT) aktivaation kautta Epac, joka on Rap1 GEF, tai ilmentämällä konstitutiivisesti aktiivisen Rap1 mutantti (cRap1) estää endoteelisolujen solujen kemotaksista ja myöhemmät angiogeneesiä. Kun testasimme tämän mallin yhteydessä eturauhasen -tuumoriksenografti, huomasimme, että 8CPT ei ollut merkittävää vaikutusta eturauhasen kasvaimen kasvua yksin. Kuitenkin soluissa kätkeminen cRap1, 8CPT dramaattisesti esti paitsi eturauhasen kasvaimen kasvua vaan myös VEGF ilmaisun ja angiogeneesiä sisällä kasvain microenvironment. Myöhempää analyysia mekanismin kävi ilmi, että eturauhassyövän epiteelisolujen, 8CPT toimi stimulaation kautta PKA sijaan Epac /Rap1. PKA antagonisoi Rap1 ja hypoksinen induktion 1α proteiinin ilmentymisen VEGF tuotantoa ja lopulta angiogeneesiä. Yhdessä nämä havainnot tarjoavat näyttöä uudenlainen vuorovaikutus Rap1, Epac, ja PKA joka säätelee kasvainta strooman angiogeneesin induktio.

Citation: Menon J, Doebele RC, Gomes S, Bevilacqua E, Reindl KM, Rosner MR (2012) romaani vuorovaikutusta Rap1 ja PKA Säätelee angiogeneesin induktio Eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (11): e49893. doi: 10,1371 /journal.pone.0049893

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 syyskuu 2012; Hyväksytty: 15 lokakuu 2012; Julkaistu: 15 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Menon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat PC094476 – puolustusministeriön (DOD) Eturauhassyöpä Research Program (PCRP) Post Jatko Fellowship (JM) ja National Institutes of Health /National Cancer Institute R01-CA109278 (MRR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat miehillä Yhdysvalloissa [1]. Korkea sairastuvuus ja kuolleisuus, jotka liittyvät puhkeamista hormoni-tulenkestävien, metastaattinen eturauhassyöpä toimeksiantojen tarvetta löytää uusia hoito-parantaa ennustetta tämän sairauden. Useita strategioita on käytetty kohdentamaan angiogeneesin eturauhassyövän, mukaan lukien salpaamalla pro-angiogeenisten tekijöiden, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) kautta monoklonaalisia vasta-aineita tai pienien molekyyli-inhibiittorien kohdistaminen alavirran signalointia efektori väyliä, kuten VEGF-reseptorityrosiinikinaasin reitti [2], [ ,,,0],3], [4]. Kuitenkin suuri puute tässä lähestymistavassa on huomattava määrä pro-angiogeenisten tekijöiden lisäksi VEGF, jotka voivat aiheuttaa angiogeneesiä ja välttyä näin näiden aineiden. Vaihtoehtona estämään yhtä tai useampia pro-angiogeenisten tekijöiden on tunnistaa molekyylejä, jotka toimivat säädellä angiogeneesiä [5].

Useat tutkimukset ovat osallisina Rap1 välittäjänä angiogeneesin [5], [6] [7], [8], [9], [10], [11]. Viallinen angiogeneesi ja hematopoieesia havaittiin hiirillä puuttuu Rap1a tai Rap1b ja järjestelyihin, integriinit ja VEGF-reseptorien endoteelisolujen äskettäin raportoitu [12], [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Siten menetys Rap1 estää angiogeneesin kehityksen aikana, sopusoinnussa rooli Rap1 pelaa solusignalointia, integriini-välitteistä soluadheesiota ja solujen soluliitos, toiminnot, jotka ovat tärkeitä putkimainen rakenne muodostumista. CAMP johdannainen 8CPT-2Me-cAMP (8CPT) on voimakas agonisti Epac, guaniininukleotidiä vaihto tekijä Rap1, ja heikkona agonistina PKA [18], [19]. Edellinen työ meidän laboratorio osoitti, että ensisijainen ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja, pitkäaikainen stimulaatio Rap1 joko Epac aktivaatio seuraavien 8CPT hoitoon tai ilmentämällä konstitutiivisesti aktivoitua Rap1 A63E (cRap1) estää kemotaksista ja angiogeneesiä [8], [9]. Täten angiogeneesin voidaan myös inhiboida endoteelisolujen, kun Rap1 edellyttää pitkäaikainen stimulaatio huumeiden tai mutaatio. Yhdessä nämä tutkimukset viittaavat siihen, että aste Rap1 aktivointi on kriittinen angiogeenisen prosessin.

PKA on myös yhdistetty angiogeneesiin sekä positiivisena ja negatiivisena säätelijänä [20], [21], [22], [ ,,,0],23], [24], [25], [26]. Lisääntynyt aktiivisuus PKA edistää endoteelisolujen putken muodostumiseen, mikä edistää angiogeneesiä [27]. Toisaalta, PKA aktivointi aiheuttaa fosforylaatio transkription repressori ID1 [28] ja häiritsee sen tuma-sytoplasma-shuttling, estäen siten angiogeneesin [29]. Lisäksi, joko yli-ilmentyminen katalyyttisen alayksikön PKA tai farmakologisen aktivaation PKA indusoi kuoleman endoteelisolujen apoptoosin, tukahduttamalla angiogeneesiä [22], [23]. Kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että angiogeneesiä johtuu tasapaino pro-ja anti-angiogeenisten tekijöiden kuten Rap1 ja PKA, ja joko äärimmäinen on haitallisia vaikutuksia.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää Rap1 säätelee angiogeneesiä eturauhasen kasvaimia. Tuloksemme viittaavat siihen, että konstitutiivinen Rap1 aktivoitumista ihmisen eturauhaskasvainsoluissa edistää hypoksinen induktion VEGF ja angiogeneesiä, ja PKA antagonisoi tätä vaikutusta. Lisäksi tutkimuksemme viittaavat siihen, että 8CPT hoito voi inhiboida angiogeneesiä kautta kaksi eri mekanismia, johon PKA-aktivaation eturauhaskasvainsoluissa, kuten kuvassa, ja Epac /Rap1 aktivoitumisen endoteelisoluilla [8].

(A ja B)

Vasen paneeli

: Kasvaimen tilavuus (millimetreinä

3) ihmisen PC3 ja PC3-cRap1 ksenograftien käsiteltävä ilmoitetulla mitattiin menetelmät kuvatulla tavalla. Päivä 0 edustaa hoidon ensimmäisenä päivänä; * P

0,05, n = 7 kussakin ryhmässä.

Right Panel

: Kuvia edustajan kasvaimen kustakin hoitoryhmässä lopussa kokeen (päivä 28). (C) Kasvaimen tilavuus (millimetreinä

3) ihmisen PC3 ja PC3-cRap1 ksenograftien käsiteltävä ilmoitetulla mitattiin kuten A; * P

0,05, n = 7 kussakin ryhmässä. (D) Kasvaimet paneelista C: ssa, punnittiin kokeen lopussa (päivä 28) ja grammoina; * P 0,05; (

n

= 7).

Materiaalit ja menetelmät

Eturauhassyöpä Cell Lines, hoidot, Antibodies, plasmidit, ja reagenssit

Epac aktivaattori 8- (4-kloorifenyylitio) -2-O-metyyli-cAMP (8CPT) ja PKA aktivaattori N6-Benzoyladenosine- 3 ’, 5’-syklinen monofosfaatti (6-Bz-cAMP) ostettiin biolog Life Sciences Institute (Bremen , Saksa). LNCaP-solut ja PC3-soluja, jotka on saatu American Tissue Culture Collection (Manassas, Virginia), pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 Mediatech RPMI 1640-väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, 50 ug /ml penisilliiniä ja 50 U /ml streptomysiiniä. Kaikki alustat ja kasvun reagenssit hankittiin Gibco BRL (Grand Island, NY). Soluja inkuboitiin 24 h seerumittomassa elatusaineessa ennen kutakin hoitoa. Soluja käsiteltiin yli yön 10 uM 8CPT tai 10 uM 6Bz-cAMP liuotettuna PBS: ää tai pelkkää PBS: ää kontrollina välineellä. Soluja käsitellään edelleen 6 h (ellei toisin mainita) 10pM CoCl

2 jäljittelemään hypoksinen tila tai SDF-1α 200 ng /ml 20 minuutin ajan. Soluja esikäsiteltiin PKA estäjien H-89 (10 uM) 30 minuuttia ennen CoCl

2 hoitoa. Vasta-aineita Epac ja tubuliinin saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Hiiren anti-humaani CD31 ja kanin anti-humaani-VEGF hankittiin Abcam (Cambridge, MA). SDF-1α saatiin R * P 0,05; n = 7; A.U. = Mielivaltaisina yksikköinä. (C) Kasvaimen tilavuus (millimetreinä

3) ihmisen PC3-cRap1 ksenografteissa. PC3-cRap1 soluja injektoitiin ksenografteja päivänä 0 ja annettiin kasvaa 10 päivää, ennen kuin osmoottinen minipumppu, joka sisältää hoitoja istutettiin jatkuvan infuusion (päivä 10, pumppu). Käsitellyt kasvaimet kuten mitattiin, kuten on kuvattu menetelmät; * P 0,05; n = 8 kullekin ryhmälle. (D) Kasvaimen paino ihmisen PC3-cRap1 ksenografteissa. Kasvainten paneeli C punnittiin lopussa kokeen (päivä 38) ja grammoina; * P 0,05; (

n

= 8).

Ethics lausunto

Kaikki toimenpiteet, joissa hiiret noudattanut politiikkaa Chicagon yliopistossa Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC ) ja hyväksyi IACUC pöytäkirjan mukaisesti # 1196. Hiiriä pidettiin siinä Vivarium että Gordon Center for Integroidun Science yliopistossa Chicagossa vuonna omistettu huoneissa on tuuletusaukkoja häkki HEPA-suodatettua ilmaa (12 tunnin valo /pimeä sykli). Hiirillä oli vapaa pääsy veden ja ruoan. Hiiriä seurattiin päivittäin tutkimushenkilökunnalle. Kyky pääsy ruoan ja veden, takaraajan liikkuvuus, normaali hengitys, normaali liikkuminen ja sosiaalinen käyttäytyminen arvioitiin. Jos eläin vaikutti huonosti se tarkkailtiin 24 tuntia ja sitten nukutettiin isofluraanilla ja lopetettiin kaasumaista ainetta ja sen jälkeen taittamalla niskasta. Eläimet olivat myös lopetettiin suosituksesta eläinlääkäri tai kliinisen henkilöstön. Kaikki toimenpiteet suoritetaan ketamiini /ksylatsiinia anestesia, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Vieraslajisiirteen Model of Human Eturauhassyöpä

Mies atyymisissä hiiriä (15-20 g, 4-6 viikkoa iästä, National Cancer Institute, Frederick, MD) istutettiin ihonalaisesti alempaan vasempaan kylkeen 1 x 10

6 PC3 (PC3-GFP) tai PC3-cRap1 (PC3-cRap1A63E-GFP) syöpäsolujen suspendoitiin 200 ui PBS: ää. Hiiret satunnaistettiin hoitoon joko PBS: ää tai 2,5 umoolia 8CPT tai 2,5 umoolia H-89. Tätä varten hiiret nukutettiin kuten edellä on kuvattu ja osmoottisia minipumppuja (Alzet malli 2004, Durect Corp, Cupertino, CA) istutettiin ihonalaisesti valaa joko PBS: ää, 8CPT tai H-89 28 päivää. Lopussa hoidon eläimet lopetettiin, tuumorit poistettiin, punnittiin ja käsitelty immunohistokemiaa. Kasvaimen tilavuus mitattiin käyttämällä kaavaa -1/2 × l × w

2 joka toinen päivä, jossa l = pituus ja w = leveys.

(A) VEGF tasot mitattiin ELISA PC3 ja PC3-cRap1 solujen hypoksisissa kaltaisissa oloissa (CoCl

2) menetelmät kuvatulla tavalla; * P 0,05, (n = 3). (B) immunoblottianalyysi ydin- otteita PC3 ja PC3-cRap1 solujen käsiteltävä ilmoitetulla. HIF-1α-proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella spesifistä vasta-ainetta; (C) analyysi VEGF-mRNA-tasojen qPCR PC3 ja PC3-cRap1 solujen käsiteltävä ilmoitetulla. Data normalisoitiin GAPDH tasolle; * P 0,05 (

n

= 3).

immunohistokemia

Hiiren kasvaimia kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 24 tunnin ja inkuboitiin 70% etanolissa 48 h ennen parafiiniupotusta. Sulautettu kasvaimet leikattiin viiteen mikrometrin paksuisia leikkeitä ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla määrittää morfologia. Osiot Kasvainten infusoida 8CPT, H-89 tai PBS immunovärjättiin VEGF, CD31 tai Ki67 käyttäen leimattua streptavidiini-biotiini tapa mitata solujen angiogeneesin tai lisääntymistä. Stained osat visualisoitiin ja valokuvattiin videokuva analyysijärjestelmää (Scion, Inc., Frederick, MD). Automatisoitu solukuvauksessa järjestelmää käytettiin määrittämään VEGF immunohistokemiallisella värjäyksellä. Capillary tiheys laskettiin laskemalla alusten immunovärjättiin CD31 +. Vähintään 6 satunnainen kentät laskettiin edustavaa osaa. Arvot esitetään keinona plus tai miinus SEM.

VEGF ELISA

Solut (5 x 10

4) maljattiin 24-kuoppaisille levyille. Kun solut olivat 70-80% konfluentteja, ne käsiteltiin kuten edellä on kuvattu. Alusta kerättiin kuopista ja VEGF tasot määritettiin valmistajan ohjeiden Ihmisille VEGF ELISA Development sarjat (PeproTech, Rocky Hill, NJ).

RNA: n eristäminen ja Reverse Transcription /reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

-RNA eristettiin soluista käyttämällä QIAshredder ja RNeasy

R Minikit Qiagen biotieteiden ja alistettiin RT-PCR: llä käyttäen korkean kapasiteetin cDNA käänteiskopioijaentsyymin kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qPCR) suoritettiin käyttäen Gene Expression Analyysit Applied Biosystems ja 2X master mix Applied Biosystems tai ABgene Applied Biosystems 7300 on StepOne Plus Real-Time PCR System. Tulokset kvantitoitiin kuten Ct-arvoja, jossa Ct on määritelty raja-syklin PCR, jossa monistettu tuote ensin havaitaan, ja määritellään suhteellinen geenin ilmentymisen (suhde kohde /kontrolli). Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja normalisoitiin GAPDH (Applied Biosystems, Carlsabad, CA).

valmistaminen Nuclear uutteet ja Western-blottaus

Sub-konfluentteja PC3 ja PC3-cRap1 solut hajotettiin kylmä ydin-puskuria (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCI2, 0,5 mM DTT: tä, ja 5% glyserolia), joka sisälsi täydellisen proteaasi-inhibiittoreita (EMD Chemicals, Paulsboro, NJ). Valmisteen sentrifugoitiin 10000 g: ssä 15 minuutin ajan. Pelletti suspendoitiin uudelleen 50 ul: aan korkean suolapitoisuuden puskuria (10 mM HEPES, pH 7,9, 400 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM DTT: tä ja 5% glyseroli) ja inkuboitiin jäillä 20 min. Kun oli sentrifugoitu 14000 g 20 minuuttia, supernatantti kerättiin ja otetaan tumafraktios- ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Tumaproteiinit (50 ug /kuoppa) ohjaus ja 8CPT käsiteltyjä soluja hypoksiaolosuhteissa kaltaisissa oloissa erotettiin 7,5% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Membraanit inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön (HIF-1α, 1:500; Novus Biologicals, Inc., Littleton, CO), mitä seurasi 1 tunnin inkuboinnin johdetun anti-hiiri-vasta-ainetta, piparjuuriperoksidaasiin (1:2500; Sigma, St. Louis, MO). Kemiluminesenssiin reagenssit käytettiin havainnollistamaan immunoreaktiivisia bändejä. a-tubuliinia (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) toimi latauskontrollina.

siRNA Transfektio

Epac siRNA (ON-TARGETPlus siRNA, Dharmacon) 100 nM transfektoitiin PC3-soluihin elektroporaatiolla (223 V 23 ms). Solut analysoitiin 48 tuntia transfektion jälkeen.

Rap1 Activity Assay

Rap1-GTP-tasot mitattiin käyttämällä Rap1 Activation Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) seuraten valmistajan protokollaa.

tilastollinen analyysi

tiedot analysoitiin käyttämällä GraphPad Prism v5 (GraphPad Software, Inc.). Tiedot annetaan keskiarvona ± SE ja verrattiin t-testillä, Wilcoxonin testi ja yksi- tai kaksisuuntainen ANOVA, jonka jälkeen seuraavat asianomaiset post-hoc t-testi määrittää p-arvot. P-arvo 0,05 katsottiin merkitseväksi.

Soluja käsiteltiin kuten on osoitettu, ja VEGF-tasot mitattiin ELISA: lla, kuten on kuvattu menetelmät. (A ja B) PC3 tai PC3-cRap1 soluissa; * P 0,05, n = 3. (C ja D) LNCaP tai LNCaP-cRap1 solut; * P 0,05, n = 2.

Soluja käsiteltiin kuten on osoitettu, ja VEGF-tasot mitattiin ELISA: lla, kuten on kuvattu menetelmät. (A) peruutus 8CPT vaikutuksia H-89 PC3-cRap1 soluissa; * P 0,05, n = 3 (B) peruutus 6BzcAMP (6 miljardia) vaikutukset H-89 PC3-cRap1 soluissa; * P 0,05, n = 3 (C) peruutus 8CPT vaikutuksia H-89 PC3-cRap1cells; * P 0,05, n = 3.

Tulokset

8CPT inhiboi Vieraslajisiirteen kasvu Eturauhasen solut, jotka ilmentävät Aktivoitu Rap1

vaikutuksen määrittämiseksi aktivoidun Rap1 eturauhasen tuumorin kasvu, me ruiskutetaan kateenkorvattomissa hiirissä kanssa PC3-soluja, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktivoitua Rap1A63E (PC3-cRap1) tai käsitelty cAMP johdannaisen 8CPT. Sillä 8CPT toimitus, eläimiä käsiteltiin ihon alle joko PBS: ää tai 8CPT käyttäen osmoottista minipumppua. 8CPT annettiin annoksena 2,5 umol yli 28 päivää, perustuu aikaisemmin pilottitutkimus osoittaa, että tämä infuusionopeutta oli hyvin siedetty hiirillä. Infuusion aikana eläimet ylläpidetään normaalia ruokaa ja vettä ja osoittanut mitään merkkejä alentuneesta motoriikka. Ei brutto patologista poikkeavuuksia havaittiin tärkeimpien elinten, viitaten siihen, ettei myrkkyvaikutuksia 8CPT annos. Ensimmäinen päivä infuusion nimettiin päivänä 0, ja eläimet uhrattiin 28 vuorokauden kuluttua hoidon.

Kumpikaan konstitutiivisesti Rap1 (PC3-cRap1 + PBS) eikä 8CPT hoito yksinään (PC3 + ​​8CPT) muuttunut merkittävästi kasvaimen kasvua PC3 ksenografteissa (Fig. 1A, 1C). Kuitenkin 8CPT vähentynyt huomattavasti kasvaimen kasvua PC3-cRap1 ksenografteissa (Fig. 1 B, 1 C). Analyysi kasvain painot vahvisti 50%: n lasku kasvainten PC3-cRap1 hiiriä hoidettiin 8CPT (Fig. 1 D). Sekä aktivoitu Rap1 ja 8CPT hoitoa olivat tarpeen tätä vaikutusta, koska mitään muutosta kasvainten havaittiin 8CPT-käsitelty PC3 ksenografteissa tai PBS-käsiteltyjen Rap1 ksenografteissa.

(A ja B) pKa-inhibiittori, H-89 (2,5 umol), käänteinen kasvaimen kasvun esto ja kasvaimen painonpudotukseen välittämän 8CPT PC3-cRap1 ksenografteissa. PC3-cRap1 kasvaimia hiirissä infusoida PBS, 8CPT, tai H-89 mitattiin ja kasvaimen tilavuus määritettiin kappaleessa Menetelmät kuvatulla tavalla; * P 0,05; n = 8 kussakin testiryhmässä. (C) CD31 ja VEGF immunoreaktiivisuus PC3-cRap1 kasvaimet käsiteltävä ilmoitetulla. Immunovärjäys mitattiin, kuten on kuvattu menetelmät.

Ylä Paneelit

: edustaja mikrovalokuvia.

Ala Paneelit

: kvantifiointi immunohistokemiallisella värjäyksellä kasvaimen siivuja; * P 0,05; n = 8 kussakin testiryhmässä; A.U. = Mielivaltaisina yksikköinä.

8CPT estää angiogeneesin PC3-cRap1 ksenoqraftit

Voit seurata vaikutuksen 8CPT angiogeneesiin eturauhasen kasvaimia formaliinikiinnitetyt kasvain viipaleita immunovärjättiin vasta-aineilla CD31 ja VEGF, endoteelisolujen markkerin ja proangiogeeninen tekijä, tässä järjestyksessä. Sisäinen kasvain verisuonia (CD31 +) tunnistettiin aluksen morfologia ja laskettiin (kuvio. 2A). Kasvainten PC3 eläinten ryhmässä infusoida PBS: ää tai 8CPT oli samanlainen määrä verisuonia ja VEGF immunoreaktiivisuuden (Fig. 2A, 2B). Yleinen VEGF immunoreaktiivisuus on PC3-cRap1 hiiren kasvainten nostettiin suhteessa PC3 hiiren kasvaimia vaikuttamatta merkittävästi kapillaari tiheys. Yllättäen hoidon 8CPT, verrattuna PBS: llä, huomattavasti vähentää sekä aluksen tiheys ja VEGF-immunoreaktiivisuus PC3-cRap1 kasvaimia. Nämä tulokset osoittavat, että konstitutiivisesti aktiivinen Rap1 indusoi VEGF: n tuotantoa, ja 8CPT antagonisoi tätä vaikutusta. Lisäksi 8CPT vähentää verisuonten muodostumista, joka voi myötävaikuttaa eston eturauhasen kasvaimen kasvua hiirissä.

8CPT Vähentää jatkuva kasvu Pre-muodostunut Eturauhasen kasvaimet ilmaiseminen Rap1

Meidän Alkukokeissa (Fig. 1), me ruiskutetaan PC3-cRap1 soluja ja käsiteltiin 8CPT samana päivänä (päivä 0) estää kasvaimen kasvua. Sen määrittämiseksi, ovatko 8CPT voisi myös estää jatkuva kasvainsolujen kasvua, me pistetään PC3-cRap1 soluja hiiriin ja annettiin niitä kasvaa ilmeni selvänä kasvain ennen hoidon 8CPT kautta osmoottisten mini pumput (Fig. 2C). Samanlainen kuin edellinen hoito, 8CPT hoitoon olemassa olevien kasvainten aiheutti yli 43%: n vähennys kasvaimen painoa verrattuna PBS infuusiona eläinten (Fig. 2D). Analyysi kasvainsoluproliferaation immunovärjäämällä Ki67 vasta-aineella oli vain vaatimaton väheneminen seuraavat 8CPT hoidon, mikä viittaa siihen, että väheneminen solujen määrä johtuu myös solumenetyksen (Fig. S1). Kuitenkin apoptoosin yksin ei todennäköisesti ole vastuussa, koska TUNEL värjäys ei osoittanut merkittävää eroa (tuloksia ei ole esitetty). Tulokset osoittavat, että 8CPT paitsi pyrkii estämään kasvaimen kasvua vaan myös vähentää jatkuvan kasvun ennalta muodostetun kasvaimia.

8CPT Estää angiogeenisen Indusorit PC3-cRap1 Cells Hypoksisissa olosuhteet

Ymmärtääksemme mekanismi, jolla 8CPT estää VEGF: n eturauhassyövän cRap1 ksenografteissa, olemme kehittäneet soluviljelyolosuhteissa matkia tätä vaikutusta. Solid kasvainsolut kasvavat usein hypoksisissa olosuhteissa, ja hypoksia edistää angiogeneesiä. Siksi olemme analysoineet VEGF-proteiinin tasot mediassa eristettiin soluista esikäsitelty yön yli 8CPT pienenemiseen seerumissa ja sitten käsiteltiin edelleen CoCl

2 6 tuntia tuottaa hypoksia kaltaisissa oloissa. PC3-cRap1 soluja, 8CPT hoito laski VEGF tuotantoa vain hypoksisissa kaltaisissa oloissa (CoCl

2) (Fig. 3A). Sitä vastoin ei ollut vähentynyt selvästi VEGF tuotannon PC3-soluissa 8CPT hoidon samanaikaisen altistuminen CoCl

2 (Fig. 3A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että 8CPT aiheuttama VEGF: n ilmentymisen havaittiin PC3-cRap1 kasvaimia voidaan toisteta

in vitro

jäljittelemällä hapenpuuteympäristössä.

HIF-1α on heterodimeerinen transkriptiotekijä, joka on yliaktiivista hypoksisiin kasvainsoluissa ja edistää angiogeneesiä mahdollistamalla transkription angiogeneesiä geenejä kuin VEGF [30]. Sen määrittämiseksi, onko HIF-1α esto voisi olla välittäjänä 8CPT vaikutus VEGF-määrät, analysoimme HIF-1α-proteiinin ilmentymistä ydin- otteita PC3 ja PC3-cRap1 soluja käsiteltiin 8CPT ja CoCl

2. Kuten odotettua, merkittävän kasvun taso HIF-1α proteiini nähtiin sekä PC3 ja PC3-cRap1 soluissa CoCl

2 hoitoa. Kuitenkin HIF-1α-proteiinin tasot laskivat, kun PC3-cRap1 soluissa, mutta ei PC3-soluja esikäsiteltiin 8CPT (Fig. 3B). Tämän mukaisesti tulos, havaitsimme merkittävän laskun VEGF mRNA vain PC3-cRap1 soluja käsiteltiin sekä CoCl

2 ja 8CPT (Fig. 3C).

8CPT Säätelee VEGF Tuotanto eturauhasen solulinjoihin Käsitelty kanssa Physiologic Activator of Rap1

Rap1 aktivoidaan useat sisäiset tekijät, mukaan lukien stroomakasvaimet Derived Factor 1α (SDF-1α), kemokiini, joka sitoutuu CXCR4-reseptoriin ja helpottaa ohjautumisen luuytimestä peräisin olevat solut [ ,,,0],31], [32]. Kuten on esitetty aikaisemmin [31], hoito PC3-solujen kanssa SDF-1α 20 minuuttia huomattavasti suurentunut taso aktivoitua endogeenisen Rap1-GTP (Fig. S2). Emme havainneet kohonneita endogeenisen Rap1-GTP joko PC3 tai PC3-cRap1 solujen yli yön solujen käsittely 8CPT. Nämä tulokset viittaavat siihen, että joko akuuttia SDF-1α hoitoon tai konstitutiivinen Rap1 aktivaation, mutta ei jatkunut 8CPT hoito johtaa koholla Rap1 aktiivisuus eturauhasen tuumorisoluissa.

Sen määrittämiseksi, onko Rap1 aktivoituu vasteena SDF-1α säädösten samalla konstitutiivisesti aktivoitu Rap1, tutkimme vaikutus SDF-1α ja 8CPT on erittyy VEGF. SDF-1α indusoi VEGF: n tuotantoa PC3-soluissa verrattuna käsittelemättömiin PC3-solut (Fig. 4A), ja tämä induktio on estetty PC3-soluja, jotka ilmentävät Rap1GAP, joka on Rap1 GTPaasia, joka inaktivoi Rap1 (Fig. S3). Lisäksi, hoito CoCl

2 indusoi edelleen VEGF tuotantoa SDF-1α-stimuloitujen PC3-soluja, joka on samanlainen CoCl

2 hoitoon PC3-cRap1 solut (Fig. 4A, 4B). Kuten PC3-cRap1 soluja, 8CPT käänteinen induktio VEGF tuotantoa SDF-1α-käsiteltyjen PC3-solujen hypoksisissa olosuhteissa.

Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös vähemmän aggressiivinen, androgeeniriippuvainen eturauhassyövän solulinjaa LNCaP, että joko käsiteltiin SDF-1α tai pysyvästi ilmensivät konstitutiivista Rap1 (Fig. 4C, 4D). Nämä tulokset osoittavat, että VEGF: n tuotannon 8CPT hypoksisissa olosuhteissa ei rajoitu yhden solun tyyppi ja havaitaan vasteena fysiologisten sekä konstitutiivisen aktivaation Rap1.

8CPT Säätelee VEGF tuotanto alavirtaan Rap1

roolin ymmärtämiseksi Rap1 aktivoinnin säätelyssä VEGF tuotantoa, samanlaisia ​​tutkimuksia 8CPT tai CoCl

2 käsittely tehtiin stimuloimattomissa tai SDF-1α stimuloimaa PC3-solut, jotka ilmentävät stabiilisti Rap1GAP. Kaiken VEGF-tasot alenivat seurauksena Rap1GAP ilmentymisen (Fig. S4). Vaikka induktio johtuu SDF-1α oli täysin tukahdutetaan, CoCl

2 edelleen stimuloi VEGF tuotantoa läsnäollessa Rap1GAP, sopusoinnussa HIF-1α vakauttaminen. Lisäksi yön yli Esihoitoa 8CPT edelleen pienentää CoCl

2-stimuloidun VEGF tuotantoa, vastaa meidän havainto, että 8CPT toimii ylävirtaan HIF-1α vähentää sitä ekspressiotasoja (kts. 3B). Lopuksi 8CPT esikäsittely ei vähentänyt konstitutiivista Rap1 aktiivisuutta (kuvio. S2), mikä viittaa siihen, että se toimii alavirtaan Rap1. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että 8CPT estää VEGF-proteiinin tuotantoa estämällä Rap1 tai hypoksinen induktion HIF-1α.

8CPT Säätelee VEGF Tuotanto kautta PKA eturauhaskasvainsoluissa

Vaikka 8CPT aktivoi Rap1 kautta Epac endoteelisoluissa [8], meidän nykyinen tulokset osoittavat, että 8CPT antagonisoi aktivoitu Rap1 toimintoa epiteelisolujen eturauhaskasvainsoluissa viittaa siihen, että eri mekanismilla on vastuussa. Tämän mukaisesti hypoteesin, osittainen ehtyminen Epac1 ja Epac2 jonka siRNA ei ollut mitään vaikutusta erittyy VEGF PC3-cRap1 soluja (Kuva. S5), vaikka emme voi sulkea pois rooli Epac.

8CPT voi aktivoida PKA vaikka sen affiniteetti Epac on 107-kertaa suurempi [19], [33]. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, päätimme siitä 8CPT stimuloi PKA PC3 ja PC3-cRap1 soluissa käyttäen VASP fosforylaation indikaattorina PKA aktivointia. 8CPT aktivoitu PKA samanlainen 6-bentsoyyli-cAMP (6BzcAMP), enemmän selektiivinen PKA aktivaattori (Fig. S6). Sitten tutkittiin kyky kahden PKA estäjät, H-89 tai PKI, kääntää VEGF tuotantoa välittämää 8CPT. Hoito PC3-cRap1 soluja altistetaan CoCl

2 ja 8CPT kanssa PKA estäjien osittain pelasti VEGF tuotantoa PC3-cRap1 soluja (Kuva. 5A, Fig. S7). Lisäksi 6BzcAMP jäljitteli 8CPT estämällä VEGF tuotantoa PC3-cRap1 solujen hypoksisissa olosuhteissa, ja tämä estyminen osittain päinvastaiseksi H-89 tai PKI (Fig. 5B; Fig. S8). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että 8CPT toimii estäjänä pro-angiogeenisten tekijöiden in hypoksinen Rap1 stimuloiman eturauhaskasvainsoluissa kautta PKA aktivaation.

Tämän testaamiseksi mekanismi eturauhaskasvaimissa, päätimme siitä PKA esto voisi kääntää kasvaimen kasvun ja angiogeneesin eston välittämä 8CPT

in vivo

. Injektion jälkeen kateenkorvattomissa hiirissä, joilla aktiivisesti lisääntyvissä PC3-cRap1 soluja, eläimiä käsiteltiin ihon alle PBS: llä, 8CPT, tai H-89 + 8CPT käyttäen osmoottisia minipumppuja. Kuten aiemmin havaittu hiirillä ruiskutetaan PC3-cRap1 solujen kasvaimet kasvoivat koko ajan, mutta kasvaimen kasvua väheni merkittävästi käsittelemällä 8CPT (Fig. 6A). Kuitenkin samanaikaisesti hoidon 8CPT ja H-89 käänteinen kasvaimen kasvun estäminen aiheuttamat 8CPT PC3-cRap1 ksenografteissa. Vastaavasti 65%: n lasku kasvaimen painon 8CPT käsiteltyjen eläinten pelastettiin samanaikainen hoito H-89 (Fig. 6B). Lopuksi, kuten on esitetty kuviossa. 6C, immunohistokemiallinen analyysi CD31 ja VEGF-proteiinin ilmentyminen kohdissa hiiriltä infusoida PBS, 8CPT tai H-89 + 8CPT osoitti, että PKA estäjä H-89 myös käänteinen väheneminen CD31 ja VEGF immunoreaktiivisuus välittämää 8CPT että PC3 cRap1 ksenograftit. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että PKA esto voisi kääntää kasvaimen kasvun esto ja angiogeneesin eston välittämä 8CPT

in vivo

.

Keskustelu

Käyttäen yhdistelmää analyysejä sekä

in vitro

ja

in vivo

järjestelmissä, Tutkimuksemme antaa näyttöä, että uusi vuorovaikutus Rap1, Epac, ja PKA säätelee kasvaimen mikroympäris- angiogeneesin induktio. Osoitimme aikaisemmin, että jatkuva aktivointi Rap1 mukaan 8CPT /Epac tai cRap1 estää endoteelisolujen kemotaksista ja angiogeneesissä [8], [9]. Testata tärkeää Rap1 aktivoinnin eturauhasen ksenograftimallissa, olemme analysoineet vaikutuksia 8CPT tai cRap1 on PC3-soluissa. 8CPT ollut mitään vaikutusta kasvaimen kasvua vanhempien PC3-soluissa mutta vähensi paitsi kasvaimen koon, myös VEGF ja angiogeneesiä eläimillä ruiskutettiin PC3 soluihin, jotka ilmentävät cRap1. Yllättäen 8CPT esti VEGF induktio ja eturauhasen kasvaimen kasvua mekanismilla, johon PKA sijaan Epac /Rap1 aktivointi. Tuloksemme osoittavat, että Rap1 aktivaatio eturauhaskasvainsoluissa edistää angiogeneesiä hypoksisissa kaltaisissa oloissa kautta HIF-1α ja VEGF, ja PKA aktivointi antagonisoi tämä induktio (katso kaavio kuviossa. 7). Lisäksi tutkimuksemme viittaavat siihen, että endoteelisolujen ensisijaisesti aktivoida Epac vastauksena jatkuva 8CPT hoitoon taas eturauhasen epiteelisolujen ensisijaisesti aktivoida PKA.

Sekä Rap1 ja PKA on yhdistetty aiemmin syövän eturauhasen epiteelisolujen malli. Androgeeniriippuvaisissa ja riippumattaman eturauhassyövän solulinjoissa näihin endogeenisen Rap1 [31], [34]. Rap1 aktivoidaan erilaisia ​​kasvutekijöitä, mukaan lukien verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF), epidermaalinen kasvutekijä (EGF), endoteliini, ja lysofosfatidihappo (LPA) erilaisten mekanismien kautta, mukaan lukien cAMP aktivointi Epac [35]. Hoito LNCaP mutta ei PC3 syöpäsolujen forskoliinilla tai cAMP aiheuttaa Rap1 fosforylaation ja aktivaation proteiinikinaasi A (PKA) [36], ja aktivoitu Rap1 on osoitettu indusoivan MAPK-reitin stimuloimalla B-Raf [37], [ ,,,0],38]. Kuitenkin tulokset kuvaamme tässä viittaavat siihen, että eri mekanismilla on vastuussa havaituista vaikutuksista. Ensinnäkin näemme vaikutuksia sekä LNCaP ja PC3-soluissa. Lisäksi voimistamisen sijasta Rap1 toimintaa, PKA toimii antagonistista tavalla tukahduttaa Rap1 aiheuttama VEGF tuotantoa.

Rap1 on liitetty etenemistä tumorigeneesin pitkälti sääntelyn soluadheesion ja solu-solu liittymissä. Esimerkiksi Rap1 edistää invaasio ja etäpesäkkeiden PC3-soluissa säätelemällä integriinien α4β3 ja a vp 3 [31]. Sen sijaan tuoreessa tutkimuksessa raportoitiin, että 8CPT estää soluvaelluksen eturauhassyövän soluissa aktivoimalla Epac [39]. Tuloksemme viittaavat siihen, että tämä vaikutus voi johtua osittain PKA aktivoinnin 8CPT, tulkinta sopusoinnussa havaittu vastakkainasettelusta Rap1 ja PKA eturauhaskasvainsoluissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että aktivoitu Rap1 eturauhaskasvainsoluissa herkistää solut eston HIF-1α aktiivisuutta PKA.