Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ruokatorven adenokarsinooma (EAC) on harvoin parannettavissa tauti ja kasvaa nopeasti maailmanlaajuisesti ilmaantuvuus. Barret n ruokatorvi (BE) ja dysplasiaan (HGD) pidetään suurimmista riskitekijöistä invasiivisia adenokarsinooma. Nykyisessä tutkimuksessa, puolueeton globaali metabolinen profilointi menetelmiä sovellettiin seeruminäytteistä potilaalla on EAC, BE ja HGD, ja terveet yksilöt, jotta voidaan tunnistaa metaboliitiksi perustuu biomarkkereita liittyy alkuvaiheessa EAC, jonka tavoitteena on parantaa ennustettavuutta.

Menetelmät /Principal havainnot

Serum aineenvaihduntatuotteiden profiilien potilaista, joilla EAC (n = 67), BE (n = 3), HGD (n = 9) ja terveillä vapaaehtoisilla (n = 34) olivat saatu käyttäen korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa-massaspektrometria (LC-MS). Kaksitoista aineenvaihduntatuotteita erosivat merkittävästi (

p

0,05) välillä EAC potilaiden ja terveiden verrokkien. Osittainen pienimmän neliö- erotteluanalyysi (PLS-DA) malli oli hyvä tarkkuus kanssa ala saa operatiivinen ominaiskäyrä (AUROC) on 0,82. Kuitenkin, kun tulokset LC-MS yhdistettiin 8 aineenvaihduntatuotteiden havaita ydinmagneettisen resonanssin (NMR) aikaisemmassa tutkimuksessa, yhdistelmä NMR ja MS havaittujen aineenvaihduntatuotteiden edellyttäen paljon parempi suorituskyky, jossa AUROC = 0,95. Edelleen, keskiarvot 12 Näiden aineenvaihduntatuotteiden vaihteli johdonmukaisesti terveisiin kontrolleihin korkean riskin yksilöitä (BE ja HGD potilasta) ja EAC aiheita. Altered metaboliareittiä lukien useita aminohapon reittejä ja energia-aineenvaihdunnan tunnistettiin perustuen muuttuneisiin tasoilla lukuisia aineenvaihduntatuotteiden.

Johtopäätökset /merkitys

metaboliaprofiilien johdettu yhdistelmä LC-MS ja NMR menetelmiä helposti erottaa EAC potilaiden ja potentiaalisesti lupaavat tärkeitä reittejä ymmärtämään syövän synnyn ja havaitsemalla syöpä. Erot metaboliaprofiilien välisen korkean riskin yksilöitä ja EAC osoittavat mahdollisuus tunnistaa potilaiden riski huomattavasti aikaisemmin kehittämiseen syövän.

Citation: Zhang J, Bowers J, Liu L, Wei S , Gowda GAN, Hammoud Z, et al. (2012) ruokatorven syöpä Metabolinen biomarkkerit havaittu LC-MS ja NMR menetelmät. PLoS ONE 7 (1): e30181. doi: 10,1371 /journal.pone.0030181

Editor: Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, Ranska

vastaanotettu: 22 syyskuu 2011; Hyväksytty: 12 joulukuu 2011; Julkaistu: 23 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Purdue University Center for Cancer Research ja onkologisen Sciences Center Discovery Park Purdue. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on tappava tauti, jonka arvioitu 16640 uutta tapausta ja 14500 kuolemantapausta Yhdysvalloissa vuonna 2010 [1]. Vuonna 2000 vastaavat luvut olivat 12300 ja 12100, vastaavasti [2], jotka osoittavat merkittävää nousua esiintymistä. Niistä kaksi syöpätyyppejä, ruokatorven adenokarsinooma (EAC) ja okasolusyöpä, EAC on yleisempää Yhdysvalloissa. Vaikka liittyvät riskitekijät EAC ei ymmärretty tasalla, Barrettin ruokatorvi (BE) katsotaan olevan tekijä syövän synnyn ruokatorven [3]. Lisäksi dysplasiaan (HGD) pidetään välittömästi esiaste invasiivisia adenokarsinooma [4]. Kuitenkaan mitään väliintuloa tällä hetkellä olemassa, että voi estää etenemistä BE tai HGD sen EAC [5]. Perinteisiä diagnosoimiseksi ruokatorven syöpä, mukaan lukien tähystys ja barium niellä, kärsivät huonosta spesifisyys ja herkkyys, joka tyypillisesti johtaa taudin havaitsemisen vasta myöhäisessä vaiheessa [6], [7], [8], [9]. Vaihtoehtoisesti toivotaan, että tietty osajoukko molekyyli biomarkkereiden voi luonnehtia sairauden vaiheesta ja auttaa muokata hoito [10]. Molekyylitasolla, karsinogeneesi ruokatorven arvellaan olevan monimutkainen prosessi useita geneettisiä poikkeavuuksia ja ympäristötekijät. Lukuisat tutkimukset raportoivat erityisiä muutoksia proteiinien geenejä ja metaboliateissä EAC jotka voivat olla hyödyllisiä apuna diagnosoinnissa, ennusteen ja hoidon ruokatorven syöpään [11], [12], [13], [14]. Microarray tutkimukset ovat myös keskittyneet löytämään uusia merkkiaineita perustuu yksittäisten kasvainten geneettinen koostumus [15]. Kuitenkin luotettava markkereita, erityisesti varhaisessa ja mahdollisesti parantava vaiheessa ovat edelleen suuri kysyntä.

Metabolomiikka, myös yleisesti tunnettu metabolinen profilointi ja metabonomiikalla, on nopeasti kasvava alalla systeemibiologian ja tarjoaa tehokkaan ja lupaava lähestymistapa tunnistaa biomarkkerit liittyvät syöpää ja muita sairauksia. Metabolomiikka keskittyy johtuvat pitoisuudet ja vuot pienimolekyylipainoisen aineenvaihduntatuotteiden ( ~ 1 kDa) in Biofluids tai kudoksen, joka antaa yksityiskohtaisia ​​tietoja biologisten järjestelmien ja niiden tilan [16], [17]. Massaspektrometria (MS) ja ydinmagneettisen resonanssin (NMR) ovat kaksi tehokkain ja yleisesti käytetty analyyttisiä menetelmiä metabolisen sormenjälkien [17], [18]. Nämä kaksi menetelmää ovat toisiaan täydentäviä; kun MS on erittäin herkkä, NMR on erittäin määrällinen ja toistettavissa. Hyödyntäminen sekä MS ja NMR menetelmiä johtaa rutiinianalyysin yli 1000 aineenvaihduntatuotteiden.

Yhä useammat metabolomiikan ole raportoitu havaitsemiseksi erilaisiin syöpiin [19], [20], [21], [22 ], [23]. Kuitenkin tutkimukset keskittyvät EAC ovat vielä suhteellisen vähän. Äskettäin kaksi papereita raportoitu analyysiin kudos aineenvaihduntatuotteiden käyttämällä maaginen kulma spinning (MAS) NMR ja kaasukromatografiaa (GC) MS kukin yhdistettynä tilastollisia monimuuttujamenetelmiä [24], [25]. Molemmat teokset raportoitu useita tilastollisesti merkitsevä erottava aineenvaihduntatuotteita. Toinen

1 H-NMR Tutkimuksessa selvitettiin ihmisen plasmaa ja tunnistettu vaihtelua useissa metaboliittipitoisuuksien liittyy EAC että erosivat etnisten ryhmien [26]. Ponnistelut laboratoriossamme on keskittynyt kehittämään metabolomiikan työkalujen ja biologisten merkkiaineiden ehdokkaiden havaita varhain EAC ja tunnistaa potilaat, joilla on suuri riski sairastua EAC. Olemme äskettäin raportoitu metabolomiikan perustuvia tutkimuksia EAC käyttämällä

1H NMR-spektroskopia ja osoitti, että kahdeksan seerumin aineenvaihduntatuotteiden eriytetty EAC terveiden valvontaa [27]. Olemme myös kohdennettua joukko nukleosideja seerumissa käyttäen nestekromatografia-kolmen neljän (LC-QQQ) MS ja osoittivat hyvin merkittäviä eroja useissa normaali ja denaturoidulla nukleosidien EAC [28]. Jonka tavoitteena on parantaa herkkyyttä ja spesifisyyttä hoitoisuusluokituksen sekä tunnistamaan henkilöitä vaarassa sairastua syöpään, tässä tutkimuksessa käytimme globaali metabolinen profilointi lähestymistapaa seeruminäytteistä EAC, BE ja HGD potilaiden ja terveiden verrokkien käyttämällä erittäin herkkä ja ratkaistu aika-of-lennon massaspektrometriaa yhdistettynä nestekromatografia (LC-TOF) MS. Metabolinen profiilit analysoitiin erikseen ja yhdessä aikaisemmin johdettuihin metaboliitin markkereita käyttäen NMR menetelmiä [27]. Arvioimme yhdistelmä NMR ja MS-tulokset mitattuna niiden suorituskyvyn luokittelussa EAC potilaiden ja terveiden verrokkien verrattuna suorituskykyä joko MS tai NMR-tiedot yksin. Kyky metaboliaprofiilien erottaa korkean riskin yksilöitä (BE ja HGD potilasta) peräisin EAC sekä terveillä verrokeilla tutkittiin. Olemme myös tunnistanut useita metaboliitteja, toimi nousussa markkereita, että niiden keskimääräinen pinta nousi /laski jatkuvasti terveisiin kontrolleihin korkean riskin henkilöiden ja sitten EAC potilaita.

Materiaalit ja menetelmät

kemikaalit

deuteriumoksidiliuosta (99,9% D) hankittiin Cambridge Isotooppi Laboratories, Inc. (Andover, MA). Trimethylsilylpropionic happo-d

4 natriumsuola (TSP), tridekaani- happo, kloorifenyylialaniinia, maitohappo, väliini, leusiini, isoleusiini, metioniini, karnitiini, tyrosiini, tryptofaani, myristiinihappo, margariini-, linoleenihappo, linolihappo ja pyroglutamiinihappo ostettiin Sigma-Aldrich (analyyttinen laatu, St. Louis, MO). 5-hydroxytryptophan ostettiin Alfa-Aesar (analyyttinen laatu, Ward Hill, MA). HPLC-laatuista metanolia ja etikkahappoa ostettiin Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Deionisoitua vettä saatu EASYpure II UV vedenpuhdistus järjestelmä (Barnstead International, Dubuque, IA).

Serum näytteiden keräämistä ja varastointia

paastoverinäytteet näytteitä Histologisesti todettu EAC (n = 67), HGD (n = 9) ja BE (n = 3) kerättiin Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). Yksityiskohtainen ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia EAC potilasta kuvattu edellisessä paperi [27], ja yhteenveto on esitetty taulukossa S1. Käytimme 68 EAC, 11 HGD ja 5 BE näytteet edellisessä NMR tutkimuksessa. Kuitenkin johtuen rajallinen määrä näytteitä, poistimme 1 EAC, 2 HGD ja 2 BE näytteiden LC-MS kokeiluja ja tarkempaa analysointia tähän työhön; vastaava NMR-tulokset myös pois yhdistetystä analysointia ja keskustelua. Verinäytteitä terveillä vapaaehtoisilla (n = 34) saatiin paasto-olosuhteissa. Kukin verinäyte annettiin hyytyä 45 minuuttia ja sitten sentrifugoitiin 2000 rpm: ssä 10 min. Seerumi kerättiin, alikvootit erillisessä injektiopullossa, jäädytetty, ja kuljetetaan yli kuivan jään Purdue University (West Lafayette, IN), jossa ne varastoitiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kaikki näytteet kerättiin seuraavan protokollan hyväksymän Indiana University School of Medicine ja Purdue University Institutional Review Boards. Kaikki aiheet mukana tutkimuksessa edellyttäen kirjallinen lupa hoitokäytännön mukaisesti.

Näytteiden valmistus ja tiedonkeruu

LC-MS-analyysia, pakastetut seeruminäytteet sulatettiin, ja proteiini saostettiin sekoittamalla 100 ui seerumia ja 200 ui kylmää metanolia. Kaksi sisäisiä standardeja, tridekaani- happoa ja kloorifenyylialaniinia otettiin myös seurata uuttotehokkuutta. Seosta sentrifugoitiin 13200 rpm: ssä 10 min. Supernatantti jälkeen saatu liuos proteiinin poiston kuivattiin tyhjössä ja saatu jäännös liuotettiin uudelleen 15 ul: metanoli /vesi (01:01) liuos. Saatu liuos oli jälleen sentrifugoitiin 13200 rpm: ssä 10 min poistamiseksi hiukkasten, jos sellainen on, ja supernatantti siirrettiin LC pulloon. Erikseen, yhdistettyä näytettä saatiin sekoittamalla 20 ui kustakin 20 ihmisen seeruminäytteitä valitaan satunnaisesti kaikkien näytteiden, ja metaboliitit uutettiin käyttäen samaa menetelmää kuin edellä. Tämä yhdistetty näyte, kutsutaan laadunvalvonta (QC) matriisi näyte, alistettiin analyysi säännöllisesti välillä joka 10. näytteen. QC Otostiedoille toimi myös teknisen rinnakkaista koko datajoukon arvioida prosessin toistettavuus. LC-MS-analyysi suoritettiin käyttäen Agilent LC-QTOF järjestelmä (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), joka koostuu Agilent 1200 SL nestekromatografia järjestelmän yhdistettynä verkosta Agilent 6520 aika-of-lennon massaspektrometrillä. A3 xl: n näyte käyttövalmista näytettä ruiskutettiin 2,1 x 50 mm Agilent Zorbax Extend-C18 1.8 pm hiukkanen pylväästä 2,1 × 30 mm Agilent Zorbax SB-C8 3,5 um hiukkas- Suojakolonnia jotka olivat molemmat kuumennettiin 60 ° C. Seerumin aineenvaihduntatuotteiden oli gradienttieluointi 600 ui /min käyttäen liikkuva faasi A: 0,2% etikkahappoa vedessä, ja liikkuva faasi B: 0,2% etikkahappoa metanolissa (2%: sta 98% B 13 min, 98% B 6 min ). Sähkösumutusionisaatiota (ESI) käytettiin, positiivinen toiminto. MS käyttöliittymän kapillaarin pidettiin 325 ° C: ssa, jossa on vaippa kaasun virtaus 9 l /min. Suihke jännite positiivinen ioni injektio oli 4,0 kV. Massa-analysaattori skannattiin yli 50-1000

m Twitter /

z

. Agilent MassHunter Workstation LC-TOF ja QTOF Acquisition ohjelmistot (B.02.01) käytettiin automaattiseen huipun havaitsemista ja massaspektri dekonvoluutio.

yksityiskohtaiset menettelyt näytteen valmistamiselle ja NMR-kokeet olivat äskettäin julkaistu muualla [27]. Lyhyesti, pakastetut seeruminäytteet sulatettiin, ja 200 ui sekoitettiin 350 ui D

2O. Saadut liuokset siirrettiin 5 mm: n NMR-putkiin. 60-pl liuosta, jossa oli TSP (0,12 mg /ml) suljetussa kapillaari käytettiin sisäisenä standardina, joka toimi kemiallisen siirtymän vertailua (δ = 0,00). Kaikki

1H NMR-kokeet suoritettiin 25 ° C: ssa Bruker DRX-500 spektrometrillä varustettu kolminkertainen resonanssi

1 H käänteistä detektiokoetinta kolminkertainen akseli magneettikenttägradientteja.

1 H-NMR-spektrit saatiin käyttäen standardia yksiulotteinen CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) pulssin peräkkäin vedellä signaali esikyllästysjaksolla. Kukin aineisto oli keskiarvona 64 häiriö- käyttäen 16 K aikatason pistettä. Aineisto Fourier jälkeen kertomalla eksponentiaalista ikkunan funktio viivalla laajentamista 1 Hz, ja spektrit olivat vaiheessa ja lähtötilanteessa korjattuina Bruker TopSpin ohjelmistoa (versio 3.0).

Tietojen analysointi

LC-MS Aineisto käsiteltiin käyttämällä Agilent MassHunter laadullinen analyysi (versio B.03.01) koostettujen tunnistamiseen. Luettelo ioni-intensiteettien kunkin havaitun huipun luotiin käyttäen retentioajan (RT) indeksin ja m /z tietojen tunnisteet kunkin ionin. Agilent MassHunter Workstation Mass Profiler Professional (versio B.02.00) käytettiin sitten yhdisteen piikin linjaus. Suodatin asetettiin poistamiseksi metaboliitiksi signaaleja, jotka olivat puuttuu piikit (ioni intensiteetti = 1) yli 10% näytteistä mihinkään ryhmään. Huiput sisäiset standardit poistettiin myös. Lopuksi Agilent Formula Database (Agilent, 2010) käytettiin yhdisteen tunnistamiseen sovittamalla tarkka massaspektri tietokantaan Metaboliittien yhdisteitä. Parittomia Opiskelijan

t

-testin tietojen analysointi suoritettiin arvioimaan eroja havaittujen yhdistettä intensiteetin keskuudessa EAC, BE ja HGD näytteitä, ja terveillä verrokeilla. Metaboliitit alhainen

p

-arvot ( 0,05) valittiin mahdollisiksi biomarkkereiden ehdokkaita ja tarkasti päässä massaspektrit ja RTS aitoja kaupallisten yhdisteiden ajaa erikseen. Taitteen muutos (FC) kullekin metaboliitille laskettiin määrittämään metaboliitin vaihtelusta ryhmissä.

NMR spektrin alueet olivat binned 4 K kauhat yhtä leveitä (1,5 Hz) minimoida virheet johtuvat vaihtelut kemiallisten siirtymät johtuvat pH tai ionipitoisuus muunnelmia. Kukin spektri oli linjattu metyyli huippu alaniini 1,48 ppm, ja normalisoitu käyttämällä integroitua TSP signaalia. Spectral alueet 0,3-10,0 ppm käytettiin analyysin jälkeen poistamalla vesi ja urea-signaalit (4,5-6,0 ppm). Univariate analyysi suoritettiin käyttämällä paritonta Studentin

t

-testi tunnistaa merkittävästi erilaiset spektrin astiat keskuudessa EAC, BE ja HGD potilaiden ja terveiden verrokkien. Korit, jotka osoittivat merkittäviä eroja eri potilaiden /ohjaa ryhmiä siirrettiin siis vastaavan aineenvaihduntatuotteiden vertaamalla kemialliset siirtymät ja multiplicities huippujen kirjallisuuden tai online-tietokannoista [29], [30], [31]. Ominainen spektrin alueilla kullekin metaboliitille integroitiin, ja

p

-arvot ja kertamuutoksia eri ryhmien välillä laskettiin.

MS /NMR-tiedot valitun tilastollisesti merkitsevä aineenvaihduntatuotteiden (jossa

p

0,05) tuotiin Matlab (R2008a, Mathworks, Natick, MA) asennettu PLS työkalupakin (versio 4.1, ominaisvektori- Research, Inc., Wenatchee, WA) ja PLS-DA analyysit. X matriisi, joka koostuu MS /NMR-spektritiedot, on autoscaled ennen kaikkia tilastollisia analyysejä. Riippuen ryhmän kukin aihe on valittu ”0” (eli potilas) ja ”1” (ts terveisiin) palvelemaan (yksiulotteinen) Y matriisi. Jätä-one-out cross validointi (CV) valittiin, ja määrä piilevä muuttujia (LVS) valittiin mukaan pienin tehollisarvo virhe CV menettelyn. Ennustukset tehtiin visuaalisesti käyttäen Y-ennustettu sirontakaavio joiden raja-arvo valitaan minimoimaan virheet luokassa jäsenyyden. R tilastopaketista (versio 2.8.0) käytettiin tuottamaan vastaanottimeen käyttöominaisuuksien (ROC) käyriä, laskea ja verrata herkkyys, spesifisyys ja ala ROC-käyrän (AUROC).

Tulokset

LC-MS-spektri kunkin seeruminäytettä kuului yli 5000 ominaisuuksia joista lähes 1400 piikit määrättiin aineenvaihduntatuotteet käyttäen Agilent tietokantaa. Piikit spektrit, jotka puuttuivat yli 10% näytteistä mistä tahansa ryhmästä jätettiin pois lisäanalyysistä. Käyttö tämän suodattimen ja Agilent kemiallinen kirjasto tuotti kaikkiaan noin 200 tunnistettavissa aineenvaihduntatuotteiden yleisin kaikille ryhmille. Edelleen tunnistaa tiettyjä aineenvaihduntatuotteita parhaiten korreloivat eroihin biologista tilaa eri vertailuissa, kirjasto-tunnistetut aineenvaihduntatuotteet analysoitiin univariate analyysiä. Tulokset osoittivat, että 40 aineenvaihduntatuotteiden vaihtelivat huomattavasti (

p

0,05) välillä joko EAC ja terveiden verrokkien, EAC ja suuren riskin potilailla (BE ja HGD potilasta), tai korkean riskin potilailla ja terveillä verrokeilla. Kolmetoista näistä metaboliiteista voitaisiin todentaa päässä massaspektrit ja retentioaikojen aitoja kaupallisia yhdisteitä. Taulukossa S2 näyttää listan todennettujen aineenvaihduntatuotteiden LC-MS sekä niiden kaavat, massat ja retentioajat. Samoin kuten taulukossa S3, viisitoista potilaan luokan erottaa aineenvaihduntatuotteiden alhainen

p

-arvot (

p

0,05) saadaan integroimalla asiaa NMR-piikit vahvistettiin sovittamalla havaitut kemialliset siirtymät ja multiplicities aiemmin ilmoitettujen tietojen [29], [30], [31].

Kooste aineenvaihduntatuotteen biomarkkereiden ehdokkaat LC-MS ja NMR niiden

p

– arvot ja kertamuutoksia esitetään taulukossa 1. ANOVA suoritettiin myös, lopputulos on lähes yhdenmukainen niillä,

t

-testi (taulukko S4). Koska olimme kiinnostuneita tunnistamaan yksittäisiä markkereita, jotka erottaa kunkin kolmen potilasaineistoihin erikseen, käytimme

t

-testi tietojen tunnistamiseksi merkkiaineita pienoismallit. Herkkyys, spesifisyys ja AUROC arvot PLS-DA malleja kunkin vertailu on lueteltu taulukossa 2. Vertailu MS ja NMR-tietojen avulla

t

-testi, erikseen, ei osoittanut merkittäviä eroja johtuu sukupuolten, iästä tai syöpä vaiheessa (

p

0,05) välillä EAC ja valvonta (taulukko S5).

vertaaminen metaboliaprofiilien välillä EAC potilaiden ja terveiden verrokkien

Kuten taulukosta 1, kaksitoista aineenvaihduntatuote merkki ehdokkaat havaita LC-MS eriytetty EAC potilaiden ja terveiden kontrollien, ja niiden identiteetit vahvistettiin autenttisen yhdisteitä. Kuvassa S1 esittää Rasia ja hiuksenhienosti tontteja huippuintensiteeteillä 12 eriyttää biomarkkereiden ehdokasta. Kuten nähdään taulukossa 1 ja kuviossa S1, tasot maitohapon, karnitiinin ja margariini- hapon olivat korkeammat, ja ne, valiini, leusiini /isoleusiini (nämä rakenteelliset isomeerit, ei ole voitu erottaa nykyisen LC-menetelmä), metioniini, tyrosiini, tryptofaani , 5-hydroxytryptophan, myristiinihappo, linoleenihapon ja linolihappoa olivat pienemmät EAC potilaita terveisiin kontrolleihin verrattuna.

merkki ehdokkaita

1H-NMR-analyysi on raportoitu edellisessä tutkimuksessa [27]. Lyhyesti, joukko 8 metaboliittien, mukaan lukien β-hydroksibutyraatti, lysiini, glutamiini, sitraatti, kreatiniini, laktaatti, glukoosi ja tuntematon molekyyli, olivat tilastollisesti merkitseviä (

p

0,05), ja korkeampi kunkin ne aineenvaihduntatuotteiden EAC yksilöt havaittiin (taulukko 1).

kuvassa 1 vertailun suorituskyvyn 3 metaboliaprofiilien välillä EAC potilaiden ja terveiden verrokkien. PLS-DA mallia käyttäen kahdentoista LC-MS johdettu aineenvaihduntatuotteiden (ja jätä-yksi-out cross arvostus) säädetty 77% herkkyys ja 86% tarkkuus joiden AUROC on 0,82. Samanlainen analyysi käyttäen kahdeksaa NMR johdettu aineenvaihduntatuotteiden edellyttäen 82% herkkyys ja 88% tarkkuus joiden AUROC 0,86. Kuitenkin kun metaboliitin analysoitiin yhdistämällä 12 LC-MS ja 8 NMR havaittujen aineenvaihduntatuotteiden, antaman mallin paljon parempi suorituskyky sekä herkkyys ja spesifisyys 91%, ja AUROC 0.95.

(A ) Vasen, tulos PLS-DA mallia käyttäen 12 metaboliitiksi markkereita LC-MS-analyysit; keskimmäinen, ROC käyrä käyttäen rajat validoitu ennustetut luokan arvot (AUROC = 0,82); oikea, PLS-DA ennusteen BE ja HGD näytteitä LC-MS malli vertaamalla EAC ja terveillä verrokeilla. (B) Sama kuin (A), paitsi että käytettiin 8 aineenvaihduntatuotteen markkereita NMR-analyysit, (AUROC = 0,86); (C) Sama kuin (A), paitsi että käytettiin yhdistelmä LC-MS ja NMR havaittu metaboliitti markkereita, (AUROC = 0,95).

arvioimiseksi BE ja HGD näytteitä, sama PLS-DA mallia sovellettiin, ja tulos on myös esitetty kuviossa 1 (oikealla). BE näytteet antoi sekoitettu tulos, eikä varmoja johtopäätös voitaisiin tehdä koska pieni määrä näytteitä. Kuitenkin suurin osa HGD näytteet ennustettu EAC tässä tapauksessa. PLS-DA mallia, joka perustuu NMR havaittujen aineenvaihduntatuotteiden, ja malli, joka perustuu yhdistyvät LC-MS ja NMR havaittujen aineenvaihduntatuotteiden molemmat osoittivat, että 7 ulos 9 HGD potilasta osoitti samankaltaiseksi kuin EAC näytteitä.

vertailu metabolisen profiilit EAC ja korkean riskin potilailla

tiedot suuren riskin potilailla (BE ja HGD potilasta) yhdistettiin analyysiä varten, koska niiden pieni näyte numeroita. Univariate tietojen analysointi osoitti, että 7 LC-MS ja 8 NMR havaittujen aineenvaihduntatuotteiden vaihtelivat huomattavasti EAC ja korkean riskin potilailla, jotka yhdessä

p

-arvot ja kertamuutoksia esitetään taulukossa 1.

PLS-DA mallit sitten rakennettu käyttäen LC-MS ja NMR-johdetut aineenvaihduntatuote signaaleja, erikseen ja yhdessä, testata luokitustarkkuudesta kahden potilasryhmien, ja tulokset esitetään kuviossa 2. LC -MS johdettu aineenvaihduntatuotteiden edellyttäen herkkyys ja spesifisyys 83% ja 80%, vastaavasti, ja AUROC 0,87, ja NMR johdettu aineenvaihduntatuotteiden edellyttäen sekä herkkyys ja spesifisyys 77%, joiden AUROC 0,72. Kun analysoitiin yhdistämällä LC-MS ja NMR johdettujen metaboliittien herkkyys ja spesifisyys 67% ja 97% saatiin, vastaavasti, ja AUROC on 0,82. Tässä, vaikka suorituskyky mallin yhdistetyn datan oli hieman parempi kuin NMR-tietojen perusteella yksin, malli johdettu LC-MS havaittujen aineenvaihduntatuotteiden osoitti parhaan suorituskyvyn. Kun testataan säätimiä käyttäen samaa PLS-DA malleja johdettu LC-MS havaittu, NMR havaita ja yhdistetty aineenvaihduntatuotteita, 22, 12 ja 22 34 ohjaa ylittivät raja-arvon, vastaavasti, ja sen vuoksi on luokiteltu ei ole samanlainen EAC potilaille.

(A) vasen, tulos PLS-DA mallia käyttäen 7 aineenvaihduntatuotteen markkereita LC-MS-analyysit; keskimmäinen, ROC käyrä käyttäen rajat validoitu ennustetut luokan arvot (AUROC = 0,87); oikea, PLS-DA ennuste terveillä verrokeilla mallin kehitetty käyttäen LC-MS aineenvaihduntatuotteiden verrataan EAC ja korkean riskin potilailla. (B) Sama kuin (A), mutta käyttämällä 8 aineenvaihduntatuotteen markkeria NMR-analyysit, (AUROC = 0,72). (C) Sama kuin (A), paitsi että käytettiin yhdistelmä LC-MS ja NMR havaittu metaboliitti markkereita, (AUROC = 0,82).

Verrattaessa metaboliaprofiilien terveiden valvonnan ja korkean riskin potilailla

Vain yksi metaboliitti, pyroglutamiinihappo, havaita LC-MS, ja kolme NMR havaittujen aineenvaihduntatuotteiden, proliini, maitohappoa ja tuntematon metaboliitti, erosivat merkitsevästi (

p

0,05) välillä korkean riskin potilaita terveisiin kontrolleihin (taulukko 1). Lisäksi huipun, jotka johtuvat N-asetyloitu-proteiinin NMR-spektrit osoittivat merkittävää eroa kahden ryhmän välillä. Vaikka tasot pyroglutamiinihapon, proliini ja maitohappo olivat suuremmat riskiryhmään, muut olivat alhaisemmat.

LC-MS ja NMR-tiedot korkean riskin yksilöitä ja terveillä verrokeilla verrattiin käyttämällä PLS-DA-analyysi (kuva S2). Yksinäinen erottava metaboliitti LC-MS, pyroglutamiinihappo ollut herkkyys ja spesifisyys 74% ja 75%, tässä järjestyksessä, ja AUROC 0,76. PLS-DA malli perustuu NMR havaittujen aineenvaihduntatuotteiden edellyttäen herkkyys ja spesifisyys 68% ja 92%, tässä järjestyksessä, ja AUROC 0,80. Yhdistetty analyysi tietoja kahden analyysimenetelmien tuloksia saatiin samanlainen kuin NMR yksin. Kuitenkin kaikki mallit eivät anna selkeää ennusteen EAC potilaista käyttämällä vain korkean riskin ja terve kohortteja, mikä osoittaa, että (ei yllättäen) EAC potilaan näytteitä rakentamiseen tarvitaan onnistuneen havaitsemisen malli.

Nousussa markkereita

tasot metaboliittien välillä kolmeen ryhmään, EAC, BE HGD, ja terveillä verrokeilla verrattiin käyttämällä Rasia ja hiuksenhienosti tontteja. Mielenkiintoista on, että keskimääräiset tasot 12 aineenvaihduntatuotteiden, kuten maitohappo, väliini, leusiini /isoleusiini, metioniini, tyrosiini, tryptofaani, myristiinihappo, linolihappo, β-hydroksibutyraatti, lysiini, glutamiini ja sitraatti vähitellen muuttui keskimääräiset tasot BE ja HGD potilaat laskussa välisiä terveiden valvontaa ja EAC (kuva 3). Vaikka tasot maitohappo, 3-hydroksibutyraatti, lysiini, glutamiini ja sitraatti lisääntynyt, tasot väliini, leusiini /isoleusiini, metioniini, tyrosiini, tryptofaani, myristiinihappo ja linolihappoa laski vähitellen.

Vaakasuora viiva keskiosassa ruutuun, mediaani; alhaalta ja ylhäältä rajoja laatikot, alemman ja yläkvartiili; viikset, 5 ja 95 prosenttipisteet; avoimet ympyrät, poikkeavia havaintoja. Ensimmäisen kahdeksan markkereita havaittiin LC-MS, ja loput neljä havaittiin NMR: llä.

Käyttäen näitä 12 markkereita, PLS-DA mallit jälleen rakennettu LC-MS ja NMR erikseen ja yhdistelmä, testata luokittelun tarkkuus kummankin ryhmän vertailu (kuvio 4). Kuvio 4A esittää PLS-DA malli EAC v. Terveillä verrokeilla ja ennustaa arvot korkean riskin potilailla. Malli tarjosi herkkyys ja spesifisyys 89% ja 90%, vastaavasti, ja AUROC 0,92, vaikka ennustava testi BE ja HGD eivät paranevan vuodesta käyttämällä edellistä PLS-DA malli (kuvio 1 B ja C). Kuviossa 4B on esitetty PLS-DA mallia verrataan EAC ja korkean riskin potilasryhmässä, jolloin herkkyys, spesifisyys ja AUROC 76% 70% ja 0,78, tässä järjestyksessä. Tällöin paraneminen ennustavan testaamiseen verrokeilla saatiin, jossa on 30 ulos 34 ohjaa näkymisen yläpuolella valorajan (non-EAC kaltainen). Nämä 12 markkereita ei voida käyttää muodostamaan selkeä luokitus välillä terveiden kontrollien ja riskin potilailla käyttäen PLS-DA, sen vuoksi ei ole mahdollista käyttää tällaista mallia ennustamaan EAC (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Performance vertailu metaboliaprofiilien välillä EAC potilaiden ja terveiden kontrollien, AUROC = 0,92. (B) Performance vertailu metaboliaprofiilit välillä EAC ja BE /HGD potilailla, AUROC = 0,78.

Keskustelu

Tämä tutkimus keskittyy tunnistamaan erottaa aineenvaihduntatuotteita perustamaan paremman kliinisen biomarkkereita EAC havaitsemista, kehittämistä vankempi luokitusmalli, ja oivalluksia muuttuneen metaboliateissä EAC.

erottaa aineenvaihduntatuotteiden peräisin yksittäisistä LC-MS ja NMR-analyysit osoittivat selviä eroja useissa metaboliittien välillä EAC ja valvontaa ja saavuttaneet hyviä luokitustarkkuudesta. Kuitenkin yhdistelmä metaboliaprofiilien kahdesta mahdollistamat keinot käytettävissään vähitellen kasvava määrä erottaa aineenvaihduntatuotteiden. Ennustavan voiman mallin johdettu yhdistämällä MS ja NMR-menetelmät toimivat paremmin sekä herkkyys ja tarkkuus verrattuna tuloksiin yksittäisistä analyysimenetelmät. Toisiaan täydentävä luonne yhdistettynä metabolisen altaan johdettu kahdesta menetelmistä osaltaan tähän parannukseen mallin. Itse asiassa, kaikki LC-MS havaittu metaboliitti markkeri ehdokkaita paitsi maitohapon eroavat havaita NMR: llä. On kuitenkin korostettava, että vaikka parannus luokitus oli hyvin selkeä erottamiseksi EAC ja valvontaa, kun kahden analyysimenetelmien yhdistettiin parantuneesta erotteleva suuri riski (BE ja HGD) potilaista verrattuna EAC oli vähemmän havaittavissa ja vain korkea spesifisyys alue (kuviot 1 ja 2). Tämä vaikutus johtuu todennäköisesti vähäisen määrän korkean riskin potilaita ja mahdollisesti vaihtelua aineenvaihdunnan muutoksia suuremmassa määrin yhdestä potilaasta toiseen, jotka molemmat voivat tehdä mallin ennustuksen haastavampaa.

vertailu yksittäisten aineenvaihduntatuotteet ja tilastollisia malleja kehitetty käyttäen erottaa aineenvaihduntatuotteet kolmeen ryhmään osoitti, että metabolista profiilit BE ja HGD potilaat olivat erilaisia ​​kuin sekä EAC potilaiden ja terveiden verrokkien. Progressive määrän muutoksia 12 aineenvaihduntatuotteiden peräisin LC-MS ja NMR menetelmät osoittavat mahdollisen käyttökelpoisuuden tunnistamiseksi BE ja HGD potilaat, joille saattaa kehittyä EAC (kuva 3). Tämä on erityisen tärkeää, koska BE ja HGD ovat merkittäviä riskitekijöitä kehittämiseen EAC. Aineenvaihduntatuotteiden näillä potilailla, jotka ovat mahdollisesti ennustavat kehittäminen EAC on erityisen tärkeää hallinnan vaarassa potilaista.

tunnistetiedot metaboliatiet liittyy erityisiä aineenvaihduntatuotteiden näyttämällä muuttuneita tasoja voidaan parantaa ymmärrystä biologia ja patologiasta lentoradan normaalista ruokatorven sairaus ja lopulta syöpä. Aikaisemmin osoitimme yksinkertaistettu polun kartan perusteella aineenvaihduntatuote markkereita tunnistetaan NMR- ja vertasivat tuloksia muun tyyppinen syöpien [27]. Pohjalta tämän mallin, kuvio 5 esittää yksityiskohtaisemman koulutusjakson kartan liittyy metaboliitin merkkiaineiden tunnistaa käyttämällä sekä MS ja NMR menetelmiä. Muuttaa reittejä ovat muutokset aminohappometabolian, biosynteesiä ja hajoamista (glutamiini, lysiini, karnitiini, väliini, leusiini /isoleusiini, metioniini, tryptofaani, 5-hydroxytrytophan, ja tyrosiini), glykolyysin (laktaatti ja glukoosia), ketoaineiden synteesi ja hajoaminen (