Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

vimentiinista on läsnä mesenkymaaliset väli hehkulampun tukevat menettelyn ulkopuolelle rakenteellinen eheys lepotilassa olevat solut osallistuessaan tarttuvuus, muuttoliike, selviytyminen ja soluviestitykseen prosessien kautta dynaaminen kokoonpano /purkaminen aktivoiduissa soluissa. Pehmytkudossarkoomien ja jotkut epiteelisyövissä näytteille ”epiteelin ja mesenkymaalitransitioon” fenotyypit ilmaista vimentiinista. Withaferin-A, luonnossa johdettu bioaktiivisten yhdisteiden, voi molekyylirakennetta kohdistaa vimentiinista, joten pyrimme arvioimaan sen vaikutuksia kasvaimen kasvuun

in vitro

ja

in vivo

siten selvittämiseen roolia vimentiinista huumeiden indusoiman vastauksia.

menetelmät ja havainnot

Withaferin-A sai aikaan huomattavaa apoptoosia ja vimentiinista lohkaisu vimentiinista ilmentäviä kasvainsoluja, mutta huomattavasti vähemmän normaaleissa mesenkyymisolujen. Tämä proapoptoottiset vaste kumottiin jälkeen vimentiinista Knockdown tai saarto kaspaasi aiheuttaman vimentiinista hajoamisen kautta kaspaasi estäjiä tai yliekspressio mutatoitujen kaspaasi kestävä vimentiinista. Lausutaan antiangiogeenisiä vaikutuksia Withaferin-A osoitettiin, vain vähäinen vaikutus nähdään proliferoimattomissa endoteelisoluissa. Lisäksi Withaferin-A merkittävästi estetty pehmytkudossarkooman kasvua, paikallisen uusiutumisen ja etäpesäke paneelissa pehmytkudoksen sarkooma vierassiirrekokeissa. Apoptosis, väheni angiogeneesi, ja vimentiinistä hajoaminen olivat kaikki nähneet Withaferin-A käsitelty yksilöitä.

Johtopäätökset

Näiden havaintojen arviointiin Withaferin-A, sen analogit tai muu anti vimentiinista terapeuttisia lähestymistapoja pehmytkudossarkooman ja ”epiteelin ja mesenkymaalitransitioon” kliininen yhteyksissä on perusteltua.

Citation: Lahat G, Zhu QS, Huang KL, Wang S, Bolshakov S, Liu J, et al. (2010) vimentiinista on uusi Anti-Cancer terapeuttinen kohde; Insights from

In vitro

ja

In vivo

Hiiret Vieraslajisiirteen Studies. PLoS ONE 5 (4): e10105. doi: 10,1371 /journal.pone.0010105

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 syyskuu 2009; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2010; Julkaistu: 16 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Lahat et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukevat NCI /NIH R01 avustus CA138345 (DL) ja Amschwand sarkooma Syöpäsäätiön siemeniä avustus (SW). MD Anderson Cancer Center solulinjassa luonnehdinta ja sytogeneettinen Core Tilat ovat molemmat tuetaan NCI Cancer Center Support Grant. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koostuu yli 50 histologinen alatyyppi, pehmytkudoksen sarkooma (STS) voidaan jakaa kahteen pääryhmään: ne, joilla on erityisiä geneettisiä muutoksia (toiselle siirtäminen tai pistemutaatiot) ja suhteellisen yksinkertainen karyotyyppejä, ja ne, joilla monimutkaisia, epäsymmetrinen aneuploidi karyotyyppejä [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Parannettu ymmärrystä molekyyli poikkeavuuksien ajo lähtien ja etenemisen useita STS alatyyppejä kuuluvat ensimmäiseen ryhmään (esim c-Kit mutaatiot ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimiin [GIST] tai 17; 22 translokaatio johtaa PDGF-B over-ilmentyminen dermatofibrosarcoma protuberans; [DFSP]), on johtanut kliinisissä sovelluksissa tehokkaiden kohdennettua hoitoa (esim imatinibimesylaatti) huomattavasti nykyistä tulos [6]. Tällaiset terapeuttiset edistysaskeleet ovat erittäin rohkaisevia, ja korostavat tarvetta tunnistaa muita uusia molekyylikohteista ylimääräisiä STS alatyyppejä.

Suurin osa STS kuuluvat toiseen ryhmään kätkeminen aneuploidi karyotyyppejä; tämä ryhmä koostuu pääasiassa pahanlaatuisten kuitu- histiosytoomaa (MFH, jota kutsutaan myös luokkiin pleomorphic sarkooma [UPS]), leiomyosarkoomat, pahanlaatuinen ääreishermoston tuppi kasvaimet (MPNST), ja dedifferentoituneiden tai pleomorphic liposarkooma. Vaikka kliininen esitys ja taudin oireet vaihtelevat tietyn histologinen alatyyppi, kokonaisuutena, nämä monimutkaiset karyotyyppi STS on synkkä ennuste, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 50%. Huolimatta alkuperäisen Paikallisohjaukseen (saavuttaa leikkaus tai ilman säteily), paikallisen uusiutumisen ja systeeminen leviäminen esiintyy yleisesti ja tehottomuuteen terapeuttisia vaihtoehtoja näissä kliinisissä tilanteissa on merkittävä ratkaisematon ongelma STS. Toisin geneettisen yksinkertaisuus STS ensimmäisessä ryhmässä, biologisen ja molekyylitason monimuotoisuutta monimutkaisten karyotyyppi STS merkittävästi rajoittaa tunnistamiseksi yhden ja erityinen ”onkogeenisten riippuvuus” poikkeavuuksia. Vaikka haastava, valaisemaan Uusien hoitomuotojen, jotka saattavat olla käyttöä varten monenlaisiin karyotyyppi STS on ratkaiseva.

Koska 1960-luvun alussa, kasvit ja mikrobit ovat tuottaneet useita hyödyllisiä, luonnosta peräisin, pienet orgaaniset molekyylit, joilla syöpälääkkeen ominaisuudet [7], [8], [9], [10].

rohtokoisio

(ashwagandha) on lääkekasvi yleisesti käytetty Intian perinteisen lääketieteen hoitoon monenlaisia ​​sairauksia [11], [12], [13], [14], [15]. Withaferin-A (WFA), erittäin happipitoista C-28 ergostaanityypin steroideihin laktoni, on bioaktiivisten yhdisteiden eristetyn

rohtokoisio

. WFA esittelee monipuolista farmakologisen toiminnan, kuten tulehdusta, immunomodulatorisia ja angiogeneesin vastaista vaikutusta [15], [16], [17], [18]. Useat tekijät osoittavat, että WFA on syövän ominaisuuksia, ilmenee suoraan kohdistettu kasvainsolujen ja välillisesti estää [kasvaimeen liittyvän uudissuonittumisen [19], [20]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että WFA tukahduttaa ihmisen rinta- ja eturauhassyöpää solujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

indusoimalla merkitty apoptoosin [19], [21], [22]. WFA aiheuttama solun tukirangan arkkitehtuurin muuttaminen [23], [24], [25], reaktiivisen hapen sukupolven [26], [27], mitokondrioiden [26], ja proteosomal inhibitio [21] on myös ehdotettu. Normaali, ei tuumorigeeninen solujen havaittiin olevan kestävämpi kuin kasvainsolujen WFA-indusoidun apoptoosin [22]; selektiivisyys pahanlaatuisten solujen säästäen normaalit solut on erittäin haluttu ominaisuus syöpää torjuvia terapeuttisia aineita.

tarkka mekanismeja WFA toiminta ei ole lopullisesti määritelty. Useat kohdemolekyylit on ehdotettu, mukaan lukien transkriptiotekijä NF-KB: n [28], [29]; signalointi molekyyli AKT [27]; proapoptoottiset molekyylit PAR-4, FOXO-3, ja Bim [22]; ja proteosomal kymotrypsiini alayksikköä β5 [21]. Tuore tutkimus hyödyntää kemiallisen geneettinen ja proteomiikka tutkitun lähestymistavan [30], jossa biotinyloitu WFA analogista käytettiin koettimena kaatamaan WFA sitoutumispartnereihin endoteelisoluissa. Tämä strategia johti tunnistamiseen vimentiinista, tyypin III väli hehkulampun, uutena WFA alustaan. Lisäksi WFA-modifioitu vimentiinista todettiin herättämään merkittäviä proapoptoottiset ja antiangiogeenisten vaikutuksia, kun taas vimentiinistä knockdown johti vähentynyt WFA herkkyys. Nämä kokeet tarjoavat käsityksen WFA aktiivisuutta ja painottaa näiden käyttökelpoisuuden vimentiinista uutena syöpälääkkeen terapeuttinen kohde.

STS ovat mesenkymaalisten ja siksi kaikki ilmaista vimentiinista riippumatta histologisia alatyyppiä. Näin ollen on todennäköistä, että anti-vimentiinista hoitostrategioita voisi saada anti-STS vaikutuksia laaja STS. Tämä hypoteesi sai meidät vaikutusten arvioimiseksi WFA monimutkaisia ​​karyotype STS

in vitro

ja

in vivo

. Käytimme ihmissolulinjat edustavat leiomyosarkooma, MPNST, fibrosarkooma, ja UPS /pleomorphic liposarkooma arvioida vaikutuksia vimentiinista on WFA herkkyys. Tuloksemme viittaavat siihen, että STS ovat erittäin herkkiä WFA, vaikutus, joka on huomattavasti voimakkaampaa kuin vimentiinista-negatiivinen epiteelisyövissä. WFA indusoi kaspaasiriippuvaisen hajoamista vimentiinista, mikä selvästi anoikis riippumaton apoptoosin ja STS-liittyvä antiangiogeenistä vaikutuksia. Tulokset tukevat voimakkaasti arviointia WFA tai sen analogeja uutena kliininen strategia potilaiden kätkeminen näiden tuhoisien syöpäsairauksia.

Tulokset

sarkooma solut ovat erittäin herkkiä WFA

vaikutuksen arvioimiseksi WFA monimutkaisia ​​karyotype STS valitsimme paneeli ihmisen STS solulinjojen edustavat fibrosarkooman (HT1080), leiomyosarkooma (SKLMS1), MPNST (STS26T), ja korkea laatu pleomorphic sarkooma /liposarkooma (PLS-1). Tämä jälkimmäinen solulinja on hiljattain perustettu laboratoriossamme (katso Data S1 ja kuvio S1 lisätietoja). Hoito yllä solujen WFA johti merkittävään väheneminen liitettyjen solujen ja merkitty morfologisia muutoksia, kuten solun-pyöristystä ja ydin- tiivistyminen (kuvio 1A). Vaikutukset WFA ilmeni jo 2 tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta ja olivat annoksesta ja ajasta riippuvaa (kuvio S2). Solujen kasvun määritykset osoittivat WFA aiheuttama annoksesta riippuvainen väheneminen STS solujen kasvua (kuvio 1 B). Keskiarvo ± SD WFA IC

50-arvot (24 h hoidon) kirjattiin 0,4 uM ± 0,07, 0,41 uM ± 0,03, 0,37 uM ± 0,12, ja 0,53 uM ± 0,1, ja HT1080, SKLMS1, STS26T, ja PLS -1, vastaavasti. Samoin pieniä annoksia WFA (0,5 uM) merkittävästi estivät STS solujen pesäkkeiden muodostumisen kapasiteetti (kuvio 1 C). Lopuksi vaikutus WFA STS kiinnityspisteeseen riippumattomaan kasvuun tutkittiin. Kaikki STS solut arvioitiin osoittaneet pystyvänsä kasvaa pehmeässä agarissa; tämä kasvu kumoutui kuluttua 24 h WFA (0,5 uM) käsittely (kuvio 1 D). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että ihmisen STS solut ovat erittäin herkkiä kasvua estäviä vaikutuksia WFA.

A)

WFA käsittely (1 uM /24 h) johtaa merkitty morfologisia muutoksia, kuten solun-pyöristäminen ja ydinvoiman tiivistymistä, STS-soluissa;

B)

MTS määritykset osoittavat WFA aiheuttama, annoksesta riippuvaa vähenemistä STS solujen kasvua;

C) B-WFA (0,5 uM /24 h) inhiboi huomattavasti STS solujen pesäkkeiden muodostumista kapasiteetti mitataan kymmenen päivän kuluttua;

D) B WFA (0,5 uM /24 h) kumoaa STS solujen ankkurointi riippumatonta kasvua mitataan kolmen viikon kuluttua. Kuvaajat edustavat keskimäärin kolme kokeiden toisto ± SD.

WFA indusoi merkitty apoptoosin STS soluissa mutta vähemmän apoptoosin normaaleissa ihmisen fibroblasteissa ja myogenic solujen

vaikutuksen arvioimiseksi WFA on STS solujen eloonjäämistä, teimme anneksiini V /FACS-analyysit. STS-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla WFA (0-5 uM) 4 h ja 24 h; huomattava apoptoosin induktio oli ilmeistä jopa lyhyen ajan kuluessa etenkin suuria annoksia käytettiin ( 2,5 uM, p 0,05; kuvio 2A). Annoksesta ja ajasta riippuvaa kasvaimen apoptoosia havaittiin kaikissa soluissa testattu. Apoptoosin heijastui myös havaitun lisäystä aktivoidun kaspaasi 3 ja PARP pilkkominen (Western blot-analyysi [WB], kuvio 2B).

A)

anneksiini-V /FACS analyyseja, jotka osoittavat merkitty WFA aiheuttama apoptoosin STS soluissa (mustat palkit edustavat 4 h WFA hoidon ja harmaat palkit edustavat 24 h);

B) B WFA (1 uM /24 h) indusoi kaspaasi-3 (Casp-3) pilkkominen ja PARP aktivaatio STS soluissa (WB analyysi);

C) B STS solut ovat resistenttejä anoikis verrattuna normaaliin ihmisen ihon fibroblasteista (NHDF). WFA (1 uM /24 h) indusoi apoptoosia sekä liitteenä ja kelluvat STS soluja;

D) B Transmission (TEM) valokuvat kuvaavat STS apoptoosia (iso nuoli-ydin- tiivistyminen, pieni nuoli-sytoplasman kupliminen) vastauksena WFA. Kuolion osoitetaan kelluva STS soluissa;

E)

NHDF ovat vastustuskykyisempiä vaikutusten WFA (IC50: 3,7 uM ± 0,15) verrattuna STS soluihin. Kuvaajat ovat keskimäärin kolme kokeiden toisto ± SD.

Seuraavaksi arvioimme onko WFA indusoiman apoptoosin voi johtua kasvainsolujen tarttumisen menetyksestä ja irrottautuminen viljelmästä levy, jolloin anoikis. Normaali ihmisen ihon fibroblasteissa (NHDF) tehtiin merkittäviä apoptoosin viljeltiin suspensiossa, kun taas STS-solut olivat resistenttejä anoikis eikä merkittävää apoptoosin lisääntymistä voitiin havaita (kuvio 2C). WFA parannettu apoptoosia sekä liitteenä ja kelluvat STS-soluissa.

WFA indusoiman apoptoosin vahvistettiin edelleen käyttäen transmissioelektronimikroskopia (TEM). Merkkejä apoptoosin, mukaan lukien kromatiinin tiivistyminen ja sytoplasman kutistuminen, oli havaittavissa 4 tuntia. 24 tunnin kuluttua, merkitty apoptoosin havaittiin yhdessä tumakalvoa menetys ja soluliman kupliminen; nämä vaikutukset havaittiin sekä liitteenä ja kelluvat STS soluja. Kelluva nekroottinen STS soluja havaittiin myös (~20-30% koko kelluva soluja).

Viime, arvioimme vaikutus WFA normaaleilla mesenkyymisolujen (kuvio 2E ja S3). Primaariviljelmät NHDF ja ihmisen suolen sileän lihaksen soluissa (HISMC) käsiteltiin kasvavia annoksia WFA 24 tuntia. Toisin kuin meidän havaintoja STS soluissa vähenee solujen lukumäärän ja morfologiset muutokset olivat ilmeisiä mikroskoopilla vasta suuria WFA ( 2,5 uM). Mean ± SD WFA IC

50-arvot olivat 3,7 uM ± 0,15 ja 3,2 uM ± 0,21 NHDF ja HISMC, vastaavasti. Nämä arvot olivat yli 9 kertaa korkeammat kuin havaitut STS soluissa. Samoin WFA indusoi huomattavasti matalampi apoptoosin näissä normaaleissa soluissa (P 0,05). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että WFA on voimakas proapoptoottiset yhdistettä. STS-solut ovat erittäin herkkiä WFA, kun taas normaalit mesenkymaaliset solut ovat vastustuskykyisempiä sen vaikutuksia.

WFA kumoaa STS solumigraatioon ja invaasiota

vieressä arvioitiin vaikutusta WFA STS solujen vaeltamiseen ja invaasio. STS-soluja esikäsiteltiin pienillä annoksilla WFA (0,5 uM) 4 h, jolloin WFA pestiin pois huolellisesti ja scratch haavan paranemista analyysin toimintaa. Havaitsimme vähentyneen merkittävästi muuttoliikkeen (kuva S4A). Lisäksi muutettu Boyden kammioita käytettiin kvantitointiin vaikutuksen WFA muuttoliikkeitä ja hyökkäystä. STS-soluja esikäsiteltiin pienellä annoksella WFA (0,5 uM) 4 tuntia. Lopettamisen jälkeen WFA, solut pestiin ja laskettiin; Vain elävät solut käyttää edelleen. WFA esti merkittävästi maahanmuuton ja invaasio kaikissa STS soluissa tutkittiin (P 0,05; kuva S4b).

Yksi mahdollinen vastalause Näiden kokeiden on, että vaikutus osoitti saattaa heijastaa antiapoptoottisten tai kasvua estäviä vaikutuksia WFA sijaan sen suorat vaikutukset motiliteettia ja /tai hyökkäystä. Ongelman mahdollisuus, yhdessä edellä kokeissa esikäsittelimme STS solujen pienellä annoksella WFA (0,5pM 4 h) tai DMSO (kontrolli); lopetettaessa WFA, solut pestiin ja laskettiin, ja elävät solut uudelleen pinnoitettu. Cell laskenta lopussa kokeen havaittiin vain pientä laskua ( 10%) määrä elinkelpoisia WFA-käsitellyissä soluissa suhteessa määrän valvonta-käsiteltyjen solujen (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että WFA kumoaa STS solun liikkuvuus ja invaasiota.

WFA indusoi vimentiinista hajoamista ja vimentiinista knockdown vähentää solujen herkkyyttä WFA

Tuoreessa tutkimuksessa tunnistettiin vimentiinista koska mahdolliset WFA molekyylikohteena [30]. Siksi arvioimme vaikutus WFA on vimentiinista ilmaisun ja hajoamista. WFA-hoito johti vähentyneeseen täyspitkän vimentiinista tasot ja lisääntynyt ilmentyminen vimentiinista hajoamistuotteiden kaikki STS-soluissa testattiin (kuvio 3A). WFA vaikutus vimentiinista on annoksesta ja ajasta riippuva; korkea WFA pitoisuudet johtavat vimentiinista pilkkominen jälkeen vain 4 h hoidon, kun taas vimentiinistä hajoamista havaitaan 24 tunnin jälkeen pienemmillä annoksilla.

A)

WFA käsittely (5 uM /4 h) tulosta vähentyneeseen täyspitkä (FL) vimentiinista tasot ja lisääntynyt ilmentymä vimentiinista hajoamistuotteita (VDP) kaikissa STS soluissa testattu. WFA annoksesta riippuva vaikutus SKLMS1 soluissa, joita käsiteltiin 4 h on myös esitetty. Vimentiinista pilkkominen havaitaan toissijainen mataliin WFA pitoisuudet kuluttua 24 h hoidon;

B) B Anti-vimentiinista SMARTpool siRNA (20 nM) saa aikaan vähentyneen merkittävästi vimentiinista ilmentymisen SKLMS1 soluissa (WB). Vimentiinista pudotus olennaisesti estää WFA aiheuttama (1 uM /24 h) apoptoosin;

C) B Endogeeninen vimentiinista ensin pudotettiin vuonna SKLMS1 soluissa käyttäen anti-vimentiinista antisense fosforodiamidaatti morfolino oligomeerit. Sen jälkeen Knockdown, vimentiinistä oli väkisin uudelleen soluissa ilmennetty (WB). Samanlaisia ​​tuloksia siRNA pudotus, anti-vimentiinistä morfolino oligomeerit merkittävästi estää WFA-indusoidun (1 uM /24 h) apoptoosin. Re-ilmentyminen vimentiinista palauttaa SKLMS1 herkkyys WFA;

D) B-STS-soluja (SKLMS1 ja PLS1) ilmentävät huomattavasti korkeampi liukoisen vimentiinista verrattuna normaaliin mesenkyymisolujen (sileän lihaksen solut: HA-SMC: n ja HC-SMC ja fibroblastit: NHDF). (NT siRNA = ei kohdistettu siRNA, Vim siRNA = anti-vimentiinista siRNA smartpool; NT morfolino = non kohdentamiseen morfolino; Vim KD = vimentiinista Knockdown)

Voit selvittää, onko vaikutuksen WFA STS solujen ainakin osittain välittyvät vimentiinista, valitsimme käyttää vimentiinista knockdown lähestymistapaa. Anti-vimentiinista SMARTpool siRNA herättänyt huomattavaa laskua vimentiinista ilmentymisen SKLMS1 soluissa (WB; kuvio 3B). Vimentiinista pudotus

sinänsä

ei aiheuttanut merkittävää apoptoosia STS soluissa, verrattuna mock tai ei-suunnattu siRNA transfektiota. Kuten odotettua kohti kokeissa edellä, WFA hoito johti merkittävään apoptoosin mock ja ei-kohdistaminen siRNA transfektoiduissa soluissa. Kuitenkin vimentiinistä knockdown olennaisesti estetty WFA: n indusoiman apoptoosin. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että WFA aiheuttama vimentiinista hajoaminen on välttämätöntä parantaa terapeuttisen vaikutuksen.

Vahvista mahdollista roolia vimentiinista in WFA: n indusoiman apoptoosin, käytimme pelastus kokeellista lähestymistapaa. Endogeeninen vimentiinista ensin pudotettiin vuonna SKLMS1 soluissa käyttäen anti-vimentiinista antisense fosforodiamidaatti morfolino oligomeerit. Nämä morpholinos kohdistaa vimentiinista pre-mRNA, mikä mahdollistaa pakko uudelleen ilmentäminen vimentiinista transfektoimalla vimentiinista rakentaa kestävä jatkuva läsnäolo morfolino oligomeerien. Sen jälkeen Knockdown, vimentiinistä oli väkisin uudelleen ilmaistu soluissa (WB, kuvio 3C); Soluja käsiteltiin WFA tai DMSO: ta kontrollina ja alistettiin anneksiini V /FACS-analyysi. Samanlaisia ​​tuloksia siRNA pudotus, anti-vimentiinistä morfolino oligomeerit hoito esti merkittävällä WFA: n indusoiman apoptoosin. Re-ilmentyminen vimentiinista palautettu SKLMS1 herkkyys WFA (kuvio 3C).

Sekä STS soluja ja normaaleja mesenkymaaliset solut ilmentävät vimentiinista. Kuitenkin, kuten on esitetty kuviossa 2, WFA indusoi suurempia pro-apoptoottisia vaikutuksia STS-soluissa verrattuna normaaleihin mesenkyymisolujen (eli fibroblastien ja lihassoluja). Aiempi julkaistut tiedot edellä kuvattu (30) tunnistetaan WFA sitoutua tetrameerisen, liukoinen vimentiinistä. Niinpä pyrimme arvioimaan tasoa tämän vimentiinista jae normaaleissa vs. STS soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 3D, kasvainsolut ilmentävät huomattavasti korkeampi liukoisen, vapaa vimentiinistä verrattuna normaaliin mesenkyymisolujen. Tämä havainto tarjoaa mahdollinen selitys meidän havaittu ero WFA vaikutuksia.

WFA aiheuttama vimentiinista hajoaminen on kaspaasiriippuvaisen

vimentiinista hajoamista esiintyy yleisesti kautta aktivoitumisen kaspaasi-reitin. Sen arvioimiseksi, WFA aiheuttama vimentiinista hajoaminen on seurausta kaspaasi pilkkominen, esikäsittelimme STS Z-VAD (Promega, Madison, WI), pan-kaspaasi-inhibiittori, ennen WFA hoito (24 h). Z-VAD esikäsittely johti väheni vimentiinista hajoamisen yhteydessä alhaisempi sekä pilkkoa kaspaasi-3 ja aktivoitu PARP (kuvio 4A). Lisäksi Z-VAD esikäsittely merkitsevästi kumottu WFA aiheuttamaa apoptoosia (24 h WFA hoito) STS soluissa (kuvio 4B). Seuraavaksi kun vimentiinistä pudotus käyttäen morfolino oligoja, SKLMS1 transfektoitiin ilmaista joko villityypin vimentiinista tai vimentiinista mutatoitu kaspaasi katkaisukohdat (D85N ja D259N). WFA (1 uM) indusoi selvästi apoptoosia villityypin vimentiinista transfektoituja soluja, joissa vimentiinista hajoamista ja kaspaasi-3-aktivaation havaittiin (kuvio 4C). Olemme kuitenkin havaittu merkittävä lasku WFA aiheuttaman apoptoosin soluissa, jotka ilmentävät mutatoitunut vimentiinista, ja huomasimme dramaattinen väheneminen sekä vimentiinista hajoamista ja kaspaasi-3 aktivaation (kuvio 4C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat mahdolliseen WFA aiheuttama noidankehä, jossa WFA sitoutuminen vimentiinista aikaansaa sen hajoamiseen caspases ja mainitun hajoaminen johtaa ylimääräisiä kaspaasin aktivaation ja apoptoosin.

A)

Pretreatement (4 h) ja SKLMS1 solujen Z-VAD (yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä) johtaa laski WFA aiheuttama (24 h) vimentiinista hajoaminen yhdessä alhaisempi sekä pilkkoa kaspaasi-3 ja aktivoitu PARP;

B) B Z-VAD (4 h) esikäsittelyyn merkittävästi kumoaa WFA aiheuttama (24 h) apoptoosin SKLMS1 soluissa;

C) B vimentiinista pudotti SKLMS1 transfektoitiin ilmaista joko villityypin vimentiinista tai vimentiinista mutatoitu kaspaasi katkaisukohdat (D85N ja D259N). WFA (1 uM /24 h) indusoi selvästi apoptoosia villityypin vimentiinista transfektoituja soluja, joissa vimentiinista hajoamista ja kaspaasi-3-aktivaatio voidaan havaita (WB). Kuitenkin merkittävä lasku WFA-indusoitua apoptoosia soluissa, jotka ilmentävät mutatoidun vimentiinin, havaitaan sekä lasku sekä vimentiinista hajoamista ja kaspaasi-3 aktivaation. (WT Vim = villityyppi vimentiinista; Mut Vim = mutatoitunut vimentiinista; Vim FL = täyspitkä vimentiinista; VDP = vimentiinista hajoamistuotteita)

WFA aiheuttama molekyylien sääntelyn purkaminen ovat ainakin osittain, välittyy vimentiinistä

Useat molekyylitason mekanismeja on aiemmin ehdotettu taustalla WFA antituumorigeenistä vaikutuksia, kuten estämällä AKT-fosforylaation [27], kumota NF-KB: n toiminta [20], [31], ja suora proteosomal esto [21] . Ensin pyrittiin arvioimaan, ovatko nämä molekyyli sääntelyn purkaminen tapahtuu STS soluissa vasteena WFA hoitoon. Havaitsimme WFA ja ajasta riippuva väheneminen Pakt tasolla, mutta eivät koko AKT tasoilla, STS-soluissa (kuvio 5A). Vastaavasti, annoksesta riippuvalla väheneminen NF-KB (p65) on myös osoitettu, että vaikka tämä lasku oli vain 24 tunnin jälkeen hoidon. NF-KB: n aktiivisuuden, ja toisaalta, osoitettiin inhiboituvan pian hoidon, mikä viittaa siihen, muiden mekanismien kuin laski NF-KB-proteiinin ilmentymisen, jotka vaikuttavat NF-KB: n aktiivisuutta. Lisäksi löysimme selvästi annoksesta ja ajasta riippuvaa kerääntymistä ubikitinoitu proteiineja, tukemalla WFA aiheuttama proteosomal esto näissä soluissa.

A)

WFA hoito sai aikaan ja ajasta – alentavan Pakt ilman vaikutusta koko AKT: tä. Vastaavasti, annoksesta riippuvalla väheneminen NF-KB (p65) proteiinia ilmentyminen on myös nähtävissä, vaikka tämä lasku tapahtuu vain 24 tunnin jälkeen hoidon. NF-KB: n aktiivisuuden PLS1 soluissa, kuten on kuvattu kaavioita edustaa lusiferaasireportteri määrityksen tulokset, on osoitettu olevan estyy pian hoidon (4 h). Merkitty ja ajasta riippuva kertymistä ubikitinoitu proteiinien on myös esitetty;

B) B-vimentiinista pudotus on SKLMS1 soluissa kumoaa WFA (2,5 uM /24 h) indusoidun Pakt inhibition, NF-KB-proteiinin vähenemistä, ja kohonneeseen proteiinin ubikitinaation. Samoin vimentiinistä taintumisen lohkot WFA (1 uM /4 h) aiheuttaman väheneminen NF-KB: n aktiivisuutta. Kuvaajat edustavat keskimäärin kolme kokeiden toisto ± SD.

Tuloksemme viittaavat keskeinen rooli vimentiinista soluissa ”vastauksena WFA. Niinpä pyrimme arvioimaan, voitaisiinko WFA näihin erilaisia ​​reittejä voi, ainakin osittain, välittyvän vimentiinista. SKLMS1 soluja transfektoitiin ohimenevästi anti-vimentiinista siRNA tai ei-suunnattu siRNA ja käsiteltiin sitten WFA. Vimentiinista pudotus kumotaan WFA aiheuttama Pakt inhibition, NF-KB-proteiinin vähenemistä ja toiminnan salpaus, ja kohonneita proteiinin ubikitinaation (kuvio 5B). Nämä kokeet tarjoavat lisäksi näyttöä siitä, että vaikutukset WFA välittyvät vimentiinista ja korosta uusia potentiaalisia vimentiinista toimintoja.

WFA indusoi apoptoosia endoteelisolujen viljeltiin STS-elatusaine

Analogisesti kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia, STS koostuvat sekä kasvaimen ja kasvaimeen liittyvien normaaleissa soluissa; STS kasvu, muuttoliike, ja levittäminen riippuu ylikuuluminen näiden kahden osaston. STS ovat yleensä hyvin verisuoni- ja angiogeenisen, jolloin lisääntynyt metastaattisen potentiaalin. Aiemmat tiedot viittaavat siihen, että WFA saattavat satama antiangiogeenisesti ominaisuuksia [17], [30]. Jotta voitaisiin edelleen laajentaa nämä ensimmäiset havainnot ja arvioitava mahdollisuudet antiangiogeenisen vaikutukset WFA yhteydessä STS microenvironment, arvioimme vaikutus WFA endoteelisolujen kasvatettu säännöllistä valvontaa väliaineessa (puuttuu angiogeenisten tekijöiden, matkien lepotilassa endoteelisolut) ja endoteelisoluissa viljeltiin STS-väliaine (CM; matkimalla lisääntyvien angiogeenisten endoteelisolujen). Käytimme sekä ihmisten endoteelin (HDMEC) ja hiiren endoteelisolujen (LEC) ja havaittiin merkittävästi suurempi WFA aiheuttama kasvun esto endoteelisoluissa viljeltiin STS-CM kuin verrokeilla väliaineessa (keskiarvo ± SD WFA IC

50: 0,42 uM ± 0,16 vs. 1,4 uM ± 0,04 HDMEC ja 0,38 uM ± 0,09 vs. 2,3 uM ± 0,1 LEC; P 0,05, kuva 6A). Samoin WFA indusoi korkeamman apoptoosin endoteelisolujen kasvatettu STS-CM kuin verrokeilla väliaineessa (kuvio 6B).

A)

merkitsevästi korkeampi WFA aiheuttama (24 h ) kasvun esto nähdään endoteelisolujen (ihmisen ihon mikroverisuoniendoteelisoluja-HDMEC ja hiiren keuhkon endoteelisolut-LEC) viljeltiin STS väliaine (CM) kuin verrokeilla säännöllistä väliaineessa (RM);

B) B WFA (1 uM /24 h) indusoi korkeamman apoptoosin endoteelisolujen kasvatettu STS-CM kuin verrokeilla väliaineessa;

C) B WFA (1 uM /24 h) indusoi huomattavasti suurempia vimentiinista hajoamisen ja kaspaasi-3-aktivaation endoteelisolujen kasvatettu STS-CM kuin lepotilassa endoteelisoluissa;

D) B WFA (1 uM) kumoaa muuttoliike ja invaasion endoteelisolujen viljelty STS-CM;

E) B WFA (2 mg /kg) johtaa merkittävään väheneminen määrän keskiarvon CD31-positiivisten (punainen) verisuonia vertailuryhmän DMSO hoitoa käytettäessä

in vivo

Gelatiini sienellä määritys . CD-31 (punainen) /TUNEL (vihreä) kaksinkertainen värjäys paljastaa endoteelisolujen apoptoosin WFA-käsitellyissä hiirissä. Kuvaajat edustavat keskimäärin kolme kokeiden toisto ± SD. (Vim FL = täyspitkä vimentiinista; VDP = vimentiinista hajoamistuotteita)

endoteelisolut mesenkymaaliset alkuperää ja näin ollen ilmaista vimentiinista, joten arvioimme vaikutus WFA on vimentiinista ilmaisun ja pilkkominen sekä tavallisissa media ja STS-CM. Mielenkiintoista, WFA indusoi huomattavasti suurempia vimentiinista hajoamisen ja kaspaasi-3-aktivaation endoteelisolujen kasvatettu STS-CM kuin lepotilassa endoteelisoluissa (kuvio 6C). Seuraavaksi arvioimme vaikutus WFA on endoteelisolujen migraatiota ja invaasiota. Samanlainen edellä kuvattu kokeellinen lähestymistapa hyödynnetään STS soluja, käytimme elinkelpoisten endoteelisolujen esikäsitelty lyhytaikainen WFA (4 h) modifioitu Boyden kammiossa määrityksiä. Kuten odotettua, STS-CM parannettu endoteelisolujen migraatiota ja invaasiota. Tärkeämpää, WFA kumotaan muuttoliike ja invaasion endoteelisolujen viljelty STS-CM, mutta ei niitä kasvatetaan säännöllisesti väliaineessa (kuvio 6D).

Viime, vahvistaa, että havaitut WFA angiogeneesin vastainen vaikutus ilmenee

in vivo

samoin, teimme Gelatiini sienellä angiogeneesimääritys Gelatiini sienellä sienet inkuboitiin STS-CM ja istutettiin ihonalaisesti kylkiin SCID hiirillä. Kaksi päivää istutuksen jälkeen, hiiriä käsiteltiin i.p. WFA (2 mg /kg; n = 4) tai DMSO: ta (n = 4) 10 peräkkäisenä päivänä; at päättymisen Tutkimuksen Gelfoams leikattiin irti ja alistettiin IHC-analyysi (kuvio 6E). WFA hoito johti vähentynyt merkittävästi määrän keskiarvon CD31-positiivisten verisuonten vertailuryhmän DMSO hoitoon (41 ± 7,2 vs. 6 ± 5,3, tässä järjestyksessä; P 0,05). CD-31 /TUNEL kaksinkertainen värjäys paljasti endoteelisolujen apoptoosin WFA-käsitellyissä hiirissä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että WFA mahdollisesti kumoaa solujen kasvua, estää maahanmuutto- ja invaasio, ja indusoi apoptoosia lisääntyvissä endoteelisoluissa sisällä STS microenvironment.

epiteeliperäisten syövät herkkyys WFA paranee soluissa näytteille epiteelin ja mesenkymaalitransitioon ( EMT) B

keskeinen hypoteesi on, että solut, jotka ilmentävät vimentiinista odotetaan osoittavan korkeampaa WFA herkkyys. Toisin STS, yleisempää epiteelin alkuperä syövistä eivät luonnollisesti ilmaista vimentiinista. Kuitenkin merkittävä tiedot osoittavat, että sekä invaasio ja etäpesäkkeiden voivat kriittisesti riippuvainen hankinnasta ”mesenkymaalisten” fenotyyppi alkava syöpäsolu [32], [33], [34]. Yksi tunnusmerkkejä tämän epiteelin ja mesenkymaalitransitioon, indusoidaan vimentiinistä ilme. Kun tämä otetaan huomioon, analysoimme vimentiinistä ilmaisun paneelia sinoomasolulinjoja ja arvioitiin niiden reaktio WFA. Kolme solujen (MCF7, HT29, ja TMK1) ei esiintynyt vimentiinista mRNA ja proteiinin ilmentymisen, ja kaksi muuta (MDA231 ja A549) ilmaistuna vimentiinista (kuvio 7A). Solut, jotka ilmentävät vimentiinista olivat huomattavasti herkempiä WFA kuin eivät ilmennä vimentiinista (keskiarvo ± SD WFA IC

50 arvoja MDA231 ja A549-solut olivat 1,3 uM ± 0,42 ja 1,8 uM ± 0,37, vastaavasti, ja 2,9 uM ± 0,31, 7,8 uM ± 2,34, 3,1 uM ± 0,18 MCF-7, HT29, ja TMK1 solut, vastaavasti; P 0,05). Samoin WFA (1 uM 24 h) herättänyt huomattavasti korkeampi apoptoottisten korko vimentiinista ilmentäviä karsinoomasolut (P 0,05; kuvio 7B). WB-analyysi osoitti myös vimentiinista hajoamistuotteiden MDA231 soluissa yhdessä tehostetun halkaistut kaspaasi-3 ja aktivoitu PARP ekspressiotasot (kuvio 7C). Sitä vastoin vain vähän tai ei lainkaan ekspressiota pilkottiin kaspaasi-3 ja aktivoitu PARP osoitettiin MCF7 ja HT29, vastaavasti. Tässä esitetyt tiedot tukevat edelleen rooli vimentiinista kuin WFA molekyylikohteena, mikä viittaa mahdolliseen terapeuttiseen tehoon WFA on epiteelisyövissä näytteille EMT fenotyyppejä.

A)

WFA aiheuttama kasvun esto vastaa että vimentiinista ekspressiotaso epiteeliperäisten syöpäsoluja;

B) B WFA (1 uM 24 h) saa aikaan merkittävästi suuremman apoptoottisten korko vimentiinista ilmentäviä karsinoomasoluja;

C) B WB analyysi osoittaa, vimentiinista hajoamista MDA231 solut yhdessä tehostetun halkaistut kaspaasi-3 ja aktivoitu PARP ekspressiotasoja. Kaikki rakenteet vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla.