Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA 130b (miR-130b) on merkittävästi väärin säädellystä erilaisissa ihmisen kasvaimen tyyppejä. Tässä tutkimuksessa käytetään microarray määritystä, me luonnehti säätelyä miR-130b ilmentymistä kolorektaalisyövässä (CRC) yksilöitä. On kuitenkin vähän tietoa rooleista poikkeavan miR-130b ilmaisun CRC. Meidän tutkimukset CRC soluissa osoitti, että miR-130b merkittävästi vähentää solujen vaeltamiseen ja invaasio, mutta sillä ei ole ilmeisesti vaikutuksia soluproliferaatioon ja apoptoosiin. In yli-ilmentyminen miR-130b CRC-soluihin ja CRC yksilöt, havaitsimme alentunut taso integriini β1 proteiinia, jota pidetään keskeisenä molekyyli osallistuu solun liikkuvuus. Kohdentamaan 3′-UTR alue integriinin β1 geenin miR-130b paljastui käyttäen lusiferaasireport- määritys. Sääntely integriinin β1 by miR-130b Lisäksi osoitettiin käyttäen miR-130b jäljittelee sekä estäjä miR-130b. Heikentynyt motiliteettia miR-130b yliekspressio soluissa otetaan talteen osittain integriini β1 puuttuu 3′-UTR. Lisäksi knockdovvn integriini β1 aiheuttaa myös lasku solujen vaeltamiseen ja invaasio, joka on samanlainen kuin haitannut motiliteetin johtuen yli-ilmentymisen miR-130b CRC soluissa. Lisäksi käänteinen ilmauksia miR-130b ja integriini β1 havaittiin CRC yksilöitä. Yhteenvetona, nämä tulokset osoittavat, että miR-130b downregulates kohteeseensa-integriini β1, joka johtaa heikentynyt muuttoliike ja invaasion CRC soluja.

Citation: Zhao Y, Miao G, Li Y, Isaji T, Gu J Li J, et al. (2014) microRNA 130b vaimentaa Migration ja invaasiota peräsuolen syövän solut kautta alassäätely integriini β1. PLoS ONE 9 (2): e87938. doi: 10,1371 /journal.pone.0087938

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 07 marraskuu 2013; Hyväksytty 3 joulukuuta 2013 mennessä; Julkaistu: 03 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China Grant 81101859, National Natural Science Foundation of China Grant 81270379, National Natural Science Foundation of China Grant 81070231 ja Beijing Natural Science Foundation 5102039. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruu ja analysointi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä ei- koodaavat RNA: t 24 ja 25 nukleotidin, jotka välittävät geenin hiljentäminen kautta epätäydellinen hybridisaatio 3’alue (3′-UTR) kohde-mRNA: [1]. MiRNA tärkeitä rooleja lähes kaikissa biologista aktiivisuutta nisäkkäillä ja muiden monisoluisten organismien [2]. Lisäksi on raportoitu, että miRNA vaikuttavat lukuisat syöpää asianmukaisia ​​prosesseja, kuten muuttoliike, leviämisen. Vielä tärkeämpää on, microRNA molekyylit jo syöttämällä klinikalla ja ennustavia biomarkkereita potilaan kerrostuminen ja myös terapeuttisina kohteina ja aineita [3]. Äskettäin miR-130b paljastuu yhden uusista kasvaimeen liittyviä miRNA ja merkittävästi väärin säädellystä kasvaimissa on kattava meta-analyysi miRNA ilmaisun microarray aineistoja, joka käsittää 33 vertailuja ja lähes 4000 kasvaimen ja vastaavat nontumors näytteet [4]. Niinpä miR-130b on havaittu yliaktiivista eri syöpätyyppien: mahasyövän [5], [6], ihon pahanlaatuisen melanooman [7], pään ja kaulan okasolusyöpä [8] ja virtsarakon syöpä [9]. Yhdessä se on arvioitu, että miR-130b pelaa tärkeitä tehtäviä aikana syövän synnyn.

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja toiseksi naisilla maailmanlaajuisesti. Noin 608000 kuolemantapauksia kolorektaalisyövän arvioidaan maailmanlaajuisesti, joten se neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan [10]. Tällä hetkellä yksi esteistä syövän hoidossa on korkea tuumorimetastaasin. Metastaattista prosessi seuraa sarja vaiheessa: ensin syöpäsoluja sisällä primaarikasvaimen irtautua naapurikennoon hyökätä tyvikalvon. Tämä paikallinen invaasio voi usein laukaista asiayhteyteen signaalit, jotka aiheuttavat syöpäsolut läpikäymään epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [11]. Sen jälkeen intravasation solut saattavat ekstravasoitumaan verenkierrosta ympäröivään kudokseen, jossa ne voivat olla lepotilassa tai aloittaa ja ylläpitää kasvua muodostavat angiogeenisten etäpesäkkeitä [12], [13]. Etäpesäke on yleisin kuolinsyy monissa syövissä, mukaan lukien CRC [14] – [16]. Siksi ymmärtää paremmin molekyylitason mekanismien etäpesäke tarvitaan helpottamaan kehittämään tehokkaita hoitostrategioita potilaille, joilla on CRC.

Tutkimuksessamme vertasimme miRNA ilmentymistä yksilöiden CRC potilaista käyttäen microRNA microarray ja havaittu merkittävää säätelyä miR-130b ilmaistun CRC yksilöitä. Jotta saadaan käsitys rooleista miR-130b CRC, tutkimme vaikutuksia miR-130b CRC soluissa ja CRC yksilöitä. Meidän tiedot osoittivat, että integriinin β1 on tavoite geeni miR-130b ja downregulation integriini β1 by miR-130b johtaa heikentynyt muuttoliike ja invaasion CRC soluja.

koemenettelytavat

Clinical yksilöitä

peräsuolen syövän ja viereisen ohjaus kudosnäytteet saatiin 33 potilasta Beijing sairaala, Ministry of Health (Peking, Kiina) jälkeen kirurgisen resektion. Kasvainkudoksessa ja viereisen normaalin kudokset jäädytettiin nestetypessä resektion jälkeen. Ei potilaan olevassa tutkimuksessa saaneet kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Kaikki potilaat edellyttäen kirjallinen lupa käyttöön kudoksiin, mukaan Helsingin julistus. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea Beijing Institute of geriatrian, terveysministeriön.

MicroRNA mikrosiruanalyysi

Small RNA: t eristettiin kasvain kudosten ja viereisten normaaleissa kudoksissa. Laadunvalvontaa, merkinnät, hybridisaatio- ja skannausproseduurit suoritettiin CapitalBio (Peking, Kiina), käyttäen Affymetrix n GeneChip- miRNA array siru V1.0. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä kasvainkudoksissa ja viereisten normaaleissa kudoksissa analysoitiin käyttämällä SAM ohjelmiston 3,02. MiRNA että täyttivät q arvo (%) ≤5 ja taita muutos ≥2 tai luovuttaa muutos ≤0.05 ryhmien välillä katsottiin olevan merkittävästi erilainen. Lämpö kartta suoritettiin käyttäen Cluster 3.0 pakettiohjelmistona. Tiedot esitetään tässä tutkimuksessa on talletettu National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) ja ovat saatavilla kautta GEO hakunumero GSE53592.

Soluviljely

paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa SW-480 ja SW-620 ostettiin Cell Resource Center, IBMS, LÄHETYKSET /PUMS ja kulunut alle 6 kuukautta. Soluja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK), jossa oli 10% FBS: ää (Gibco, Paisley, UK) ja 2 mmol /l L-glutamiinia (Gibco, Paisley, UK), 100 U /ml penisilliiniä (Gibco, Paisley, UK), ja 100 ug /ml streptomysiiniä sulfaatti (Gibco, Paisley, UK).

Pri-miR-130b kloonaus, lentivirus tuotanto ja transduktio

ihmisen ensisijainen microRNA 130b geeni (pri-miR-130b), monistettiin PCR: llä ihmisen genomisesta DNA: sta käyttäen seuraavia alukkeita: Forward 5′-ATATTCTCGAGGGGGATCTCCC-3 ’ja Reverse 5′-ATATCGGATCCTCTTACCCCAG-3’, ja sitten subkloonattiin pLVX-IRES-Hyg vektori ( TaKaRa, Dalian, Kiina) tuottaa pLVX-miR-130b. Viruspartikkelit kerättiin 48 h transfektion jälkeen ja pLVX-miR-130b HEK-293T-soluihin käyttäen Lenti-HT pakkaus mix (TaKaRa, Dalian, Kiina). SW480 solut infektoitiin korjatusta yhdistelmä-lentivirus läsnäollessa 6 ug /ml Polybrene (Sigma, St. Louis, USA). SW480-soluja pidettiin täydellisessä kasvualustassa läsnä ollessa 1 mg /ml hygromysiiniä (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa). PCR-amplikoni ja pri-miR-130b on myös subkloonattiin pWPI lentivirusvektori (Addgene, Cambridge, MA, USA) tuottaa pWPI-miR-130b. Tyhjä pWPI vektori, joka koodaa vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP), jota käytettiin kontrollina. Viruspartikkelit kerättiin, kuten aikaisemmin on kuvattu. SW620-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti GFP valittiin fluoresoivalla-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS), jossa käytetään Vantage SE Diva solulajittelijalla (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

RNA käänteinen transkriptio ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) määritykset

kokonais-RNA, mukaan lukien pienet RNA: t, uutettiin kliinisistä näytteistä tai CRC solut Mirvana MicroRNA Isolation Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) ja alistettiin käänteistranskriptioon. qRT-PCR suoritettiin käyttäen kanssa SYBR Esisekoite Ex Taq mix (TaKaRa, Dalian, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden ja näytteet ajettiin iQ5 monivärinen Reaaliaikainen PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, USA) . Terminen reaktio sykliä 95 ° C 30 s, ja 45 toistojen 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 20 s käytettiin. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: HSA-miR-130b eteenpäin 5′-GCCGCCAGTGCAATGATGAA-3 ’HSA-miR-130b Reverse 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′; U6 Forward 5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ’; U6 Reverse 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3 ’

lusiferaasireporttiterilla määritys

täyspitkän 3′-alueen (3′-UTR) fragmenttien integriinin β1-geeni monistettiin PCR: llä ihmisen genomi-DNA: sta käyttäen alukkeita eteenpäin 5′-GTACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 ’ja Reverse 5’-TGCTTTTCCTCAACTTCTTTAATC-3, ja kloonattiin pMD18-T-vektoriin (Takara, Dalian, Kiina).

Sac

I

Sal

I-pilkottuun tuotteet kloonattiin pmirGlo Dual-lusiferaasi miRNA Target Expression Vector (Promega, Madison, USA), jolloin muodostuu 3′-UTR-lusiferaasireportterilla vektori . SW480-solut kotransfektoitiin 24-kuoppaisilla levyillä käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) kanssa 3′-UTR-lusiferaasireportteri- vektori ja ilmoitettu miRNA. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, tulikärpäsen ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin peräkkäin käyttäen dual-lusiferaasi-määritys (Promega, Madison, USA), valmistajan mukaan protokollia. Negatiivinen kontrolli vektori luotiin kloonaamalla sama 3′-UTR integriinin β1 geenin päinvastaisessa suunnassa. Aktiivisuus Näytteet mitattiin GloMax 20/20 luminometrillä (Promega, Madison, USA). Tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus transfektiotehokkuuden.

Cell transfektio

käytetty plasmidi integriini β1, josta puuttuu 3′-UTR (β1-ORF) on kuvattu aiemmin [17]. Käytimme pWPI vektori kontrollina. HSA-miR-130b jäljittelee, HSA-miR-130b estäjä (anti-miR-130b), ohjaus jäljittelee ja siRNA vastaan ​​integriini β1 [18] syntetisoitiin Ribobio (Guangzhou, Kiina). Sekvenssit olivat seuraavat: HSA-miR-130b jäljittelee, 5′-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3 ’; HSA-miR-130b estäjä, 5’-AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUG-3 ’; integriinin β1 siRNA, (sense) 5’-GGAACAGCAGAGAAGCUCA-3 ’[18]; SW480-solut transfektoitiin käyttäen RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, USA) tai Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Cell migraatiokokeessa ja invaasiomääritys

solumigraation määritys arvioitiin käyttämällä transwell kammiota (8 um, BD Bioscience, San Jose, USA). 5 x 10

5-solut sijoitettiin ylempään kammioon kunkin insertin, ja 500 ui täydellistä alustaa lisättiin pohjaan hyvin. Solut, jotka eivät siirry poistettiin yläpintojen läpi käyttäen vanupuikkoja, ja solut, jotka olivat siirtyneet alapinnat suodattimet fiksattiin 4% paraformaldehydillä liuoksella ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Kuvia kolme satunnaista kenttien vangittiin kustakin kalvo, ja määrä vaeltavia solujen laskettiin. Samanlaisia ​​insertit päällystetty matrigeeliä käytettiin määrittämään invasiivisia mahdollisia.

Soluproliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen tetratsoliumyhdiste [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium, sisäinen suola (MTS) (CellTiter 96 vesipitoista ei-radioaktiivisen Cell Proliferation Assay) (Promega, Madison, USA), mukaisesti valmistajan protokollan . Lyhyesti, ilmoitettuina aikoina, määritykset suoritetaan lisäämällä CellTiter 96 vesikerros ratkaisu Reagent suoraan viljelykuoppiin, inkuboimalla 2 tuntia ja sitten tallennuksen absorbanssi 490 nm: ssä 96-kuoppaisen levyn lukijaa.

Western blotting

proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore, Bedford, USA). Kalvo blokattiin 5% rasvatonta maitoa ja inkuboitiin hiiren anti-integriini β1 (1/2500, BD Biosciences, San Jose, USA), hiiren anti-E-kadheriinin (1/2000, BD Biosciences, San Jose, USA), kanin anti-kaspaasi 3 (1/1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), kanin anti-kaspaasi 8 (1/800, Millipore, Billerica, USA) tai hiiren anti-GAPDH (1/10000, Sigma , St Louis, USA) vasta-aineita.

tilastollinen analyysi

tiedot esitetään keskiarvona ± sD Tilastollinen merkitsevyys ryhmien välillä arvioitiin Studentin

t

-testi. Arvo

P

0,05 katsottiin tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

Detection lisääntyneen miRNA-130b tasot CRC yksilöiden

Käyttäen microarray määritys, me tunnettu miRNA ilmentyminen kolorektaalisyövässä (CRC) kudoksia ja marssivat viereisten normaaleissa kudoksissa korjattu 3 potilasta (P1, P2 ja P3). Luonnehdinta CRC potilaista on kuvattu taulukossa 1. Testasimme ero miRNA ilmentävät käyttämällä SAM paketti. 31 huomattavasti voimistunut miRNA (Fig. 1A) koetinsarjojen (fold≥2) havaittiin CRC yksilöitä. Ja 17 merkittävästi vaimentua miRNA esitetty taulukossa S1. Vuonna mikrosiru lukemat, huomasimme, että miR-130b on yksi huomattavasti voimistunut miRNA. Yhä useammat tutkimukset ovat miR-130b kasvaimen liittyvät miRNA ja miR-130b tärkeä rooli aikana oncogenesis [4]. Ymmärtää paremmin sen mahdolliset toiminnot CRC, me ensin käytetty qRT-PCR vahvistaa miR-130b ilmentymisen 3 CRC potilaalla (Fig. 1 B). Yhdenmukainen microarray readouts kuvassa. 1A, qRT-PCR tulokset paljastivat parannetun ilmentymisen miR-130b on 3 CRC tuumorikudoksissa (Fig. 1 B). Sitten syntyy lentivirusvektorilla ilmentävät ensisijainen microRNA 130b (Lenti-pri-miR-130b) (Fig. 1 C ylempi paneeli), ja rakennettu SW-480-solujen stabiileja yli-ilmentymisen miR-130b (Lenti-miR-130b solut) ja vastaavien ohjaus (Lenti-vektori soluihin). Huomasimme, että tasot kypsän miR-130b ovat huomattavasti neljässä pesäkkeet Lenti-miR-130b soluissa, verrattuna Lenti vektori soluihin (Fig. 1 C alempi paneeli).

, Heat kartta kaavio 31 merkittävästi kohonnut miRNA kolorektaalisyövässä kudoksissa verrattuna sovitettu viereisten kontrollisilkkipaperia 3 potilaalla (P1, P2 ja P3). Viereiset kontrollisilkkipaperia kutsutaan N1, N2 ja N3. Kasvaimet viitataan T1, T2 ja T3. MiRNA esitetään riveihin. Näytteet sijoitetaan sarakkeisiin. Punainen väripalkkisignaaliin osoittaa korkeampi ilmaisun ja sininen ilmaisee alemman ilmaisua. MiR-130b (

Red Arrow

) on yksi selvästi voimistunut miRNA.

B

, suhteellinen ilmauksia miR-130b (normalisoitu U6) kasvaimiin yli viereiseen kontrollisilkkipaperia (T /N) P1, P2 ja P3, määritettiin qRT-PCR (keskiarvo ± sd; n = 3).

C

,

Ylähavas

: Kaavakuva lentiviruksen pLVX-IRES-Hyg vektori, joka sisältää ensisijaisen microRNA 130b (Lenti-miR-130b).

Alahavas

: Suhteellinen ilmauksia miR-130b (normalisoitu U6) in SW480-soluissa stabiilisti ilmentää miR-130b (Lenti-miR-130b) tai kontrolli (Lenti-ohjaus), tutkittiin qRT-PCR ( keskiarvo ± sd, n = 3). Neljä pesäkettä Lenti-miR-130b soluja kutsutaan 1,2,3,4.

MiR-130b vähenee muuttoliikkeen ja invaasion CRC solujen

seuraava tutkittiin miten miR-130b voisi toimia sisällä peräsuolen syövän soluja. Lenti-vektori soluihin ja Lenti-miR-130b soluja käytettiin analysoimaan vaikutuksia miR-130b on CRC-soluissa. Solut ensin altistettiin migraatiokokeessa ja invaasiomääritys, vastaavasti. Havaitsimme, että miR-130b merkittävästi estää migraation Lenti-miR-130b-soluissa (kuvio. 2A). Sitten tutkittiin, mikä vaikutus miR-130b on invasiivisuus solujen avulla Matrigel invaasiomääritys järjestelmään. Yhdenmukainen tulos migraatiokokeessa, invasiivisuus on pienentynyt huomattavasti Lenti-miR-130b solut (Fig. 2B). Mielenkiintoinen, ei ole merkittävää eroa leviämisen välinen Lenti-vektori-solujen ja Lenti-miR-130b solut (Fig. 2C). Lisäksi meillä ei havainnut ilmeisiä erilaiset ekspressiotasot apoptoottisten caspases- kaspaasi 3 ja kaspaasi 8 välillä Lenti-vektorin soluihin ja Lenti-miR-130b-soluissa (kuvio. 2D). Kaikki nämä tulokset viittasivat siihen, että yli-ilmentyminen miR-130b tuloksia heikentynyt solun liikkuvuus CRC-solujen, mutta sillä ei ole vaikutusta proliferaatioon ja apoptoosiin CRC soluja.

A, B

, Transwell muuttoliike (

) ja invaasio (

B

) määritykset Lenti-ohjaus solujen ja Lenti-miR-130b soluja (asteikko bar = 100 pm; keskiarvo ± sd, n = 4; *

P

0,05; **,

P

0,01). Edustavat kuvat siirtynyt solujen (

) ja tunkeutuu soluihin (

B

) esitetään.

C

, yleistyminen Lenti-ohjaus solujen ja Lenti-miR-130b soluihin mitattiin MTS-määritys aikana kolmen päivän ajan funktiona (keskiarvo ± S.D .; n = 4).

D

, Western blot analyysit kaspaasi-3 ja kaspaasi-8 ilmentyminen in Lenti-ohjaus solujen ja Lenti-miR-130b solujen kolmesta itsenäisestä kokeesta. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

MiR-130b estää integriini β1 ilmaisun kautta 3′-UTR

Tutkimme lisäksi mekanismi, jonka miR-130b vaikuttaa motiliteettia CRC solujen . Aikaisemmat tutkimukset olivat osoittaneet, että translaation jälkeinen modifikaatio on tärkeä rooli integriini-välitteisen muuttoliike [17], [19], [20]. Integriinit ovat ryhmä solun adheesiomolekyylien, joka käsittää 18α ja 8β alayksikköä, jotka yhdistävät ainakin 24 heterodimeerejä. Vielä tärkeämpää on, sytoplasmadomeenissa integriinin β1 transdusoi kaksisuuntaista signaaleja solun sisällä säätelemällä rakenne ja ligandin affiniteetit solunulkoisen domeenin (nurinpäin signalointi), kun taas välittävien alavirran signalointia ja vuorovaikutus solun tukirangan (ulkopuolella-in signalointi) [ ,,,0],21] – [23]. Joten, integriinin β1 on avainsäätelijänä mukana etäpesäke

in vitro

ja

in vivo

[24] – [27]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ektooppinen ekspressio miR-130b in SW480-soluissa johtaa lasku endogeenisen integriini β1-proteiinin taso neljä Lenti-miR-130b pesäkkeistä noin 50%, verrattuna kuin Lenti-vektori-soluja ( kuva 3A). Johdonmukainen Tuloksena havaittiin SW-620-solujen yli-ilmentymisen miR-130b (Fig. 3B). Kuitenkin, ei ole muutosta ekspressiotaso E-kadheriinin (kuvio. 3C), joka on keskeinen molekyyli osallistuu EMT. Ja kuten aiemmin mainittiin, EMT on ensimmäinen askel etäpesäkkeitä. Tutkimme myös ilmentymisen integriinin β1 on 3 paria yksilöitä suoritettiin microarray kuviossa. 1A. Yhdenmukainen tiedot on esitetty. 3A ja kuvio. 3C, integriini β1-proteiinin ilmentyminen on vähentynyt kasvainkudoksessa verrattuna vastaavan viereisen normaalien kudosten (Fig. 3d (a)), kun taas mitään ilmeistä muutosta ilmentymisen E-kadheriinin havaittiin (Fig. 3d (b)) . On huomattava, että alentunut taso integriini β1-proteiinia ei havaittu yli-ilmentyminen miR-130b CRC-soluja (Lenti-miR-130b-solut) ja CRC-näytteet hyvin. Siksi pyrimme tutkimaan, onko miR-130b voi säädellä integriini β1.

,

Ylähavas

: Western blot analyysit integriinin β1 proteiinin ilmentymistä in Lenti-ohjaus solut ja Lenti-miR-130b soluja (SW480-solut) kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Alahavas

: Densitometria analyysi Western blot data normalisoidaan GAPDH (keskiarvo ± S.D .; n = 3, *,

P

0,05).

B

(

), suhteellinen ilmauksia miR-130b (normalisoitu U6) in SW620-soluissa tartunnan lenti-ohjaus virus tai lenti-miR-130b virus, tutkittiin qRT-PCR (keskiarvo ± sd, n = 3). (

b

),

Ylähavas

: Western blot analyysit integriinin β1 ilmentyminen Lenti-ohjaus ja Lenti-miR-130b soluja (SW620-solut) kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Alahavas

: Densitometria analyysi Western blot data normalisoidaan GAPDH (keskiarvo ± S.D .; n = 3, *,

P

0,05).

C

, Proteiinin ekspressiota E-kadheriinin analysoitiin immunoblot Lenti-ohjaus solujen ja Lenti-miR-130b-solujen kolmesta itsenäisestä kokeesta. Neljä pesäkettä Lenti-miR-130b soluja (SW480-solut) viitataan 1,2,3,4. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

D

, The ekspressiotasot integriini β1 (

) ja E-kadheriinin (

b

) määritettiin Western blot -analyysit käyttämällä sovitettu viereisen kontrollisilkkipaperia ( N) kasvaimia (T) päässä 3 kolorektaalisyövän potilaalla (potilas 1, Potilas 2, ja potilaan 3). Kukin määritys on itsenäisesti toistettiin kolme kertaa. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

Ensinnäkin tutkia miR-130b pystyi vuorovaikutuksessa 3′-UTR integriini β1 teimme lusiferaasireport- määrityksissä on SW480-soluissa. Täydellinen 3′-UTR-integriinin β1-geenin kloonattiin pmirGlo Dual-lusiferaasireportterilla vektori. SW-480-soluja kotransfektoitiin pmirGlo vektorilla, joka sisälsi 3′-UTR: integriinin β1 ja miR-130b jäljittelee (Fig. 4A), tulos osoitti huomattavasti pienempi lusiferaasi verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu samalla reportteri vektori ja ohjaus microRNA jäljittelee (NC) (Fig. 4A). Vaikutus miR-130b on lusiferaasiekspressio poistui, kun 3′-UTR integriinin β1 kloonattiin päinvastaisessa suunta (3′-ITGB1-rev) (Fig. 4A). Seuraavaksi vahvistaa sääntelyä miR-130b integriiniin β1 CRC soluissa, testasimme integriini β1 proteiinin taso transfektoiduissa soluissa miR-130b matkii ja miR-130b estäjä (Anti-miR-130b) vastaavasti (Fig. 4B ). Tulokset osoittivat, että ilmentyminen integriini β1 tukahdutetaan transfektion jälkeen miR-130b jäljittelee (Fig. 4B (a)). Knockdown endogeeninen miR-130b kanssa miR-130b estäjä tehostaa integriini β1 ilmentyminen (Fig. 4B (b)). Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että integriinin β1 on tavoite geeni miR-130b.

, Täydellinen 3′-UTR integriinireseptoriperheen β1 geeni (3′-ITGB1) olivat kloonattiin pmirGlo Dual-lusiferaasireportteri- vektori ja ko-transfektoitiin miR-130b jäljittelee (miR-130b), ja ohjaamaan miR jäljittelee (NC) osaksi SW480-soluissa, vastaavasti. Kontrolli Vektori muodostettiin kloonaamalla sama 3′-UTR integriinin β1 geenin päinvastaisessa suunta (3′-ITGB1-rev). Tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin ja normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuutta (keskiarvo ± S.D .; n = 3, *, P 0,05).

B

, Western blot analyysit integriinin β1 ilmentyminen SW480 transfektoiduissa soluissa NC, miR-130b matkii (

ruutu a

) ja miR estäjä ohjaus (Anti-NC) tai miR-130b estäjä (Anti-miR-130b) (

paneeli b

) kolmesta itsenäisestä kokeesta. Densitometrian analyysi Western blot data normalisoidaan GAPDH (keskiarvo ± sd, n = 3, *,

P

0,05).

MiR-130b estää solumigraation ja invaasiota kautta downregulation integriini β1

tutkimiseksi edelleen, että suppressio-integriinin β1 by miR-130b johtaa heikentynyt motiliteetti Lenti-miR-130b-solut, teimme integriini β1 pelastus kokeessa käyttäen Lenti- miR-130b soluja. Käytimme ekspressiokonstruktin, joka koodaa integriini β1 avoin lukukehys (β1-ORF), joista puuttuu 3′-UTR: [17], joka tuottaa mRNA, joka on resistentti miRNA-välitteisen suppression. Havaitsimme selvään kasvuun integriinin β1 ilmentyminen Lenti-miR-130b transfektoitujen solujen β1-ORF, verrattuna soluihin kontrollivektorilla (Kuva. 5A). Lisäksi solujen vaeltamiseen määritykset osoittivat, että ektooppinen ekspressio integriinin β1-ORF kykeni osittain talteen motiliteettia Lenti-miR-130b-soluissa 76% (kuvio. 5B ja 5C).

,

Vasen paneeli

: Western blot analyysit integriinin β1 ilmentyminen Lenti-ohjaus soluja, Lenti-miR-130b soluja, Lenti-miR-130b, jotka on transfektoitu kontrollivektorilla tai β1-ORF vektorin kolmen erillisen kokeen.

Oikea paneeli

: Densitometria analyysi Western blot data normalisoidaan GAPDH (keskiarvo ± S.D .; n = 3, *,

P

0,05).

B, C

, TranswellTM muuttoliike määrityksiä solujen (asteikko bar = 100 pm; keskiarvo ± S.D .; n = 3, *,

P

0,05). Edustavat kuvat siirtyneet solut näkyvät. Lenti-miR-130b + kontrollivektorille: Tällä Lenti-miR-130b transfektoitu kontrollivektorilla. Lenti-miR-130b + β1-ORF: Tällä Lenti-miR-130b transfektoitujen solujen β1-ORF vektori. ORF: avoin lukukehys.

jälkeen esti integriinin β1 ilmentyminen käyttämällä erityistä siRNA [18] SW-480-solut (Fig. 6A). Huomasimme, että solujen vaeltamiseen (Fig. 6B) ja invaasiota (Fig. 6C) on huomattavasti vähentynyt kautta estämällä integriini β1 lauseke tietyn siRNA. Siksi laskua soluliikkuvuus saavutetaan tukahduttaminen integriinin β1 ilmaisua. Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että miR-130b tukahduttaa solumigraation ja invaasiota, ainakin osittain, kautta downregulation integriinisalpaajien β1 CRC soluissa.

, Western blot analyysit arvioitiin proteiinin taso integriinin β1 vuonna SW480-soluissa transfektoitu siRNA vastaan ​​integriini β1 (p1 siRNA) tai negatiivinen kontrolli siRNA (Scramble) 20 nM ja 50 nM. Kukin määritys on itsenäisesti toistettiin kolme kertaa.

B, C

, TranswellTM muuttoliike (

B

) ja invaasio (

C

) määrityksissä SW480 transfektoitujen solujen β1 siRNA tai Scramble 50 nM (asteikko bar = 100 mikrometriä; keskiarvo ± sd, n = 3, **,

P

0,01). Edustavat kuvat siirtynyt solujen (

B

) ja tunkeutuu soluihin (

C

) esitetään.

käänteinen korrelaatio miR-130b ja integriinin β1 ilmentyminen CRC yksilöt

edelleen testata korrelaatio integriini β1 ja miR-130b, laajensimme analyysi kohortin 33 parittaista kliinisen viereisen normaalin (N) ja peräsuolen kasvaimen kudokset (T). Analysoimme ilmentymisen miR-130b by qRT-PCR ja ekspressiotaso integriini β1 Western blotilla. Kuten on esitetty kuviossa. 7, vertaamalla kasvainten normaaleissa kudoksissa, käänteinen korrelaatio miR-130b ja integriinin β1 ekspressio havaittiin 23 33 (69,7%) paria kliinisistä näytteistä. Niistä 23 paria, 12 paria osoitti lisääntynyt miR-130b ja laski integriini β1; 11 paria osoitti väheni miR-130b ja kohonnut integriini β1.

ilmentyminen miR-130b mitattiin qRT-PCR, integriini β1 mitattiin Western blot analyysi kohortin 33 Hyväksytty -pairs vierekkäisten normaalin (N) ja kasvaimen (T) kudoksiin. Suhteellinen ilmentyminen suhde miR-130b (normalisoitu U6) T yli N (T /N) edustettuna kertainen ero (sarakkeet tummanharmaa). Suhteellinen ilmentyminen suhde integriini β1 (normalisoitu GAPDH) T yli N (T /N) edustettuna kertainen ero (sarakkeet vaaleanharmaa). keskiarvo ± S.D. Kukin määritys itsenäisesti toistettiin kolme kertaa.

Keskustelu

MicroRNA 130b (miR-130b) on merkittävästi väärin säädellystä monissa ihmisen kasvainten tyyppejä. Kuitenkin rooli miR-130b CRC ei ole hyvin ymmärretty. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet microRNA ilmentymistä peräsuolen syöpä (CRC) käyttäen microRNA microarray profiloinnin kasvaimia ja viereisen normaalin kudoksen näytteissä. Havaitsimme 48 merkittävästi ilmentyvät eri miRNA liittyy CRC. MiR-130b on yksi ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA. Tämä tieto vahvistettiin myöhemmin qRT-PCR. Potentiaalin testaamiseksi roolit lisääntyneen ekspression miR-130b CRC teimme toiminnalliset analyysit jälkeen rakentamalla CRC solulinja vakaa yli-ilmentymisen miR-130b. Tuloksemme osoittivat, että miR-130b kykenee merkittävä estävä vaikutus motiliteettia CRC solujen (Fig. 2), mutta ei ole vaikutusta soluproliferaatioon ja apoptoosiin. On raportoitu, että

TAp63

Knockout hiirimallissa, downregulation miR-130b menetys TAp63 johtaa lisäykseen tuumorimetastaasissa [28]. Tukahduttaminen miR-130b jonka p53 mutantti tuloksia voidaan vahvistaa ZEB1 riippuvaisten EMT ja solujen invaasiota endometriumin syöpäsoluissa [29]. Kaikki nämä tiedot ehdotti antimetastaattisia roolia miR-130b. Lisäksi downregulation miR-130b annetaan monilääkeresistenttien fenotyypin munasarjasyöpäsoluja [30]. Kuitenkin toinen raportti on ehdottanut, että yli-ilmentyminen miR-130b in CD133 (+) maksakasvain-aloittamista solujen lisää niiden kyky uusiutua ja chemoresistance [31]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-130b voi olla kaksi tehtävää tuumorisuppressorina tai onkogeenin, joka riippuu syövän tyypistä ja solujen yhteydessä.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että integriinin β1 on uusi kohde miR-130b. Alentunut taso integriini β1 proteiinin havaittiin koska yli-ilmentymisen miR-130b in CRC yksilöt (Fig. 3d) ja CRC-soluissa (kuvio. 3A ja 3B) samoin. Lusiferaasireportterigeenin määritys osoitti, että miR-130b sitoutuu 3′-UTR integriini β1 ja estää sen ilmentymistä (Fig. 4). Lisääntyminen miR-130b by miR-130b jäljittelee transfektio johtaa alennettua integriini β1, kun taas knockdown miR-130b kanssa miR-130b estäjä johtaa lisääntyneeseen integriini β1 ilmentyminen. Lisäksi heikentynyt motiliteettia miR-130b yli-ilmentyminen soluissa on pelastettu osittain integriini β1, josta puuttuu 3′-UTR (Fig. 5). Lisäksi knockdovvn integriini β1 aiheuttaa myös lasku solumigraatioon ja invaasiota (Fig. 6). Nämä tulokset osoittivat, että miR-130b tukahduttaa solumigraation ja invaasion CRC soluja, ainakin osittain, kautta downregulation integriinin β1. Lisäksi käänteinen korrelaatio miR-130b ilmaisun ja integriini β1 ekspressio havaittiin 23 33 paria (69,7%), CRC kliinisistä näytteistä. Estyminen muuttoliike ja invaasio CRC soluihin kohdistaminen suoraan integriini β1 on sopusoinnussa antimetastaattisia rooli ehdotettujen miR-130b [28], [29]. Suuri elin kokeellista näyttöä tukevat olennainen rooli integriini β1 aikana kasvaimen induktion ja invasiivisuus [32] – [36].