Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ctf18-replikointi tekijä C monimutkainen lukien Dscc1 (DNA: n replikaatiota ja sisarkromatidin koheesio 1) on sekaantunut sisarkromatidin yhteenkuuluvuuden DNA replikoinnin ja genomin vakautta

S. cerevisiae

ja

C. elegans

. Olemme aikaisemmin suoritettu geeniekspressioprofilointi primaarisissa peräsuolen syövän soluja voidakseen tunnistaa uusia molekyylikohteista hoitoon kolorektaalisyövän. Piirre syöpään liittyvän transkription allekirjoitus ilmestyy tähän toimintaan on kohonnut ilmentyminen esikasvaintekijän

DSCC1

. Täällä olemme kuulustelleet molekyylitason perustan poikkeavaan ilmentymistä ihmisen DSCC1 peräsuolen syövän ja sen kyky edistää eloonjäämistä syöpäsoluja. Kvantitatiivinen PCR ja immunohistokemiallinen analyysit vahvistivat, että ekspressiotaso DSCC1 on kohonnut 60-70% Kolorektaalituumorien verrattuna niiden täsmäsi noncancerous paksusuolen limakalvoa.

in silico

arvioinnissa oletettujen

DSCC1

promoottorialue konsensukseen DNA transkription säätelyelementtejä paljasti mahdollisen roolin E2F perheen DNA sitovien proteiinien säätelyssä DSCC1 ilme. RNAi-välitteinen väheneminen E2F1 pienentää ilmentymisen DSCC1 peräsuolen syöpäsoluja. Vahvistus- ja menettämisestä toiminto kokeet osoittivat, että DSCC1 on mukana elinkelpoisuuden syöpäsolujen vastauksena genotoksinen ärsykkeisiin. Me paljastaa, että E2F-riippuvaisen ilmentymä DSCC1 antaa antiapoptoottisten ominaisuuksia peräsuolen syövän soluja, ja että sen tukahduttaminen voi olla käyttökelpoinen vaihtoehto kolorektaalisyövän hoitoon.

Citation: Yamaguchi K, Yamaguchi R, Takahashi N, Ikenoue T, Fujii T, Shinozaki M, et al. (2014) yli-ilmentyminen yhteenkuuluvuus perustaminen Factor DSCC1 kautta E2F sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (1): e85750. doi: 10,1371 /journal.pone.0085750

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 lokakuu 2013; Hyväksytty: 30 marraskuu 2013; Julkaistu: 17 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Yamaguchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (# 23790126), MEXT /JSP, Japani K. Yamaguchi, ja Global COE ohjelma ”keskus koulutuksen ja tutkimuksen kehittyneen genomin perustuvan lääketieteen henkilökohtaisen lääketieteen ja valvonta maailmanlaajuinen tartuntatautien ”, MEXT /Japani Society for Promotion of Science, Japanin Y. Furukawa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä ihmisen kasvaimet maailmassa. CRC soluissa, häiriöt järjestelmiä, jotka ohjaavat geneettisiä tai epigeneettiset eheyttä tekee erilaisia ​​ominaisuuksia, kuten kromosomi epävakaus (CIN), mikrosatelliittien epävakaus (MSI), ja CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP). Valtaosa Kolorektaalituumorien näytteille CIN joka sisältää brutto geneettisiä muutoksia, kuten poistot, monistuksia, käännellen, uudelleenjärjestelyt, voitto tai tappio kokonaisia ​​tai suuria osia kromosomeista, ja alueelta toiselle siirtäminen [1]. Aikaisempi tutkimus tunnistettiin somaattisia mutaatioita viisi geeniä kuten

MRE11

,

ZW10

,

ZWILCH

,

ROD

, ja

DING

muun 100 ihmisen CIN-kandidaattigeenejä että jaettu samankaltaisuus hiiva tai lentää ”epävakauden” geenit [2]. Niiden tiedot osoittivat, että vähintään yksi kolmesta toimintoja, kuten double-lohkon murtuma korjaus, Kinetokori toiminto, ja kromatidityyppisiä erottelu, on heikentynyt CIN kasvaimia somaattinen mutaatio. Toisessa tutkimuksessa etsitään mutaatioita 102 humaaneja hiivan CIN geenien 132 kolorektaalisyövissä. Näin ollen ne tunnistettiin yhteensä 11 mutaatioita viisi geeniä, joka sisälsi neljä liittyy sisarkromatidin koheesio (

SMC1L1

,

CSPG6

,

NIPBL

, ja

STAG3

, homologit hiiva

SMC1

,

SMC3

,

SCC2

, ja

SCC3

vastaavasti) [3]. Koska sisarkromatidin koheesio on välttämätöntä solun prosesseissa, kuten kromosomin erottelu, homologisia rekombinaatiotapahtumia korjaus, ja transkription säätely [4], geneettisten muutosten komponenttien ja viranomaisten olisi keskeinen rooli CIN Kolorektaalituumorien.

Olemme aikaisemmin suoritettu geeniekspressioprofiili analyysi CRC [5], ja todettiin, että DNA: n replikaatiota ja sisarkromatidin koheesiota 1 (

DSCC1

, joka tunnetaan myös nimellä

DCC1

) oli yleensä koholla Kolorektaalituumorien verrattuna ei-syöpä paksusuolen limakalvolla. Dcc1p, homologia DSCC1, tunnistettiin ensin jäsenenä alterative replikaatiotekijää C (RFC) monimutkainen hiiva, ja fyysisesti kumppaniaan Ctf8p ja Ctf18p [4]. Poistetaan komponentti, Ctf18p, Ctf8p tai Dcc1p, johtanut vakavaan sisarkromatidin koheesion vikoja, ja lisääntynyt herkkyys mikrotubulusten depolymeroimiseksi lääkkeitä, mikä viittaa siihen, että nämä komponentit ovat välttämättömiä ylläpito kromatiinin eheyden [4]. Vaikka Dcc1p ei ollut välttämätöntä elinkelpoisuuden hiiva, poistetaan Dcc1p johti synteettisiä kuolleisuutta yhdessä mutaation muiden sisarkromatidin koheesiota proteiineja [6]. Sen lisäksi, että implisiittisesti sisarkromatidin yhteenkuuluvuuden CTF18-DSCC1-CTF8-RFC kompleksi on keskeinen tehtävä DNA replikaatiota vuorovaikutusta yksijuosteisen ja pohjamaalattujen DNA kuormaimen lisääntyvien solujen tuma-antigeenin [7]. Lisäksi geneettiset verkko analyysi toiminnallisesti liittyvien geenien hiiva ehdotti, että komponentit CTF18-DSCC1-CTF8-RFC kompleksin vuorovaikutuksessa MAD /BUB karan tarkastuspiste reitissä RAD51 DNA korjaukseen liittyvän reitin kaksinkertaisen juosteen katkeaa, RAD9 DNA-vaurion tarkastuspiste, ja TOF1 /MRC DNA: n kahdentuminen tarkistuspiste koulutusjakson [8], [9]. Havainto, että mutaatio CTF18-RFC kasvoi kolmikon toista epävakautta tukevat roolia tämän monimutkaisen DNA-replikaatiota tarkastuspiste [10]. Nämä tulokset osoittivat, että DSCC1 tärkeä rooli lisääntymään, kara tarkistuspiste ja DNA korjaus, joka sai meidät tutkimaan, onko vapautettu ilmaus DSCC1 osallistuu paksu- ja kasvaimien syntyyn.

Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että DSCC1 on usein säädelty vahvistavasti CRC ainakin osittain parannetulla transkription aktivoitumisen E2F. Olemme myös paljastaa, että kohonnut ilmentyminen DSCC1 annetaan chemoresistance CRC soluissa antamalla kasvainsolujen anti-apoptoottisia ominaisuuksia. Nämä havainnot auttavat ymmärtämään paremmin CRC, ja toimii lähtökohtana kehittää uusia strategioita diagnosointiin ja hoitoon CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tämä projekti hyväksyi eettisen komitean Institute of Medical Science, University of Tokyo (IMSUT-IRB, 21-14-0806). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta tässä tutkimuksessa. Kaikki peräsuolen syövän kudokset ja vastaavat ei-syöpäkudokset saatiin kirurgisista näytteistä potilaista, joille tehtiin leikkaus.

Soluviljely

Ihmisen CRC solulinjat HCT116, HCT-15, SW480, DLD-1 , LoVo, Caco-2, LS174T, HT-29, ja RKO hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Kaikki solut kasvatettiin tarvittaessa alusta täydennettynä FBS (Life Technologies, Carlsbad, CA) ja antibiootti /antimykootti-liuosta (Sigma, St. Louis, MO).

valmistaminen ilmentävien plasmidien DSCC1 ja E2Fs

koko koodaava alue

DSCC1

cDNA (GenBank-nro NM_024094) monistettiin RT-PCR: llä käyttäen alukesarjaa, forward-aluke: 5′-CCGGAATTCATGAAGAGGACCCGCGAC-3 ’ja reverse-aluke: 5′-CGGCTCGAGAGAAATGGGTCTTCTCGAATTAT-3’ (alleviivatut nukleotidit osoittavat tunnistuskohtia restriktioentsyymien). PCR-tuotteet kloonattiin

Eco

RI ja

Xho

I sivustoja pcDNA3.1 /myc-His. Olemme lisäksi plasmidit ilmentävät HA-tagged DSCC1 (pCAGGS-DSCC1). Konstruktit pcDNA3-HA-E2Fs ystävällisesti Dr. JR Nevins (Duke University, Durham, NC).

kvantitatiivinen PCR ja geenin kopioluku analyysi

Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen LightCycler 480 järjestelmä (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Genomiset DNA: t uutetaan CRC solulinjoja kopiomäärä analyysiä. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System, käyttäen FAM-leimatut koettimet (5′-TCAGGTTTCCTACCTTCCGGCTGCTT-3 ’) ja joukko alukkeita (eteenpäin: 5′-GGCGCGCTTTCAAACG-3′, käänteinen: 5’-GCGGGCAAGAAAGAAGTTCC-3 ’) ja

DSCC1

, ja TaqMan Kopioi numero Viite Analyysit RNaasi P kvantitatiivinen ohjaus (Life Technologies). Kopioluku

DSCC1

syöpäsoluissa laskettiin verrattuna genomi-DNA terveiltä vapaaehtoisilta käyttäen CopyCaller Software.

Subsellulaariset ja immunoblottaus

Solut lyysattiin radioimmunopresipitaatiotutkimuksessa määrityspuskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS) täydennettynä proteaasiestäjäseostabletit sarja III (Calbiochem, San Diego, CA). Nuclear uutteet valmistettiin käyttäen Nuclear Extract Kit (Active motiivi, Carlsbad, CA). Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus-analyysi suoritettiin käyttäen mainituilla vasta-aineilla. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri- tai anti-kani-IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) toimi sekundäärisenä vasta-aineena ECL Detection System (GE Healthcare).

Immunovärjäys

Ensisijainen vasta-aineita käytetään immunohistokemiallista ja immunosytokemiallista värjäystä olivat anti-DSCC1 (B01P, Abnova, Taipei, Taiwan) ja anti-Myc (Sigma). Spesifisyys DSCC1 vasta-ainetta vahvistettiin, että eston kanssa DSCC1 rekombinanttiproteiinia (tuloksia ei ole esitetty). Nämä kokeet suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [11].

Apoptoosin ja virtaussytometria

tutkimiseksi apoptoosin induktion, soluja käsiteltiin kamptotesiini (Wako, Osaka, Japani), doksorubisiini (LC Laboratories, Woburn, MA), MG132 (Merck Millipore, Darmstadt, Saksa), tai altistunut y-säteilytys (Gammacell 40, Atomic Energy of Canada, Ontario, Canada). Expression katkaistun poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja pilkottiin kaspaasi-3 havaittiin Western blot -analyysillä käyttäen anti-katkaistuun PARP (9541) ja anti-kaspaasi-3-vasta-aineita (9662), vastaavasti (Cell Signaling Technology, Danvers , MA). Arviointi apoptoosin suoritettiin myös anneksiini V ja PI kaksinkertainen värjäys käyttäen Alexa Fluor 488 anneksiini V /Dead solukuoleman Kit (Life Technologies). Lyhyesti, viljellyt solut käsiteltiin ajoneuvon tai kamptotekiinin 24 tuntia. Solut värjättiin anneksiini V ja PI, ja sen jälkeen analysoitiin FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) käyttäen FlowJo ohjelmistoa (Puu Star, Ashland, OR).

solunelinkykyisyysmääritys

ilmentävien plasmidien lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) käyttäen U6-promoottori (psiU6BX3.0) valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Ilmentävien plasmidien DSCC1 shRNA (psiU6-shDSCC1) rakennettiin kloonaamalla kaksijuosteisia oligonukleotidejä osaksi

Bbs

I kohtiin psiU6BX3.0 vektorin. Kaksi kohdesekvenssejä, 5′-GUGGACAGAAGAAGAUAUU-3 ’(shDSCC1 # 1) ja 5′-GCAAACCAUAGGUGCAUUA-3′ (shDSCC1 # 2), käytettiin DSCC1 shRNAs. Negatiivisina kontrolleina, valmistimme plasmidi kohdistaminen tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (psiU6-shEGFP), ja ne kohdistuvat salattu sekvenssit shDSCC1 # 1 (5’-AAAUUGCGAAGGUGAUGAA-3 ’; psiU6-shDSCC1 # 1scr) tai shDSCC1 # 2 (5’- AACACGUUAAUAACCGGUG-3 ’; psiU6-shDSCC1 # 2scr). Solujen elinkelpoisuus määritykset suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu käyttäen HCT116, SW480 ja RKO, jotka on transfektoitu ilmentävien plasmidien shEGFP, shDSCC1 tai sekoituskoodin shDSCC1 [11]. Tutkia vaikutuksen DSCC1 ilmentymisen vaikutus soluproliferaation, transfektoimme SW480 ja HCT116-solujen pCAGGS-DSCC1 ja perustettiin kaksi tai kolme kloonia, jotka ilmentävät stabiilisti eksogeenista DSCC1. Ohjaus SW480 ja HCT116-solut transfektoitu tyhjällä vektorilla oli myös näytetty toteen mock soluja.

Järjestäjä toimittaja määrityksiä ja mutageneesin

lusiferaasireporttiterilla plasmidit, jotka sisältävät

DSCC1

promoottori oli valmistettiin kloonaamalla 5′-reunustavan alueen

DSCC1

osaksi

Mlu

I ja

Bgl

II restriktioentsyymikohtia pGL3-Basic-vektoriin (Promega, Madison, WI ). DNA-fragmentti oli noin 1,0 kb: n 5′-reunustava alue on

DSCC1

monistettiin PCR: llä käyttäen genomista DNA: ta terveiltä vapaaehtoisilta ja joukko alukkeita (eteenpäin: 5′-CGACGCGTATGTCTGCTCAGATCCTTTGAAT-3 ’, käänteinen : 5’-GAAGATCTCGCCGGGTCTAGGAGTCC-3 ’). Mutant plasmideja, jotka sisältävät substituutioita oletetun E2F sitoutumiskohdat

DSCC1

promoottorin muodostettiin kohdennetulla mutageneesillä käyttäen QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). -Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille transfektoitiin toimittaja plasmideilla yhdessä PRL-TK (Promega) käyttämällä FuGENE 6 reagenssia. Solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen, ja toimittaja toimintaa mitattiin dual lusiferaasi-järjestelmän (TOYO B-Net, Tokio, Japani). Sillä knockdovvn E2F1 ilmaisun, synteettinen E2F1 siRNA ostettiin Sigma (sense: 5′-GGGAGAAGUCACGCUAUGA-3 ’, antisense: 5′-AUAGCGUGACUUCUCCCCC-3’).

Kromatiini immuunisaostustesti

tutkimiseksi vuorovaikutuksen E2F1 kanssa

DSCC1

promoottorialueen, kromatiinin immunosaostus (chip) määritys suoritettiin Agilent Nisäkkäiden ChIP protokolla pienin muutoksin. HCT116-solut silloitettu 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja reaktio pysäytettiin 0,4 M glysiiniä. Chromatin uutteet leikattiin micrococcal nukleaasidigestion, ja sen jälkeen proteiini-DNA-kompleksit immunosaostettiin 3 ug anti-E2F1 polyklonaalista vasta-ainetta (C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) sidottu anti-kani IgG dynakuulia ( Life Technologies). Ei-immuuni-kani-IgG (Santa Cruz Biotechnology) käytettiin negatiivisena kontrollina. Saostunut DNA: t tehtiin kvantitatiivinen PCR-analyysi alukesarja (eteenpäin (-26) 5′-CCGGAAACACGCCCATGGC-3 ’ja reverse (+127) 5′-GGGTCCTCTTCATCGCAGC-3’) monistamiseksi

DSCC1

promoottorialueen. Spesifisyys määritettiin monistamisen distaalinen ylävirran alue

DSCC1

promoottorin kanssa seuraavia alukkeita: eteenpäin (-1279) 5′-AGTTGTAGGGAATGTTTCCCATT-3 ’ja reverse (-1111) 5’- GATTGGTTCATGTGACCTACTTC-3 ’. Lisäksi siihen liitetyt solunjakautumisen sykli 2 (

cdc2

) promoottorin ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin (

GAPDH

) promoottoria käytettiin positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti (alukkeet:

cdc2

eteenpäin 5′- CGCCCTTTCCTCTTTCTTTC-3 ’,

cdc2

reverse 5′- ATCGGGTAGCCCGTAGACTT-3′,

GAPDH

eteenpäin 5′- TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3 ’,

GAPDH

reverse 5′- TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3 ’).

tulokset

ilmentyminen DSCC1 on usein koholla CRC

jotta tunnistaa uusia kohdemolekyylien varten hoito ja /tai diagnostinen biomarkkereita CRC, me aikaisemmin suoritettu ilmentymisprofiili kolorektaalisen kasvaimia ja niiden vastaaviin normaaleihin peräsuolen kudoksista cDNA microarray [5]. Niistä geenit vapautettiin Kolorektaalituumorien, ilmentyminen DNA: n replikaation ja sisarkromatidin koheesiota 1 (

DSCC1

) nostettiin yli kaksinkertaiseksi 5 7 peräsuolen syöpiä verrattuna vastaaviin ei-syöpä paksusuolen limakalvo (kuvio 1A ). Myöhemmät reaaliaikainen PCR-analyysi käyttäen vielä 20 CRC kudosten ja vastaavien ei-syöpä limakalvon paljasti, että

DSCC1

ekspressio kohonnut enemmän kuin kaksi-kertaiseksi 12 20 kasvaimia (kuvio 1A). Immunohistokemiallinen värjäys osoitti kertynyt DSCC1 proteiinia 29 40 CRC kudosten verrattuna vastaaviin viereisen ei-syöpä paksusuolen limakalvon (kuvio 1 B). Vaikka olemme etsineet korrelaatioita sen ilmaisun ja kliinis tekijät, kuten ikä ja sukupuoli potilaista, sijainti, koko, ja histologinen data kasvaimia, kuten syvyys invaasio, imusolmuke osallistuminen, ja verisuoni tai lymfaattinen alus invaasio, yksikään tekijöistä oli merkitsevästi yhteydessä DSCC1 ilme (taulukko S1). Lisäksi, western blot-analyysillä käyttäen CRC solulinjoja paljasti, että DSCC1 oli ilmentyy runsaana HCT116, HT-29, ja DLD-1-soluja, ja että se ekspressoituu pieninä määrinä SW480, SW620, ja Caco-2-soluja (kuvio 1 C) . Vaikka vertasimme stabiilisuutta DSCC1 proteiinin HCT116 (DSCC1-korkea) ja SW480 (DSCC1-matala) soluihin sykloheksimi- Chase määritystä DSCC1 oli suhteellisen vakaa sekä HCT116 ja SW480-soluissa. Hoito MG132, proteasomin estäjä myös ei tehostanut DSCC1 ilmaisu (kuvio S1A). Nämä tiedot osoittivat, että proteiini vakaus ei todennäköisesti tärkeä rooli korkeammalla ilmentyminen DSCC1 syöpäsoluissa.

(A) Suhteellinen ilmentyminen suhteet

DSCC1

seitsemässä peräsuolen syöpä kudoksia niiden vastaavat normaalit kudokset meidän microarray data (ylempi paneeli). Suhteellinen ekspressiotasot

DSCC1

vuonna vielä 20 Kolorektaalituumorien ja vastaava ei-syöpä limakalvon analysoitiin kvantitatiivinen PCR (alempi kuva). Määrä on

DSCC1

normalisoitiin

HPRT1

ilme. Y-akseli osoittaa suhde keskiarvo

DSCC1

ilmaisua kasvain on, että niiden vastaavat normaalia kudosta. Data edustaa keskiarvo ± SD kolminkertaisista kokeista. (B) edustaja kuva immunohistokemiallisella värjäyksellä DSCC1 ihmisen paksusuolen syöpä kudosta sisältäviä syöpäsoluja ja vieressä normaali limakalvo. (C) Expression of DSCC1 CRC solulinjoissa detektoitiin Western-blottauksella käyttämällä anti-DSCC1 vasta-aine. (D) HCT116-soluja tutkittiin anti-DSCC1 vasta-ainetta ja sen jälkeen FITC-konjugoitua anti-hiiri-IgG sekundääristä vasta-ainetta (vihreä). Tumat counter-värjättiin DAPI (sininen). (E) HCT116, RKO, ja DLD-1 solut erotettiin sytoplasmisen (CF) ja ydin- fraktiot (NF), ja sytoplasmisen ja tumaproteiinit tehtiin SDS-PAGE ja sen jälkeen western blottauksella. Fraktioiden puhtaus määritettiin, kun läsnä on β-tubuliinia (sytoplasminen markkeri) ja lamiini B (ydin-markkeri). (F) Kopioi numero analyysi

DSCC1

kahdeksassa CRC solulinjoissa ja HEK293-soluissa. Suhteellinen kopioluku

DSCC1

geenin määritettiin kvantitatiivisella PCR: llä käyttäen

RPPH1

kuin endogeeninen viitteenä. Kopioluku laskettiin jakamalla niiden PCR-tuotteita Alan ääreisvalkosoluista terveistä vapaaehtoisista, ja sittemmin kertomalla 2.

immunohistokemiallinen analyysi yllättäen kuvattu kertynyt DSCC1 sytoplasmassa ja tumassa DSCC1-positiivisten syöpä solut (kuvio 1 B), vaikka Dscc1 ilmoitettiin osansa perustaminen koheesion aikana DNA: n replikaation hiivassa. Selvittämiseksi sen solunosasijaintia, suoritimme immunosytokemiallisessa värjäytymistä endogeenisen DSCC1 in HCT116-soluissa. Yhdenmukainen immunohistokemiallisella värjäyksellä syöpä kudoksiin, DSCC1 proteiini sijaitsi sekä sytoplasmassa ja tumassa (kuvio 1D ja S1B). Lisäksi Western blot-analyysillä käyttämällä soluliman ja ydinvoiman jakeet uutettiin HCT116, RKO, ja DLD-1-soluissa (kuvio 1 E), ja soluja, jotka ilmentävät Myc-merkityn DSCC1 vahvisti solunosasijaintia sytoplasmassa sekä tumassa (kuvio S1C ja S1D) .

Kopioi numero analyysi

DSCC1

Vastatakseen onko geeni vahvistus on mukana DSCC1 yli-ilmentyminen, teimme kopiomäärä analyysi kvantitatiivinen PCR käyttäen RNaasi P kontrollina . Verrattuna ääreisvalkosoluista terveiltä vapaaehtoisilta, kopioluku

DSCC1

ei noussut missään CRC testatut solulinjat (kuvio 1 F). On syytä huomata, että lasku kopioluvun havaittiin HT-29-soluja, jotka ekspressoidaan runsaasti DSCC1 (kuvio 1C). Olemme edelleen analysoitiin kopioluvun muuttaminen

DSCC1

paksusuolen ja peräsuolen adenokarsinooma (Cancer Genome Atlas paksusuolisyöpä hanke) käyttäen cBioPortal tietokantaa (https://www.cbioportal.org/public-portal/). Tämän seurauksena otaksuttu kopioluvun muutoksia todettiin 7 257 peräsuolen adenokarsinoomat (2,7%), mikä viittaa siihen, että monistuminen

DSCC1

ei merkittävä rooli tehostetussa DSCC1 ilmaisua.

sääntely

DSCC1

promoottorin aktiivisuutta

Voit ratkaista mekanismi kohonnut DSCC1 ilmaisun CRC, tutkimme promoottorin aktiivisuutta

DSCC1

in HCT116-soluissa. Reportterimääritys käyttäen plasmideja, jotka sisältävät 5′-reunustava alue on

DSCC1

(pDSCC1-1023 /+ 109) osoittivat, että tällä alueella on huomattava promoottorin aktiivisuutta (tuloksia ei ole esitetty). Alueella, olemme tunnistaneet oletetun E2F-sitova motiivi, EBS1 (-3 /+ 5, 5′-CTTGGCGC-3 ’) käyttäen Jaspar (https://jaspar.genereg.net/) ja TFSEARCH tietokannat (http: //www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (kuvio 2A). Tämä otaksuttu sitoutumiskohta jaettu korkea samankaltaisuus kanssa konsensus motiivi E2F, TTTSSCGC S = G tai C. Koska E2F transkriptiotekijöitä usein vapautettu erilaisia ​​kasvaimia, testasimme vaikutus E2Fs on

DSCC1

promoottorin aktiivisuutta. Vaikka E2F1, E2F2, E2F3 ja E2F4 lisääntynyt promoottorin aktiivisuutta, E2F6 ei muuta toimintaa. E2F1, joka osoitti vahvinta induktio joukossa neljä jäsentä, täydennetty toiminta annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2B ja S2A). Tämä parannus havaittiin myös muita solulinjoja, mukaan lukien LoVo, HeLa, ja HEK293 (tietoja ei ole esitetty). Tutkia mahdollista osallistumista EBS1 on lisälaite, mittasimme toimittaja aktiivisuus käyttämällä konstrukteja pDSCC1-10 /+ 109 ja + 10 /+ 109: n läsnä tai poissa ollessa E2F1 (kuvio 2C). Pohjapinta reportteri toimintaa näiden toimittaja plasmidien eivät olleet merkittävästi erilaiset ilman E2F1 plasmideihin. Poistaminen EBS1 (pDSCC1 + 10 /+ 109) laski rajusti E2F1 aiheuttama reportteriaktiivisuutta (20,4-kertainen 3,2-kertainen). Yllättäen tehostaminen toimittaja aktiivisuuden E2F1 havaittiin vielä vuonna + 10 /+ 109. Lisädeleetio jopa +70 promoottorin (pDSCC1 + 70 /+ 109) kokonaan vähentynyt E2F1 aiheuttama reportteriaktiivisuutta (kuvio 2C). Yhteisymmärryksessä tähän tulokseen, löysimme kaksi ylimääräistä ennakoivalla EBSS, EBS2 (+ 31 /+ 38; 5′-CTTCCGGC-3 ’) ja EBS3 (+ 57 /+ 64; 5′-TTGCCCGC-3’) välisellä alueella +10 ja +70. Voit osoite vastuut EBS1, EBS2 ja EBS3 induktioon, valmistimme neljä mutantti reportterirakenteet (kuvio 2D) korvaamalla runsaasti GC segmentti E2F konsensusyksiköitä, TTTSSCGC (S = C tai G) tai STTTS, koska näitä keskeisiä kuviot olivat kuulemma ratkaiseva E2F sitova [13], [14]. Verrattuna villityypin pDSCC1-10 /+ 109 (14,8-kertainen induktio), molempien EBS1-mutantin plasmidit (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1, ja Mut1 ’) huomattavasti vähentynyt reportteri toimintaa vasteena E2F1 (5,2-kertainen ja 5,8-kertaiseksi). Mutaatiot sekä EBS1 ja EBS2 (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1 + 2) edelleen vähentyneet E2F1 aiheuttama aktiivisuus (3,7-kertainen). Mutant toimittaja Plasmidi, joka sisälsi substituutioita kolme elementtiä (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1 + 2 + 3) lähes vähentynyt parantamiseksi (1,7-kertainen), mikä viittaa siihen, että kolme E2F sitovat motiivit ovat vastuussa sääntelystä

DSCC1

promoottorin aktiivisuutta.

(A) nukleotidisekvenssi -10-90 emäsparia alueen ihmisen

DSCC1

. Kolmen oletetun E2F sitovat motiivit on alleviivattu. (B) pDSCC1-1023 /+ 109 oli transfektoitu tilapäisesti PRL-TK ja pcDNA3 HA-E2Fs osaksi SW480 tai PRL-TK ja pcDNA3 HA-E2F1 (0,01-1 ug) osaksi SW480 ja HCT116-soluissa. (C) pDSCC1-10 /+ 109 tai lyhyempi promoottorikonstrukteja transfektoitiin E2F1 tai tyhjän vektorin SW480-soluihin. (D) Site-mutaatio-analyysi otaksutun E2F sitoutumiskohdat proksimaalinen promoottorialue. pDSCC1-10 /+ 109 tai sen mutantin kloonit transfektoitiin E2F1 tai tyhjän vektorin SW480-soluihin. Data edustaa keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Promoottori aktiivisuus osoittaa suhteellisen lusiferaasiyksikkönä tai kertaiseksi induktio yli tyhjän vektorin transfektanttia. (E) Kromatiini immunosaostus suoritettiin käyttäen anti-E2F1-vasta-ainetta. Saostunut DNA: t alistettiin monistamisen

DSCC1

promoottorin kvantitatiivinen PCR. Selvittämiseksi sitoutumaan spesifisesti EBS, monistuminen distaalinen ylävirran alue

DSCC1

promoottoria käytettiin normalisointi. Merkittävä ero määritettiin t-testillä. (F) HCT116-solut transfektoitiin kontrolli tai E2F1 siRNA (25 nM) 48 tuntia.

DSCC1

ilmentymistä havaittiin kvantitatiivisen PCR. Merkittävä ero määritettiin t-testillä. (G) SW480-solut transfektoitiin kontrolli tai E2F1 siRNA (25 nM), jota seurasi 8 tunnin kuluttua transfektio reportteriplasmidilla (pDSCC1-10 /+ 109) ja E2F1 ekspressiovektori tai tyhjän vektorin. 48 tunnin kuluttua, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Data edustaa keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

vuorovaikutus E2F1 kanssa

DSCC1

promoottorialueen

Sen määrittämiseksi, onko E2F1 sitoutuu promoottorialueen

DSCC1

, teimme kvantitatiivinen ChIP määritys käyttäen anti-E2F1 vasta-ainetta ja joukkoa alukkeita, joka kattaa kolmen oletetun E2F-sitovia osia. Promoottori solunjakautumisen aikana 2-geenin (

cdc2

), tunnettu E2F1 tavoite oli rikastettu 13,4-kertaisesti immunosaostettiin DNA (kuvio S2B). Odotetusti,

DSCC1

promoottorialue rikastettiin jopa 15,4-kertaiseksi DNA, mikä viittaa vuorovaikutusta

DSCC1

promoottorialueen E2F1 (kuvio 2E).

vahvista osallistumista E2F1 säätelyssä DSCC1 ilmaisun, tutkimme hiljentäminen vaikutus E2F1 on DSCC1 ilme. Reaaliaikainen PCR ja western blot-analyysit osoittivat, että ehtyminen E2F1 laski DSCC1 ilmaisu (kuvio 2F ja S2C). RNAi-välitteinen knockdovvn E2F1 aktiivisuuden vahvistettiin reportterianalyysi osoittaa merkittävä väheneminen

DSCC1

promoottorin aktiivisuutta 10,4 (Ctrl siRNA) 4,7-kertaisesti E2F1 siRNA SW480-soluissa (kuvio 2G). Nämä tulokset viittaavat siihen,

DSCC1

transaktivaation on, ainakin osittain, sääntelee E2F1 CRC kautta vuorovaikutuksessa

DSCC1

promoottorialue, ja että kolme EBSS tärkeä rooli transkription aktivaation. Tutkia tarkemmin, ovatko DSCC1 ilmentymistä moduloidaan E2F transkriptioaktiviteettia vertasimme suhteellista ilmentymistä

DSCC1

kanssa

CDK1

(

cdc2

), koska lukema E2F transkriptionaalisen aktiivisuuden käyttäen kahta itsenäistä aineistoja (E-MEXP-3715 ja geod-23878) on Gene Expression Atlas-tietokanta (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). Vuonna aineistoja,

DSCC1

ja

CDK1

olivat merkittävästi säädellään ylöspäin Kolorektaalituumorien verrattuna normaaliin paksusuolen kudoksiin (kuva 3). Erityisesti molemmat aineistoja laskettu korkeat arvot korrelaatiokerroin (E-MEXP-3715,

r

= 0,912 ja geod-23878,

r

= 0,864) välillä

DSCC1

ja

CDK1

, tukee käsitystä, että

DSCC1

on toinen alavirtaan geeni säätelee E2F.

Tämä yhdistys osoitettiin kaksi microarray data, E-MEXP-3715 (A) ja geod-23878 (B), Gene Expression Atlas-tietokanta (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). Pearsonin korrelaatiokerrointa (r) välillä

DSCC1

ja

CDK1

ilmaisu arvot laskettiin sitten arvioida niiden korrelaatiota.

vaikutus DSCC1 proliferaatioon CRC solut

Vastatakseen roolin sen kohonnut ilmentyminen CRC soluissa, me tutkimme, DSCC1 osallistuu syöpäsolujen lisääntymistä. Suoritimme solunelinkykyisyysmääritys käyttäen ilmentävien plasmidien sekä DSCC1 shRNA (shDSCC1 # 1, tai shDSCC1 # 2) ja neomysiiniresistenssigeeni. Plasmidit, jotka sisältävät muokatun sekvenssin DSCC1 shRNAs (shDSCC1 # 1scr ja shDSCC1 # 2scr), ja plasmidi, joka sisältää EGFP shRNA (shEGFP) toimivat kontrolleina. Transfektio näillä DSCC1 shRNAs (shDSCC1 # 1, tai shDSCC1 # 2) vähensi ilmentymistä DSCC1, kun taas transfektio kontrolleihin (shEGFP, shDSCC1 # 1scr ja shDSCC1 # 2scr) ei ollut mitään vaikutusta (kuvio 4A). HCT116-soluja viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi sopivan pitoisuuden G418 ja solujen elinkyky mitattiin. Olemme havainneet, että elävien solujen lukumäärä oli transfektoitu DSCC1 # 1 tai DSCC1 # 2 shRNA on merkittävästi vähentynyt verrattuna transfektoitu EGFP, DSCC1 # 1scr tai DSCC1 # 2scr shRNA, mikä osoittaa, että DSCC1 on rooli elinkelpoisuuden syöpäsolujen (kuvio 4B). Yhtenäisiä tietoja saatiin SW480 ja RKO soluja (kuvio S3A). Nämä tulokset vahvistettiin toistuvissa kokeissa.

(A) HCT116-solut transfektoitiin ohjaus (Mock ja EGFP) ja DSCC1 shRNAs 48 tuntia käyttäen Nucleofector kit, ja western blot -analyysi suoritettiin. Expression of β-aktiini toimi kontrollina. (B) solujen elinkelpoisuus oli transfektoitu shRNAs mitattiin WST-8-määrityksessä. Aineisto edustaa keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä transfektioiden. P-arvot laskettiin Dunnettin testi useita vertailuja shEGFP-transfektoiduissa soluissa. (C) yli-ilmentyminen DSCC1 in SW480-soluissa varmistettiin western-blottauksella käyttäen anti-DSCC1 vasta-aine. Vastaava määrä kolme mock ja kolme DSCC1 solut maljattiin 96-kuoppalevyille, ja soluproliferaatiomääritykset suoritettiin osoitettuina ajankohtina. Data edustaa keskiarvo ± SD viidestä kokeesta. Merkittävä ero mock ja DSCC1 solut määritettiin kaksisuuntainen toistettujen mittausten ANOVA.

Lisäksi perustimme SW480-soluja, jotka konstitutiivisesti ilmentävät eksogeenisiä DSCC1, ja verrattiin niiden leviäminen kontrolli jotka oli transfektoitu mock vektori (kuvio 4C). Yhdenmukainen DSCC1-knockdown data, solut, jotka ilmentävät eksogeenisiä DSCC1 osoittivat lisätyn solujen lisääntymistä verrattuna vanhempien SW480 soluihin tai kontrolli solut (

p

= 2,2 × 10

-5). Vastaavasti eksogeenisen DSCC1-ilmentyminen tehosti leviämisen HCT116-soluja (kuvio S3B).

rooli DSCC1 on apoptoosin induktioon

Koska E2F1 resistenssin genotoksisille solvausten [15], [16 ], [17], me tutki tarkemmin sitä koholla DSCC1 ilme on merkitystä herkkyys syöpäsolujen genotoksinen ärsykkeisiin. SW480-soluja, jotka ekspressoivat eksogeenista DSCC1 (SW480-DSCC1 # 1, # 3 ja # 8) altistettiin y-säteilytys, ja apoptoosin induktio analysoitiin immunoblottauksella anti-katkaistuun PARP-vasta-aine.