Krooninen sairaus

tiivistelmä

metastasointiin on monivaiheinen prosessi, johon kasvaimen kasvua ja selviytymistä, liikkuvuuteen ja invaasio, ja myöhemmin proliferaation sopimattoman ympäristössä. Src-proteiini-tyrosiinikinaasi on liitetty monia biokemiallisia reittejä, jotka ohjaavat näiden käyttäytymistä. Vaikka Src itsessään on vain harvoin mutatoitunut ihmisen kasvaimissa, sen poikkeava toiminta on todettu erilaisissa syövissä ja ehdotti toimia barometri metastaattisen potentiaalia. Näiden ominaisuuksien mielessä, tutkimme Src sääntelyä rakenteellisia, entsymaattinen, ja ekspressiotasot funktiona asteittain invasiivisen eturauhassyövän solulinjoissa. Yllättäen molemmat yhteensä Src sisällön ja kinaasiaktiivisuutta lasku kasvaessa solulinjan aggressiivisuus, havainto, joka näyttää olevan ristiriidassa hyvin dokumentoitu rooli Src in signalointireittien että kasvua ja invaasiota. Emme kuitenkaan havaita suora korrelaatio Src

ominaisaktiivisuus

(yhteensä Src aktiivisuuden /yhteensä Src sisältö) ja metastaattinen aggressiivisuus, mahdollisesti viittaa siihen, että erittäin aggressiivinen solulinjoissa, avain signalointi entsyymit ovat globaalisti palvelukseen ajaa syöpä fenotyyppi. Lisäksi, vaikka odotettu tehostettu fosforylaatiota Src at Tyr-416 (aktivointikohdan) on läsnä kaikkein aggressiivinen eturauhassyöpä solulinjoissa, odottamattoman suuri fosforylaatio tasoilta Tyr-527 estävä site havaitaan samoin. Jälkimmäinen sijaan edustaja estetty entsyymi, on enemmän osoitus pohjustettu Src vastaavat paikallisiin fosforyloidun sidoskumppanien.

Citation: Xu W, ALLBRITTON N, Lawrence DS (2012) Src Kinase asetuksen Asteittain kohdunkaulan syöpä. PLoS ONE 7 (11): e48867. doi: 10,1371 /journal.pone.0048867

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 20 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 01 lokakuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää 5R01CA140173 DSL. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Src proteiinikinaasi on perustajajäsen Src-alaryhmä nonreceptor proteiinityrosiinikinaaseja. Katalyyttinen aktiivisuus näitä entsyymejä säädellään osittain kautta fosforylaatio [1]. Erityisesti täysi aktivointi Src riippuu fosforylaation Tyr-416. Sen sijaan, Tyr-527 fosforylaatio estää katalyyttinen aktiivisuus, edistämällä molekyylinsisäinen vuorovaikutus entsyymin SH2 (ja SH3) verkkotunnuksia. Itse asiassa taso fosforyloidun Tyr-527, joka käy ilmi Western blot analyysi tai immunovärjäystä, otetaan usein mittana aktiivinen entsyymi. Esimerkiksi Src-kinaasiaktiivisuutta oli kuitenkin säädellään ylöspäin hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä arvioituna fosforyloitua Tyr-416 sisältö [2]. Tämä tulkinta on täynnä vaaroja. Vaikka alhainen

in vitro

katalyyttinen aktiivisuus pTyr-527 Src on kiistaton, vastaavaa toimintaa saman entsyymin biologisessa ympäristössä on epävarmempaa. Kun vuorovaikutus SH2 tai SH3-domeenien Src-entsyymin muiden proteiinien kanssa, inhiboiva pTyr-527 tähteen vapautuu, joka tuottaa täysin aktiivinen pTyr-527 Src [3] – [5]. Itse asiassa tämä prosessi on toisteta lyhyen pTyr sisältävät peptidit, että sitoutumisen Src: n SH2 domain häiritä intramolekulaarinen estävää pTyr-527 vuorovaikutuksen ja siten aktivoida kinaasitoiminta [6] – [8]. Niinpä pTyr-527 tila ei ole välttämättä osoitus inhiboidusta entsyymin

sinänsä

, vaan entsyymin, joka on mahdollisesti pohjustettu ja valmiina ”päällä” vuorovaikutuksella sopivan lisävarusteen proteiinia. Lyhyesti, korkea pTyr-527 Src tasoilla voisi edustaa estyy entsyymi, aktivoitu entsyymi tai jonkin variantti siltä väliltä. Tämä epävarmuus korostaa tarvetta näyte Src

suoraan

kautta sen kyky fosforyloida kohdesubstraattiin. Lisäksi fosforylaation, Src-kinaasi säätelee proteiinitasolla kautta ubikitinaation ja siten hajoamista proteasomin-välitteisen reitin [9]. Näin ollen, hyvin samalla tavalla kuin fosforylaatio tila on kyseenalainen enne kinaasiaktiivisuuden, mRNA-tasot eivät välttämättä ole osoitus Src sisältöä tai toimintaa.

Src on vahvasti osallisena polkuja, jotka ohjaavat monet ominaisuuden solu käyttäytymistä vastaava kasvaimen invaasion ja etenemiseen. Esimerkiksi Src välittää tarttuvuus ja solun tukirangan dynamiikkaa ja siten ohjaa solumigraatio [10], [11]. Invasiivinen siirtymä täydennetty Src-riippuvaa epiteelisolujen-mesenkymaalitransitioon [12] ja aktivointi matriisin hajottavien proteaasien [13] – [16]. Src fosforylaatio kaspaasin 8 on antiapoptoottisten [17], kun taas Src-välitteinen STAT aktivointi edistää solujen kasvua ja selviytymistä [9]. Lyhyesti, Src on osallisena lukuisia reittejä, joita säädellään ylöspäin monia kaikkein aggressiivinen ja invasiivisen syövän muotoja. Koska Src on vain harvoin mutatoitunut ihmisen kasvaimissa, poikkeava Src käyttäytyminen on useimmiten seurausta sen epänormaali sääntelyä. Olemme tutkineet Src sääntelyä rakenteellisia, katalyyttinen, ja ekspressiotasot poikki alusta eturauhassyövän solulinjoissa, jotka vaihtelevat käyttäytymistä noninvasive erittäin invasiivisia ja androgeeniriippuvaisen androgeenin riippumaton. Yllättäen huomasimme, että Src katalyyttinen aktiivisuus ja proteiinin tasot vähensi kaikkein aggressiivinen solulinjat. Sitä vastoin nämä aggressiiviset solulinjat osoittavat korkeaa Src spesifinen aktiivisuus ja parantaakseen fosforylaation Tyr-527 (ns inhiboiva site) suhteessa niiden vähemmän aggressiivisia kanssa. Näitä tuloksia käsitellään yhteydessä mekanismin Src-vaikutuksen erittäin proliferatiivisen ympäristöissä.

Tulokset

Suunnittelu ja synteesi Src Sensor

Perustuu osittain on Src alustalle sekvenssin identifioitu suuntautunut peptidi kirjasto [18], rakensimme fluorofori-merkitystä sekvenssi: 5-FAM-Orn (Ac) Glu-Glu-Glu-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-Orn ( ac) amidi (1), jossa Tyr on paikalla fosforylaation. Lisäksi, ornitiinin (Orn) tähteet asetettiin kuhunkin päähän peptidisekvenssi, siinä tapauksessa, että peptidi osoittautui näyttää huono selektiivisyys Src verrattuna muihin proteiinikinaaseihin. Olemme aiemmin osoittaneet, että sivuketjun muuttaminen aktiivisen suunnatun peptidejä, joilla on luonnotonta substituentit voivat dramaattisesti parantaa selektiivisyyttä kohteena proteiinikinaasin (

vide infra

) [19] – [25]. Sekä ei-fosforyloitu ja fosforyloidun muodot [5-FAM-Orn (Ac) Glu-Glu-Glu-Ile-pTyr-Gly-Glu-Phe-Orn (Ac) amidin (2)] peptidin valmistettiin kautta kiinteän faasin peptidisynteesin. 5-FAM (5-karboksifluoreseiinin) valittiin fluoroforin substraatin ja tuotteen havaitsemista LIF.

erottaminen ei-fosforyloidun substraatin ja fosforyloidun tuotteen CE-LIF on esitetty kuviossa. 1A. 01:01 seos peptidien ladattiin kapillaarin. Alle erotusolosuhteita kuvattu Materiaalit ja menetelmät, alustan peptidi 1 purkautuu 240 s, kun taas fosforyloitu tuote 2 näkyy 290 sekuntia. Kasvuun jälkimmäisen seurattiin, kuten ajan funktiona, inkuboimalla substraatti (1), jossa aktiivinen Src. 290 s huippu vahvistettiin olevan fosforyloitu tuote pisteväkevöimällä synteettisellä fosfo-peptidin 2. kinetiikka fosforylaatio saatiin arvioimalla talteen ajankohtana näytteissä CE-LIF ja määrän laajuus fosforylaation kautta integrointi eri piikkien. Peptidi 1 fosforylaatio on oleellisesti mennyt loppuun 3 min määritysolosuhteissa, että käytetään puhdasta Src-entsyymiä (Fig. 1 B). Sitä vastoin myöhemmissä kokeissa solulysaateista (

vide infra

) edetä enemmän verkkaiseen tahtiin. Jälkimmäisessä tapauksessa, alkunopeus kinetiikka ( 10% peptidin fosforylaatio) hankittiin 10 min solulysaatin inkuboinnin.

(a) CE-LIF erottaminen ja visualisointi Src-peptidin alustan 1 ja sen kemiallisesti syntetisoidaan fosforyloitua vastine 2. (b) Src-katalysoitu fosforylaation peptidi 1: n ajan funktiona määritettiin CE-LIF.

vakaus Src Kinase Peptide Substrate 1 Prostate solulysaateista

peptidit yleisesti kärsivät proteaasi-katalysoidun hajoaminen soluissa sekä solulysaateista. Näin ollen, ennen kuin tutkitaan Src-katalysoitu fosforylaation peptidi 1 lysaateilla, tarkkailtiin vakautta peptidin ajan funktiona. Solut hajotettiin käyttämällä Piercen M-PER nisäkkäiden lyysipuskuria, ja ilman ATP: n ja Mg

2+ (eli ei havaittavissa kinaasiaktiivisuuden), lysaatti lisättiin peptidiin 1. Ainoastaan ​​noin 10% peptidin hajoaa 1 h kuluttua (taulukko S1). Koska fosforylaation nopeus mitataan 10 minuutin inkubaation (Fig. S1), peptidi on riittävän vakaa tarpeisiimme.

Arvio Src Aktiivisuus Eturauhassolupinnan Line lysaatit

Alkuperäiset tutkimuksemme keskittyy ei-invasiivisia kuolemattomaksi normaalin eturauhasen epiteelisolujen linjat PZ-HPV-7 ja RWPE1 ja erittäin invasiivinen CaP solulinjoja DU145 ja PC3. Tutkimme myös Src-vaikutuksen ei-metastasoitunut CWR22Rv1 solulinjan, jolla on androgen riippumaton kasvu, joka on ominainen käyttäytyminen pitkälle CaP [26] korreloi Src [2]. Arvioimme alkunopeusvalinta kinetiikka (ts 10% tuotteen muodostumisen) peptidin fosforylaation (kuvio. S1) ja olivat hämmästyneitä siitä, että Src kinaasiaktiivisuutta (funktiona kokonaisproteiinia ote määrä) on huomattavasti alhaisempi aggressiivinen eturauhassyöpä solulinjoja (CWR22Rv1, DU145 ja PC3) kuin ei-syöpä eturauhasen solulinjoissa (PZ-HPV-7 ja RWPE1) (Fig. 2; harmaat palkit; P 0,001). Tämä yleinen suuntaus on ristiriidassa yleisen käsityksen, että korkea Src aktiivisuus korreloi eturauhasen solulinjaan aggressiivisuus (ts invasiivisia käyttäytyminen ja androgeenista riippumattoman kasvun). Aiemmat raportit ovat todenneet, että korkea pTyr-416 ovat läsnä kaikkein aggressiivinen korkit ja on oletettu, koko kirjallisuudesta, että pTyr-416 ja Src-vaikutuksen suoraan korreloivat keskenään. Yksi mahdollinen johtopäätös peräisin tietomme on, että yleisesti hyväksytty käsitys, että pTyr-416 tasot toimivat barometri Src toiminta on viallinen. Olemme kuitenkin tutkineet, voisiko olla olemassa vaihtoehtoisia selityksiä odottamaton suhdetta Src-vaikutuksen ja solulinjan aggressiivisuus. Yksi mahdollisuus on, että Src substraatti 1 fosforyloituu muita proteiinityrosiinikinaaseja tehden siten ilmeinen käänteinen suhde Src-vaikutuksen ja solujen aggressiivisuus harhaanjohtavaa.

Harmaat palkit fosforylaatioon määriä peptidin 1 kokosolulysaateista (normalisoitu kokonaisproteiinista uutetta määrä). Valkoiset pylväät ovat fosforylaatio hinnat solulysaateista takia Src yksin vähentämisen jälkeen ei-Src tausta fosforylaation 1. Vertailu syöpäsolujen (PZ-HPV-7, RPWE1) ja aggressiivinen syöpä solulinjoja (CWR22Rv1, DU145, PC3) osoitti merkittävästi alentuneet Src-kinaasiaktiivisuutta, joka liittyy myöhemmin (p 0,001). Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena. Virhe palkit ovat SEM.

arviointi valikoivuus peptidi 1 Src in eturauhasen solulinjoihin

Tutkimme Src-selektiivisyys 1 käyttäen CaP solulysaateista köyhdytettyä Src (kuvio . S2). Vaikka Src-vapaa solulysaateista kykenevät fosforyloimaan peptidi 1, he tekevät niin paljon vähäisemmässä määrin (alle 30%) kuin kokosolulysaateista sisältävän Src (Fig. 2, valkoiset pylväät). Kontaminoivat tyrosiinikinaasit, jotka voivat olla vastuussa alhainen peptidi 1 fosforylaation puuttuessa Src voi olla yksi tai useampi kahdeksasta muiden jäsenten Src-ryhmän kinaasien (SKF). Itse asiassa monet SFK perheenjäsenet, kuten Fyn, Brk, Lyn Lck ja kyllä ​​tiedetään esittää eturauhasen solulinjoissa [27]. Kun otetaan kuitenkin huomioon suhteellisen vaatimaton taso peptidi 1 fosforylaatiota Src-vapaa lysaatit, päätimme, että peptidi 1 on, meidän tämänhetkisiä tarpeita, riittävän Src valikoiva.

arvioitiin myös kyky Src peptidi 1 /CE-LIF menetelmä havaita Src-vaikutuksen käyttämällä kahden tunnetun Src-inhibiittorit. Imatinibi (markkinoidaan Gleevec), jota käytetään kroonisen myelooisen leukemian ja muiden syöpien, on Abl-estäjä kanssa osoitti heikko anti-Src-vaikutuksen. Imatinibi estää kinaasiaktiivisuutta toimimalla kilpaileva estäjä ATP. Kuten imatinibi saracatinib (AZD0530) on kilpaileva estäjä ATP, mutta näyttää erittäin selektiivisesti ja vankka vahvuus, Src. Esimerkiksi

IC

50-arvot imatinibin ja saracatinib yksittäisiä Src entsyymiä 24,4 uM [28] ja 2,7 nM [29], tässä järjestyksessä. Käyttämällä DU145 Solulysaattien, huomasimme, että voimakas Src-estäjällä saracatinib lohkot peptidi 1 fosforylaatiomallissa submikromo- laarisena

IC

50 (0,35 ± 0,08 uM), kun taas vastaavasti huono Src-estäjällä imatinibi näyttää

IC

50, joka on yli 100 uM (kuvio. S3). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​käsitystä, esimerkkinä Src Depleetiokokeita että Src peptidi 1 /CE-LIF menetelmä toimii tehokkaana ja selektiivinen Src-vaikutuksen havaitsemiseen modality. Src-kinaasiaktiivisuutta arvioitiin myös elävien yksittäiset solut, sekä puuttuessa ja läsnä imatinibin ja saracatinib (Fig. S3).

src eksressoitumistasojen ja fosforylaatio Status eturauhasen solulinjoihin

src aktiivisuus on suurempi kuin aggressiivinen solulinjoissa ja pienempi aggressiivinen solulinjoissa (Fig. 2), joka on ristiriidassa yleisen käsityksen, että Src on avainasemassa karsinogeneesis-, etäpesäkkeitä, ja siirtyminen androgeenisäädellyn itsenäinen valtio. Kuitenkin se tapahtui meille, että koko Src sisältö voi vaihdella yhdestä solulinjasta toiseen, joka voisi ilmeinen (mutta harhaanjohtava) käänteinen suhde Src-vaikutuksen ja CaP aggressiivisuus.

Src pitoisuus kvantitoitiin western blot analyysi (Fig. 3A) ja normalisoitiin suhteessa a-tubuliinia. Olemme havainneet, että invasiivinen solulinjat, sekä androgeenistä riippumaton solulinja, näyttää vähemmän Src kuin vastaava ei-invasiivisia, androgeeniriippuvainen solulinjojen (Fig. 3B, p 0,001). Näiden tietojen kädessä, me myöhemmin piirretty Src ominaisaktiivisuus (eli yhteensä Src-vaikutuksen /yhteensä Src pitoisuus) vs. solulinjassa aggressiivisuus. Jälkimmäinen paljastaa Src spesifinen aktiivisuus on merkitsevästi korkeampi aggressiivinen solulinjoissa (CWR22Rv1, DU145, PC3) kuin ei-aggressiivinen /normaali solulinjojen (PZ-HPV-7, RWPE1) (Fig. 4, p = 0,0015).

(a) Prostate solulysaatit testattiin täydellistä Src, pY416 Src ja pY527 Src, jossa α-tubuliinin käytettiin lastaus ohjaus. (B) intensiteetit kunkin kaistan päässä Western blot mitattiin ja normalisoitiin vastaavaksi α-tubuliinin ohjaus, ja verrataan sitten solulinja RWPE1 (RWPE1 kuin 1). Vertailu ei-syöpä (PZ-HPV-7, RPWE1) ja aggressiivinen syöpä solulinjoja (CWR22Rv1, DU145, PC3) osoitti merkittävää alentuneet Src ilmentymisen jälkimmäisessä (p 0,001). Tiedot edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen ja ovat keskiarvoa ± SEM.

Src spesifinen aktiivisuus laskettiin jakamalla Src-vaikutuksen (Fig. 2), jotka ovat koko Src proteiinipitoisuuden (Fig. 3). Src spesifinen aktiivisuus on merkittävästi korkeampi aggressiivinen kuin ei-syöpäsolujen linjojen (P 0,0001). Virhe palkit ovat SEM.

Lisäksi tutkittiin mitä suhde, mahdollisesti välillä tasojen pTyr-416 ja pTyr-527 Src ja Src spesifinen aktiivisuus. Fosforylaatio 416 tarvitaan täydelliseen aktivaatioon Src-vaikutuksen taas fosforylaation Tyr-527 on inhiboiva johtuen muodostumista molekyylinsisäisen vuorovaikutusta, joka estää Src-kinaasiaktiivisuutta [1]. pTyr-416 murto tasot (pTyr-416 /yhteensä Src pitoisuus) (Kuva. 5A) korreloi erityisiä Src-vaikutuksen (Fig. 4) (r = 0,89), mikä viittaa siihen, että pTyr-416 sisältö on hyvä mittari Src-vaikutuksen ja solulinjaa aggressiivisuus (Kuva. 5A). Kuitenkin kuten alla, tämä korrelaatio ei ulotu kaikkiin solulinjoihin. Sen sijaan pTyr-527 sisältö, oletettu indikaattori estetty Src, on voimakkaampi aggressiivinen solulinjoissa (kuvio. 5B). Tämä havainto on ristiriidassa yleisen käsityksen, että aktivoitu Src korreloi solulinjan aggressiivisuus. Lyhyesti, fosforylaatiota asema Tyr-416 ja Tyr-527, yhdessä, eivät anna yhdenmukaista kuvaa Src-vaikutuksen yli joukko CaP solulinjoissa.

(a) pY416 tasot olivat peräisin kaistaintensiteettien Länsi blotit (Fig. 3A), normalisoitu vastaavaksi α-tubuliinin ohjaus, ja sitten verrataan solulinjaan RWPE1 (RWPE1 kuin 1). (B) pY527 tasot olivat peräisin juovien voimakkuudet on Western blot (kuvio. 3A), normalisoitu vastaavaksi α-tubuliinin ohjaus, ja verrataan sitten solulinja RWPE1 (RWPE1 kuin 1). Tiedot edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen, ja on esitetty keskiarvona ± SEM. p-arvot on osoitettu.

Src Activity, Expression tasot, ja fosforylaatio Status RWPE1-Derived eturauhasen solulinjojen

Lisäksi standardin eturauhasen solulinjojen arvioitiin kuviossa. 2, 3, 4, ja 5, arvioimme useita solulinjoja, jotka on johdettu altistuminen RWPE1 N-metyyli-N-nitrosourea. Solulinjoja lisätä invasiivisuus on tunnistettu sarjan kautta

in vitro

ja

in vivo

valinta kokeet: RWPE1, WPE1-NA22, WPE1-NB14, WPE1-NB11 ja WPE1-NB26 [ ,,,0],30]. Tämä sarja näyttää Src-kinaasiaktiivisuutta ja aggressiivisuus korrelaatiot, jotka ovat analogisia edellä kuvatun standardin eturauhasen solulinjoissa. Ensimmäinen, yhteensä Src-vaikutuksen näyttää merkittävää laskeva (p = 0,018) funktiona kasvava solulinja aggressiivisuus (Fig. 6A). Toinen, lukuun ottamatta WPE1-NB26 yhteensä Src sisältö myös pienenee lineaarisesti (p = 0,01) funktiona solulinjan aggressiivisuuden (Fig. 6B ja kuvio. S5). Kolmanneksi, jälleen lukuun ottamatta WPE1-NB26 erityisiä Src-kinaasiaktiivisuutta (Src-kinaasiaktiivisuutta /yhteensä Src sisältö) näyttää merkittävää lineaarista kasvava suuntaus (p 0,001) funktiona kasvava solulinja aggressiivisuus (Fig. 6C). Lopuksi, jyrkässä ristiriidassa näkyvät tulokset kuvassa. 5A, korrelaatio pTyr-416 murto tasot (pTyr-416 /yhteensä Src sisältö) ja Src spesifinen aktiivisuus on heikko (r = 0,58), mikä viittaa siihen, että se on vaarallista luottaa yksinomaan pTyr-416 sisältö barometri Src-vaikutuksen (Fig. 6D). Mielenkiintoista on, että meillä ei havaita erittäin voimakas korrelaatio suhteessa murto pTyr527 sisällön ja tietyn Src-vaikutuksen RWPE1 sarjassa solulinjoja (Fig. S6, r = 0,99), joka on samanlainen kuin kuvassa. 5B (r = 0,88).

lisääminen invasiivinen kyky on piirretty x-akselin. (A) Harmaat palkit ovat fosforylaatioon määriä peptidin 1 kokosolulysaateista (normalisoitu proteiinin kokonaismäärästä). Valkoiset pylväät ovat fosforylaatio hinnat solulysaateista takia Src yksin vähentämisen jälkeen ei-Src tausta fosforylaatioon 1. (b) Yhteensä Src määritettyyn western blot-analyysi (kuvio. S5) (c) Src spesifinen aktiivisuus määritettynä Mitattu Src-vaikutuksen (Fig. 6A) jaettuna yhteensä Src valkuaispitoisuus (Fig. 6B). (D) pY416 tasot olivat peräisin juovien voimakkuudet on Western blot (kuvio. S4), normalisoitu vastaava α-tubuliinin ohjaus, ja verrataan sitten solulinja RWPE1 (RWPE1 kuin 1). Tiedot edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen ja esitetty keskimääräisinä SEM.

Keskustelu

Generic ELISA- [31] ja γ-

32P-ATP-pohjainen [32] menetelmiä ovat kaksi yleisintä strategioita käytetään arvioitaessa aktiivisuus puhdasta entsyymiä alle

in vitro

olosuhteissa. Lisäksi, fluorofori-leimatun peptidit [33] – [37], samoin kuin GFP-proteiinien [38], [39], on kuvattu, että näytteille fluoresoiva vaste fosforylaatioon, jolloin Src-kinaasiaktiivisuutta on jatkuvasti näytteitä elävissä soluissa kautta fluoresenssimikroskopialla. Vaikka nämä tekniikat toimittaa ikkunan biokemiallinen perusta solun käyttäytymistä, ne ovat vähemmän helposti käännetään rutiini, cross-platform metodologia (puhdasta entsyymiä, solulysaateista, ja ehjät solut), jotka voidaan myös soveltaa rajallinen määrä ensiöparit käytettävissä potilaan näytteissä. Tässä suhteessa, CE on ultraherkät menetelmä, jolla pieniä määriä analyytit erotetaan ja määrällisesti kautta soveltaminen sähkökentän ja sen jälkeen sen havaitsemiseksi analyyttien [40]. Koska Src katalysoi siirtoa γ-fosforyyliryhmä ATP on tyrosiinitähde substraatin, maksu ero substraatin ja tuotteen pitäisi mahdollistaa näiden lajien voidaan erottaa, visualisoida ja kvantifioida kautta muutos elektroforeettisen liikkuvuuden [41 ] – [43]. Todellakin, fluoreseiini-substituoidun Src alustan 1 ja sen fosforyloidun vastine erottuvat helposti altistettaessa sekä puhtaisiin Src (Fig. 1) ja eturauhasen solulysaateista (kuvio. 2). Jälkimmäisessä tapauksessa, lähes kaikissa solulinjoissa, valtaosa havaittu fosfotransferaasiaktii- aktiivisuuden ( 70%) johtuu Src (Fig. 2). CE määritys edelleen validoitu tarkastelemalla Src estävä vaikutus saracatinib ja imatinibin, jos viimeksi mainittu on neljä kertaluokkaa pienempi (

IC

50 = 24,4 uM) kuin entinen (

IC

50 = 2,7 nM) vastaan ​​puhdasta entsyymiä [28], [29]. Yhdenmukaisesti näiden tulosten, havaitsimme ero estotehokkuuden välillä saracatinib (

IC

50 = 0,35 ± 0,08 uM) ja imatinibi ( 100 uM) ja Src in DU145 solulysaateista analoginen raportoitu ero alle yksinkertainen puskuria olosuhteissa. Lopuksi tutkimme, CE-strategiaa voitaisiin käyttää tarkkailemaan Src-vaikutuksen ja eston yksittäiset solut (Fig. S4). DU145-soluja mikroinjektoidaan, jossa Src alustan 1, soluja sitten inkuboitiin 2 min, yksittäin hajotettiin käyttämällä fokusoitua Nd: YAG-laserilla, ja sitten lysaatti jokainen solu erikseen elektroforeesi. Muodostumista Phosphopeptide tuotteen havaittiin soluista, joita ei ole esi-inkuboitiin estäjän (14 ± 2% koko peptidin pitoisuus) tai soluissa esi-inkuboitu 1 uM heikko estäjä imatinibin (

IC

50 100 uM, 15 ± 3% koko peptidin pitoisuus). Sitä vastoin ei-peptidi fosforylaatio ei havaittu soluissa, jotka oli esi-inkuboitu 1 uM estäjä saracatinib (

IC

50 = 0,35 ± 0,08 uM).

kyky näyte Src-vaikutuksen käyttäen puhdistettua entsyymiä, solulysaateista, ja yksittäiset solut, tutkimme Src aktiivisuutta noninvasive, invasiivisia, ja androgeeni-riippumaton eturauhasen solulinjoissa (Fig. 2). Yllättäen huomasimme, että Src fosfotransferaasigeeni aktiivisuus on korkein noninvasive solulinjoissa, mikä näyttää olevan vastoin yleistä käsitystä, että Src on tärkeä rooli mahdollistamisessa metastaattista potentiaalia ja siirtymistä ja ylläpitoon androgeenista riippumattoman kasvun eturauhassyöpää. Kuitenkin se tapahtui meille, että Src tasot voivat vaihdella eri solulinjoissa. Jälleen kerran, yllättäen, olemme havainneet, että invasiivisia ja androgeenistä riippumattomat solulinjat osoittavat huomattavasti vähemmän Src kuin niiden ei-invasiivisia androgeeniriippuvaisissa kollegansa (Fig. 3). Toisaalta, suhde Src toiminnan Src sisältöä (spesifinen aktiivisuus), paljasti, että aggressiivinen ja androgeenistä riippumattomat solulinjoissa näyttää suuremman Src spesifinen aktiivisuus kuin ei-aggressiivinen androgeeniriippuvaisissa solulinjojen (Fig. 4). Lisäksi tämä suuntaus pätee sarjan N-metyyli-N-nitrosourea johdetut solulinjat RWPE1 (alkaen reunavyöhykkeen normaalin ihmisen eturauhasen). Erityisesti havaitsimme väheni yhteensä Src-vaikutuksen ja Src sisältöä, ja lisääntynyt Src spesifinen aktiivisuus funktiona kasvava solulinja invasiivisuus (RWPE1 WPE1-NA22 WPE1-NB14 WPE1-B11) (Fig. 6A-B). Teemme huomata yksi poikkeus korrelaatio, eli eniten aggressiivinen RWPE1 johdettu solulinja, WPE1-NB26. Jälkimmäinen on saanut paljon huomiota, koska sen erittäin invasiivisia fenotyyppi [30], [44] – [53]. Käyttämällä koko Src sisältöä ja tiettyä toimintaa toimenpiteitä aggressiivisuus, olisimme annetaan ei-invasiivisia fenotyyppi WPE1-NB26 (eli samanlainen kuin vanhemman solulinjan RWPE1). Koska tämä on selvästi virheellinen, aggressiivisuus liittyvät tähän N-metyyli-N-nitrosourea solulinja saattaa johtua ainakin osittain mekanismeista, jotka ovat riippumattomia Src signalointi.

Miksi koko src pitoisuus laski eniten aggressiivinen solulinjat? Yksi mahdollinen selitys on tunnetun herkkyyden aktivoitua Src, suhteessa ei-aktivoidun vastine, ubikitiinille välittämää hajoaminen [54], [55]. Näin ollen solulinjoja, jotka ovat voimakkaassa aktivoida Src paine voisi ironisesti näyttää alempi Src pitoisuus kuin vähemmän aggressiivisia soluja. Lisäksi kaksi viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen mikro-RNA (MIR): sta riippuva mekanismi, jolla Src tasot ovat säänneltyjä. Bhatnagar

et al

ovat osoittaneet, että mitä enemmän invasiivisia eturauhasen solulinja korkeampi miR-205 taso [48]. miR-205 tiedetään säätelevät vaimentaen Src ilmaisun [56]. Meidän havainto, että Src tasot ovat alhaisemmat aggressiivisia eturauhasen solulinjoissa on yhdenmukainen sekä ubikitiinillä ja miRNA mekanismeja. Lisäksi, mitä suurempi spesifinen aktiivisuus aggressiivinen solulinjoissa osoittaa, että näissä soluissa, mutta on vähemmän Src läsnä, suurempi osa se sijaitsee aktiivisessa muodossa.

Src fosforylaation tila on oletettu korreloivan toimintaa, jossa pTyr-416 otetaan aktiivisina ja pTyr-527 ei-aktiiviseksi muotoja entsyymin. Tässä mielessä, mittasimme tasoja pTyr-416 kautta Western blot-analyysi ja piirtää pTyr-416 Src /yhteensä Src (murto pTyr-416) versus solulinjassa aggressiivisuus. Kuten on ilmeistä kuviosta. 5A ja 6D, erittäin aggressiivinen solulinjoja näyttää liian korkeaa suhde pTyr-416 yhteensä Src kuin niiden aggressiiviset kollegansa. Tämä vastaa tuoreessa raportissa Evansin ja kollegat, jotka osoittavat Src-estäjällä saracatinib on tehokkain vastaan ​​eturauhasen solulinjoja, joilla on korkein suhde aktiivisten-to-total Src [57]. Jälkimmäisessä tutkimuksessa, ”aktiivinen Src” otettiin olla pTyr-416 Src. Nämä tutkijat kertoi myös, että solut, jolla on pienin (pTyr-416 Src /yhteensä Src) suhteet ilmaista kaikkein Src.

Korkean pTyr-527 /yhteensä Src suhteen tulisi olla, mukaan kuin perinteinen, osoittaa yleinen alempi osa aktiivista entsyymiä. Olemme kuitenkin huomanneet, että tämä suhde on suurempi aggressiivinen linjat sekä (Fig. 5B ja kuvio. S5). Yksi mahdollinen selitys tälle odottamaton tulos on tiedossa kyky pTyr-527 Src entsyymi aktivoitumaan fosforyloidut peptidit ja proteiinit. Lyhyesti, vaikka pTyr-527 Src on aktiivinen sen eristetty, puhdistettu muoto, päinvastainen voi olla totta, kun potentiaalisia fosforyloidun sitovia kumppaneita ovat läsnä. Näin ollen voimme päätellä, että pTyr-527 Src taso ei ole käyttökelpoinen mittari aktiivinen Src ja pikemminkin saattaa itse asiassa olla sopivampi prognosticator Src toimintaa. Sivuhuomautuksena voidaan todeta, että Länsi-blotit Tässä tutkimuksessa käytetyt havaita Src fosforylaatioon tila käytetään suuria solupopulaatioiden. Kuitenkin viimeaikaiset edistysaskeleet vetämänä CE tekniikkaa, mahdollistavat fosforylaatiotilaa proteiinien ratkaisemiseksi ja havaita niin vähän kuin 25 soluja [58]. Todellakin, CE kuin mikromitta- Western blotting järjestelmä on saanut merkittävää huomiota [59]. Näin ollen se voi lopulta olla mahdollista samanaikaisesti näyte tasot erityisten entsyymin fosfo-isoformeja sekä entsyymin aktiivisuutta muutaman solun avulla CE tekniikkaa.

On ollut ja on edelleen herculean vaivaa tunnistaa CaP markkereita, jotka korreloivat periytyvyys sekä hankittu somaattisista mutaatioista. Esimerkiksi yli 40 herkkyys loci on osoitettu noin 25% periytyviä riskin. [60] Lisäksi sekä koodausalue ja koko genomin analyysit on tehty tunnistamaan geneettisen harhautumista jotka korreloivat somaattisesti hankittu korkki. Esimerkiksi äskettäin koko genomin tutkimus tehtiin käyttämällä kasvaimen näytteitä potilaista, joilla on aggressiivisia CaP. Nämä tutkijat tunnistettu lähes 4000 somaattisten emäksen mutaatiot ja 90 kromosomi uudelleenjärjestelyt per kasvain, sekä korrelaatioita joukko uudelleenjärjestely raja-arvot ja erilaisia ​​epigeneettiset markkaa. [61] Kirjoittajat toteavat, että ”kirjo mekanismien suoraan eturauhassyövän synnyssä ja etenemisessä” [61] ja näin ollen mikään yksittäinen muutos entsyymiaktiivisuuden on vastuussa puhkeamiseen, etenemiseen ja /tai aggressiivisuus tauti. Esimerkiksi koko genomin uudelleenjärjestelyä vallalla Cap arvellaan iskeytymistä poistamista ja monistuminen joukko geenejä, jotka koodaavat tunnettuja tuumorisuppressorien ja onkogeenien vastaavasti. Siitä huolimatta meidän tiedot eivät viittaa siihen, että Src spesifinen aktiivisuus voi toimia barometri CaP aggressiivisuus. Tämä on todennäköisesti seurausta siitä, että Src itsessään on keskeisesti mukana väyliä, jotka välittävät solujen kasvua ja liikkuvuus, mikä puolestaan ​​voi heijastaa valtavia ja koko genomin rakenteellisia muutoksia vallalla korkki. Lisäksi, vaikka olemme huomanneet, että pTyr-416 Src /yhteensä Src on luotettava indikaattori Src tietyn toiminnan, tuloksia pTyr-527 ovat, ensi silmäyksellä, odottamaton. Fosforyloitua Tyr-527 on yleensä pidetty heijastava inaktiivisten entsyymin. Olemme kuitenkin huomanneet, että suhde pTyr-527 /yhteensä Src on huono indikaattori

aktiivisesti Src korkki solulinjoissa. Pikemminkin, jälkimmäinen suhde näyttää olevan paljon parempi ennustaja aktiivisia Src. Vuodesta mekanistinen näkökulmasta, tämä saattaa johtua läsnäolo fosforyloidun proteiineja, jotka voivat liittää (via Src: n SH2 domain) ja siten nopeasti aktivoi estetty entsyymi. Näin ollen toiminnan tilan pTyr-527 Src pitäisi nähdä ”viritetty toimintaan” sijasta staattisesti aktiivinen.

Yhteenvetona olemme kehittäneet herkkä ja valikoiva Src aktiivisuuden tunnistava järjestelmä. Käyttämällä useita aggressiiviset, aggressiivinen, ja androgeeni-riippumaton eturauhasen solulinjoissa, olemme huomanneet, että koko Src toiminta laskee funktiona kasvava eturauhasen solulinjan aggressiivisuus. Fmoc-Orn(Aloc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Tyr(PO(OBzl)OH)-Gly-Glu(OtBu)-Phe-Orn(Aloc)-amide-Resin