Krooninen sairaus

tiivistelmä

p37-proteiini pinnalla

Mycoplasma hyorhinis

soluja on osa korkea- affiniteetti liikennejärjestelmä ja on yhteydessä esiintyvistä eläinten ja ihmisten syöpiin. Tässä näytämme NIH3T3-fibroblasteissa, p37 aiheuttaa nopeasti geenien osallisina tulehdusta ja syövän etenemistä. Tämä geeni aktivointi oli pääasiassa kautta TLR4 reseptorin. Aktiivisuus katosi p37, kun C-terminaalinen 20 aminohapon poistettiin tai neljän aminohapon spesifinen vetysidos tiamiinipyrofosfaatti oli korvattu valiinilla. Tukkiminen IL6 reseptorin tai estämään STST3 signalointi lisännyt p37-geenin indusoidun ilmentymisen. Koska syöpä liittyy fibroblastien kasvun tukemiseksi, invaasio ja metastaasi kautta kykyä säädellä kasvaimeen liittyvä tulehdus, nopea induktio fibroblasteissa proinflammatoristen geenien p37 voisi olettaa vaikuttavan syövän kehittymisessä.

Citation: Gomersall AC , Phan HA, Iacuone S, Li SF, Parish RW (2015)

Mycoplasma hyorhinis

p37 proteiini aiheuttaa nopeasti Geenit fibroblasteissa tulehdukseen ja syöpä. PLoS ONE 10 (10): e0140753. doi: 10,1371 /journal.pone.0140753

Editor: Yi-Hsien Hsieh, Institute of Biochemistry and Biotechnology, Taiwan

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 30 syyskuu 2015; Julkaistu: 29 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Gomersall et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Alkuperäinen CEL tiedostot mikrosiruanalyysi ja muut vastaavat tiedot on nyt talletettu Figshare klo https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1574136.

Rahoitus: ACG oli vastaanottaja Australian jatko-palkinnon .

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

p37-proteiini havaittiin ensimmäisen pinnalla hiiren sarkooma FS9 soluissa [1] . Monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja p37-proteiini esti invasiivisen käyttäytymisen FS9 solujen vastassa kanan sydämen fibroblastit [2]. P37-proteiinin havaittiin olevan peräisin

Mycoplasma hyorhinis

ja muodostavat osan kolmen proteiinin korkean affiniteetin liikennejärjestelmää [3]. Nämä proteiinit ovat erittäin samankaltaisia ​​kuin periplasmiseen sitovat suurella affiniteetilla liikennejärjestelmien gram-negatiivisten bakteerien. P37-N-pää hallussaan C-S-N aminohapposekvenssi vaaditaan N-pään glyseridi-kysteiini lipidejä laajennus, joka lisää suoraan mycoplasmal kalvo [4]. Kun

M

.

hyorhinis

oli läsnä, Rat-1-soluja ja FS9, L929 ja NIH3T3 hiiren fibroblasteissa kaikki tunkeutuneet kanan sydän fibroblastien kohtaavat explant määritys [5]. Jos p37-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita lisättiin määritykseen invasiivisen käyttäytymisen estyi.

löytö p37-indusoidun solun invasivity ehdotti, että

M

.

hyorhinis

-infektio voi olla rooli syövän kehittymiseen.

M

.

hyorhinis

infektio on myöhemmin havaittu liittyvän ihmisten ja eläinten syöpiä, kuten eri karsinoomat [6], sekä munasarjasyövän ja imusolmuke etäpesäke [7].

M

.

hyorhinis

infektio on korreloi etäpesäkkeitä ja ennustaa huono selviytyminen mahasyöpäpotilaista [8]. Fareed et ai. analysoidaan immuunivasteen, jotka on immunisoitu intralymphatically kasvainsolujen kanssa ja sen on todettu potilailla, joilla kasvaimen regressio oli mitattavissa titteri vasta-aineita 38 kDa: n proteiini [9]. Ilantzis et ai. vahvisti, että proteiini on p37 [10]. P37-proteiinin on havaittu liittyvät ihmisen mahakarsinoomat ja eturauhastuumorit [11, 12]. Käyttämällä vasta-ainetta, joiden tavoitteena on N-päässä p37 proteiini tunnistettiin mahalaukun, paksusuolen, ruokatorven, keuhko-, rinta- ja gliooman karsinoomat samoin kuin verenkierrossa olevia kasvainsoluja potilaista, joilla maksasyövän [6, 13].

lisäys p37 ihmisen mahasyöpä (AGS) solujen lisääntynyt maahanmuutto on transwell (Matrigel) määritys [11]. Hoito eturauhassyövän linjat PC-3 ja DU145 kanssa p37 kasvattivat invasivity kautta matrigeelin [14]. Sisällyttäminen p37-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine esti tätä hyökkäystä. Taso metalloproteinaasi 2 (MMP2) lisääntyi tiedotusvälineissä P37-käsiteltyjen ja

p37

-transfected AGS soluihin [11]. Goodison et ai. ehdottaa lisääntynyt invasivity voi edustaa suurempaa maahanmuuttoluku seuraavat p37 hoidon sijaan lisääntynyt kapasiteetti hajottamaan matrigeelin [15]. P37 hoito havaittiin myös lisätä

tuumorinekroositekijä α

(

TNFa) B-geenin transkription ja TNFa-tasot tiedotusvälineissä ihmisen perifeerisen veren mononukleaaristen solujen [16].

eri mycoplasmal infektioita on yhdistetty syöpään ja niveltulehdus eläimillä ja ihmisillä. Esimerkiksi infektio 32D hematopoieettisten solujen

M

.

fermentansin

tai

M

.

penetrans

varten 4-5 viikkoa aiheuttama pahanlaatuisiksi ja kun ruiskutetaan nude-hiiriin soluihin nopeasti muodostunut kasvaimia [17].

M

.

hyorhinis

,

M

.

pneumoniae

,

M

.

hominis

,

M

.

fermentansin

,

M

.

penetrans

ja

M

.

arthritidas

on kaikki liitetty ihmisen niveltulehdus [18-21].

M

.

fermentansin

akuutteja niveltulehdus kanit [21].

M

.

hyorhinis

infektio liittyy myös moniherakalvotulehduksen ja niveltulehdus Sian [22].

Tavoitteena työ raportoitu tässä oli tunnistaa geenejä, joiden ilmentyminen on nopeasti aktivoituu seuraavat p37 hoitoon NIH3T3-fibroblasteissa

in vitro

. NIH3T3-solut valittiin, koska ne ovat vakiona fibroblasti linja, joka on osoittautunut arvokkaaksi tutkimuksessa ihmisten sairauksien kuten cancer.The membraanireseptoriin (t) vastaa geeniaktivaatioon oli myös tunnistaa.

Methods

plasmidikonstruktion

Plasmidi rakentaminen suoritettiin käyttäen standardeja restriktioentsyymiä kloonausta.

p37

geeni insertoitiin

Bam

HI leikkaus sivusto pUC-johdettu pRSET ekspressiovektoriin (Invitrogen; Cat # V351-20) (S1A Kuva).

Katkaistu p37 rakennettiin käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR) esitellä

Bam

HI ja

Ncol

I restriktiokatkaisua sivustoja reunustavat

p37

geeni. Päinvastainen alukkeet (S1 taulukko) esitteli

Ncol

I restriktiokatkaisua päällä useissa kohdissa, jotka helpottivat tuotantoa DNA-sekvenssit, jotka vähensivät kokoa p37-proteiinin 20, 60, 80 tai 105 aminohappoa. PCR-tuotteet pilkottiin

Bam

HI ja

Ncol

I restriktioentsyymeillä ja ligoitiin pUC-johdettu pRSET ekspressiovektoriin (Invitrogen; Cat # V351-20) (S2 kuvassa) .

kohdennettu mutageneesi

mutageneesi koodaavan geenin p37 suoritettiin käyttäen Mutagene fasmidikirjaston

in vitro

-mutageneesitarvikkeissa (Bio-Rad; Cat # 170-3581) . Oligonukleotidit toimitetaan S2 taulukossa.

neljän aminohapon S255, F256, S257 ja K258 in p37 muutettiin valimiin käyttäen QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies; Cat # 200521), ja pohjamaalin suunnittelu kehittämä menetelmä Zheng et al. [23]. Kaksi polymeraasiketjureaktion käytettiin suorittamaan mutaatiot; kunkin eteenpäin ja käänteisalukkeet luetellaan S3 taulukossa ja sekvenssianalyysillä S3 kuvassa. Optimaalinen alukkeen lämpötila määritettiin 56,4 ° C.

Proteiinin ilmentymisen ja selvennystä

ilmentäminen P37 proteiini, typistetty p37 proteiineja (p37-20, p37-60, p37-80 ja p37-105) ja mutatoitunut p37-proteiinin valmistui OneShot®BL21 (DE3) -soluihin (Invitrogen; Cat # C6000-03). Soluja viljeltiin Luria-Bertani (LB), joka sisälsi 100 ug ml

-1 ampisilliiniä ja indusoidaan IPTG: llä (isopropyyli β-D-1-tiogalaktopyranosidi) loppukonsentraatioon 1 mM ja 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa sekoittaen . Indusoidut solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuria (50 mM NaH

2PO

4, 300 mM NaCl, 10 mM imidatsoli, 1 mg ml

-1 Lysotsyymiä, pH 8,0), joka sisältää täydellisen, Mini proteaasinestäjä cocktail Tabletti (Roche; Cat # 11836153001). Raakalysaatit saatiin sonikoimalla (6 sykliä, 30 sekunnin välein), minkä jälkeen sekoitettiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla 12000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja yhdistettiin suodattamalla läpi 25 um: n suodattimen.

arginiini liota proteiinin selvennystä

Korkeammat pitoisuudet p37 katkaistun peptidit sijaitsevat liukenematon osa

E

.

coli

lysaatti ja siten tuottavuuden lisäämiseksi liukoisen p37 arginiinilla liota (argSOAK) menetelmää käytettiin. Katkaistun peptidit liuotetaan 1 M arginiini liota ennen puhdistusta käyttäen menetelmää, jonka Tsumoto et al. [24]. Native p37 puhdistettiin myös käyttämällä 1 M arginiini liota varmistaa menetelmä ei inaktivoida proteiinin.

Proteiinin puhdistus

Proteiinin puhdistus saatiin aikaan käyttämällä Profinity

TM IMAC Hartsi (BioRad; Cat # 156-0123), jossa poikkeamat valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Kaksi ml Profinity

TM IMAC Hartsi lisättiin jokaista 25 ml valmistettua selvitetty lysaattia. Sitoutumisen mahdollistamiseksi proteiinin hartsi /lysaattia Seosta inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, samalla sekoittaen. Sitten seosta sentrifugoitiin 1 minuutti nopeudella 3000 g pelletoimiseksi hartsia. Hartsi pestiin 10 ml Wash Buffer (50 mM NaH

2PO

4, 300 mM NaCl, 20 mM imidatsoli, pH 8,0), sekoittamalla 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Hartsi /pesu seosta sentrifugoitiin 1 minuutti 3000 g pelletoimiseksi hartsia. Proteiini absorbanssilukemia 280 nm (A

280) otettiin pesun supernatantit. Hartsi pestiin toistuvasti kunnes pestä supernatantit

280 oli alle 0,01.

Eluutio saatiin aikaan lisäämällä 7 ml eluutiopuskuria (50 mM NaH

2PO

4 300 mM NaCl, 500 mM imidatsoli, pH 8,0), joka 2 ml hartsia, jolla on 1 tunnin inkubaation sekoittaen 4 ° C: ssa. Seosta sentrifugoitiin 1 minuutti nopeudella 3000 g pelletoimiseksi hartsin, joka 7 ml, viisi 1 ml: n supernatanttia, joka sisältää Eluoitu proteiini kerättiin. Eluoitu proteiini säilytettiin -80 ° C: ssa.

Proteiinikonsentraatiot arvioitiin sen jälkeen, kun Pierce® BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific; Cat # 23227) ja BCA-ohjelma Eppendorf BioPhotometer 6131. ​​

SDS-PAGE, Coomassie Blue-värjäys ja Western-blottaus

Proteiininäytteet denaturoitiin 95 ° C lämpökäsittely 10 minuuttia ja erotettiin 12%: sta akryyliamidia erottaa geelejä, joissa on 4%: sta akryyliamidia -vertailugeeliä. Geelit rakennettava seuraavan Mini-PROTEAN

® 3 Cell (BioRad; Cat # 165-3301 /165-3302) valmistajan ohjeita. Mini-PROTEAN 3 Cell Mini Tank (BioRad; Cat # 165-3302) koottiin mukaan valmistajan ohjeiden ja geelit kesti 60 minuuttia, 200 volttia 4 ° C (Bio-RAD PowerPac

TM Basic Virtalähde ).

määrittämiseksi puhdistusteho SDS-PAGE-geelit värjättiin 0,1% Coomassie Blue Stain (0,1% Coomassie Blue R-250, 40% metanolia, 10% etikkahappoa) yön yli huoneen lämpötilassa varovasti sekoittaen. SDS-PAGE-geelit kiinnitettiin ennen Coomassie Blue värjäyksellä Kiinnitys Solution (50% metanoli, 10% etikkahappoa), huoneen lämpötilassa 10 minuuttia kevyesti sekoittaen. Seuraavat Coomassie Blue-värjäyksellä geelit väri poistettiin käyttäen 40% metanolia, 10% etikkahappoa värinpoistoliuos 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa varovasti sekoittaen.

Proteiinin tunnistaminen, erottamisen jälkeen 12%: sta akryyliamidia erottamalla geelit, proteiinit olivat siirrettiin polyvinylideenifluoridilla kalvo jälkeen BIO-RAD Mini Trans-Blot

® elektroforeettinen protokolla (Cat # 170-3930 /170-3935). BIO-RAD Mini Trans-Blot

® elektroforeettinen järjestelmä kesti 2 tuntia 200 volttia.

Kalvot blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris puskuroidussa suolaliuoksessa Tween-20 (TBST puskuri: 137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20), inkuboitiin jälleen 1 tunti T7-Tag monoklonaalinen vasta-aine (Novagen, Cat # 69522), laimennettu 1: 10000 5% rasvatonta kuivamaitoa, jota seuraa 1 tunnin inkubaatio vuohen anti-hiiri-IgG piparjuuren Peroxide (HRP) konjugaattia (Invitrogen; Cat # G-21040) laimennettuna 1: 10000 5% rasvatonta kuivamaitoa.

Western blotit kehitettiin käyttäen alkalisella fosfataasilla konjugaatti substraattipakkausta (BioRad; Cat # 170-6432). Kalvo valotettiin 10 minuuttia sekoittaen ja pestiin DDH

2O pysäyttää reaktion ennen skannausta.

PageRuler Esivärjätyt Protein Ladder (Fermentas; Cat # SM0671) käytettiin analysoimaan proteiinin kokoa.

Microarray Analysis

Yhteensä RNA eristettiin NIH3T3-fibroblasteissa käsiteltiin 15 ug ml

-1 puhdistettua p37-proteiinin 24 tuntia tai ei-käsitelty NIH3T3-fibroblasteja käyttäen RNeasy® Mini Kit ( Qiagen; Cat # 74104). Kolme biologinen rinnakkaista otettiin kunkin hoidon. Genominen saastuminen seulottiin PCR: llä ja eliminoitu Deoksiribonukleaasi I, Amplification Grade (Invitrogen; Cat # 18068-015) kohti valmistajan ohjeiden. RNA eheys ja laatu tarkastettiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA).

RNA monistettiin ja cDNA syntetisoitiin ohjeita Genechip® 3 ’IVT Express Kit Käyttäjän käsikirja ( Affymetrix; Cat # P /N702646 Rev.8). Sen jälkeen biotiini merkinnöistä cDNA ja pirstoutuminen, näytteet hybridisoitiin Affymetrix Mouse Genome 430 2,0 Arrays, pestään käyttäen Genechip® Fluidics asemalta ja avulla skannattujen Genechip® Scanner 3000. Microarray Aineisto käsiteltiin käyttämällä Affymetrix® Expression Console ™ Software 1.2 (Affymetrix ; Cat # P /N 702387 Rev. 2) ja CLC Genomics Workbench 4.7 (CLC bio, https://www.clcbio.com; alv # DK28305087).

RT

2 Profiler ™ PCR Array järjestelmä

Kokonais-RNA uutettiin NIH3T3-fibroblasteissa, jotka oli käsitelty p37, p37 ja S31-201, S31-201 vain tai ei-käsitelty NIH3T3-fibroblasteja käyttäen RNeasy® Mini Kit (Qiagen; Cat # 74104) . Kolme biologinen rinnakkaista otettiin kunkin hoidon. Genominen saastuminen seulottiin PCR: llä ja eliminoitu Deoksiribonukleaasi I, Amplification Grade (Invitrogen; Cat # 18068-015) kohti valmistajan ohjeiden. RNA eheys ja laatu tarkastettiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA).

RNA Käänteinen transkriptio ja RT

2 Profiler

TM tulehdusreaktio Autoimmuniteetin PCR-matriisia (SABioscience; Cat # PAMM-077A-12) tehtiin sen jälkeen, kun valmistajan ohjeen (SABiosciences Osa # 1022A). Vahva positiivinen korrelaatio syklin kynnys (Ct) arvot välillä PCR joukko biologisen rinnakkaista kunkin hoidon osoitti luotettava qPCR havaitseminen geenien ilmentymisen (S4 kuvio).

ANOVA-analyysi suoritettiin vertaamalla geenin Ct-arvot käsitellyn näytteet käsittelemättömään kontrolliin.

Kvantitatiivinen PCR (qPCR) B

RNA uutettiin käyttäen RNeasy® Mini Kit (Qiagen; Cat # 74104) kolmesta biologisesta rinnakkaista käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen NIH3T3 fibroblasteissa. RNA oli DNAasi saaneista (Invitrogen; Cat # 18068-015) ennen täydentäviä DNA muuntamista (SuperScript

TM III, Invitrogen; Cat # 18080-044). Määrällinen amplication cDNA suoritettiin kolmena kappaleena kunkin biologisen rinnakkaisten käyttäen iQ

TM SYBR

® Green Supermixiä (BioRad; Cat # 170-3884) ja qPCR oligonukleotidien (S4 taulukko) käyttäen iCycler iQ

TM Real -Aika PCR Detection System (BioRad, 170-8740). Sama vahvistus olosuhteita käytettiin kaikille alukesarjoilla; alkuperäisen denaturoinnin 95 ° C: ssa 3 minuuttia; vahvistus prosessi kierrättää 40x kautta denaturaatio 95 ° C: ssa 10 sekuntia, alukkeen 60

° C: ssa 30 sekunnin ajan ja sitten 72 ° C ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Lähtevä fluoresenssi mitattiin aikana, pyöräillyn jatkotutkimuksessa. Lopullinen laajentaminen 95 ° C 1 minuutin ajan on suoritettu ennen dissosiaatiokäyrä. Dissosiaatiokäyrän alkoi 55 ° C: ssa lisäystä 0,5 ° C kunnes lopullinen lämpötila 95 ° C oli saavutettu.

Negatiiviset kontrollit tarkistettiin poistamaan saastumista ja vain yksi piikki hyväksyttiin dissosiaatiokäyrän tahansa testattu geenin. Kaikki monistetut tuotteet sekvensoitiin osoittaa spesifisyyden qPCR oligonukleotidien.

kertaluokkamuutos

normalisoimiseksi eri pitoisuuksilla välillä näytteiden kaikkien geenien kohteisiin (GOI) Ct-arvot vähennettiin keskimääräinen Ct-arvoja kahden endogeenisten viittaus geenien

βactin

ja

GAPDH

(

Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi

); ACt (yhtälö 1). Kaikki Ct-arvot saatiin kolmesta biologisesta rinnakkaisnäytettä ja kolme teknistä rinnakkaisnäytettä kunkin biologisen rinnakkaisten (N = 9).

Yhtälön 1

ero kiinnostavan geenin ACt käsitellyn näytteen ja kontrollinäytteen laskettiin; ΔΔCt (Eq 2). Vahvistus tehokkuus eksponentiaalisen muutoksen per sykli per geeni (E) kutakin aluketta laskettiin prosenttia tehokkuudesta (E%); E (Eq 3). Prosenttia hyötysuhde 100 ± 10% ja R

2≥0.985 katsottiin hyväksyttävää. Kaikki alukepari tehokkuutta löytyy S4 taulukossa.

Yhtälö 2Equation 3

ΔΔCt käytettiin kunkin geenin aluke E arvo lasketaan suhteellinen kertainen muutos geenin ilmentymisen vuoksi hoitoon (Eq 4). Normalisoitu ΔΔCt 1 tarkoittaa säätelyä ja 1 tarkoittaa downregulation.

Yhtälö 4

Virhepalkkien

keskihajonta (

σ

) laskettiin perustuen ΔΔCt (yhtälö 5). Standardi virhe (SE) laskettiin keskihajonnan (Eq 6) ja ylemmän (Eq 7) ja alemman (Eq 8) virhepalkkeja laskettiin keskivirhe, E-arvo ja taita muutos. N, numero näytteen size = 9.

Yhtälö 5Equation 6Equation 7Equation 8

Error bar arvot kaikki graafit toimitetaan S5 taulukossa.

varianssianalyysi (ANOVA) B

ANOVA-analyysi suoritettiin kaikki qPCR vertailutietoja normalisoitu syklin kynnys (ACt) käsiteltyjen näytteiden valvontaa tai käsitelty kontrollinäytteitä. Kaikissa kokeissa oli kolme biologisten rinnakkaisnäytteiden ja kolme teknistä rinnakkaisnäytettä kunkin biologisen rinnakkaisten (N = 9).

nisäkässoluja

Hiiren alkion (NIH3T3) fibroblastit perustetaan NIH: in sveitsiläiset hiiren alkioiden, saatiin The Peter MacCallum Cancer Centre, Melbourne.

Cell viljelyolosuhteet

NIH3T3-fibroblastit kasvatettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM). Media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), NaHCO

3 ja penisilliini-streptomysiiniä. Plasmocin

TM (Invivogen) lisättiin kaikki viljelyväliaineeseen pitoisuutena 5 ug ml

-1. Solulinjasta ja median testattiin mykoplasmakontaminaation käyttämällä Mycoplasma alukkeita kuvanneet Uphoff ja Drexler [25]. PCR-monistaminen olosuhteissa mukana alustavan denaturoinnin 95

° C: ssa 3 minuutin ajan ja sen jälkeen vahvistus prosessi kierrättää 32x kautta denaturointi 95

° C: ssa 10 sekuntia, alukkeen 65

° C: ssa 30 sekunnin ajan ja laajentamisesta 72

° C: ssa 30 sekuntia. Lopullinen laajentaminen 95

° C: ssa 1 minuutti saatiin päätökseen. Solulinjasta ja kaikki kokeen Soluväliaineet havaittiin negatiivisiksi Mycoplasma saastuminen.

Kaikki kulttuuri levyjä inkuboitiin vesivaippainkubaattorissa Incubator (Forma Scientific). Inkubaattoria automaattisesti säännelty 37

° C 5% CO

2.

estäjät

Seuraavia inhibiittoreita käytettiin: IL6R estäjä LEAF

TM puhdistettua anti- hiiri /rotta CD126 monoklonaalinen vasta-aine (IL6R

i

) (Biolegend; Cat # 115809) (AB_2127939) lopullisessa pitoisuudessa 0,1 ug ml

-1. Lopullinen konsentraatio määritettiin käyttämällä RT-PCR: ää, jotka osoittivat, että pitoisuudet IL6R

i

vaihtelevat 0,1-,5 ug ml:

-1 esti p37-induced

seerumin amyloidi A3

(

Saa3

) ilmaisua. Kemiallinen koetin STAT3 Inhibitor VI (S31-201) (Santa Cruz Biotechnology, Cat # sc-204304) käytettiin lopullisena pitoisuutena 100 uM [26]. Viral Inhibitor Peptide TLR4 (VIPER) ja VIPER kontrollipeptidi CP7 käytettiin lopullisessa pitoisuudessa 0,5 uM (IMGENEX; Cat # IMG-2011set). Käärmeen inhibition konsentraatio 0,5 uM määritettiin käsittelemällä NIH3T3-solut 1 ug ml

-1 lipopolysakkaridi (LPS) (InvivoGen; Cat # tlrl-3pelps) estämällä 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10 ja 25 uM VIPER. Lopullinen pitoisuus 0,5 uM VIPER havaittiin vähentävän ilmentymistä

Saa3

12-kertaiseksi ja 5-kertaiseksi. CP7 havaittiin myös estävän LPS-indusoitua

Saa3

ilmentymisen suurempina pitoisuuksina, mutta 0,5 uM CP7,

Saa3

ekspressio ei ollut merkittävästi estyy.

Cell hoidon

NIH3T3-fibroblasteissa hoitoon oli siirrostetaan tarvittava määrä kudosviljelylevyillä mahdollistaa kolmen biologisen rinnakkaista käsittelyä kohti. Kaikki NIH3T3 linjat peräisin samasta jäätyä alas erässä klo passage 10; käsittely tapahtui ennen kulkua 15. Ennen hoitoa, DMEM10% FCS imettiin pois ja soluviljelmissä pestiin kaksi kertaa 1x fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4.2H

2O, 2 mM KH

2PO

4, pH 7,4), ellei toisin mainita.

p37 hoitoon tarvittava pitoisuus puhdistettua p37 lisättiin DMEM10% FCS, joka kattaa solut ja viljelmiä inkuboitiin tarvittava määrä aikaa. Jos kyseessä on aika-ajoja, solu hoito aloitettiin annoksella kertaa sallitaan kaikille hoitojaksoa voidaan synkronoida ja valmis RNA lämpötilassa T

0.

NIH3T3 fibroblasteja käsiteltiin estäjillä ennen 24 tunnin hoidon tai ilman p37. Esikäsittely inkubaatioajan vaihdella riippuen estäjä; 1 tunti IL6R

i

, 2 tuntia VIPER ja CP7 ja 24 tuntia S31-201.

Hoidot lopetettiin pesemällä ja solujen lyysistä välittömästi RNA. Solut havaittiin jälkikäsittelyä varten haitallisia, jos siellä oli havaittavissa myrkkyvaikutus koe lopetettiin.

Migration määrityksissä

Solun muuttoliikettä stimuloitiin yksikerroksinen käyttämällä

vuonna vitro

tyhjästä haava määrityksessä. NIH3T3-fibroblastit kasvatettiin 100%: n yksisolukerros ja naarmuuntunut käyttämällä steriiliä pipetin kärkeä, joka muodostaa haava on noin 300 um. Soludebris pestiin pois 1x PBS: lla ja DMEM10% FCS lisättiin 25 ug ml

-1 p37 käsitellyille NIH3T3-fibroblasteissa. Kulttuureissa, jotka eivät olleet saavuttaneet yksisolukerroksena jälkeen 24 tunnin hoidon ja haavat, jotka olivat yli tai alle 300 um jätettiin analyysin ulkopuolelle. Kuvat otettiin 0, 14, 19, 24 ja 38 tuntia. Kuusi kuvaa otettiin kiinni aikapistettä kohti levyä kohti. Kolmena kappaleena maljoja päätökseen kunakin ajankohtana (N = 18). Luokitus solumigraation ilmaistiin pinta-ala (im

2) kuuluvat vaeltavien solujen jaettuna aika (tuntia). Luoda alue, johon solut olivat vaeltaneet kullakin ajanhetkellä, alueen haavan kussakin aikapisteessä vähennettiin alkuperäisen haavan alueelle. ImageJ käytettiin määrittämään haavan alueelle.

Tulokset

Geenien ilmentyminen profilointi p37 käsiteltiin NIH3T3-fibroblasteissa

Rekombinantti

p37

geenin ilmentyminen indusoitiin in

Escherichia coli

ja proteiini puhdistetaan käyttäen Ni-affiniteettikromatografialla (kuvio 1). Aluksi vaikutus puhdistetun p37 NIH3T3 fibroblastivaeltamista määritettiin. Vuonna haavan paranemista määritys 25 ug ml

-1 p37 käsitelty fibroblastit näytteillä lisääntynyt siirtymänopeuksien (S5B kuvio) ja nopeampi haavan sulkemiseen kuin kontrollit (S5a kuvio). P37 ei vaikuttanut leviämisen nopeus NIH3T3-solut. On yksi raportti p37 hoito aiheuttaa lievää nousua leviämisen DU145 eturauhasen solujen (ei tietojen) kuitenkin PC3 eturauhasen solut pysyivät muuttumattomina (15).

Puhdistettu p37 erotettiin 12% SDS PAGE: lla ja värjättiin Coomassie-sinisellä (A). Puhdistettu proteiini siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja ja tutkittiin T7-Tag monoklonaalinen vasta-aine, ja vuohen anti-hiiri-IgG piparjuuren Peroxide (HRP) konjugaattia (B). Molekyylipaino standardit (MW) ovat kilon daltonia (kDa) ja merkitty vasemmalle kuvion. Puhdistettu p37-proteiini juoksi asemaan noin 52 kDa. P37-proteiinin ennustetaan olevan 43,5 kDa ja lisäksi 8,5 kDa seurauksena 6x His Tag ja Xpress-epitoopin ja pRSET lukeminen kehys. Identiteetti puhdistettua p37-proteiinin varmistettiin edelleen käyttäen proteiinisekvensoinnilla.

NIH3T3 fibroblasteja inkuboitiin 15 ug ml

-1 p37: ssa 24 tuntia ja microarray-analyysi puhdistetusta kokonais-RNA osoitti ilmaus 537 geenien vaikutti merkittävästi (p≤0.001); 288 näistä geeneistä oli voimistunut (kertaluokkamuutos ≥ 3) (S6 taulukko). Geeni ontologian toimeksiantoja 288 geenien merkittävästi yliaktiivista toimitetaan S6 kuvassa. Kymmenen voimakkaimmin voimistunut geenit (9- 64-kertainen) on kaikki raportoitu vaikuttavan syövän etenemiseen ja /tai tulehdus (katso keskustelu). Valitsimme analysoitavaksi uuden kahdeksan geenejä (voimistunut 3- 9-kertainen), jotka myös vaikuttavat tulehdus /syöpä. Mikromatriisi tiedot kahdeksantoista geenien validoitiin käyttäen kvantitatiivista PCR (qPCR) (S7 kuvio). Kiihdytyssäätely vastauksena p37 hoitoon vahvistettiin neljätoista geenien. Taitteen muutokset pysyivät suhteellisen vakiona eri (myöhemmin) kokeissa. Me käytettiin myöhemmin 25 ug ml

-1 p37 ja 24 tunnin käsittelyt; kertamuutoksia vastasivat toisiaan kokeiluja.

haptoglobiini

(

Hp

) oli poikkeus.

mikrosiruanalyysi tunnistettu 249 geenejä voimakkaasti vaimentua (fold muutos ≥ 3) (S7 taulukko). Downregulation viisi näiden geenien on liittynyt kasvaimen etenemistä ja aktivointi akuutin vaiheen proteiini (APP) geenit (S8 taulukko).

vaikutus eri p37 pitoisuuksien ja käsittely kertaa

NIH3T3-fibroblasteissa inkuboitiin 0,5, 1, 5 ja 25 ug ml

-1 p37 24 tuntia. Alempi P37 pitoisuudet olivat vähemmän tehokkaita stimuloimaan geeniekspressiota vaikka

komplementtikomponentti 3

(

C3

) ja

lipokaliini 2

(

Lcn2

) olivat edelleen merkittävästi aktivoitu 5 ug ml

-1 p37 (taulukko 1).

Määritä muutoksia geenien ilmentyminen ajan NIH3T3 fibroblasteja käsiteltiin 5 ug ml

-1 p37 2 , 4, 8, 12 ja 24 tuntia.

angiopoietiini kuten-4

(

Angptl4

),

Seerumin amyloidi A3

(

Saa3

),

Vascular adheesiomolekyyli 1

(

Vcam1

) ja

interleukiini 6

(

IL6

) ilmaisu kasvanut voimakkaasti ensimmäisten 4 tunnin hoitoa, mutta aktivoinnin oli laskenut alhaiselle tasolle tai oli poissa 24 tuntia (taulukko 2). Suuren kasvun

Lcn2

ja

C3

ilmaisu tapahtui välillä 12 ja 24 tuntia.

Decorin

(

Dcn

) ja

leukemiaestotekijä

(

LIF

) ilmaisu kasvoi ensimmäisellä 4 tuntia, minkä jälkeen se ja sitten nousi hieman uudelleen 24 tuntia.

Vaikka jotkin vaihtelua kertainen muutos tapahtui NIH3T3 fibroblasteja käsiteltiin 25 ug ml

-1 p37 24 tuntia (taulukko 1 ja myöhemmin kokeiluja), viisi geeniä

Angptl4

,

Saa3

,

Dcn

,

C3

ja

Lcn2

oli jatkuvasti aktivoitu yli 10-kertaisesti. Kolme geeniä

hyaluronaanisyntaasia 2

(

HAS2

),

Hp

ja

LIF

vähintään 5-kertaiseksi.

P37 aktivoi geenin ilmentymisen kautta TLR4 reseptorin

nopea nousu

Angptl4

,

LIF

,

Saa3

,

IL6-

ja

Vcam1

ilmentymistä p37 käsitelty fibroblasteissa ehdotti p37-proteiini on signaloinnin kautta toll-like-reseptori 4 (TLR4). NIH3T3-fibroblasteissa hallussaan TLR4 jälkeen 1 ug ml

-1 (LPS) hoitoon 6 tunnin johti 28-kertainen

IL6

ilmaisun NIH3T3-fibroblasteissa [27]. Käsittelimme NIH3T3-fibroblasteissa 1 ug ml

-1 LPS 24 tuntia ja löysi 2-kertaiseksi ja 12-kertainen

IL6-

ja

Saa3

ilmaisu, vastaavasti (data ei näytetty). Viral Inhibitor Peptide TLR4 (VIPER) ja sen valvontaan peptidi (CP7) [28], käytettiin sen määrittämiseksi, onko p37 signaaleja TLR4. NIH3T3-fibroblasteja inkuboitiin 24 tuntia p37 (25 ug ml

-1) tai esikäsitelty 2 tuntia kanssa VIPER tai CP7 peptidejä (0,5 uM), ennen kuin lisättiin p37. Vaikutus peptidien ilmentymisen tasot seitsemän geenien voimakkaimmin indusoiman p37 määritettiin (kuvio 2). P37-indusoidun ilmentymisen kaikki seitsemän geenien inhiboi merkittävästi VIPER. Vaikka jotkut CP7 inhiboivan tapahtui, useimmissa tapauksissa tämä on huomattavasti pienempi kuin aiheuttama esto VIPER. Hoito NIH3T3-fibroblasteissa 0,5 uM Viper tai CP7 yksinään ei ollut vaikutusta geenien testattu, lukuun ottamatta

Saa3

jota säädeltiin vähentävästi 0,5 kertaiseksi (S8A kuvio).

kvantitatiivinen PCR ( qPCR) analyysi NIH3T3-fibroblasteja käsiteltiin 25 ug ml:

-1 p37: ssa 24 tuntia (musta) tai esikäsiteltiin 2 tuntia VIPER (harmaa) tai kontrollipeptidiä CP7 (valkoinen) ennen 25 ug ml:

-1 P37-hoito 24 tuntia. Merkittävät erot CP7 tai VIPER + p37 hoitoja ja p37 hoito laskettiin ANOVA (+ p≤0.05, ++ p≤0.01, +++ p≤0.001).

katkaisu p37 tai mutatoimalla TPP sitoutumiskohdan estää geenin aktivaation

neljä katkaistun p37 peptidit valmistettiin josta 20, 60, 80 tai 105 aminohappoa oli poistettu C-päähän. Liukoiset peptidit (25 ug ml

-1) puhdistettiin käyttämällä argSOAK menetelmää käytettiin hoitoon NIH3T3-fibroblasteissa. Kapasiteetti p37 aiheuttaa geenin ilmentyminen menetetään, kun C-terminaalinen 20 aminohapon olivat poissa (kuvio 3). Poikkeuksena oli

Angptl4

jonka ilmentyminen tasolla indusoi 20 aminohapon typistetty peptidi oli samanlainen kuin täyspitkän p37-peptidin. Ilmentymisen tasot muiden geenien testattu (seitsemän esitetty) ei vaikuta merkittävästi katkaistun p37 peptidien.

Kvantitatiivinen PCR-analyysi NIH3T3-fibroblasteja käsiteltiin 25 ug ml:

-1 p37 ilman 20 aminohapon (aa), 60aa, 80aa tai 105aa (tummanharmaa valkoinen) C-terminaalisessa päässä; 24 tunnin ajan. Arginiini liota (argSOAK) puhdistettu p37 (tummin harmaa) laskee hieman p37-induced (musta) geeniekspressio NIH3T3-fibroblasteissa. Merkittäviä eroja hoidettujen ja hoitamattomien fibroblastit laskettiin käyttäen ANOVA (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

kiderakenne p37 on määritelty 1.9 päätöslauselman [29]. P37 on alfa /beeta-luokan proteiini, joka koostuu kahdesta domeenista erotettu halkeama, joka mallinnus osoittaa sitoo tiamiinipyrofosfaattia (TPP).