Krooninen sairaus

tiivistelmä

Berberiini on todettu anti-proliferatiiviset vaikutukset eri syöpäsoluja. Monet tutkijat ovat yrittäneet valaista syövän mekanismeja Berberiini perustuu ilmentyvät eri geeneistä. Kuitenkin differentiaalisesti vaihtoehtoisen silmukoinnin geenien aiheuttama Berberiini voi myös edistää sen farmakologiset vaikutukset ja ei ole raportoitu vielä. Lisäksi mahdollisuus toiminnalliset rajat puhumisen välillä kaksi geenien ansaitsee tutkia edelleen. Tässä tutkimuksessa, RNA-seq tekniikkaa käytettiin havaitsemaan differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja differentiaalisesti vaihtoehto saumattu geenejä BEL-7402 syöpäsoluihin aiheuttama berberine. Toiminnalliset rikastamiseen analyysi osoitti, että nämä geenit olivat pääasiassa rikastettu p53 ja solusyklin signalointireitille. Lisäksi se oli tilastollisesti todistettu, että kaksi geenit olivat paikallisesti yhteistyössä rikastettu pitkin kromosomia, läheisesti toisiinsa perustuen proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen ja toiminnallisesti samanlaiset Gene ontologia puu. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kaksi geenit säätelevät berberiini saattaa olla toiminnallisesti rajat puhui ja yhdessä edistää sen solusyklin pidätti vaikutus. Se on tarjonnut uusia vihjeitä edelleen tutkii farmakologisen mekanismeista Berberiini sekä muut kasvitieteellinen huumeita.

Citation: Sheng Z, Sun Y, Zhu R, Jiao N, Tang K, Cao Z, et al . (2015) Toiminnallinen Cross-Talking välillä ilmentyvät eri ja vaihtoehtoisesti liitettyjä Geenit ihmisen maksan Syöpäsolut Hoidettu Berberiini. PLoS ONE 10 (11): e0143742. doi: 10,1371 /journal.pone.0143742

Editor: Emanuele Buratti, kansainvälinen keskus geeni- ja biotekniikan, ITALIA

vastaanotettu: toukokuu 14, 2015; Hyväksytty: 09 marraskuu 2015; Julkaistu 25 marraskuuta 2015

Copyright: © 2015 Sheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat osittain National korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma ( ”863” Program) Kiina (2012AA020405), ja rahoitus ministeriön Health (2012ZX10005001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet : DASG, Differentially Alternative saumattu Genes kahden näytteen välillä; DEG, differentiaalisesti ilmentyvien geenien kahden näytteen välillä

Johdanto

Vaihtoehtoinen silmukointi on tiukasti säänneltyä prosessin aikana geenin ilmentymisen, joka voi tuottaa eri proteiinin samasta geenistä. Lisäksi on osoitettu, että vaihtoehtoisen silmukoinnin voi myös määrittää sitovia ominaisuuksia, solunsisäinen sijainti, entsymaattinen aktiivisuus, proteiinin stabiiliuden ja translaation jälkeisiä modifikaatioita suuri määrä proteiineja [1]. Viime vuosina yhä useammat farmakologisen tutkijat ovat havainneet, että pienen molekyylipainon lääkkeitä voitaisiin käyttää niiden farmakologisia vaikutuksia ei vain säädellään transkription tasot geenien mutta myös muuttamalla geenin vaihtoehtoisen silmukoinnin [2].

berberine, joka on isokinoliini kvaternaarinen eristetty alkaloidi berberis lajeista [3], on laaja kirjo farmakologisia vaikutuksia, kuten anti-mikrobi, diabeteksen ja anti-tulehdus [4]. Kliinisesti sitä on käytetty hoitamaan erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien sepelvaltimotauti, diabetes, alkoholittomat rasvamaksa, hyperlipidemia, metabolinen oireyhtymä, liikalihavuus ja munasarjojen monirakkulatauti (https://www.clinicaltrials.gov/). Viime aikoina, varaamiseen tutkimuksissa on havaittu, että Berberiini myös hallussaan voimakas syövän vastaista aktiivisuutta, joilla on vähän tai vähän epätoivottuja myrkyllisiä vaikutuksia [5, 6]. Siksi monet tutkijat ovat yrittäneet valaista syövän mekanismeja Berberiini perustuu geenin differentiaalikaavojen. Esimerkiksi on raportoitu, että berberiini voisi indusoida apoptoosia HepG2-soluissa kautta AMPK-välitteisen mitokondrioiden reitin lisäämällä suhde Bax /Bcl-2 [7]. Aiemmissa tutkimuksessa olemme myös havainneet, että berberiini voi aiheuttaa G1 solusyklin pysähtymisen BEL-7402-solujen osittain kautta häiritsemättä vuorovaikutusta kalmoduliinista kanssa CaMKII ja estää muita p27-proteiinin hajoamista. [8]

Vaikka nämä teokset ovat antaneet joitakin perustavaa laatua tietoa syövän vastaisen mekanismi berberiini, vaihtoehtoisen silmukoinnin syöpäsoluissa jälkeen käsitelty Berberiini ei ole raportoitu vielä. Ensinnäkin, se on ymmärtää, että monet syöpälääkkeiden voi estää syöpäsolujen kasvua muuttamalla geenin vaihtoehtoisen silmukoinnin [9-11]. Lisäksi on raportoitu, että geenin transkription ja vaihtoehtoisen silmukoinnin voidaan fyysisesti ja toiminnallisesti kytketty [12, 13], jolloin yhdessä edistää farmakologisia vaikutuksia näiden lääkkeiden. Sen vuoksi on tarpeen mittaamaan samanaikaisesti differentiaalisesti ilmentyvien geenien (DEGS) ja differentiaalisesti vaihtoehtoisesti silmukoituneet geenejä (DASGs) syöpäsoluissa hoidon jälkeen berberiini ja systemaattisesti tutkia, onko minkäänlaista toiminnallista rajat puhuu näiden kahden geenien .

kysymys edellä mainittiin, uusimman sukupolven sekvensointi teknologia (RNA-seq) käytettiin saamiseksi transcriptomic profilointi BEL-7402-solujen jälkeen berberine hoidon. Sitten DEGS ja DASGs aiheuttama berberine huolellisesti havaitaan sarja sekvenssianalyysillä työkaluja. Lopuksi toiminnallinen ylikuuluminen näiden DEGS ja DASGs analysoitiin tilastollisesti ja niiden mahdollinen osuus syövän vastaisen vaikutuksen Berberiini keskusteltiin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

perustettiin ihmisen maksan syöpäsolu linja (BEL-7402, Cat. No .: TCHu_10) [8, 14, 15] ostettiin ja talletetaan kantasolupankit instituutin Biokemian ja solubiologian, Shanghai Institutes for Biological Sciences, kiinalainen Academy of Science (https://www.cellbank.org.cn/) ja ystävällisesti Dr. Xuan Liu (Shanghai Institute of Materia Medica, Kiinan tiedeakatemia, Shanghai, PRChina). Soluja pidettiin kosteutetussa 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 ja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa (GIBCO, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM /L-glutamiinia, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 mg /ml streptomysiiniä. Tässä tutkimuksessa olemme yhdistäneet 3 ~ 5 biologinen toistojen yhteen RNA-seq kokeilu saavuttaa saman määrän kokonais-RNA sisältöä. Tarkemmin sanottuna, solun viljelemisen jakson syöpäsoluja 8 ~ 10 eri petrimaljoille jaettiin kahteen yhtä suureen ryhmään. Yksi ryhmä on käytetty berberiini käsitellyssä ryhmässä, muut käytettiin kontrollina /hoitamattomassa ryhmässä.

RNA: n eristämistä

uuttamalla kokonais-RNA, solut maljattiin 10 cm: n levyille (Corning, Acton, MA, USA) täydellisessä väliaineessa 12 tuntia. Sitten, 50 uM berberine (puhtaus ≥ 98%, Tauto Biotech, Shanghai, Kiina, IC50 mukaan Ref. [8]) lisättiin ja jätetään kosketuksiin 24 tuntia. Sen jälkeen solut huuhdeltiin PBS: ssä ja hajotettiin TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Jäljelle jäänyt kontaminoivaa genomista DNA: ta poistettiin kokonais-RNA osa käyttäen Turbo DNA-sarjaa (Ambion, Austin, TX, USA). mRNA eristettiin DNA-free kokonais-RNA käyttäen Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. Lopuksi, jotta saadaan riittävästi määrä mRNA sisällön sekvensointia varten, koko RNA-näytteet kustakin ryhmästä yhdistettiin yhdeksi yhdistetty näyte.

transcriptome sekvensointi

mRNA valinta, kirjasto valmistelu ja sekvensointi suoritettiin Shanghai ceneter varten bioinformaatioteknologian (SCBIT) kantaa Illumina Hiseq 2000 sekvensointialustamme mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, mRNA valittiin käyttäen oligo (dT) koettimia, ja sen jälkeen fragmentoida kaksiarvoiset kationit. cDNA: t syntetisoitiin käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita, muutettu ja rikastettiin kiinnitys Illumina virtausta soluun. Sekvensoimme kaksi 60-sykli 100 emäsparin × 2 pariksi-end rataa, tuottaa ~ 83100000 lukee.

Nämä linjaus

Raaka sekvensointi lukee karsittiin pois Ns ja heikkolaatuinen alueilla (keskiarvo pohja laatu pisteet 5 mer slide-ikkunan alle 20, eli sekvensointi virhemäärä ≤1%). Lue-pareja, joissa on vähintään 36 emäsparin jäljellä kussakin lukea pidettiin puhtaana lukee. Sekvensointi laatu arvioitiin käyttämällä FastQC [16]. Sitten, puhdas lukee kartoitettiin ihmisen viite genomin (Ensembl GRCh37.66 = hg19) käyttäen aligner Tophat [17] (versio 2.0.6) parametreilla (r /-vuori-mate-etäisyys: 70, -g /-max -multihits: 1, -ei-kattavuus-haku, -ei-romaani-junc, muut kuin oletus). Lähdöt Tophat käytettiin panoksia HTSeq [18] ja AltAnalyze [19] suorittaa geenin ero ilmentymiseen tai vaihtoehtoisen silmukoinnin analyysiä vastaavasti.

Differential geenin ilmentymisen analyysi

DEGS (ilmentyvät differentiaalisesti geenit) viitataan niihin geenejä merkittäviä muutoksia niiden ilmaisun tasolla. Ensinnäkin, määrä lukee kartoitettu genomisen alueen kunkin geenin jokaista näytettä arvioitiin HTSeq [18]. Sitten DESeq [20] käytettiin arvioimaan eron geenin ilmentymisen eri näytteitä. Lopuksi DEGS suodatettu seuraavia sääntöjä: 1) itseisarvo log2 [fold-muutos] oli suurempi kuin 1. 2) p-arvo oli alle 0,05.

Differentially geenin vaihtoehtoisen silmukoinnin analyysi

DASGs (Differentially Alternative saumattu Genes) viitataan niihin geenejä, joilla ei ole tai pieniä vaihteluita niiden koko-geenin ilmentymisen tasoa, mutta merkittäviä muutoksia niiden eksonissa käyttö, etenkin vaihtoehtoisten eksonit (kuvio 1). Ero silmukoinnin analyysi kuvaa eroja vaihtoehtoisen silmukoinnin sivuston käytön kahden näytteen välillä, joka on kriittinen tutkimuksia mekanismeja vaihtoehtoisen silmukoinnin ja sen sääntely, ja pystyy paljastamaan toiminnallista monimuotoisuutta on jäänyt differentiaalisella geeniekspressioanalyysissä [21]. Kymmeniä käytettävissä ohjelmistotyökaluja ja paketteja, kuten Cuffdiff2 [22], MISO [23], DEXseq [24], DEGseq [25], DiffSplice [26], Jatkaminen kompassi [27], AltAnalyze [19] ja jne, otti käsitteellisesti erilaisia ​​lähestymistapoja, jotka voivat tunnistaa ero silmukoinnin tasolla isoformin /transkriptio, eksoni tai molempia. Kuitenkin valinta sopivan lähestymistavan tutkimus riippuu kokeellinen tavoite ja odotettu lopputulos. Näistä lähestymistavoista ja paketteja, vain AltAnalyze tarjoaa graafisen käyttöliittymän, kun taas loput ovat ajetaan Commend linja. Lisäksi AltAnalyze tarjoaa kätevän työnkulun purkaa merkittävän vaihtoehtoisen silmukoinnin sääntelyn tapahtumia ja sen jälkeen tutkia mahdollisuuksia biologisen vaikutuksia tällaisten silmukointitapahtumilla ja siihen liittyvien mekanismien yhteydessä molekyylivuorovaikutusten ja sitovat kohdat [19]. Useita algoritmit ovat saatavilla AltAnalyze tunnistaa yksittäisiä ominaisuuksia (eksonit tai risteykset) tai vastavuoroista risteykset ovat differentiaalisesti säännelty suhteessa geenin ilmentymisen muutoksia. Tässä työssä, yksi ominaisuus analyysi (jatkaminen Index, SI) suoritettiin heti vastavuoroisia risteyksen analyysejä (analyysi Jatkaminen mukaan isoformiseosten Vastavuoroisuus, ASPIRE) [28] samassa luettelossa ilmaistu ominaisuuksista, jonka avulla voimme tarkastella vaihtoehtoisia eksonit ennustettiin paria vastavuoroinen liittymien lisäksi ennakoidut yhden säännellyn eksonit /liittymissä (ks AltAnalyze-Manual). Jatkaminen indeksi on yksi mittaus ero liitos kahden näytteen välillä. Eksonit SI-arvo on suurempi kuin 1 merkitsee enemmän sisällyttäminen eksonin kypsynyt mRNA saumauksen aikana prosessin käsitellyssä näytteessä verrattuna kontrollinäytteeseen, kun taas ne, joilla on SI-arvo on vähemmän kuin 1 tarkoittaa vähemmän sisällyttämistä mutta ohitus eksonin, ja niitä SI-arvo on 1 tarkoittaa, ettei muutosta käyttö eksoni.

. Ilmaisu tai vaihtoehtoisen silmukoinnin DPM1 geenin pysyi ennallaan jälkeen berberine hoidon. B. silmukoinnin NFKBIA geenin pysyi ennallaan jälkeen berberine hoidon osoittamalla tavalla silmukoinnin (SI) arvo kunkin sen eksonien. Kuitenkin, ekspressio NFKBIA geenin voimistuvan yli 2-kertainen, kun berberiini hoidon (p 0,05), koska kukin sen eksonit yli-ilmentynyt. C. silmukoinnin RLIM geenin muutettu berberiini hoidon kuten on osoitettu SI arvo eksonin 2 (SI 0,5) sisällä RLIM geenin. Mutta ilmaus RLIM geenin ei ole muuttunut merkittävästi sen jälkeen, berberiini hoidon. Suhteellinen ekspressio, suhteellisen ilmentymistason geenin tai kaikki eksonit verrattuna kontrollinäytteeseen.

*, DEG;

#, DSAG.

Differentially vaihtoehtoisen silmukoinnin analyysi suoritettiin käyttäen AltAnalyze oletusparametrit. Ensinnäkin oli kolme kriteeriä eksonien suorittaa differentiaalisesti geenin vaihtoehtoisen silmukoinnin analyysi: 1) Vähintään 5 lukee oli kartoitettu eksonin; 2) RPKM (Lukee Per Kilo-base eksonin mallin miljoonassa kartoitettu lukee) arvo eksonin oli suurempi kuin 0,3; 3) ilmaisulla muutos vastaavan geenin oli alle 2-kertainen. Sitten kaksi eksoni-keskeinen algoritmeja käytettiin havaitsemaan differentiaalisesti vaihtoehtoisen silmukoinnin eksonit: jatkaminen (SI) ja analyysi jatkaminen mukaan isoformiseosten Vastavuoroisuusmekanismi (ASPIRE) [28]. SI-arvo kullekin eksoni tai risteyksen laskettiin alla.

(1)

Missä,

RPKM

(

eksoni

i

) ja

RPKM

(

geenin

) olivat ilmentymistä arvo i: nnen eksonin ja geenissä, vastaavasti. SI algoritmi, eksonit SI 2-kertainen kutsuttiin AS-exons_SI. Vuonna pyrkii algoritmi, eksonit jossa Ai 0,2 kutsuttiin AS-exons_ASPIRE. Kyseisiä kahta algoritmeja on kuvattu AltAnalyze työnkulun (https://www.altanalyze.org/). Päällekkäisiä vain AS-eksonien molemmat algoritmit valittiin edelleen toiminnallista analyysiä. Ja geenit, jotka sisältävät näitä eksonit kutsuttiin erilaisesti vaihtoehto saumattu geenejä (DASG).

Gene Set Functional rikastus Analysis

Gene joukko rikastamiseen analyysit tehtiin toiminnallisen merkinnästä DEGS ja DASGs erikseen. Toiminnallinen Käsinkirjoitustyökalut in DAVID bioinformatiikan Resources [29] käytettiin tällaisten analyysien tekemiseen. Ne geeni ontologian (GO) [30] biologisen prosessin kannalta tai Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) [31] väyliä väkevöimistä p-arvo alle 0,05 (modifioitu Fisherin testiä) ja yli kaksi geeniä pidettiin merkittävästi rikastettu toiminnot tarkempaa analysointia.

paikallinen yhteistyö rikastamiseen analyysi pitkin kromosomi sekvenssit

sen testaamiseksi, DEGS ja DASGs osoitti vastaavia rikastamiseen jakautuminen pitkin kromosomeja, paikallisosuuspankit rikastaminen analyysi. Ensinnäkin rikastumisen pisteet (

ES

) laskettiin geenin asetettu kussakin kromosomissa bändi, joka näytetään myös intensiteetti kyseisen alueen kuvion 2A [32]. Koska geeni asetettu

X

:

{x

1

,

x

2

,

… x

N

}

, kromosomi band

b

:

{b

1

,

b

2

,

… b

M

}

määrä geenejä kullakin kaistalla

g

:

{g

1

,

g

2

,

… g

M

}

, sitten

ES

pisteet laskettiin seuraavaa.

(2)

. Global intensiteetti tontti sijoitteluun rikastamiseen DEGS ja DASGs. Jokainen solu kuvaa kromosomaalisen bändi ja intensiteettiä sen väri on verrannollinen vastaavaan rikastuminen DEGS tai DASGs tällä taajuusalueella, joka on normalisoitu molemmat kokonaismäärä geenien kaistalla ja määrän joko DEGS tai DASGs. Kukin pylväs edustaa kromosomi sisältää kaikki bändit ja väri, joko sininen tai punainen, ennen pylvään erottamaan luokan geenien DEGS ja DASGs. B. viulu kuvaaja paikkasidonnaisen yhteistyössä rikastus pisteet (etäisyys) kahden geenin sarjaa. Käyrä, joka kattaa keltainen alue edustaa etäisyyttä jakautumista kaksi satunnaista geenin sarjaa samankokoisia DEGS ja DASGs vastaavasti. Lyhyempi etäisyys tarkoittaa korkeampaa yhteistyössä rikastaminen näiden kahden geenin sarjaa. Punainen timantti piste tarkoittaa etäisyyttä DEGS ja DASGs.

Tämän jälkeen

ES

pisteet vektori

EX

:

{ex

1

,

ex

2

,

… ex

M

}

oli saanut geenien set

X

kaikilla kaistoilla

B

. Vastaavasti toinen vektori

ey

:

{ey

1

,

ey

2

,

… ey

M

}

voitaisiin sai toisen geeniperimä

Y

. Lopuksi samankaltaisuus (

LCE

) kahden värin bändit

X

ja

Y

mitattiin euklidinen etäisyys toisistaan.

(3)

Global läheisyys proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen (PPI) verkko

arvioida topologinen läheisyyden välillä DEGS ja DASGs että PPI-verkkoon, keskimäärin lyhimmän reitin pituus niiden välillä käytettiin toimenpiteen. Keskimääräinen lyhin polku pituus on käsite verkkotopologia, joka on määritetty keskimäärin vaiheita pitkin lyhimmän polun kaikki mahdolliset paria verkon solmut, joka on mitta tehokkuudesta tietoja liikenteen verkossa [33]. Tämä toimenpide on myös sovellettava kahden aliverkossa kysymyksiä laskemalla keskimääräinen reittietäisyyteen kaikkia mahdollisia pareja solmuja näistä kaksi verkkoa, x ja y. (4) jossa D (i, j) on lyhin tie etäisyys

i

nnen geenin osajoukko x ja j: s geenin osajoukon y. Tässä analyysissä taustalla verkko rakennettiin käyttäen koko PPI tiedot Internet-tietokannasta Ihmisen proteiini viitetietokantaan (HPRD).

Functional semanttinen samankaltaisuus Gene ontologia (GO) puu

On the tree Gene ontologia, geenit luokitella eri funktionaaliset ryhmät nimettiin GO ehdot perustuvat biologisiin prosesseihin, joissa ne ovat mukana. Perustuen kuvaaja rakenteesta GO, semanttinen samankaltaisuus minkä tahansa kahden GO termejä laskettiin kuvatulla Wang et.al [34] käyttäen GOSemSim paketti [35]. Sitten semanttinen samankaltaisuuteen kahden geenin sarjaa kuten DEGS ja DASGs voitaisiin laskea keskiarvona kaikkien mahdollisten parien GO termejä, joihin geenit näissä kahdessa geenissä sarjaa. Koska kaksi luetteloa GO termejä,

lähteä

1

ja

lähteä

2

liittyy geenien kahden geenin sarjaa,

X

ja

Y

, semanttinen samankaltaisuus

SemSim

määriteltiin: (5) Jos

N

GO

on kokonaismäärä GO termejä käytetään semanttisen samankaltaisuuden laskentaan.

tulokset

Yhteenveto RNA-seq tulokset BEL-7402 solut käsitellään berberine

koko transcriptomic profilointi BEL-7402 solut käsitellään tai ilman berberine arvioitiin emäsparin resoluutio kautta RNA sekvensoinnilla. Sen jälkeen huonolaatuisia lukee (kuten edellä Read linjaus osiossa Materiaalit ja menetelmät) on puhdistettu, noin 30 miljoonaa lukee ulos ~ 41,5 milj raaka lukee (lukee pysyvyytensä: 70%, GC-pitoisuus: 45 ~ 46%, sekvenssi pituus: 36 ~ 100 bp) kartoitettiin viitata genomin kullekin näytteelle (taulukko 1). Mukaan ”

Standards

,

Ohjeet ja parhaat käytännöt RNA-Seq

” hyväksymän ENCODE [36], tämä sekvensointi syvyys on hyvä ero ilmentymisen analyysiä ja on hyväksyttävää vaihtoehtoisen silmukoinnin analyysiä ihmisen transcriptome.

Differentially ilmaistaan ​​ja vaihtoehtoisesti saumattu geenien aiheuttama berberine hoito

Kun analysoitiin DESeq ohjelmisto, RNA-seq tulokset palautetaan 343 DEGS in BEL-7402-solujen jälkeen käsitelty jossa berberiini, jossa 111 säädelty ja 232 alassäädetty (taulukko A S1 File). Mielenkiintoista, biologinen prosessi vastaus bakteerin (GO: 0009617) havaittiin merkittävästi rikastaa sääteli DEGS (taulukko 2), joka on sopusoinnussa kliininen käyttö Berberiini kuin laaja-alaista anti-mikrobi lääketiede [3]. Ja löysimme geenit liittyvät positiivisten angiogeneesin säätelyyn laskivat tuntuvasti-säädellään berberiini, jonka osuus anti-angiogeneettisiä aktiivisuus Berberiini raportoitu aiemmista teoksista. [37-39] mukaan Kegg koulutusjakson rikastamiseen analyysin DEGS merkittävästi rikastuneet p53 signalointireitillä (hsa04115) ja useat syöpään liittyvien reittien kuten Jak-STAT signalointireitin (hsa04630), Apoptosis (hsa04210) ja Pathways syövän ( hsa05200) (taulukko 3). JAK-STAT signalointi reitti on tärkeä signalointi osallistuu sääntelyn immuunijärjestelmän, mikä viittaa koskemattomuus säätelevä aktiivisuus Berberiini voi vaikuttaa sen syövän vaikutusta.

Samalla vaihtoehtoisten silmukoinnin analyysi suoritettiin käyttäen AltAnalyze ohjelmistoa. Tulokset osoittivat, että 1083 erilailla vaihtoehtoisesti liitettyjä eksonit, mikä vastaa 867 DASGs (taulukko B S1 File) havaittiin BEL-7402 syöpäsoluihin jälkeen berberine hoidon. Taken RLIM geeni esimerkkinä (kuvio 1), sisällyttäminen taso eksonin 2. kypsynyt mRNA oli merkittävästi muuttunut (liitos indeksi 0,5) jälkeen berberine hoidon, vaikka oli vain pieni muutos koko sen geenin ilmentymisen taso. Verrattuna RLIM oli dramaattisesti vaihtelua (fold-muutos 6) geeni-ilmentymisen tason NFKBIA (esimerkkinä DEG), mutta mitään merkittäviä muutoksia (liitos index ≈ 1) kun sisällyttäminen sen eksonien (kuvio 1). Kuten on esitetty taulukossa 2 DASGs olivat mukana erilaisia ​​biologisia prosesseja, kuten solukierron (GO: 0007049), kromosomi organisaatio (GO: 0051276), makromolekyylikompleksi kokoonpano (GO: 0065003) ja solujen vasteena stressille (GO: 0033554). Pathway rikastamiseen analyysi edustaa että nämä DASGs rikastuneet PI3K-AKT-mTOR signalointireitistä (on: 04150) ja sääntely aktiinisytoskeletonin (on: 04810) (taulukko 3), jossa kaikki erittäin liittyvät solusyklin prosessiin ja solujen lisääntymistä [40 ]. On selvää, nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä DASGs saattavat myös liittyä kanssa syövän vastaisen toiminnan Berberiini.

Tilastollinen analyysi toiminnallisen rajat puhumisen välillä DEGS ja DASGs

Tutkiakseen, onko minkäänlaista toiminnallisten rajat puhumisen välillä DEGS ja DASGs, tilastolliset testit suoritettiin kolmesta ensisijainen mutta eri näkökulmista.

Paikallinen yhteistyö rikastamiseen keskuudessa kromosomin sekvenssit.

Intuitiivisesti on testaukseen ensiksi, onko ne DEGS ja DASGs rikastuvat yhdessä samaan tai lähellä alueet kromosomeissa. Toteuttaa tätä tentti, jonka rikastusaste tilanne oli kullekin bändi kaikkien kromosomien DASGs ja DEGS vastaavasti [32]. Kuten kuvassa 2A, ne DEGS ja DASGs näytteillä varsin erilainen rikastamiseen jakaumat maailmanlaajuisesti. Kuitenkin kuviot voisi löytyä kunkin paikallisen alueen. Useimmat DASG rikastetun sivustot ovat tai lähellä sivustoja rikastunut degs. Määrällisesti yhteistyössä rikastamiseen kuvio välillä DEGS ja DASGs, Euklidinen etäisyys (0,941) laskettiin väliin rikastamiseen pisteet kaikissa kromosomissa bändejä DEGS ja DASGs. Voit testata tilastollista merkitystä välisen etäisyyden DEGS ja DASGs, simulaatiot satunnaisesti näytteitä kahden geenin sarjaa samassa koko DEGS ja DASGs suoritettiin 10000 kertaa tuottaa jakelun Euklidinen etäisyys minkä tahansa kahden geenin sarjat kromosomien . Kuten on esitetty kuviossa 2B, välinen etäisyys DEGS ja DASGs oli huomattavasti lyhyempi kuin välillä satunnaisesti näytteitä sarjaa. Nämä tulokset osoittivat selvästi, että DEGS ja DASGs ovat fyysisesti samassa rikastettu vastaavasta kromosomeja.

Global läheisyys perustuu proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen (PPI) verkkoon.

Edellä esitetyn johdosta uusia pyrkimyksiä otettiin mitata välisen toiminnallisen yhteyden näiden kahden geenin sarjaa, joka perustuu PPI-verkkoon. Aluksi 100000 kertaa satunnainen simulaatioita tehtiin rakentaa jakelun keskimäärin lyhimmän reitin etäisyys minkä tahansa kahden geenin sarjaa samalla asteikot kuin DEGS ja DASGs [33]. Sitten keskimäärin etäisyys DEGS ja DASGs laskettiin ja verrattiin jakeluun. Kuten kuviossa 3, edellinen on kaukana keskiarvo simuloidun jakauman tilastollista merkitystä p-arvo 0,05. Tulokset osoittivat, että nämä DEGS ja DASGs saattaa olla tiiviisti kytketty proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen.

. Esimerkki kuvaa läheisyydestä kahden geenin sarjaa. Jokainen kiersi piste edustaa verkon solmuun ja kukin rivi edustaa reunan kahden solmun välillä. Punaisia ​​polku on lyhin polku välillä X ja Y tähän verkostoon, joka on 3 askelta. Oikea osa on matriisi lyhimmän reitin pituuden kaikkien mahdollisten parien kahdesta geenistä sarjaa (set_1 {Y, C, D}, set_2 {X, A, F}). Ja heidän keskimääräinen lyhin reitin pituus on 2,78. B. sininen käyrä yläpuolella keltainen histogrammin sopii jakeluun läheisyyden kahden satunnaisen geeni sarjaa samassa koot DEGS ja DASGs vastaavasti. Punainen katkoviiva tarkoittaa etäisyyttä DEGS ja DASGs. P-arvo edustaa osuus geenin parissa, joissa lyhyemmän matkan kuin välinen DEGS ja DASGs.

Functional semanttinen samankaltaisuus Gene ontologia (GO) puu.

Vaikka degs ja DASGs havaittiin huomattavasti lyhyemmän matkan verrattuna random-näytteet geenin sarjaa mukaan PPI verkkoon, tällainen toiminnallinen korrelaatio on välillinen eikä vahvaa biologista merkitystä. Siten yksinkertaisempaa menetelmää käytettiin mittaamaan toiminnallisia korrelaatio DEGS ja DASGs perustuu biologisiin prosesseihin joita ne [35]. Tasapainottaa laskennallisen tehokkuuden ja mittaus kestävyyttä, ne GO biologinen prosessi väleissä vähintään 10 geeniä valitse ohjearvon biologisen prosessin sarja (kuvio 4A). Semanttinen samankaltaisuus tilanne oli kullekin kaksi GO ehdot perustuvat kaavion rakennetta GO, kuten kuvassa 4B. Sitten keskimäärin semanttinen samankaltaisuus pisteet laskettiin kaikkien parien GO termejä vastaavasti biologisia prosesseja vaikuttaa DEGS ja DASGs käyttäen parhaiten ottelun keskiarvo strategiaa. Ja menettelyt tehtiin kaksi pistokokein geenin sarjaa samassa mittakaavassa kuin DEGS ja DASGs 10000 kertaa saada jakelun keskimäärin semanttinen samankaltaisuus. Kuten kuviossa 4C keskimäärin semanttinen samankaltaisuus DEGS ja DASGs on erittäin suurempi kuin kaksi satunnaista-pickup sarjaa, mikä osoittaa, että nämä kaksi joukko geenejä voidaan toiminnallisesti kytkeä.

. Kakku juoni näyttää osuus GO termejä vastaavan geenin numero. Barplot edustaa lukumäärää GO väleissä geenien yli kunkin sulku geenien määrä. Ja osa GO termejä yli 10 geenejä valittiin edelleen laskentaan. B. heatmap GO semanttisen samankaltaisuuden kunkin kahden valitun GO termejä. Mitä lämpimämpi väri on, sitä suurempi samankaltaisuus on näiden kahden käsitteen. C. Käyrä edustaa jakautuminen semanttisen samankaltaisuuteen kahden pistokokein geenin sarjaa samankokoisia DEGS ja DASGs vastaavasti. Punainen timantti kohta viittaa semanttisen samankaltaisuuden DEGS ja DASGs.

Keskustelu

transkriptio ja vaihtoehtoisen silmukoinnin kaksi tärkeää biologisten prosessien aikana geenien ilmentymisen, jotka yhdessä määrittelevät proteomiin solujen alle tietyn ehdon. Tässä tutkimuksessa tutustumiseen välisen toiminnallisen yhteyden ilmentyvät eri geenien ja differentiaalisesti vaihtoehto saumattu geenien syöpäsoluissa käsitelty berberiini, mRNA profilointi BEL-7402 solut kerättiin RNA-seq. Sitten, sekä DEGS ja DASGs aiheuttama berberine huolellisesti tunnistettiin sarja sekvenssianalyysiohjelmistoa. Perustuu DEGS toiminnallinen rikastamiseen analyysi, kaksi potentiaalista mekanismit solusyklin pidätyksen omaisuuden berberine ehdotettiin alla.

Berberiini saattaa aiheuttaa p53-riippuvaista G1 vaihe pidätys BEL-7402 syöpäsoluja. Sen jälkeen BEL-7402-soluja käsiteltiin berberiini, viisi geeniä (

BBC3

,

FAS

,

CCNG2

,

GADD45B

, ja

IGFBP3

) oli säädelty ja kahdesta geenistä (

CASP9

,

THBS1

) on alassäädetty (taulukko C S1 File) p53 signalointireitin. Huomattavaa on, että viiden up-geenien ovat alavirtaan tavoitteita p53 [41-45]. Samaan aikaan p53 todettiin ilmaistaan ​​vaatimattomalla tasolla BEL-7402 solut ennen ja jälkeen berberine hoidon. Villityypin p53 tilaansa BEL-7402 solulinja vahvisti myös muut tutkijat [46, 47]. Nämä tulokset viittaavat siihen, p53 signalointireitille saattaa vaikuttaa alle berberine hämminki. Kuten on tunnettua, p53 on tärkeä solusyklin tarkistuspiste proteiinia, joka aiheuttaa solusyklin pysähtymisen vastaa DNA-vaurioita [48]. Kaksi solusyklin liittyvien geenien (CDKN2D, GADD45B), jotka ovat alavirtaan reitin p53, todettiin sääteli jälkeen berberine hoidon. Ne voi estää CDK: iden, jotka säätelevät G1-S-vaiheessa siirtyminen. Ja solusyklin pysähtymisen G1-vaiheeseen BEL-7402-solujen indusoima berberine todettiin myös edellisessä työssä läpi virtaussytometrianalyysin. [8] Yhdessä tuloksemme osoittivat, että Berberiini voi estää BEL-7402 soluproliferaatiota indusoimalla G1 solusyklin pidätys on p53-riippuvainen tavalla. Lisäksi p53-riippuvaista solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa raportoitiin myös useissa muissa syöpäsolulinjoissa jälkeen berberine hoidon. [37-39] Aiemmat tutkimukset raportoivat solukierron pysähtymisen vaikutus berberiini kohdistamalla kalmoduliinista, jotka saattavat olla alkupään signaali p53 polkuja [8].

Berberiini voi estää tulehduksellisten sytokiinien kautta NFKB eston. RNA-seq tulokset osoittivat, että

NFKBIA

(

IKB

) oli merkitsevästi ajan säädellään berberine hoito (taulukko D S1 File). Estäjänä NFKB,

IKB

voi estää translokaatiota NFKB välillä sytoplasmasta tumaan [49]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että NFkB: n voi vaikuttaa ilmentämiseen monien tulehduksellisten tekijöitä, jotka voisivat edistää kasvainsolujen kasvua ja laitoksen kasvaimen invaasion ja metastaasin [50]. Tässä tutkimuksessa viisi sytokiinien (

IL-6

,

IL-8

,

IL1A

,

IL-33

ja

IL11

) (taulukko D S1 File) todettiin alassäädetty jälkeen berberine mukaisen käsittelyn RNA-seq tuloksia. Erityisesti, kaikki nämä sytokiinit on raportoitu tulehdusta tekijät. Esimerkiksi

IL-6

ja

IL-8

raportoitiin olevan merkittävästi korkea ilmaistaan ​​ja tärkeä rooli maahanmuutto- ja kestävään leviämisen ihmisen maksan syöpäsoluja [51-53].