Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä syöpien ja on edellytys tunnistamisen prognoosi- biomarkkereita. Tässä tutkimuksessa proteiinin ilmentymisen profiilit on perustettu ja peräsuolen syövän ja normaalin paksusuolen limakalvoa proteomiikka yhdistämällä kaksiulotteinen geelielektroforeesi tuoreita jääleikkeillä pariksi Dukes B peräsuolen syövän ja normaali peräsuolen limakalvo (n = 28), geeli kuva-analyysi ja korkean suorituskyvyn nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla. Hierarkkinen klusterin analyysi ja pääkomponenttien analyysi osoitti, että proteiinin ilmentyminen profiilit paksusuolisyövän ja normaalin paksusuolen limakalvon ryhmittyneet erillisiä malleja proteiinin ilmentymisen. Neljäkymmentäviisi proteiinit, joissa on havaittu vähintään 1,5 kertaa lisääntynyt ilmentyminen kolorektaalisyövässä ja identiteetti näiden proteiinien vahvistettiin nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla. Viisitoista proteiineja, jotka osoittivat lisääntynyt ilmentyminen todensi immunohistokemiallisesti käyttämällä hyvin tunnettu peräsuolen syöpä kudos microarray sisältävän 515 ensisijainen peräsuolen syöpä, 224 imusolmuke etäpesäke ja 50 normaalin paksusuolen limakalvon näytteitä. Proteiinit, jotka osoittivat suurimmassa määrin yli-ilmentymisen ensisijaisen kolorektaalisyövässä verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvo olivat lämpöshokkiproteiini 60 (p 0,001), S100A9 (p 0,001) ja translaation ohjattu tuumoriproteiinia (p 0,001). Analyysi proteiinien yksilöllisesti tunnistettavissa 14-3-3β ennustetyövälineenä biomarkkereiden (χ

2 = 6,218, p = 0,013, HR = 0,639, 95% luottamusväli 0,448-0,913). Hierarkkinen klusterianalyysillä tunnistettu selvä fenotyyppejä liittyy selviytymisen ja kahden proteiinin allekirjoitus koostuu 14-3-3β ja aldehydidehydrogenaasin 1 tulkittiin esittävän ennustetekijöitä merkitys (χ

2 = 7,306, p = 0,007, HR = 0,504, 95 % CI 0,303-0,838) ja joka pysyi itsenäisesti ennustetekijöitä (p = 0,01, HR = 0,416, 95% CI +0,208-0,829) monimuuttuja malli.

Citation: O’Dwyer D, Ralton LD, O ’ Shea A, Murray GI (2011) Proteomiikka paksusuolisyövän: tunnistaminen Protein Signature Associated ennuste. PLoS ONE 6 (11): e27718. doi: 10,1371 /journal.pone.0027718

editori: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Kanada

vastaanotettu: 08 syyskuu 2011; Hyväksytty: 23 lokakuu 2011; Julkaistu: 18 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 O’Dwyer ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat rahoitusta Association for International Cancer Research (www.aicr.org.uk), NHS Grampianin ja yliopisto Aberdeen Development Trust (www.abdn.ac.uk/giving). Kehittäminen peräsuolen syöpä kudos microarray tukivat Scottish Academic Health Sciences Collaboration rahoittama Johtavan tutkijan toimisto Skotlannin hallitus (www.cso.scot.nhs.uk/SuppScience/SAHSC.11.html). DO’D sai osakseen perustutkintoa tutkimuksen apurahan patologisesta Society (www.pathsoc.org) suorittaako se intercalated LuK Med Sci astetta. Aberdeen Proteome Facility (www.abdn.ac.uk/ims/proteomics/) rahoitetaan yhdessä Biotechnology and Biological Sciences Research Council, Scottish rahoitus neuvoston ja Aberdeenin yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

länsimaissa paksusuolen ja peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolema [1]. Maailmanlaajuisesti miljoona ihmistä vuosittain kehittää CRC ja esiintyvyys tämä kasvain on kasvussa [1]. Useimmat CRC ovat satunnaisia ​​johtuvat kertyminen somaattisten geneettisten poikkeavuuksien liittyy erilaisia ​​ympäristö- riskitekijät [1], [2]. Loput osuus tapauksista liittyy perinnöllinen geneettinen komponentti. Lukuisat geneettisiä poikkeavuuksia kerääntyä lukien inaktivaatio adenomatoottisen polypoosin coli tuumorisuppressorigeenin ja aktivointi onkogeenien, kuten K-ras, deleetio kromosomissa 18q ja monistaminen 20q [1], [3]. Kumulatiivisesti nämä geneettiset muutokset varaa kasvain antiapoptoottisia, angiogeneesiä ja proliferatiivisia ominaisuuksia. Äskettäin on hyväksytty, että CRC on geneettisesti heterogeeninen sairaus ja kaksi eri polkuja syövän on tunnistettu. Satunnaista CRC, 85% johtuu kromosomi epävakautta ja loput 15% mikrosatelliittien epävakaus [3]. Sen sijaan, että esiintyy lineaarinen monivaiheinen prosessi, paksusuolen ja peräsuolen syövän synnyssä on todennäköisesti seurausta monimutkaisesta vuorovaikutuksesta välillä useita mutaatiostatuksesta reittejä. Tämä saattaa osittain selittää kliinisen heterogeenisyys tämän taudin ja suurta eroa, sillä tulos yksittäisten potilaiden [2]. Tämä korostaa selkeä vaatimus on puhdistettu menetelmiä luokitteluun ja luokittelemalla peräsuolen syövän tunnistamalla ja validointi sopiva biomarkkereiden.

Molecular biomarkkerit voidaan luokitella niiden kyvystä tukea ehkäisyä, edistää varhaista havaitsemista, luoda ennustetta ja ennustaa vastetta potilaan tiettyihin hoitoja [4], [5]. Löytö biomarkkereita auttaa myös ymmärtämään biologisten mekanismien taustalla taudin kehittymistä ja etenemistä. Vaikka genomiikka lukien Epigenomics ja transkriptomiikka ollut vaikutusvaltainen biomarkkereiden löytö, opiskelu geenejä ja geenien ilmentyminen ei heijasta proteiinin määrä ilmaistuna solussa. Lisäksi proteiinit läpikäyvät monia translaation jälkeisiä muutoksia, jotka voivat vaikuttaa niiden aktivoitumisen, vuorovaikutusta ja toimivat solussa. Proteomiikka joka on maailmanlaajuinen tutkimus proteiinien on avainasemassa potentiaalia tunnistamiseen kasvaimeen liittyvien biomarkkereiden [6], [7]. Suhde yksittäisten kasvaimen biomarkkereita ja peräsuolen syöpä on tutkittu laajasti ja tutkimukset ovat mukana biomarkkereita, jotka edustavat geenejä ja proteiineja, jotka liittyvät monin tavoin kasvainten kehittymistä ja etenemistä myös kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden, solusyklin säätelyssä, kasvutekijät ja apoptoosin liittyneet proteiinit [5] , [8] – [26].

tässä tutkimuksessa on käytetty vertaileva proteomiikka-analyysi (kaksiulotteinen geelielektroforeesi, kuva-analyysin geelit ja massaspektrometria) proteiinien tunnistamiseksi, jotka ovat yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä, verrattuna morfologisesti normaali peräsuolen limakalvo. Yliekspressoitu proteiinit on validoitu immunohistokemiallisesti käyttämällä suurta hyvin tunnettu joukko kolorektaalisyövissä ja proteiinia allekirjoitus liittyy ennusteen tunnistaa.

Methods

Kaksiulotteinen (2D) geelielektroforeesi

2D geelielektroforeesi suoritettiin käyttäen Hyväksytty paria tuore Dukes B paksusuolensyöpä ja morfologisesti normaalin paksusuolen limakalvo (umpisuoli ja nouseva paksusuoli, n = 15 ja sigmasuolessa n = 13) kuten aiemmin on kuvattu [20] – [22], [ ,,,0],27]. Kaikki tapaukset valittiin Aberdeen peräsuolen kasvain pankki ja kliinis yksityiskohdat käytettyjen näytteiden Proteomiikan ovat huomattava taulukossa 1. Kukaan potilaista oli saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. On kokoelma, sekä kasvain ja normaali peräsuolen limakalvo leikeltiin kolorektaalisyövän leikkaaminen näytteitä 30 minuutin kuluessa kirurginen poisto, ja pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa ennen analyysiä.

Frozen osat (20 mikronia paksuus, n = 30) kunkin näytteen leikattiin ja solubilisoitiin lyysipuskuria [27]. Yksi osa (10 mikronia paksuus) kustakin näytteestä värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja morfologinen diagnoosi vahvistettiin valoa mikroskooppinen tutkimus. Seuraavat solubulisation, näytteitä sentrifugoitiin liukenemattoman soluroskan ja käsiteltiin DNAasilla. 2D-geelielektroforeesi suoritettiin kahtena jokaisesta näytteestä käyttäen 13 cm pI3-10 epälineaarisia Immobilon nauhat (GE Health Care, Little Chalfont, UK) proteiinien kanssa on erotettu mukaan maksu (300 V, 6 min, 3500 V, 90 min , 3500 V, 300 min), ja sen jälkeen molekyylipaino (100 V, 25 mA per geeli 60 min). Päättymisen jälkeen elektroforeesi, geelit värjättiin Coomassie blue visualisoimiseksi proteiineihin paikkoja.

geeli kuvantaminen ja analyysi

Sitten geelejä skannattu tuottaa 256 harmaansävyisiä 24 bittisiä kuvia, jotka tallennetaan TIFF-tiedostot. Kuvioitua geelit analysoitiin Progenesis SameSpots ohjelmisto (Non-Linear Dynamics, Newcastle-upon-Tyne, UK). Kaikki geeli kuvat tuotiin Progenesis SameSpots analysoitavaksi. Kuvan laadun arviointi tehtiin myös käyttämällä SameSpots ohjelmisto varmistaa kaikki kuvat olivat oikeassa muodossa analysoitavaksi ja ei ollut muita ongelmia, jotka voivat häiritä myöhempiä kuva-analyysiin. Kaikki geelit alunperin automaattisesti linjassa yhdelle viite geelistä käyttäen analyysin ohjelmisto, sitten manuaalisesti kohdakkain oikean kohdistuksen varmistamiseksi kaikki geelit, jolloin kaikki kohteet voidaan havaita, normalisoitu ja Hyväksytty kaikki geelit. Artefakteja (esimerkiksi pölyhiukkaset tai juovat havaitaan proteiinitäplien) poistettiin manuaalisen muokkauksen. Viite kuva geelit luotiin seuraavat geeliä linjaus käyttäen analyysin ohjelmisto. Kun linjassa, geelit automaattisesti analysoitiin käyttäen Progenesis SameSpots ohjelmisto. Geelit erotettiin 2 ryhmään joko kasvain tai normaali geelejä. Tilastollinen analyysi proteiinin ekspressiotasoja määritettiin sitten kunkin täplän perustuen keskimääräinen spot tilavuus, ja erot proteiiniekspressiossa välillä kasvain ja normaali geelit arvioitiin ANOVA. Tahrat p≤0.05 valittiin sisällytettäväksi tuloksiin. Monimuuttuja-analyysissä tehtiin myös käyttäen Progenesis SameSpots ja sekä korrelaatio analyysi ja periaatteen komponenttien analyysi suoritettiin kuvattavan geelit. Korrelaatio analyysi tehtiin log normalisoidut päällä ekspressiotasoja ryhmitellä huomasi yhdessä mukaan yhtäläisyyksiä niiden ekspressioprofiileja. Pääkomponenttianalyysi käytetään paikalla ekspressiotasot kaikilla geelit erottamaan geelejä mukaan ilmaisua vaihtelua, mikä mahdollistaa graafisesti moniulotteisia tietoja, ryhmittyneet kahteen ryhmään; kasvain ja normaali. Loppukertomus, jossa kaikki analysoitiin läiskät geeli yhdessä ANOVA arvojen joukkoon ja ilmaisun profiileja kunkin täplän keskiarvon perusteella normalisoitu tilavuus ryhmille sitten tuotettu.

Nestekromatografia-tandem massaspektrometria

jälkeen 2D- geelielektroforeesilla ja kuva-analyysin geelien proteiinin täplät kohteisiin (kohtiin, jotka lisääntyivät merkitsevästi kasvaimen näytteistä) leikattiin irti geeleistä ja proteiinit tunnistetaan nestekromatografialla-tandemmassaspektrometrian.

proteiinit geelipalat pilkottiin trypsiinillä (sekvenssointilaatua, modifioitu, Promega UK, Southampton, UK) käyttämällä tutkija ProGest robotti työasema (Perimän Solutions Ltd., Huntingdon, UK). Lyhyesti, proteiinit pelkistettiin DTT: llä (60 ° C, 20 min), S-alkyloitu jodiasetamidilla (25 ° C, 10 min), sitten pilkottiin trypsiinillä (37 ° C, 8 h). Saatu tryptinen peptidi uute kuivattiin pyöröhaihduttimella (SC110 Speedvac, Savant Instruments, Holbrook, NY, USA) ja liuotettiin 0,1% muurahaishappoa LC-MS /MS-analyysi.

Peptide liuokset analysoitiin käyttämällä HCTultra PTM Discovery System (Bruker Daltonics Ltd., Coventry, Iso-Britannia) on kytketty Ultimate 3000 LC System (Dionex (UK) Ltd., Camberley, Surrey, UK). Peptidit erotettiin monoliittinen kapillaarikolonnia (200 um sisähalkaisija x 5 cm: n pituinen, Dionex). Eluentti A oli 3% asetonitriiliä vedessä, joka sisältää 0,05% muurahaishappoa, eluentti B -80% asetonitriiliä vedessä, joka sisältää 0,04% muurahaishappoa gradientilla 3% -45% B 12 minuutin ajan virtausnopeudella 2,5 pl /min. Peptidifragmentin massaspektrit hankittiin datariippuvainen AutoMS (2) tilassa skannauksen välillä 300-1500 m /z, 3 keskiarvot, ja jopa 3 esiaste ioneja valitaan MS skannaa 100-2200 m /z). Edeltäjäyhdisteet aktiivisesti jätetty sisällä 1,0 min ikkuna, ja kaikki yksittäin varautuneita ioneja suljettiin.

Peptide piikit havaittiin ja dekonvuloidaan automaattisesti tietojen analysointi ohjelmistot (Bruker). Mass luettelot muodossa Mascot geneeristen tiedostot luodaan automaattisesti ja käyttää tulo for Mascot MS /MS ioneja haut NCBInr tietokantaan käyttäen Matrix Science web-palvelimen (www.matrixscience.com). Oletuksena hakuparametrit käytettiin: entsyymi = trypsiini, maksimi jäi katkeamiset = 1; kiinteät muutokset = karbamidometyyli (C); muuttuja muutoksia = hapetus (M); peptidi toleranssi ± 1,5 Da; MS /MS toleranssi ± 0,5 Da; peptidi maksu = 2+ ja 3+ ja instrumentti = ESI-TRAP.

Molemmat kaksiulotteinen geelielektroforeesi ja massaspektrometrialla suoritettiin Aberdeenin yliopiston Proteome laitos (www.abdn.ac.uk/ims/proteomiikka /).

kehittäminen paksusuolen syövän kudoksen mikrosirujen

peräsuolen syöpä kudos microarray rakennettiin sisältävän normaalin paksusuolen limakalvo (n = 50), ensisijainen (n = 515) ja metastasoitunut kolorektaalisyöpä ( n = 224), kuten aiemmin on kuvattu [28], [29].

Kaikki tapaukset valittiin Aberdeen peräsuolen kasvain pankki. Kaikkiaan kasvain näytettä 515 potilasta oli mukana tutkimuksessa, kussakin tapauksessa, diagnoosi ensisijainen kolorektaalisyövän oli tehty, ja potilaat olivat tehty elektiivinen leikkaus ensisijainen peräsuolen syövän, Aberdeen, vuosina 1994 ja 2007. 99 kasvaimet olivat kauden 1994-1998, 199 kasvaimet olivat 1999-2003 ja 217 kasvaimet olivat 2004-2007. Yksikään potilaista ei ollut saanut mitään ennen leikkausta kemoterapiaa tai sädehoitoa. Tiedot potilaista ja niiden kasvaimet mukana tässä tutkimuksessa on yksityiskohtaisesti olevat tiedot taulukossa S1. Keskimääräinen imusolmuke tuotto kaikille kasvaimia tässä tutkimuksessa oli 13,4 imusolmukkeiden per kasvain ja solmulle syöpäkasvain keskimääräisen imusolmuke tuotto oli 14,4 (imusolmuke tuotto tarkoittaa kokonaismäärää imusolmukkeiden noudetaan kunkin peräsuolen syöpä resektio näyte). Survival oli saatavilla kaikille potilaille ja aikaan sensuroidaan potilaiden hoitotuloksiin data olisi ollut 237 (46%) kuolemia (valsartaania). Keskimääräinen elossaololuku oli 114 kuukautta (95% CI 105-122kuukausi). Kolorektaalikarsi- syöpä leikkaaminen näytteet saatiin raikas, avattiin yllä ja tarvittaessa alapuolella kasvain, pestään kylmällä vedellä ja sitten kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin vähintään 48 tuntia huoneenlämmössä ja edustavia lohkoja upotettiin vahaan. Leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histopatologista diagnoosia ja kasvaimia ilmoitettiin mukaan The Royal College of patologi ohjeet, jotka sisältävät ohjeita TNM5 ja TNM lavastus järjestelmä.

peräsuolen syöpä kudos microarray rakennettiin sisältävä normaali paksusuoli limakalvo (n = 50), ensisijainen (n = 515) ja metastasoitunut kolorektaalisyöpä (n = 224). Etäpesäkkeet olivat kaikki peräisin kasvain mukana imusolmukkeisiin Dukes C tapauksia. Jokainen normaali limakalvon näyte hankittiin vähintään 10 cm: n etäisyydellä kasvain kuten aikaisemmin on kuvattu [28], [29]. Kaikki tapaukset tarkistettiin ja alueilla kudoksen näyte ensin tunnistettu ja merkitty asianmukaisen hematoksyliinillä ja eosiini värjätään slide asiantuntija konsultti ruuansulatuselimistön patologi (GIM). Kaksi 1 mm ytimiä Näiltä alueilta vastaavan vahan upotettu lohko käyttäen Beecher Instruments kudoksen microarrayer (Sun Prairie, WI, USA) ja asetettiin vastaanottajan parafiiniblokkiin. Siirron jälkeen vastaanottomuodostelmaan lohko kuumennettiin 37 ° C, ja lasilevyllä käytettiin varovasti painaa alas ytimet, jotta he olivat kaikki samalla tasolla vastaanottavassa vahaa.

Immunohistokemia

immunohistokemia kunkin vasta-aineen (taulukko 2) suoritettiin biotiini free Dako Envision ™ -järjestelmä (Dako, Ely, UK) käyttäen Dako Autostaineriin (Dako), kuten aiemmin on kuvattu [28], [30], [31] . Osiot kudoksen microarray poistettiin vaha ksyleenillä, niihin lisätään alkoholin ja antigeenin haku vaihe suoritetaan. Tämä vaihe koostui Mikroaaltouunissa osioista täysin upotettuna 10 mM sitraattipuskurissa pH 6,0 20 minuuttia 800 W mikroaaltouunia toimi täydellä teholla. Leikkeet sitten jäähtyä huoneen lämpötilaan. Primaarisen vasta-aineen sopivasti laimennettu (taulukko 2) vasta-laimentimeen (Dako) levitettiin 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin puskurilla (Dako) ja myöhemmin peroksidaasin esto 5 minuuttia (Dako). Tätä seurasi yksi 2 minuutin puskuripesulla, jonka jälkeen valmiiksi laimennettu peroksidaasi-polymeeri-leimattua vuohen anti-hiiri /kani sekundääristä vasta-ainetta (Envision ™, Dako) levitettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen edelleen pesu puskurilla poistamiseksi sitoutumattoman vasta-aineen. Sites Peroksidaasiaktiivisuuden sitten osoitettiin diaminobentsidiiniä kromogeenille vaatinut kolmen peräkkäisen 5 minuutin jaksoissa. Lopuksi leikkeitä pestiin vedellä, kevyesti vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty. Jättämällä pois primaarinen vasta-aineen immunohistokemiallisella menettelyä ja korvaamalla se joko vasta-aineen laimentimen tai ei-immuuni-kanin seerumia tarvittaessa toimivat negatiivisina kontrolleina. Positiiviset kontrollit kudosten tiedetään ilmentävän yksilön proteiinia.

kohdat arvioitiin valon mikroskooppinen tutkimus ja intensiteetti immunovärjääminen kunkin ytimen arvioida itsenäisesti kahdella tutkijan (DO’D ja GIM) käyttäen pisteytysjärjestelmä on aikaisemmin kuvattu arvioinnin proteiinin ilmentyminen kasvainkudoksessa mikrosiruja [28] – [31]. Intensiteetti immunovärjääminen kunkin ytimen pisteytettiin negatiivisiksi, heikko, kohtalainen tai voimakas. Sijainti solussa (joko ydin- tai soluliman) Immunovärjäyksen arvioitiin myös. Vaihtelu immuunivärjäykseen väliin ytimien tapauskohtaisesti ei tunnistettu. Poikkeamia arvioitaessa kudoksen ytimien välillä tarkkailijaa erotettiin samanaikaisesti mikroskooppisen uudelleenarviointia.

Arvio mikrosatelliittimerkkien epävakauden tila

mikrosatelliitti epävakaus asema (MSI) arvioitiin immunohistokemiallisesti käyttämällä vasta MLH1 ja MSH2 (taulukko 2) kuten aiemmin on kuvattu [30].

tilastot

tilastollinen analyysi immunohistokemiallista dataa myös U-testi, Wilcoxonin testi, Chi potenssiin testi, hierarkkinen klusterin analyysi, Kaplan-Meier selviytymisen analyysi, log-rank-testi ja Cox monen variate analyysi (muuttujat kirjattu kategoriseksi muuttujat), mukaan lukien laskeminen riskisuhteita ja 95% CI tehtiin käyttämällä PASW v18.0.2 for Windows XP ™ (SPSS UK Ltd, Woking, UK). Log-rank testiä käytettiin määrittämään selviytymisen erot yksittäisten ryhmien. Todennäköisyys arvo p≤0.05 pidettiin merkittävänä. Tutkia vaikutuksen eri poiskytkentäpisteiden suhteessa selviytymisen immunohistokemiallinen pistemäärät kunkin merkin oli kaksijakoinen. Ryhmät, jotka analysoitiin olivat negatiivisia versus mitään positiivista värjäytymistä, negatiivinen ja heikkoa värjäytymistä vastaan ​​kohtalainen ja vahva värjäytyminen ja negatiivisia, heikkoja ja kohtalainen värjäytyminen verrattuna vahva värjäytyminen. Hierarkkinen klusterin analyysi suoritettiin käyttäen kauimpana naapurin menetelmää neliön euklidinen etäisyys kuin klusterin toimenpide ja klusterin analyysi suoritettiin ilman jatkojalostusta tietojen imputoimalla puuttuvien arvojen [18], [19].

etiikka

hanke oli hyväksynnän Pohjois-Skotlannissa Research eettisen komitean (vrt. no. 08 /S0801 /81). Kirjallinen suostumus saatiin osallistujat, jotka tarjotaan tuoreita näytteitä kudosta proteomiikan osa tutkimuksesta. Tutkimuksen eettinen komitea luopunut vaatimasta kirjallinen suostumus taannehtivaa kudosnäytteiden sisältyvät peräsuolen syöpä kudos microarray.

Tulokset

Proteomiikka

Yhteensä yli 1200 yksittäisiä proteiini täplät lakkasivat erottamisen 2D-geelielektroforeesilla ja kuva-analyysin normaalissa paksusuolen limakalvolla ja paksusuolen kasvaimet (kuvio 1). Hierarkkinen klusterianalyysi ja periaatteen komponenttien analyysi osoitti, että erottaminen proteiinien kahteen erilliseen ryhmät-normaalin ja kasvaimen (kuvio 2). Tutkimuksessa oli mukana sekä proksimaalisen ja distaalisen paksusuolen kasvaimia eikä klusterin eikä pääosatekijää analyysi osoitti, että oli mitään eroa proteiiniekspressiossa profiilien välillä kasvain ja normaali limakalvo näissä anatominen paikoissa. Proteiinit, joilla oli suurempi kuin ja yhtä suuri kuin 1,5-kertaisesti lisääntynyt ilmentyminen Tuumorinäytteissä esitetty yhteenvetona olevat tiedot taulukossa S2. Identiteetti näiden proteiinien oli enimmäkseen vahvistettiin nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla. Kullekin proteiini useita peptidejä, joilla on korkea tilastollinen todennäköisyys (p 0,05) tulitikkujen asianomaiselle proteiini analysoitiin vahvistaa identiteettiä. Tiedot massaspektrometrisia proteiinien tunnistamiseksi on esitetty olevat tiedot taulukossa S3.

edustajan viite 2D geelejä normaalin paksusuolen (A) ja paksusuolen kasvain (C). Nämä ovat selityksin viittaus geelit luoma Progenesis Sama Spots geeli kuva-analyysi-ohjelmisto analysointiin yksittäisten geelejä. Määrä kunkin täplän osoitetaan, että kuva-analyysi-ohjelmisto. Helpompi visualisointi yksittäisiä paikkoja edustavan ei-selityksin 2D geelejä normaalin paksusuolen ja paksusuolen kasvain on esitetty paneelien B ja D vastaavasti. Proteiinit joka todensi immunohistokemiallisesti on havaittu D.

edustaja hierarkkinen klusterianalyysin (A) ja pääkomponenttien analyysiä (B) normaalin ja kasvaimen geelejä. Molemmat tilastolliset menetelmät osoittavat, että proteiini ekspressioprofiileja määrittää 2D-geelielektroforeesilla ja geeli kuva-analyysi ovat erillisiä Tuumorinäytteissä tavanomaiseen verrattuna näytteitä. Alempi paneeli jokaisessa kuvassa on standardoitu ekspressioprofiileja. Luvut esitetty kuvassa 2 ovat ”kuvaruutukaappausta” lähdön analyysin mukaan Progenesis SameSpots ohjelmisto. Sekä kuviossa 2A ja kuviossa 2B edustaa tuloksia samassa kokeessa yhden tapauksen (eli yksi pari normaalia geelien N1 ja N2 ja yhden parin kasvaimen geelien T1 ja T2). Alempi paneeli kunkin osan kuvassa on standardoitu ilmaisun profiilin ja edustaa proteiinien erillisiä ilmaisun piirretään pystysuoraan rivit ”yhdistävät” vastaava proteiinit kussakin geeli. Värillinen täplät edustavat interaktiivinen paikkoja asettamat ohjelmiston käyttäjä voi käyttää kullekin tietoaineiston ja sijoitetaan mielivaltaisesti ohjelmiston ruudulla.

immunohistokemia

Viisitoista proteiineja valittiin immunohistokemiallista validointi. Kriteerit valinnassa proteiinien mukana aste yli-ilmentymisen kolorektaalisyövässä, syrjäytyminen tunnettujen rakenteellisten esim aktiini ja seerumin proteiineihin e.g.haemoglobin ja sopivien validoitu vasta jotka olivat tehokkaita formaliinilla vaha upotettu kudosta.

Kaikki proteiinit osoittivat kasvaimen solujen värjäytymisen ja paitsi nucleophosmin (NPM1) osoitti sytoplasmista värjäytymistä (kuva 3). NPM1 osoitti yksinomaan tumavärjäystä kun glyseraldehydi-3-fosfaatti (GAPDH) osoitti sekä ydin- ja sytoplasman värjäytymistä ja näiden kahden solukomponenttien lokalisoinneissa on arvioitu erikseen tätä proteiinia. S100A9 osoitti muuttuvien kasvaimen solujen värjäytymisen (S100A9t) ja muuttuva tukikudosten solujen värjäytymisen (S100A9s) ja näiden kahden solun lokalisoinneissa tämän proteiinin on arvioitu erikseen. Proteiinit että useimmin osoitti vahvaa kasvainsolujen immuunivaste ensisijainen kolorektaalisyövässä olivat NPM1 (99,6%), suuret holvissa proteiinia (MVP, 81,1%) ja prohibitin (PHB, 75,6%), kun taas imusolmuke metastaasit niitä proteiineja, jotka osoittivat yleisin vahva kasvainsolun immunoreaktiivisuus oli NPM1 (95,8%), MVP (74,5%) ja lämpöshokkiproteiini 60 (HSP60, 63,9%) (kuvio 4). Normaalissa paksusuolen proteiineja, jotka osoittivat korkeimman taajuuden vahva epiteelisolujen immunoreaktiivisuus oli NPM1 (99,6%), isositraattidehydrogenaasin 1 (IDH1, 93%) ja laktaattidehydrogenaasin B (LDHB, 82,1%) (kuvio 4).

mikrovalokuvia immunohistokemiallinen lokalisointi yksittäisten proteiinien normaalissa paksusuolessa, ensisijainen peräsuolen syövän ja imusolmuke etäpesäke.

taajuus ilmaisun arvioituna immunohistokemiallisesti yksittäisten proteiinien A. normaalissa paksusuolessa, B, ensisijainen peräsuolen syöpä ja C. imusolmuke etäpesäke.

proteiineja, jotka osoittivat suurimmassa määrin yli-ilmentymisen ensisijaisen kolorektaalisyövässä verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvo oli HSP60 (p 0,001), S100A9 (p 0,001) ja translatinally kontrolloi tuumoriproteiinia (TCTP, p 0,001, taulukko 3), kun taas Dukes C syöpien ole proteiineja oli kohonnut immunoreaktiivisuuden imusolmuke etäpesäke verrattuna vastaavan ensisijaisen ja peräsuolen syöpien ja proteiineja, jotka osoittivat eniten väheneminen ilmentymisen imusolmuke etäpesäkkeitä oli PHB (p = 0,002), peroxiredoxin (PRDX1, p = 0,003) ja HSP60 (p = 0,005, taulukko 3). Suhdetta proteiinin ilmentymisen yksittäisten Dukes vaiheiden on esitetty taulukossa 4 ja kuviossa 5.

Frequency ilmaisun yksittäisten proteiinien arvioitiin immunohistokemiallisesti A. Dukes peräsuolen syöpä, B. Dukes B peräsuolen syöpä ja C. Dukes C peräsuolen syövän.

vertailut ilmentymisen yksittäisten proteiinien ja kliinis-patologisia parametrit esitetään taulukossa 5. Useat proteiinit osoittivat erittäin merkittävää yhteyttä microsatellite epävakautta tila lukien 14-3-3β (χ

2 = 22,441, p 0,001), HSP60 (χ

2 = 27,663, p 0,001) ja IDH1 (χ

2 = 47,733, p 0,001) .

Survival analyysi

analyysi yksittäisiä merkintöjä.

suhde ilmentymisen yksittäisten proteiinien ja selviytymistä tutkittiin käyttämällä erilaisia ​​katkaisurajapisteet (negatiivinen v positiivinen, negatiivinen /heikko positiivinen v kohtalainen /strong ja negatiivinen /heikko /kohtalainen v voimakas) ja on esitetty yhteenvetona taulukossa 6 ja kuvassa 6. 14-3-3β tulkittiin esittävän ennustetekijöitä merkitys (χ

2 = 6,218, p = 0,013, riskisuhde (HR) = 0,639, 95%: n luottamusväli (CI) 0,448-,913) kun syöpäkasvain verrattiin kasvaimia osoittaa minkä verran 14-3-3β immunoreaktiivisuus (kuvio 6A). Kasvaimet esittää puuttuessa 14-3-3β immunoreaktiivisuus liittyi parempi ennuste. Jos potilaalla on 14-3-3β syöpäkasvain (n = 104, kuolleiden määrä = 36) keskimääräinen eloonjäämisaika oli 129 kuukautta (95% CI 113-145kuukausi) ja potilaille, joilla on kasvaimia (n = 398; kuolemantapauksia = 194) keskimääräinen elinaika oli 107 kuukautta (95% CI 98-117 kuukautta). Tämä oli ennusteen mukaan merkittäviä (p = 0,03, HR = 0,588, 95% luottamusväli 0,361-0,958) monimuuttuja malli sisältää kaikki muuttujat (Dukes vaiheessa EMVI, kasvainpaikkaa, potilaan ikä, potilaan sukupuoli, ilmentyminen yksittäisten proteiinien). Toinen merkittävä muuttujat olivat Dukes vaiheessa (p 0,001, HR = 0,491, 95% CI +0,357-+0,714), ikä (p 0,001, HR = 0,470, 95% luottamusväli 0,343-0,645) ja ulkopuolinen verisuonten invaasio (EMVI, p 0,001, HR = 0,467, 95% luottamusväli 0,338-0,644). Vaikka PHB lauseke (positiivinen v negatiivinen PHB immunoreaktiivisuus) pantiin merkille myös olla erittäin merkittävää yhteyttä selviytymisen (χ

2 = 7,883, p = 0,005, HR = 3,311, 95% luottamusväli 1,359-8,064) vain 6 potilasta oli PHB negatiivinen ryhmä (kuvio 6B). Muita proteiinia, joka osoitti merkittävää suhdetta selviytymisen eri cut off kohdat olivat IDH1, LDHB, TCTP ja MVP (taulukko 6 ja kuvio 6C-6G).

suhde yksittäisten proteiinien arvioitiin immunohistokemiallisesti selviytymisen eri cut-off pistettä. A. 14-3-3β (positiivinen v negatiivinen immunoreaktiivisuus), B. PHB (positiivinen v negatiivinen immunoreaktiivisuus), C. IDH1 (negatiivinen /heikko immunoreaktiivisuus v kohtalainen /voimakas immunoreaktiivisuus), D. LDHB (negatiivinen /heikko immunoreaktiivisuus v kohtalainen /voimakas immunoreaktiivisuus), E. TCTP (negatiivinen /heikko immunoreaktiivisuus v kohtalainen /voimakas immunoreaktiivisuus), F. IDH1 (negatiivinen /heikko /kohtalainen immunoreaktiivisuus v voimakas immunoreaktiivisuus), G. MVP (negatiivinen /heikko /kohtalainen immunoreaktiivisuus v voimakas immunoreaktiivisuus), H . selviytyminen kussakin 10 klustereiden tunnistaa hierarkkinen klusterianalyysin (kukin klusteri on numeerisesti tunnistettu ja vastaa klustereita, jotka on yksilöity klusterianalyysin paneeli kuvio 7), I. selviytyminen 2 clusters- cluster 1 ja klustereita 2-10 yhdistetään ja J. kaksi proteiinia allekirjoitus 14-3-3β ja ALDH1 osoittaa, että kaksinkertainen syöpäkasvain on huomattavasti parempi lopputulos.

Hierarkkinen klusterianalyysin ja tunnistaminen prognoosi- proteiinin allekirjoitus.

Hierarkkinen klusterianalyysillä käytettiin myös valmistelevan tilastollinen väline tarkastella yleistä suhdetta Merkittyjen ilmaisutapoja tulokseen ja tämän perusteella tunnistamaan proteiiniin allekirjoitus liittyy ennusteeseen. Valikoima klusteriratkaisuissa (klusterien lukumäärä) tutkittiin määrittää optimaalisen määrän klustereita, jotka tuottivat erilaisten ryhmien tuloksiin. Klusterointi datan kymmenen klustereita todettiin optimaalinen klusterien lukumäärä analyysiä suhteessa kaikkein ennusteen mukaan merkittäviä ryhmät (tukevat tiedot Taulukko S4, kuvio 6H ja kuvio 7). Nämä 10 klusterit yhdistettiin sitten kahteen ennustetekijöiden ryhmään; ennuste oli hyvä ryhmä (ryhmä 1) ja huonoon ennusteeseen ryhmä (klusteri ryhmät 2-10) (Kuva 6I). Hyvä ennuste ryhmä (keskiarvo selviytymisen = 157 kuukautta 95% CI 135-177kuukausi, n = 39, kuolleiden määrä = 8) oli merkitsevästi parempi eloonjäämisen (χ

2 = 8,144, p = 0,004, HR = 0,373, 95% CI ,179-0,757) kuin huono ennuste ryhmä (keskiarvo selviytymisen = 106 kuukautta, 95% CI 1-2-119 kuukautta, n = 392, kuolleiden määrä = 183).

graafinen esitys immunohistokemia merkki data näkyy keskellä paneelissa. Oikeanpuoleinen paneeli esittää tulokset hierarkkinen klusterianalyysin esitetään dendrogrammissa 10 yksittäisten klustereita tunnistettu. Vasemmanpuoleinen kenttä esittää laajennetun segmentin graafinen esitys.