Krooninen sairaus

tiivistelmä

fibroblastikasvutekijää 2 (FGF2) valmistetaan munasarjasyöpäsoluja ja on ehdotettu olevan tärkeä rooli syövän etenemiseen. Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että FGF2 hoito alassäädetty E-kadheriinin jopa säätelevä sen transkriptiorepresso-, Slug ja ZEB1, ihmisen munasarjasyöpä soluja. Farmakologinen esto fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K), nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR), ja MEK viittaa siihen, että molemmat PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointi tarvitaan FGF2 aiheuttama E-kadheriinin alassäätöä. Lisäksi FGF2 säädelty Slug ja ZEB1 ilmaisun kautta PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointireitteihin, vastaavasti. Lopuksi FGF2 aiheuttama soluinvaasiota poisti estämällä PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK polkuja, ja pakotti ilmentyminen E-kadheriinin vähentynyt luontainen invasiivisuus munasarjojen syöpäsolujen sekä FGF2 aiheuttama soluinvaasiota . Tämä tutkimus osoittaa uudella mekanismilla, jossa FGF2 down-regulation E-kadheriinin ilmentymisen aktivoitumisen kautta PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointi, ja ylös-säätely Slug ja ZEB1 ihmisen munasarjasyöpäsoluja.

Citation: Lau MT, niin WK, Leung PCK (2013) fibroblastikasvutekijää 2 indusoi E-kadheriinin Down-asetuksen kautta PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK Signaling in munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (3): e59083. doi: 10,1371 /journal.pone.0059083

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 7. joulukuuta 2012 Hyväksytty: 11 helmikuu 2013; Julkaistu: 15 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Lau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat toiminta-avustusta Kanadan Institutes of Health Research PCKL. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC), joka käsittää 90% kaikista munasarjojen maligniteettien, on yleisin ja tappava muoto gynekologisten syöpä kehittyneissä maissa [1], kuolleisuus tähän sairauteen ei ole muuttunut paljon viimeisten 50 vuoden aikana.

fibroblastikasvutekijä-2 (FGF2) välittää solujen eri tapahtumia, kuten leviämisen, liikkuvuuteen ja erilaistumiseen [2], [3], ja pahanlaatuiset munasarjojen kasvaimet ovat yleisempiä potilailla, joilla kohonnut FGF2 [4] – [6]. Kuitenkin rooli FGF2 munasarjasyövän eteneminen on yhä kiistanalainen. Munasarjojen kasvaimet korkea sytoplasman FGF2 liittyy alentunut kasvaimen aggressiivisuus ja lisääntynyt eloonjäämisluvut verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen FGF2 [7], [8]. Sitä vastoin edellinen

in vitro

tutkimuksissa ja geeniekspressioprofilointi kehittyneen munasarjasyövän viittaavat siihen, että FGF2 toimii autokriinikasvutekijänä munasarjasyöpä soluproliferaatiota [9] – [11] ja invaasio [12]. Lisäksi FGF2 säätelee ilmentymistä lisägeenien osallisina angiogeneesissä tai metastaasin, mukaan lukien metalloproteinaasien [13], verisuonten endoteelin kasvutekijä [14], ja E-kadheriinin [13], [15], [16].

E-kadheriinin toimii solu-solu Adhesion Protein ja tuumorisuppressoriproteiinia joka on vaiennettu monissa maligniteettien, ja menetys E-kadheriinin ilmentymisen tai toiminto on yleinen tapahtuma kasvaimen etenemistä [17], [18]. E-kadheriinin tiedetään tukahduttaa kasvainsolun invaasiota, ja uudelleen ilmentäminen E-kadheriinin in E-kadheriinin-puutosta karsinoomien palaa solujen vähemmän invasiivisia, vähemmän aggressiivisia fenotyyppi [19] – [21], kun taas menetys E -cadherin liittyy munasarjasyövän etäpesäkkeitä, vatsakalvon levittämistä, ja huono ennuste [22] – [26]. Menetys E-kadheriinin toiminto voidaan saavuttaa mutaatio E-kadheriinin geenin [27] hypermetylaatiota E-kadheriinin promoottori [28], [29], ja transkription repression E-kadheriinin [30] – [33]. Useat transkriptiotekijät on tunnistettu tukahduttaa E-kadheriinin kuten Snail, Slug, Twist ja ZEB1 kautta niiden vuorovaikutusta E-box sitoutumiskohta E-kadheriinipromoottorin [30], [31], [34] – [36] .

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että FGF2 estää E-kadheriinin erilaisissa solutyypeissä [13], [15], [16]; kuitenkin, taustalla olevien mekanismien ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että FGF2 vähentää E-kadheriinin mRNA: ta ja proteiinia tasojen ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi lisääntynyt Slug ja ZEB1 ilmentymisen aktivaation kautta PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointireittien, vastaavasti, mahdollisesti välittää vaikutukset FGF2 E-kadheriinin. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että alas-säätely E-kadheriinin välittämä FGF2 parantaa invasiivisuus vuonna munasarjasyöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

FGF2 ostettiin Sigma-Aldrich (Ontario, Kanada). Rapamysiini, U0126 ja wortmanniini hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). E-kadheriinin vasta-aineet hankittiin BD Biosciences (San Jose, CA). Akt, fosfo-Akt (Ser473), p44 /42 MAPK (ERK), fosfori-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204), p70S6K ja fosfo-p70S6K (Thr389) vasta-aineet hankittiin valmistajalta Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Β-aktiini-vasta ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä ja vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineet hankittiin Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA).

plasmidikonstrukteja

pcDNA-GFP (GFP) oli jalomielinen lahjoitus tohtori Alonzo H. Ross [37]. PcDNA-Ecadherin-GFP (Ecad-GFP) oli ystävällinen lahjoitus tri Jennifer L. Stow [38].

Soluviljely ja transfektiot

Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa (OVCAR- 4 ja SKOV-3) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niiden käyttö on hyväksytty University of British Columbian Clinical seulonta laatima tutkimusta ja muut opinnot ihmiseen kohdistuvan. Soluja viljeltiin Medium 199: MCDB 105 (1:01, Sigma-Aldrich), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone Laboratories Ltd, Logan, UT), 100 U /ml penisilliini G: tä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ( Life Technologies, Inc., Rockville, MD), kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2-95% ilmaa 37 ° C: ssa. Solut siirrostettiin 0,06% trypsiiniä (1:250) /0.01% EDTA Mg

2 + /Ca

2 + – vapaa HBSS yhtymäkohdassa.

Kaikki transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen, Burlington, oN, Kanada) mukaan valmistajan protokollan.

Käänteinen transkriptio kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (RT-qPCR) B

Kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksijuosteinen cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: ta mukaan valmistajan menettelyä (Amersham Biosciences, Quebec, Kanada). Käytetyt alukkeet SYBR Green RT-qPCR olivat seuraavat: ihmisen E-kadheriinin, sense, 5′-ACA GCC CCG CCT TAT GAT T-3 ’ja antisense, 5′-TCG GAA CCG CTT CCT TCA-3′; ja Slug, sense, 5’-TTC GGA CCCACA CAT TAC CT-3 ’ja antisense, 5′-GCA GTG AGG GCA AGA AAA AG-3′; for ZEB1, sense, 5’-GCA CCT GAA GAG GAC CAG AG-3 ’ja antisense, 5′-TGC ATC TGG TGT TCC ATT TT-3′; ja GAPDH, sense, 5’-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3 ’ja antisense, 5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG -3’. RT-qPCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System varustettu 96 kuopan optinen reaktio levylle. Suhteellinen kvantitointi mRNA-tasojen suoritettiin käyttäen vertailevaa Cq menetelmä (ΔΔCq menetelmä) ja GAPDH ohjearvon geenin.

Western blot-analyysi

Solut kerättiin lyysipuskuriin [50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 1 mM EDTA, 0,1% SDS], joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta (Sigma-Aldrich), ja proteiinin konsentraatiot määritettiin käyttämällä DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Proteiinia (40 ug) elektroforeesi 7,5% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Amersham Bioscience), ja inkuboitiin erityisiä primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli. Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita 1 tunti ja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA).

Invasion määrityksessä

Kaksikymmentä Four-hyvin siirtokuoppaan insertit jossa on 8-um huokosia päällystetty 1 mg /ml matrigeelin (50 ul /kaivo; BD tieteet, Mississauga, oN, Kanada) käytettiin arvioimaan soluinvaasiota. Trypsinoitiin soluja (1 x 10

5) 0,1% FBS: ia, tai ilman FGF2, ympättiin kolmena kappaleena ylemmässä kammiossa. 1% FBS: ia oli sijoitettu alempiin kuoppiin. Kammiot inkuboitiin 24 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. Solut, jotka eivät läpäise suodatinta pyyhittiin pois, ja hyökkäsi solut alapinnalla suodattimen kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla ja värjättiin 0,5% kristalliviolettia. Tulokset on esitetty keskimääräinen lukumäärä hyökkäsi solujen viisi kenttää (100-kertainen suurennus) ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Data-analyysi

Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta kuusi riippumatonta koetta. Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn

post hoc

testi käyttäen GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA).

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

vaikutus FGF2 E-kadheriinin ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja

Ensimmäinen askel kohti analysoimalla rooli FGF2 munasarjan syövän etenemisessä, tutkimme vaikutus FGF2 E-kadheriinin ilmentymisen OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja. Tulokset osoittavat, että hoito FGF2 alas-säänneltyjen E-kadheriinin mRNA-tasot sekä aika- (kuvio 1A) ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1B). Vastaavasti, Western blot-analyysi osoitti, että hoito FGF2 alas-säänneltyjen E-kadheriinin proteiinin tasojen annoksesta riippuvalla tavalla munasarjasyövän soluissa (kuvio 1C).

(A) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja käsiteltiin 10 ng /ml FGF2 varten 0-24 h kuten on osoitettu, ja sitten E-kadheriinin mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. (B ja C) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja käsiteltiin eri annoksilla FGF2: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen E-kadheriinin mRNA-tasot (B) ja proteiini tasoilla (C) analysoitiin RT-qPCR ja Western blotting, vastaavasti . Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 3, arvot ilman yhteistä kirjain ovat merkittävästi erilaiset,

P

0,05). Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä.

FGF2-indusoi E-kadheriinin alassäätöä kautta PI3K /Akt ja MAPK /ERK reitit

on hyvin dokumentoitu, että PI3K /Akt ja MAPK /ERK reitit ovat usein vahvistetaan ja toimivat selviytymisreittejä munasarjakarsinoomissa [39]. Lisäksi FGF2 tiedetään aktivoida PI3K /Akt ja MAPK /ERK reitit [40], [41] ja on raportoitu säätelemään E-kadheriinin alassäätöä [42], [43]. Siksi olemme analysoineet ovatko nämä kaksi reittejä olivat mukana tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentymisen FGF2. Ensin tarkasteltiin fosforylaatiota tilan Akt ja ERK käsittelemällä 10 ng /ml FGF2 5, 15, 30, 60, ja 120 minuutin jälkikäsittely ja totesi, että FGF2 indusoi fosforylaatiota Akt (Ser473) ja ERK (Thr202 /Tyr204) on ajasta riippuva tavalla SKOV-3-soluja (kuvio 2A). Sen määrittämiseksi, ovatko nämä kaksi reittejä olivat mukana tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentymisen FGF2, käytimme kaksi farmakologisen estäjiä, wortmanniini ja U0126, nimenomaan estää PI3K /Akt ja MAPK /ERK polkuja, vastaavasti, SKOV-3-soluissa ja OVCAR-4 (kuvio 2B), vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, PI3K ja ERK estäjiä huomattavasti tyvi E-kadheriinin ilmentymisen ja merkittävästi vähentynyt, mutta ei täysin poistaa, FGF2 aiheuttama tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentymisen, joka osoitti osallistuminen PI3K /Akt ja MAPK /ERK pääsyväylistä FGF2-välitteisen down-regulation E-kadheriinin ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja.

(A) SKOV-3-soluja käsiteltiin 10 ng /ml FGF2 varten 0-120 min kuten on osoitettu. Fosforyloidun ja yhteensä Akt, fosforyloidun ja yhteensä ERK, ja β-aktiini tasot analysoitiin Western blot-analyysi. (B) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja esikäsiteltiin wortmanniini (1 uM) tai U0126 (10 uM) 30 minuutin ajan ennen kuin lisättiin FGF2 (10 ng /ml) 30 minuutin ajan. Fosforyloidun ja yhteensä Akt fosforyloitu ja yhteensä ERK proteiinin tasot analysoitiin Western blottauksella. Β-aktiini-vasta-ainetta käytettiin kontrollina yhtä suuri kuormitus. (C) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja esikäsiteltiin wortmanniini (1 uM) tai U0126 (10 uM) yksin tai, kun läsnä oli 10 ng /ml FGF2: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen E-kadheriinin proteiinin tasot analysoitiin Western blotting. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM [(A) (B) n = 3; (C) n = 6; arvot ilman yhteistä kirjain ovat merkittävästi erilaiset,

P

0,05]. Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä.

FGF2 erilaisesti up-regulation Slug ja ZEB1 ilmaisun kautta PI3K /Akt ja MAPK /ERK polkuja, vastaavasti

sen tutkimiseksi, FGF2 down-regulation E-kadheriinin ilmentymisen moduloimalla transkription säätely E-kadheriinin, käytimme RT-qPCR tutkimaan mRNA tasojen E-kadheriinin transkriptiorepresso- Snail, Slug, Twist ja ZEB1. Hoito FGF2 lisäsi merkittävästi Slug ja ZEB1 mRNA tasot aika- (kuvio 3A ja 3B) ja annosriippuvaisesti (kuvio 3C ja 3D), mutta ei ollut merkittävää vaikutusta Etana ja Twist mRNA-tasot (tuloksia ei ole esitetty). Sen määrittämiseksi, onko PI3K /Akt ja MAPK /ERK signalointireittien ovat mukana FGF2-indusoimaa kasvua Slug ja ZEB1 mRNA, soluja käsiteltiin PI3K-estäjä (wortmanniinin) tai MEK estäjä (U0126) läsnä ollessa tai poissa ollessa FGF2. Mielenkiintoista, wortmanniinin merkittävästi tukahdutti pohjapinta Slug mRNA-tasolla ja poistetaan kokonaan vaikutukset FGF2 on Slug mRNA (kuvio 3E), kun taas FGF2-tehostetun ZEB1 mRNA ei vaikuttanut (kuvio 3F). Toisaalta, U0126 hoito poistetaan kokonaan vaikutukset FGF2 on ZEB1 mRNA-tasot (kuvio 3F), lääke ei ollut vaikutusta Slug-mRNA-tasot (kuvio 3E).

(A ja B) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja käsiteltiin 10 ng /ml FGF2 eri aikoina, ja mRNA: n tasot Slug (A) ja ZEB1 (B) analysoitiin RT-qPCR. (C ja D) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja käsiteltiin eri annoksilla FGF2 6 h (Slug, C) tai 24 h (ZEB1, D), ja mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. (E ja F) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja esikäsiteltiin wortmanniini (1 uM) tai U0126 (10 uM) 30 minuutin ajan ennen kuin lisättiin 10 ng /ml FGF2 6 h (E) ja 24 h ( F). Slug ja ZEB1 mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 3, arvot ilman yhteistä kirjain ovat merkittävästi erilaiset,

P

0,05). Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä.

FGF2 aiheuttama E-kadheriinin alassäätöä kautta PI3K /Akt /mTOR-reitin

Seuraavaksi tutki roolia mTOR väylän FGF2 aiheuttama E-kadheriinin alassäätöä, koska mTOR on polku alavirtaan PI3K /Akt signalointi, jonka on osoitettu olevan mukana E-kadheriinin alassäätöä [44]. Kuten on esitetty, hoito FGF2 indusoi aktivointi mTOR-signaloinnin ajasta riippuvalla tavalla SKOV-3-soluja, kuten on osoitettu fosforylaation mTOR loppupään molekyyli, p70S6K (kuvio 4A). Sen määrittämiseksi, oliko PI3K /Akt /mTOR-signalointireitin oli mukana säätelyssä E-kadheriinin tasot FGF2, käytimme mTOR-spesifinen estäjä rapamysiini estää mTOR väylän SKOV-3-soluissa ja OVCAR-4 (kuvio 4B) . Samanlaisia ​​wortmanniini, rapamysiinin täysin poistanut FGF2 aiheuttama nousu Slug mRNA (kuvio 4C), kun taas rapamysiini osoitti mitään vaikutusta ZEB1 mRNA (kuvio 4D). Lisäksi rapamysiini hoito lisäsi merkittävästi proteiinin tasot E-kadheriinin ja merkittävästi vähentynyt estävä vaikutus FGF2-E-kadheriinin proteiinin tasot (kuvio 4E), joka osoittaa, että PI3K /Akt /mTOR reitin on mukana FGF2-indusoitu E-kadheriinin estämiseen munasarjasyöpäsoluja.

(A) SKOV-3-soluja käsiteltiin 10 ng /ml FGF2 varten 0-120 min kuten on osoitettu. Fosforyloidun ja koko p70S6K tasot analysoitiin Western blot-analyysi. (B) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja esikäsiteltiin wortmanniini (1 uM) tai rapamysiini (20 nM) 30 minuutin ajan ennen kuin lisättiin 10 ng /ml FGF2 30 min. Fosfo-Akt ja Akt, sekä fosfo- p70S6K ja p70S6K-proteiinin tasot analysoitiin Western-blottauksella. Β-aktiini-vasta-ainetta käytettiin kontrollina yhtä suuri kuormitus. (C ja D) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja esikäsiteltiin rapamysiiniä (20 nM) 30 minuutin ajan ennen kuin lisättiin 10 ng /ml FGF2 6 h (C) ja 24 h (D). Slug ja ZEB1 mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. (E) OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja esikäsiteltiin rapamysiiniä (20 nM) 30 minuutin ajan ennen kuin lisättiin 10 ng /ml FGF2: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen E-kadheriinin proteiinin tasot analysoitiin Western-blottauksella. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM [(A) – (D) n = 3; (E) n = 6; arvot ilman yhteistä kirjain ovat merkittävästi erilaiset,

P

0,05). Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä.

aktivoituminen PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointireitteihin ovat kriittisiä FGF2 aiheuttama soluinvaasiota

Useat todistelinjat osoittavat, että FGF2 on tärkeä rooli invasiivisia ominaisuuksia ihmisen syöpäsoluja [45], [46]. Siten tutkimme vaikutus FGF2 solujen invaasiota in munasarjasyöpäsoluja käyttäen Matrigel päällystettyjä TranswellTM invaasio määrityksiä. OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla FGF2, johti annoksesta riippuvan stimulaation invaasion (kuvio 5A). Osallistuminen PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signaalireaktioteissä FGF2 stimuloiman solujen invaasiota arvioitiin myös. Tuloksemme osoittivat, että FGF2-indusoidun solujen invaasiota oli merkittävästi pienentynyt, mutta ei täysin, käsittelemällä wortmanniinilla, rapamysiinin tai U0126 yksinään (kuvio 5B), kun taas yhdistetty inhibitio PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointireittien poistetaan kokonaan FGF2 indusoimaan solujen invaasiota (kuvio 5B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että MAPK /ERK ja PI3K /Akt /mTOR reittejä ovat mukana FGF2 aiheuttama munasarjasyöpäsolu invaasiota.

(A) munasarjasyöpäsoluja ympättiin Matrigel kuorrutettu transwell insertit ja käsiteltiin eri annoksilla FGF2: ssa 24 tuntia. (B) Soluja esikäsiteltiin wortmanniini (1 uM), rapamysiini (20 nM) tai U0126 (10 uM) 30 minuutin ajan ja ympättiin Matrigel-pinnoitettu Transwell-irto kanssa ja viljelty 10 ng /ml FGF2: ssa 24 tuntia. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM [(A) n = 3; (B) n = 6; arvot ilman yhteistä kirjain ovat merkittävästi erilaiset,

P

0,05]. Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä.

Down-regulation of E-kadheriinin välittää FGF2 stimuloimaa munasarjasyövän soluinvaasiota

Seuraavaksi kysyimme down-regulation of E-kadheriinin välitti FGF2 aiheuttama soluinvaasiota. SKOV-3-soluja transfektoitiin väliaikaisesti ihmisen villityypin E-kadheriinin ekspressioplasmidin 48 tuntia ja sitten käsiteltiin FGF2 edelleen 24 tuntia (kuvio 6A). FGF2 pienensi E-kadheriinin proteiinin tasot transfektoitujen solujen tyhjän vektorin, kun taas mitään vaikutusta ei havaittu soluissa, jotka yliekspressoivat E-kadheriinin (kuvio 6A). Yli-ilmentyminen E-kadheriinin vähentynyt pohjapinta invasiivisuus ja poisti kyky FGF2 aiheuttaa munasarjojen syöpäsoluinvaasiota (kuvio 6B), syyllistämättä että E-kadheriinin on keskeinen rooli FGF stimuloiman munasarjasyöpäsolu invaasiota.

( A) SKOV-3-soluja olivat ohimeneviä transfektoitu pcDNA-GFP (GFP) tai ihmisen E-kadheriinin ilmentymisen plasmidit (Ecad-GFP) 48 tuntia. Transfektion jälkeen soluja käsiteltiin 10 ng /ml FGF2: ssa 24 tuntia ja suoritettiin immunoblottaus E-kadheriinin ja β-aktiini. (B) 48 h jälkeen transfektion trypsinisoitiin solut ympättiin Matrigel-pinnoitettu Transwell-irto-, ja viljeltiin 10 ng /ml FGF2: ssa 24 tuntia. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 6; arvot ilman yhteistä kirjain ovat merkittävästi erilaiset,

P

0,05). Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä.

Keskustelu

FGF2, joka kuuluu FGF-perheen, tavallisesti esittelee plasman pitoisuudella vähemmän kuin 10 pg /ml, ja korkeita (jopa 6 ng /ml), voidaan löytää askeetti nestettä munasarjasyöpä potilaiden [4]. Kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet korkeita FGF2 ja sen mRNA kehittyneissä primääri munasarjojen syöpiä verrattuna normaaliin munasarjat [6]. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet suurentaa plasman FGF2 munasarjasyöpää sairastavilla potilailla [4], [47], [48]. Kohonneet tasot FGF2 ja sen reseptoreita on läsnä munasarjojen pahanlaatuisia kasvaimia viittaavat siihen, että FGF2 on tärkeä rooli munasarjan syövän etenemistä [9]. Useat

in vitro

tutkimukset ja geenin ilmentymisen profilointi tutkimuksissa pitkälle munasarjasyövän paljastavat, että FGF2 toimii autokriinikasvutekijänä munasarjasyövän solujen lisääntymisen [9] – [11], ja hyökkäys [12]. Lisäksi FGF2 säätelee ilmentymistä eri geenien osallisena angiogeneesissä tai etäpesäkkeiden [13] – [15], [49], mikä viittaa FGF2 signalointi voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde. Kuitenkin rooli FGF2 munasarjojen syövän etenemiseen vielä selvittämättä. Tämä tutkimus osoittaa, että FGF2 aiheuttama alaspäin säätely E-kadheriinin ilmentymisen, joka osallistuu FGF2 aiheuttama munasarjasyöpäsolu hyökkäystä. Lisäksi tutkimuksemme viittaavat siihen, että FGF2 kykenee sen vaikutuksia ihmisen munasarjasyövän solujen aktivaation kautta PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointireittien ja sen jälkeen lisääntyneen ilmentymisen Slug ja ZEB1.

FGF2 toistetaan keskeinen rooli erilaisten biologisten toimintojen, kuten solujen lisääntymisen, migraation ja erilaistuminen [2], [3]. FGF2 on myös kuvattu angiogeeninen tekijä [50] ja viime aikoina on osoitettu myötävaikuttavan kehittämiseen Vatsaontelon etäpesäkkeiden [51]. Säädeltyyn FGF signalointi on yleistä monissa syövissä kuten munasarjasyöpä [4] – [6], [52], mikä viittaa siihen, että tämä signalointi voi edistää kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. FGF2 on raportoitu moduloivan E-kadheriinin ilmentymisen erilaisissa solutyypeissä. Kuitenkin sen rooli E-kadheriinin ilmentymisen näyttää olevan solutyyppispesifisiä. Haiman adenokarsinooma, FGF-1 ja FGF2 on osoitettu säätää ylös E-kadheriinin ilmentymisen [53]. Sen sijaan alas-säätely E-kadheriinin ilmentymisen kanssa FGF2 hoito on havaittu putkimainen epiteelisoluissa ja NBT-II karsinoomasoluja, mikä lisää solujen vaeltamiseen ja invaasiota [13], [15]. Lisäksi, FGF2: n on osoitettu alas-säädellä E-kadheriinin ilmentymisen ihmisen napalaskimon endoteelisolujen kautta JNK-signalointireitin [16]. Nykyiset tiedot tukevat ratkaiseva merkitys FGF2 että säätely alaspäin E-kadheriinin in munasarjakarsinoomasolut kautta PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointireitteihin. Sitoutumisen FGF2 sen reseptoreihin johtaa aktivoinnin alavirran signalointireittien, kuten PI3K /Akt ja MAPK /ERK [40], [41]. Kehittyvät todisteet osoittavat, että nämä reitit ovat mukana säätelyyn E-kadheriinin [42], [43]. Lisäksi poikkeava inhibitio mTOR-reitin, joka on alavirtaan PI3K /Akt signalointi tukossa FGF2 aiheuttama E-kadheriinin alassäätöä ja solujen invaasiota. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimuksessa osoitetaan vaatimus mTOR signalointia insuliinin kaltaisen growrh kerroin 1 aiheuttama E-kadheriinin alassäätöä in munasarjasyöpäsoluja [54]. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että FGF2-riippuvaisen PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK aktivaatio on osallisena FGF2 aiheuttama E-kadheriinin alassäätöä ja solujen invaasiota in munasarjasyöpäsoluja.

Menetys E-kadheriinin geenin ilmentyminen johtuu pääasiassa yli-transkriptiorepresso- kuten etana, etana ja ZEB1 [34] – [36]. Todellakin, kohonnut Slug ja ZEB1 mRNA-tasot on havaittu munasarjasyövän [55], [56]. Lisäksi edellinen tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen Slug in SKOV-3-solujen tuloksia alas-säätely E-kadheriinin, parantaa liikkuvuutta ja invasiivisuus [57]. Kuitenkin paljon vähemmän tiedetään sääntelyä näiden transkriptiorepresso-. Slug ilmentymistä voidaan säädellä PI3K /Akt signalointia, joka voidaan aktivoida myös FGF hoitoon [40], [41], [43], [45]. Yhdenmukainen Näiden tulosten esto PI3K /Akt signalointi wortmanniinilla vähensi pohjapinta ja poisti FGF2 aiheuttama Slug tasoja ilmaisua, viittaa siihen, että tämä reitti on kriittinen Slug ilme. Aktivoituminen PI3K /Akt signalointi on osoitettu stimuloivan Slug ilmaisun kautta GSK-3β /β-kateniinin signalointi ja tämän jälkeen alas-säädellä E-kadheriinin kohdun carcinosarcomas ja normaali maksasoluissa [43], [58]. On hyvin tunnettua, että PI3K /Akt signalointi aiheuttaa ydin- β-kateniinin kerääntyminen inhibition kautta GSK3p [59], [60]. Lisäksi mTOR-signaloinnin rapamysiini estää lisääntynyt β-kateniinin translokaation tumaan ihmisen haiman β-soluihin [61]. FGF2 voi aktivoida PI3K /Akt signalointi ja sen loppupään GSK3p ja mTOR polkuja aiheuttaa β-kateniinin-riippuvaisen transkription mukaan lukien Slug. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämiseksi tarkkaa mekanismia korkeus Slug tasojen mukaan mTOR kautta. Erityisesti, E-kadheriinin proteiinin tasot olivat selvästi kasvanut rapamysiini, kun taas pohjapinta Slug mRNA ei ollut vaikutusta. Siten tulokset viittaavat siihen, että mTOR signalointireitin moduloi myös E-kadheriinin tasot Slug-riippumattomalla tavalla. Mielenkiintoista, hoito MEK estäjän U0126 estetty vain FGF2 aiheuttama ZEB1 ilme, mutta ei estänyt FGF2 aiheuttamaa Slug ilme. Tuloksemme viittaavat siihen, että MAPK /ERK on ylävirtaan tekijä ZEB1 aktivaation munasarjasyöpäsoluja

in vitro

. FGF2 on osoitettu aktivoivan MAPK /ERK-reitin eri syöpäsoluissa [62], [63], ja osoittaa OVCAR-4 ja SKOV-3-soluja, jotka ZEB1 ilmaisu on MAPK /ERK-riippuvainen. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemman tutkimuksen osoitetaan vaatimus MAPK /ERK signalointia IGF-1-indusoidun ZEB1 ilmentymistä eturauhasen syöpäsolujen [42]. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa osoitettiin, että ERK2, mutta ei ERK1, vähensi E-kadheriinin tasojen kautta Fra1 välittämän ZEB1 /2 on transformoimattomina ihmisen rintaepiteelisolulinja, MCF-10A-solujen [64]. Yhdessä meidän havainnot osoittavat, että FGF2 differentiaalisesti säätelee Slug ja ZEB1 ilmaisun kautta PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK signalointireitteihin ihmisen munasarjasyöpäsoluja.

biologinen merkitys E-kadheriinin vähentäminen munasarjasyöpä invasiivisuus oli osoituksena se, että yli-ilmentyminen E-kadheriinin estetty FGF2 aiheuttaman soluinvaasiota

in vitro

. Todisteet osoittavat, että menetys E-kadheriinin liittyy munasarjasyövän etäpesäkkeitä, vatsakalvon levittäminen ja huono potilaan eloonjääminen [22] – [26], mikä viittaa siihen, että E-kadheriinin toimii vaimennin kasvaimen invasiivisuus. Todellakin, hiljentäminen E-kadheriinin siRNA lisää munasarjasyövän soluinvaasiota kautta ajan sääntely α5-integriini [24]. Olemme myös havainneet, että E-kadheriinin pudotus RNA interferenssin kasvattaa PI3K /Akt-signalointireitin [65], joka vuorotellen välittää E-kadheriinin-ehtyminen aiheuttaman hyökkäyksen munasarjasyöpäsoluja (Lau

et al

., julkaisematon). Lisäksi yli-ilmentyminen määräävän-negatiivinen E-kadheriinin mutantti munasarjakarsinoomasolut johtaa lisääntyneeseen mesenkymaalisten solujen vaeltamiseen [66]. Tuloksemme osoittavat, että FGF2 parantaa solujen invasiivisuutta alaspäin säätäminen E-kadheriinin ja että E-kadheriinin yliekspressio estää pohjapinta invasiivisuus ja poistetaan FGF2 aiheuttama hyökkäystä. PI3K /Akt ja MAPK /ERK signalointireitteihin osallistuvat FGF2 aiheuttaman soluinvaasiota [45], [46]. Lisäksi, muita mekanismeja, kuten korkeus proteaasiaktiivisuuden /erittymisen modulointi aktiinitukirangan, ja lisääntynyt liikkuvuus on myös kuvattu [12], [46], [67]. Ottaa huomioon, että menetys E-kadheriinin on osoitettu stimuloivan MMP-välitteistä invaasio eturauhassyövässä ja keuhkoputkien kasvainsoluissa [68], [69]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että E-kadheriinin toimii ratkaiseva vaimennin munasarjasyöpä invasiivisuus, ja yhdessä muiden kuvattujen mekanismien menetys E-kadheriinin tärkeä rooli FGF2 aiheuttama soluinvaasiota.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että FGF2-alas-säätelee E-kadheriinin ilmentymisen, todennäköisesti läpi transkription suppressio Slug ja ZEB1, jotka samanaikaisesti ilmaistaan ​​aktivoituminen PI3K /Akt /mTOR ja MAPK /ERK reittejä. Lisäksi esillä oleva tutkimus osoittaa, että alas-säätely E-kadheriinin välittää FGF2 aiheuttama munasarjasyövän soluinvaasiota (Kuva 7). Esto joko PI3K /Akt /mTOR tai MAPK /ERK signalointi johtaa osittain esti FGF2 aiheuttama E-kadheriinin alassäätöä ja solujen invaasiota. Siten nämä tulokset osoittavat, että suunnittelussa yhdistetyn hoitoja kohdistaminen FGF2 liittyvä signa- voi olla relevantti vaikutuksia ehkäisyssä ja hoidossa tämän maligniteetti.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Alonzo H. Ross (University of Massachusetts Medical School, Massachusetts), Dr. Jennifer L. Stow (University of Queensland, Brisbane, Queensland, Australia) ja ystävällisesti ja ystävällisesti antoi meille konstruktioita.

PCKL on vastaanottaja Distinguished Scientist Award Child ja Family Research Institute.