Krooninen sairaus

tiivistelmä

fotodynaaminen hoito (PDT) on tullut tehokas hoito erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia. Transkriptiotekijä Nrf2 tiedetään suojaamaan oksidatiivista ja elektrofiilisen stressin; kuitenkin, sen konstitutiivista aktiivisuutta syövän resistenssin syöpälääkkeet. Esillä olevassa tutkimuksessa selvitimme Nrf2 signalointi mahdollisena molekyyli tekijä feoforbidin a kappale (Pba) -pohjaisen PDT käyttämällä

Nrf2

-knockdown rintasyöpä MDA-MB-231-soluja. Solut, joissa vakaa

Nrf2

Knockdown osoitti parannettu sytotoksisuus ja apoptoottinen /nekroottinen solukuolema seuraavia PDT yhdessä kohonneeseen singlettihappea ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). Konfokaalisella mikroskooppinen visualisoinnin fluorogeenisen Pba osoitti, että

Nrf2

-knockdown soluihin kertyy enemmän Pba kuin kontrolli soluja. Myöhempi analyysi ilmentymisen kalvon lääkkeiden kantaja osoitti, että pohjapinta ilmentyminen

BCRP

on Nrf2-riippuvainen. Niistä mitataan lääkkeiden kantaja, pohjapinta ilmaus rintasyövän resistance protein (BCRP; ABCG2) vasta väheni

Nrf2

-knockdown. Lisäksi inkuboinnin jälkeen BCRP erityisiä estäjä, tasauspyörästö solu Pba keskittymisen ja ROS kahdessa solulinjoissa poistettiin. Lisäksi,

Nrf2

-knockdown solut ilmentävät alhaisen peroxiredoxin 3 kontrolliin verrattuna, mikä osoittaa, että vähentynyt mitokondrion ROS puolustusjärjestelmää voidaan edistää PDT herkistymistä. Rooli Nrf2-BCRP väylän Pba-PDT vaste edelleen vahvistettiin paksusuolisyöpä HT29. Erityisesti

Nrf2

Knockdown johti tiiviimpään solukuoleman ja lisääntynyt singlettihappea ja ROS tasoille PDT kautta vähentynyt ilmentyminen BCRP. Samoin PDT aiheuttama ROS sukupolvi kasvoi merkittävästi käsittelemällä

Nrf2

shRNA Rintasyövän MCF-7-solut, paksusuolen HCT116-solut, munuaissyöpä A498-solut, ja glioblastooma A172 soluja. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että manipulointi Nrf2 voi parantaa Pba-PDT herkkyyttä useita syöpäsoluja.

Citation: Choi Bh, Ryoo Ig, Kang HC, Kwak MK (2014) herkkyys syöpäsolujen feoforbidin a-Based fotodynaaminen hoito tehostuu

Nrf2

Silencing. PLoS ONE 9 (9): e107158. doi: 10,1371 /journal.pone.0107158

Editor: Michael Hamblin, MGH, MMS, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 toukokuu 2014; Hyväksytty: 06 elokuu 2014; Julkaistu: 16 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Research Foundation (NRF) rahoittama tiede, ICT ja Future Planning (NRF-2013R1A2A2A01015497). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fotodynaaminen hoito (PDT) on tullut tehokas hoitoa useita kiinteitä kasvaimia [1] – [3]. PDT vaatii kolme elementtiä: i) valolle, joka voidaan selektiivisesti kohdentaa tuumorikudoksia, ii) sopivan valolähteen, joka päästää vähän energiaa ja kudos-läpitunkeva valo, ja iii) molekyylistä happea [4]. Ensimmäinen askel PDT on aktivointi valolle valo. Kun aktivoitu valolle herkistävän sen innostunut tila palaa perustilaansa, se siirtää energiaansa happea ja tuottaa singlettihappea (

1O

2), erittäin reaktiivinen ja lyhytikäisiä reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), kuten tyypin II reaktio. Samaan aikaan, aktivoitu photosensitizer voi reagoida suoraan solun komponenttien ja siirtää vetyatomi muodostavat radikaaleja, jotka lopulta tuottaa hapettumista tuotteiden kautta reaktio hapen kanssa (tyyppi I reaktio [5]). Singlettihappi- ja ROS ovat erittäin hapettava molekyylejä; Siksi PDT-käsitellyt solut läpikäyvät solukuoleman kautta sekä kuolion ja apoptoosin [6]. Sen lisäksi, että suoraa vaikutusta tuumorisoluihin, PDT vaikuttaa kasvaimen microenvironment tuhoamalla sen mikrovaskulaarisessa ja tehostamalla tulehdusreaktioita ja kasvaimen immuunivasteet [4], [7], [8].

feoforbidin (Pba) on tuote klorofylli erittely, joka eristetään silkkitoukan eritteistä [9] ja kiinalainen lääkekasvi

Scutellaria barbarta

[10]. PBA absorboi valoa pitemmillä aallonpituuksilla kuin ensimmäisen sukupolven valoherkistintä fotofriini. Suurin aallonpituus Pba on 666 nm, kun taas on fotofriini on 630 nm [11]. Koska kudospenetraatio on parantaa pidemmillä aallonpituuksilla, Pba on pidetty valolle hoitoon suuria kasvaimia vatsaontelossa [12]. Samanlaisia ​​fotofriini, Pba indusoi apoptoosin ja nekroosin haimakarsinooma-, leukemia, ja maksasyövän solut [13] – [15]. Kohdun karsinoomasoluja, taustalla olevan mekanismin apoptoosin on Pba kertymistä mitokondrioissa, joka johtaa sukupolven ROS ja vapautumisen sytokromi c [16], [17]. Vastaavasti, Pba aiheuttaa mitokondriot-riippuvaista apoptoosia Rintasyövän MCF-7-soluja [18]. Useat

in vivo

eläinkokeet ovat tukeneet tehoa Pba-PDT ehkäisemisessä kasvainten synnyssä. Esimerkiksi liposomaalinen valmiste PBA-PDT viivästynyt kasvaimen kasvun koolonkarsinoomasolulinjassa HT29 ksenografti [19]. Suonensisäinen antaminen 0,3 mg /kg Pba seurasi valo säteilytys merkitsevästi esti kasvaimen kasvua nude-hiirissä kätkeminen ihmisen hepa- ksenograftin [11].

Yksi tekijä tehoa PDT on ilmaus ATP-sitova kasetti ( ABC) kuljettajat kohdekudokseen. Nämä kuljettajat ohjaavat kertymiseen solun ulko- kemikaalien aktiivisesti kuljettaminen ulos kennosta [20]. Rintasyöpä resistance protein (BCRP tai ABCG2) on ABC kuljettaja, joka alun perin tunnistettiin doksorubisiiniresistenttejä rintasyövän soluja [21]. N yli-ilmentyminen BCRP tuumoreihin antaa vastustuskyvyn kemoterapiaa [22]. Sen lisäksi, syöpälääkkeet, BCRP on osoitettu kuljettamaan porfyriinin-tyypin valoherkistimien. Erityisesti, HEK-solut yli-ilmentävät BCRP olivat resistenttejä Pba-indusoidun sytotoksisuuden [23]. Samaan aikaan,

BCRP

-knockout hiiret olivat erittäin alttiita ravinnon Pba aiheuttama ihon valotoksisuuden [24].

transkriptiotekijä NF-E2 liittyvä tekijä 2 (Nrf2) on jäsen cap’n’collar perheen perus leusiini-vetoketju (CNC-bZIP) transkriptiotekijöiden [25]. Nrf2 toimintaa säädellään ensisijaisesti sytoplasminen proteiini Kelch kaltaiset ECH-liittyvä proteiini 1 (KEAP1) [26], [27]. Sitoutumisen kautta Neh2 verkkotunnuksen Nrf2, KEAP1 välittää ubiquitinylation ja myöhemmin proteasomaalisten hajoamista Nrf2. Olosuhteissa oksidatiivisen ja elektrofiilisen stressi, Nrf2 on vapautunut KEAP1 ja translokoituu tumaan, jolloin transkription useiden kohdegeenien, jotka koodaavat myrkkyjä entsyymejä, antioksidantti proteiineja, stressi-vaste-proteiineja, ja niiden kuljettajat [28] – [30] . Koska sen kohdegeenien on cytoprotective vaikutuksia, Nrf2 pidetään kriittinen toimija puolustusjärjestelmää vastaan ​​oksidatiivista ja elektrofiilisen stressin [31]. Niinpä useat tutkimukset ovat osoittaneet, että geneettinen poisto

Nrf2

liittyy lisääntynyt alttius kudosvaurioita ja vammoista ympäristö- ja endogeenisen stressitekijöiden [28], [31], [32]. Toisaalta, yhä näyttöä siitä, että syöpäsolut hyödyntävät Nrf2 järjestelmän selviytymisen mukautumalla stressaavaa kasvain microenvironment [33]. Nrf2 signalointi konstitutiivisesti aktivoitu useita kasvaintyypeissä ja viljeltiin syöpäsolulinjoissa, joka liittyy lisääntynyt kasvaimen kasvu ja vastustuskyky kemoterapeuttisia aineita. Syöpäsoluissa, Nrf2 signalointi sääteli altistumisen jälkeen kemoterapeuttiset lääkkeet, joka antaa kehittynyt resistenssi kemoterapiaa [34] – [36]. Samoin PDT hyperisiini ihmisen rakkosyöpä- solut johti kohonnut ilmentyminen ydin- Nrf2-proteiinin ja hemioksigenaasi-1 (HO-1) kautta p38

MAPK ja PI3K reittejä [37]. Hoito HepG2 soluista, joissa on ei-myrkyllinen konsentraatio Pba seurasi kuva aktivointi 90 min lisännyt ilmentymisen BCRP ja hemioksigenaasi-1 (HO-1) on Nrf2-riippuvaisella tavalla [38].

esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet Nrf2 uutena molekyyli PDT tehoa. Koska Nrf2 säätelee ilmentymistä ROS-torjua komponentteja ja useita lääkkeitä kuljettajat, me arveltu, että manipuloimalla Nrf2 ilmaisua lisäisi tehoa PDT. Tämän hypoteesin testaamiseksi, loimme vakaa

Nrf2

-knockdown solulinjoissa käyttämällä ihmisen rintasyöpä MDA-MB-231-solujen ja paksusuolisyöpä HT29, ja mitataan PDT herkkyys. Tuloksemme osoittivat, että

Nrf2

Knockdown tehostaa PDT-solukuolema lisäämällä tuotantoa ROS. Koska taustalla olevaa mekanismia, BCRP ilmentyminen tukahdutettu

Nrf2

Knockdown, mikä lisää solujen kertymistä Pba ja lisääntynyt tuotanto singlettihappea.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Pba oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Nrf2-vasta-aine saatiin Abcam (Cambridge, MA, USA). Vasta-aineet tunnustaa AKR1C1 ja BCRP ostettiin Abnova (Taipei City, Taiwan) ja Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), tässä järjestyksessä. PRDX3 ja β-tubuliinin vasta saatiin Santa Cruz Biotechnology. Ko143, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), ja puromysiinin saatiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). 5 (6) -karboksi-2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFDA), trans-1- (2’methoxyvinyl) pyreenin, ja MitoGreen hankittiin Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Lentiviruksen joka sisältää valmiiksi suunniteltu ihmisen

Nrf2

shRNA ja epäspesifinen salattu RNA (scRNA) ostettiin Sigma-Aldrich.

Soluviljely

Ihmisen rintasyöpäsolujen MDA-MB-231 ja MCF-7, koolonisyöpäsolulinja HT29 ja HCT116, sekä ihmisen munuaisen karsinooma A498 saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Ihmisen glioblastoomasolulinjan A172 hankittiin Korean Cell Line Bank (Seoul, Etelä-Korea). MDA-MB-231, MCF7, A498, A172, ja HCT116 pidettiin alustassa, joka sisälsi Dulbeccon Modified Eagle Medium ja Nutrient Mixture F-12 (Hyclone, Utah, USA) suhde 01:01, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumi (Hyclone) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (WelGene Inc., Daegu, Etelä-Korea). HT29 pidettiin RPMI-1640-alustassa (Hyclone), 10% FBS: ää ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä.

valmistus lentivirus- partikkeleita, jotka sisältävät

Nrf2

shRNA ekspressioplasmidin

Lentivirusvektorikonstruktit hiukkasia shRNA tuotettiin HEK 293T-soluissa transfektion jälkeen solujen

Nrf2

shRNA ekspressioplasmidiin ja pakkauksen seosta (Sigma-Aldrich), kuten aiemmin on kuvattu [36]. Lyhyesti, HEK 293T-solut siirrostettiin 60 mm: n maljoille tiheydellä 7 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Seuraavana päivänä alusta korvattiin OptiMEMiin (Life Technologies), ja sen jälkeen, 1,5 ug pLKO.1-Nrf2 shRNA, joka sisältää ihmisen

Nrf2

erityisiä shRNA (5′-CCGGGCTCCTACTGTGATGTGAAATCTCGAGATTTCACATCACAGTAGGA-3 ’), ja pakkaus sekoitus transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technologies). PLKO.1-scRNA plasmidia käytettiin epäspesifisen kontrolli-RNA. Toisena päivänä, poistamisen jälkeen transfektion monimutkainen, täydellistä alustaa lisättiin kuhunkin kuoppaan. Media sisältäviä lentiviruksen hiukkasia kerättiin 4 päivän kuluttua.

perustaminen

NRF

Knockdown solulinja

MDA-MB-231-solujen 6-kuoppalevyllä inkuboitiin lentivirus hiukkasia joka sisältää joko scRNA tai Nrf2 shRNA ekspressioplasmidin. Jälkeen 48 h inkubaation jälkeen solut otettiin talteen täydellisessä elatusaineessa ja puromysiinin (1 ug /ml) valinta seurattiin enintään 4 viikkoa.

Nrf2

Knockdown HT29 solulinjassa määritettiin aiemmin raportoitu [39].

ohimenevä knockdovvn Nrf2

MCF-7, HCT116, A172 ja A498-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

5 solua /kuoppa ja kasvatettiin yön yli. Seuraavana päivänä soluja inkuboitiin kolesterolia 15 minuuttia ja sitten, lentiviruksen hiukkasia, jotka sisältävät scRNA tai shNRF2 lisättiin kuhunkin kuoppaan. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin viruspartikkelin sisältäviä aineita poistettiin ja solut talteen tuoreella alustalla yön yli.

PDT ja MTT-analyysi

MDA-MB-231 ja HT29 ympättiin tiheys on 7 × 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 20 tuntia. Solut käsiteltiin Pba (0-2,5 ug /ml) 6 tunnin ajan ja säteilytettiin sitten 0,3 (HT29) tai 0,6 J /cm

2 (MDA-MB-231) laser puuttuessa Pba. Sillä Lasersäteilytyksen, 670 nm LED Hybrid Lamppu järjestelmä (Quantum Spectra Life, Barneveld, WI) käytettiin. Solut otettiin talteen täydellisessä väliaineessa 18 h ja niitä inkuboitiin MTT: ssa 4 tuntia. Poistamisen jälkeen MTT-liuosta, 100 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin jokaiseen kuoppaan, ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttäen Spectro tähden Nano mikrolevylukijalla (BMG Labtechnologies, Offenburg, Saksa).

Sytotoksisuus mittaus

Sytotoksisuus PDT arvioitiin käyttäen CytoTox-Fluor-määritys (Promega, Madison, WI, USA). PDT: n jälkeen, soluja ylläpidettiin 24 tuntia, ja sitten 50 ui bis-AAF-R110 substraattia lisättiin kuhunkin kuoppaan. Substraattia sisältävää liuosta inkuboitiin vielä 2 h kiertoradan ravistellen 37 ° C: ssa. Voimakkuudet fluoresenssi mitattiin käyttämällä SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) on 485 nm Ex /520 nm Em.

Yhteensä RNA ja reaaliaikainen PCR-analyysi

Yhteensä-RNA: t eristettiin soluista käyttämällä Trizol-reagenssia (Life Technologies). Synteesin cDNA, käänteistranskriptaasin (RT) reaktio suoritettiin inkuboimalla 200 ng kokonais-RNA: n reaktioseoksessa, joka sisältää 0,5 ug /ul oligo dT

12-18 ja 200 U /ul Moloney hiiren leukemiavirus RT (Life Technologies). Sillä reaaliaikainen polymeraasi-ketjureaktio (PCR) analyysi, Roche LightCycler (Mannheim, Saksa) käytettiin Takara SYBR Esiseos ExTaq järjestelmä (Otsu, Japani). Alukkeet syntetisoitiin Bioneer (Daejeon, Etelä-Korea) ja alukkeen sekvenssit ihmisen geenit ovat:

Nrf2

, 5′-ATAGCTGAGCCCAGTATC-3 ’ja 5′-CATGCACGTGAGTGCTCT-3’;

HO-1,

5′-GCTGCTGACCCATGACACCAAGG-3 ’ja 5′-AAGGACCCATCGGAGAAGCG-GAG-3’; aldo-keto-reduktaasin 1C1 (

AKR1C1),

5′-CGAGAAGAACCATGGGTGGA-3 ’ja 5′-GGCCACAAA-GGACTGGGTCC-3’; NAD (P) kinoni oksidoreduktaasi 1 (

NQO1

), 5′-CAGTGGTTTGGAGTCCCTGCC-3 ’ja 5′-TCCCCGTGGATCCCTTGCAG-3’; katalyyttinen alayksiköt γ-glutamaatin kysteiini ligaasia (

GCLC

), 5′-TGAAGGGACACCAGGACAGCC-3 ’ja 5′-GCAGTGTGAACCCAGGACAGC-3’; epoksidihydrolaasin-1 (

EPHX1

), 5′-GCCTGCACTTGAACATGGCT-3 ’ja 5′-ATGTGCATGTAGCCGCTCTC-3’; superoksididismutaasi 1 (

SOD1

), 5′-GATTCCATGTTCATGAGTTT-3 ’ja 5′-AGGATAACAGATGAGTTAAG-3’;

SOD2

, 5′-AACCTCACATCAACGCGCAGAT-3’and 5′-TCAGTGCAGGCTGAAGAGCTAT-3 ’; katalaasia (

CAT

), 5′-GTGCATGCAGGACAATCAGG-3 ’ja 5′-GAATGCCCGCACCTGAGTAA-3’; peroxiredoxin 3 (

PRDX3

), 5′-GCCGTTGTCAATGGAGAGTTC-3 ’ja 5′-GCAAGATGGCTAAAGTGGGAA-3’;

PRDX5

, 5’GGTGGCCTGTCTGAGTGTTA-3 ’ja 5′-ACCACCATGGAGAACCTCTTG-3’; glutationiperoksidaasi 1 (

GPX1

), 5′-TTCCCGTGCAACCAGTTTG-3 ’ja 5′-TTCACCTCGCACTTCTCGAA-3’;

GPX4

, 5′-TCACCAAGTTCCTCATCGACA-3 ’ja 5′-GCCACACACTTGTGGAGCTA-3’; glutationireduktaasin (

GSR

), 5′-ACCCCGATGTATCACGCAGTTA-3 ’ja 5′-TGTCAAAGTCTGCCTTCGTTGC-3’; glutaredoksiinin 2 (

GLRX2

), 5′-GTATTGCTCTCCATCCTCCTCG-3 ’ja 5′-CTGGGAGCCTTTATGAGCGT-3’. tioredoksiini-2 (

TXN2

), 5′-CACACCACTGTGCGTGGAAA-3 ’ja 5′-ACTGTAACACCCAACCCAGC-3’; rintasyöpä resistance protein (

BCRP /ABCG2

), 5′-CACAACCATTGCATCTTGGCTG-3 ’ja 5′-TGAGAGATCGATGCCCTGCTTT-3’; monilääkeresistenssiin proteiini 1 (

MDR1 /ABCB1

), 5′-CTATGCTGGATGTTTCCGGT-3 ’ja 5′-TCTTCACCTGGCTCAGT-3’; monilääkeresistenssiin liittyvä proteiini 1 (

MRP1 /ABCC1

), 5′-AGCTTTATGCCTGGGAGCTGGC-3 ’ja 5′-CGGCAAATGTG- CACAAGGCCAC-3’;

MRP2 /ABCC2,

5′-GCTGCCACACTTCAGGCTCT-3 ’ja 5′-GGCAGCCAGCAGTGAAAAGC-3’;

MRP3 /ABCC3,

5′-ATACGCTCGCCACAGT-CCTT-3 ’ja 5′-GCTGGCCATGATGACCACAA-3’;

MRP4 /ABCC4

, 5′-CTTG- GATCGCAA-TACCCTTG-3 ’ja 5′-GACACCTCTCTTCTGCTTTG-3’;

MRP5 /ABCC5,

5′-CAGAGACCGTGAAGATTCCA-3 ’ja 5′-TTTGGAAGTAGTCCGGATGG-3’;

MRP6 /ABCC6,

5′-TGTGTGGCTCACCACGATG-3 ’ja 5′-CATAGGTAG- GTGGACAG-GTGG-3’; Orgaaninen kationikuljetusjärjestelmän uusia 1 (

OCTN1;

SLC22A4), 5′-GCTGTATGTCTTCACTGCTG-3 ’ja 5′-GGTGAGGATTCCAATCAGGA-3’;

OCTN2

(

SLC22A5

), 5′-ATTGTTGTGCCTTCCACTATC-3 ’ja 5′-GGTCATCCACAGCATTATGG-3’; monilääke ja toksiini puristamiseen kuljettaja 2 (

MATE2

;

SLC47A2

), 5′-TTCATTCCAGGACTTCCGGTG-3 ’ja 5′-AGGTGTGAGTGAGATGGATGG-3′; hypoksantiinifosforibosyylitransferaasin-1 (HPRT1), 5’-TGGCGTCGTGATTAGTGATG-3 ’ja 5′-GCTACAATGTG-ATGGCCTCC-3’.

Measurement singlettihappea

Solut ympättiin suojalasi astia (SPL Life science, Gyeonggi-do, Etelä-Korea) ja viljeltiin yön yli. Sen jälkeen, kun Pba-lasersäteilyn, solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 50 uM trans-1- (2’methoxyvinyl) pyreeni (Life Technologies) 30 minuutin ajan. Sillä ytimet värjäys, Hoechst 33342 (H342) lisättiin edellä astiat ja inkuboitiin 10 min. Green fluoresenssia singlettihappea havaittiin heti käyttäen LSM 710 -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Jena, Saksa) ja intensiteetit kvantitoitiin käyttäen ZEN2011 ohjelmisto (Carl Zeiss).

Measurement solunsisäisten ROS

Cellular ROS tasoilla tutkittiin käyttäen solun läpäisevä fluorogeenisen koetin, karboksi-H

2DCFDA. Solut ympättiin suojalasi pohja astia (SPL Life science) ja inkuboitiin vielä yön yli. Sen jälkeen, kun Pba-laser hoito, solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 30 uM karboksi-H

2DCFDA 30 min ajan 37 ° C: ssa. Sillä ytimet värjäys, H342 inkuboitiin 10 min. Sitten konfokaali kuvia otettiin ja vihreä fluoresoiva intensiteetti kvantifioitiin käyttäen LSM 710 -konfokaalimikroskoopilla ja ZEN2011 ohjelmistoja.

mittaus Pba kertymisen

Pba on fluorogeenisen aine; Tämän vuoksi tason solunsisäisen kertymisen Pba määritettiin mittaamalla punaisen fluoresenssin solussa. MDA-MB-231 ja HT29 kannessa lasilevyille inkuboitiin Pba 6 tuntia. Sitten Pba poistettiin ja PBS pesut seurasi. Voimakkuudet Pba punaisen fluoresenssin määrä määritettiin konfokaali kuvien ZEN2011 ohjelmistoa. Vaihtoehtoisena kvantifiointiin, solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (BD Biosciences) ja inkuboitiin Pba 6 tuntia. Kun solu pesun, Pba punainen fluoresenssi havaittiin käyttäen CellInsight Personal Cell Imager (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja intensiteetit kvantitoitiin CellInsight ohjelmisto (Thermo Fisher Scientific).

fluorometrinen määritys solunsisäisen PBA

solut 96-kuoppalevyille inkuboitiin Pba 6 tuntia ja sitten hajotettiin käyttämällä 1% SDS jälkeen PBS pestä. DMSO lisättiin solulysaateista liuottamiseksi solujen Pba ja mitattiin fluoresenssi-intensiteetti käyttämällä SpectraMax M5 on 415 nm Ex /673 nm Em.

Western blot-analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskurilla (50 mM Tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, ja 1% nonyyli phenoxypolyethoxylethanol 40), joka sisältää proteaasi-inhibiittori cocktail (Sigma-Aldrich). Sillä BCRP proteiini uuttamalla, 0,1% SDS: ää lisättiin RIPA-puskuria. Proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen DC-proteiinin määrityskittiä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteiini näytteet erotettiin elektroforeesilla 12% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Whatman, Dassel, Saksa). Sitten membraani blokattiin kuoritun maidon 5% tai 3% naudan seerumin albumiinia 1 tunnin ajan ja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa. Kemiluminesenssi kuvat otettiin kiinni käyttäen Fujifilm LAS-4000 mini Imager (Fujifilm, Tokio, Japani) ja intensiteetit kvantitoitiin vastaaviin ohjelmiston.

Virtaussytometria

NRFi-MDA-solut ympättiin 60 cm

2 ruokia tiheydellä 1 x 10

5 solua /syvennys ja viljeltiin yön yli. Sen jälkeen, kun Pba-lasersäteilyn, solut trypsinoitiin ja sentrifugoitiin 15000 rpm: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten, 2 x 10

5 solut siirrettiin 1,5 ml: n putkeen ja sentrifugoimalla 8000

g

5 min 4 ° C: ssa. Sitten 5 ui fluorokromilla konjugoitua anneksiini V (BioLegend, San Diego, CA, USA) ja 10 ui propidiumjodidia (PI, BioLegend) liuosta lisättiin kuhunkin putkeen ja inkuboitiin varovasti pyörteen. Soluja inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä ja sitten 400 ui anneksiini V: n sitoutumisen puskuria (BioLegend) lisättiin kuhunkin putkeen. Värjätään solut analysoitiin käyttäen Becton-Dickinson FACS Canto (SanJose, CA, USA) ja tiedot analysoitiin FACSDiva ohjelmisto (BD).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen merkittävyys määritettiin Student pariksi t-testiä seuraa tai yksisuuntaista varianssianalyysi (yksisuuntainen ANOVA), jota seurasi Student Newman-Keuls testi monimuuttujille käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston (La Jolla CA, USA).

tulokset

Pba sytotoksisuutta on parannettu

Nrf2

knockdown MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen

tutkiakseen osallistumista Nrf2 tehossa Pba-PDT rintasyöpä, perustimme

Nrf2

-knockdown rinsyöpäsolulinja in MDA- MB-231-soluja. Vakaa jotka ilmentävät epäspesifinen salattu RNA (sc-MDA) tai

Nrf2

erityisiä shRNA (NRF2i-MDA) saavutettiin alkaen puromysiiniselektion 4 viikon ajan. Ilmentymistasojen Nrf2 ja sen kohdegeenien arvioitiin näissä solulinjoissa. NRF2i-MDA-solut osoittivat 85%: n vähennys

Nrf2

mRNA ja huomattavasta laskusta ilmentymisen Nrf2 tavoitteiden

AKR1C1

ja

HO-1

(Fig. 1A). Western blot-analyysi osoitti, että proteiinit tasot Nrf2 ja AKR1C oleellisesti vähentynyt taintumisen soluissa (Kuva. 1 B). Nämä vahvistavat estämisen Nrf2 signaloinnin vakaa solulinjassa. Seuraavaksi tutkimme herkkyys

Nrf2

-knockdown MDA-MB-231-solujen Pba ja laser yhdistelmähoitoa. Ilman lasersäteily, inkubointi sc-MDA ja NRF2i-MDA-solujen Pba (0,025-2,5 ug /ml, 24 h), ei merkittävästi vaikuttanut solujen elinkykyä (Fig. 1 C). Samoin laser säteilytys ilman Pba inkubointia ei vaikuttanut solujen elävyyden (Fig. 1 D). Arvioida PDT herkkyys, solut säteilytetään 0,6-J /cm

2 laser inkubaation jälkeen Pba ja MTT-analyysi suoritettiin seuraavasti 18 h hyödyntämistä. Aluksi PDT vaikutus arvioitiin monipuolinen inkubaatioaikojen PBA. Inkubointi Pba (0,125 ug /ml) 2, 6, ja 18 h osoittivat samanlaisia ​​sytotoksisuutta sc kontrollisolut (Fig. 1 E). Tämän perusteella seurauksena 6 h-inkubointi Pba säilyivät myös tässä tutkimuksessa.

(A) Transcript tasot

Nrf2

,

AKR1C1

, ja

HO-1

mitattiin kontrolliryhmän (sc-MDA) ja

Nrf2

-knockdown soluja (NRF2i-MDA) käyttäen suhteellista kvantifiointia reaaliaikaista PCR. HPRT1 käytettiin housekeeping ohjaus geenin. Data edustaa suhteet suhteen sc-MDA ja raportoidaan keskiarvona ± standardipoikkeamat (SDS) 3 kokeen. (B) Proteiinin tasot Nrf2 ja AKR1C1 määritettiin Western blot -analyysillä, että sc-ohjaus ja NRF2i-MDA-soluja. (C) sc-MDA ja NRF2i-MDA-soluja inkuboitiin Pba (0-2,5 ug /ml) 6 tuntia, ja elävät solut kvantitoitiin käyttäen MTT-määritystä jälkeen 18 h elpymistä. (D) Soluja säteilytettiin laserilla ilman Pba, ja elävät solut kvantitoitiin käyttäen MTT-määritystä jälkeen 18 h elpymistä. (E) sc-MDA inkuboitiin Pba 2, 6, tai 18 h ja elinkelpoisten solujen määrä määritettiin sen jälkeen, kun laser-säteilytys. Tulokset edustavat prosenttiosuuksia suhteessa ajoneuvon ryhmään kunkin solulinjan ja raportoidaan keskiarvona ± SD 8 kaivojen.

MTT analyysissä Nrf2-MDA solut olivat suhteellisesti herkempiä Pba -pohjainen PDT: elävien solujen lukumäärä sen jälkeen, kun PDT oli pienempi NRF2i-MDA-soluja kuin kontrollisoluissa (Fig. 2A). Vastaavasti, kun kuolleiden solujen johdettu peptidaasi-aktiivisuus mitattiin keskipitkällä käyttäen CytoTox substraattia

Nrf2

pudotus solut osoittivat merkitsevästi korkea sytotoksisuus verrattuna sc-ohjaus (Fig. 2B).

( A) sc-ohjaus ja NRF2i-MDA-soluja esi-inkuboitiin Pba (0-2,5 ug /ml) 6 tunnin ajan, ja sitten säteilytettiin 0,6 J /cm

2 laser. Sitten MTT-analyysi suoritettiin jälkeen 18 h elpymistä. Tulokset edustavat prosenttiosuudet suhteessa ajoneuvon ryhmän kunkin solulinjan ja raportoidaan keskiarvona ± SD 8 kuoppaa.

AP 0,05 verrattuna sc-MDA ohjaus kullakin pitoisuudella Pba. (B) PDT-indusoidun sytotoksisuuden arvioitiin mittaamalla kuolleiden solujen proteaasiaktiivisuutta solussa elatusaine. Soluja inkuboitiin Pba (0,125 ja 0,25 ug /ml) 6 tuntia, minkä jälkeen lasersäteilyn, ja inkuboitiin 18 tuntia. Kuolleiden solujen johdettu proteaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen fluorogeenisen substraatin AAF-R110. Tulokset edustavat suhteellinen sytotoksisuuden suhteen ajoneuvon ryhmän kunkin solulinjan ja raportoidaan keskiarvona ± SD 8 kuoppaa.

AP 0,05 verrattuna kuhunkin sc-MDA ohjaus. (C) virtaussytometrianalyysin apoptoottisten ja nekroottisten solujen suoritettiin NRF2i-MDA-soluissa sen jälkeen, kun Pba-laserhoito. Soluja inkuboitiin PI ja anneksiini V, ja solujen populaatiot arvioitiin. (D) Pylväsdiagrammissa edustaa solupopulaation anneksiini V (AV) + /PI +, AV + /PI-, tai AV- /PI + vaihe kolmesta erillisestä kokeesta.

AP 0,05 verrattuna ilman laserin ohjaus-. (E) NRF2i-MDA solut ko-inkuboitiin Z-VAD-FMK (10 uM) tai necrostatin (Nec-1, 50 uM) ja Pba (0,125 ug /ml) 6 tuntia; sitten solut pestiin PBS: llä ja säteilytettiin laserilla. 18 tunnin kuluttua inkuboinnin elävät solut kvantitoitiin käyttäen MTT-määritystä. Tiedot ovat prosenttiosuuksia suhteessa kontrolli (ei PDT ja ajoneuvon käsittely), ja ne ilmoitetaan keskiarvona ± SD 8 kuoppaa.

AP 0,05 verrattuna kontrolliin.

PDT indusoi solukuoleman kautta apoptoottisten ja nekroottista reittejä [6], [40]. Seuraavaksi, jotta voidaan tunnistaa mekanismia solukuoleman mukana PDT-hoitoa

Nrf2

pudotus rintasyövän soluja, FACS-analyysi, jossa anneksiini V ja PI kaksinkertainen värjäys suoritettiin. NRF2i-MDA-soluja käsiteltiin PDT; välittömästi sen jälkeen, solut trypsinoitiin ja värjättiin anneksiini V (varhainen apoptoosin markkeri) ja PI (myöhäinen apoptoosin ja nekroosin merkki). Sen jälkeen Pba-laser yhdistelmähoito, suurin solupopulaatio siirtynyt apoptoottisten-nekroottinen vaiheessa (Fig. 2C). Kvantifiointi kokeellisen toistoja osoitti, että 16,7% soluista oli varhaisessa apoptoottinen vaiheessa (anneksiini V + /PI) ja 61,3% soluista oli myöhään apoptoottiset /nekroottinen vaihe (anneksiini V + /PI +). Vain 15,7% soluista oli ei-apoptoottiset ja ei-nekroottinen vaiheessa (Fig. 2D). Nämä osoittavat selvästi, että PDT indusoi solukuolemaa, johon prosessi apoptoosin ja kuolion. Koska vahvistuksen, kun soluja yhdessä inkuboitiin kaspaasi pan-estäjä Z-VAD-FMK (10 uM) ja PDT (Pba 0,125 ug /ml) prosentuaalinen elinkelpoisten solujen määrä nousi 63%: sta 80,1% (Fig. 2E ). Lisäksi inkubointi necrostatin (50 uM), joka on voimakas estäjä ohjelmoidut nekroottisen solukuoleman, korkea elinkelpoisten solujen määrä on 78,2%. Yhdessä saadut tulokset osoittavat, että

Nrf2

pudotus herkistyneet rintasyöpä MDA-MB-231-solujen Pba-pohjainen PDT, mikä parantaa solukuolema.

PDT-stimuloidun ROS: n syntyminen on kohonnut

Nrf2

knockdown MDA solujen

Pba-laser yhdistelmähoito tiedotteet singlettihappea solussa, ja tuloksena ROS on merkittävä tekijä PDT: n sytotoksisuuteen [5]. Siksi me seurataan PDT johdettuja singlettihappea tasoa molemmissa solulinjoissa. Soluja esikäsitellään Pba (2,5 ug /ml 6 h) oli säteilytetty 0,6-J /cm

2 laser, ja tasot singlettihappea määritettiin käyttäen trans-1- (2’methoxyvinyl) pyreenin, fluoresoiva väriaine, joka on spesifinen singlettihappea. Verrattuna hoitoon Pba pelkästään tai Lasersäteilytyksen vain, trans-1- (2’methoxyvinyl) pyreenin perustuvaa menetelmää osoitti, että Pba-laser yhdistelmä ryhmä näyttää parannetun fluoresoiva signaali solun sisällä (tuloksia ei esitetty), mikä vahvistaa kasvu singlettihapen upon PDT. Meidän alustava arviointi, inkubaatio trans-1- (2’methoxyvinyl) pyreenin 5 min, 30 min ja 50 min osoittivat samanlaisia ​​kasvu tasojen singlettihappea peräisin olevan fluorogeenisen pyreenin intensiteetti (Fig. 3A). Tämä vahvistaa, että singlettihappea johdettuja pyreenin fluoresenssi voidaan luotettavasti havaita näinä inkubointien aikoina; siis konfokaali määritys tehtiin 30 min inkubaation trans-1- (2’methoxyvinyl) pyreenin tutkimuksessamme. Vertaileva mittaus singlettihappea osoitti, että

Nrf2

-knockdown MDA-MB-231-solut tuottavat suurempia singlettihappea kuin kontrollisolut (Fig. 3B). Fluoresoivia signaaleita jaettiin sytoplasmassa sekä ytimen ja koko fluoresenssi-intensiteetti oli 1,5-kertaa suurempi pudotus soluissa kuin kontrollisoluissa. Näin ollen kokonaistaso ROS, joka seurattiin DCFDA, oli merkittävästi kohonnut käsittelyn jälkeen Pba-laser yhdistelmä molemmissa solulinjoissa; kuitenkin, kasvu oli suurempi NRF2i-MDA soluissa. Erityisesti käsittelyn jälkeen 2,5 ug /ml Pba ja laser säteilytys, kasvu ROS oli 4,6-kertainen

Nrf2

-knockdown solulinja kuin kontrolliryhmässä solulinjassa (Fig. 3C). Vastaavasti käsittelyn jälkeen alhainen pitoisuus Pba (0,125 ug /ml) ja laser-säteilytys, kasvu ROS oli 3,5-kertaa suurempi NRF2i-MDA-solut (Fig. 3d). Nämä tulokset viittaavat siihen, että nousu singlettihappea ja ROS parantaa herkkyyttä

Nrf2

-knockdown rintasyövän solujen PDT.

(A) sc-ohjaus Soluja inkuboitiin Pba 6 tuntia ja säteilytetään 0,6 J /cm

2 laser. Heti kun PDT, singletti happi herkkä trans-1- (2’methoxyvinyl) pyreenin lisättiin ja soluja inkuboitiin edelleen 5, 30, tai 50 min: n läsnä ollessa trans-1- (2’methoxyvinyl) pyreenin. Sitten confocal havainto tehtiin havaitsemaan fluorogeenisen värin muodostumista, joka on muodostettu reaktiossa singlettihappea.