Krooninen sairaus

tiivistelmä

Rasvakudos pidetään nyt hormonitoimintaa urut mukana aineenvaihdunnan ja tulehdusreaktioita. Adiponektiini, 244 aminohapon peptidi hormoni, joka liittyy insuliiniresistenssi ja karsinogeneesiin. Curcumin (diferuloylmethane) on pääasiallinen curcuminoid suosittu intialainen mauste, kurkuma. Curcumin hallussaan antituumorivaikutukset, kuten estämällä uudissuonittumisen ja sääntelyn solukierron ja apoptoosin. Kuitenkin vaikutukset adiponektiini ja kurkuma Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa arvioimme ilmaus adiponectin pariksi kasvaimet ja normaali keuhkojen kudoksia 77 potilasta NSCLC käyttäen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio, Western blotting ja immunohistokemia. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että potilailla, joilla on alhainen adiponectin ilme suhde ( 1) oli merkitsevästi pidempi elinaika kuin ne, joilla on korkea ilmentymisen suhteen ( 1) (

p

= 0,015). Curcumin esti muuttavien ja invasiivisia kyky A549-solujen kautta estämällä adiponectin ilmentymisen estämällä adiponectin reseptoriin 1. Curcumin hoito esti myös

in vivo

kasvaimen kasvua A549-solut ja adiponektiini ilme. Nämä tulokset viittaavat siihen, että adiponectin voi olla prognostinen indikaattori NSCLC. Vaikutus curcumin alenevassa muuttavien ja invasiivisia kyky A549-solut estämällä adiponectin ilmentyminen luultavasti välittyvät NF-KB /MMP polkuja. Curcumin voisi olla merkittävä potentiaali adjuvanttia terapeuttinen aine keuhkosyövän tulevaisuudessa.

Citation: Tsai J-R, Liu P-L, Chen Y-H, Chou S-H, Cheng Y-J, Hwang J-J, et al. (2015) Curcumin Estää ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut etäpesäke kautta Adiponectin /NF-KB /MMP signalointireitin. PLoS ONE 10 (12): e0144462. doi: 10,1371 /journal.pone.0144462

Editor: Jeremy J.W. Chen, Institute of Biomedical Sciences, Taiwan

vastaanotettu: 18 elokuu 2015; Hyväksytty: 18 marraskuu 2015; Julkaistu: 10 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Tsai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee avustukset NSC 100 – 2320 – B – 037-012 – My2 National Science neuvoston ROC, Taiwan Jong-Rung Tsai. National Science neuvosto R.O.C, Taiwan on valtion organisaatio, joka on ulkopuolinen kirjoittajien yliopiston. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti ja Taiwanissa. Huolimatta suuria edistysaskeleita ymmärtämisessä keuhkojen syövän synnyn ja uusilla hoitoja viime vuosikymmeninä, yleinen 5 vuoden pysyvyys on edelleen heikko. Innovatiivinen tutkimustyötä on suunnattava uudelleen tutkimiseksi mahdollisia merkkiaineita ennusteen, mekanismeja keuhkojen syövän synnyn, ja adjuvanttihoito.

Rasvakudos on tällä hetkellä pidetään hormonitoimintaa elin, joka erittää useita sytokiineja (adipokines) [1], mukaan lukien adiponectin ja leptiini. Adiponectin on 244 aminohapon polypeptidi, joka säätelee lukuisia metabolisia prosesseja, kuten glukoosi sääntelyn ja rasvahappojen kataboliaa [2]. Se kykenee merkittäviä vaikutuksia aineenvaihduntaan ja lipogeneesiin, sekä sääntelystä ihmisen tulehdusreaktioita [3]. Aikuisilla adiponectin pitoisuuksia käänteisesti verrannollisia kehon rasvaprosentti ja insuliiniresistenssi [4]. Adiponectin on diabeteslääkkeet, anti-atherogenic, tulehdusta, ja antiangiogeenisiä ominaisuuksia [5].

rooli adiponectin karsinogeneesis- on kiistanalainen [5]. Lihavuus liittyvät maligniteetit kuten kohdun limakalvon syöpä, vaihdevuosien jälkeisen rintasyövän, paksusuolen syöpä, munuaissyöpä, ja hematologisia syöpiä, adiponectin ilmentyminen korreloi positiivisesti tätä riskiä. Lisäksi alhainen adiponectin pitoisuuksia on raportoitu maha- ja eturauhassyövän [6]. Kuitenkin ei-lihavuuteen liittyvien syöpien, kuten keuhkosyövän, seerumi adiponectin ei ole merkittävä ennustaja riski [7].

Adiponectin reseptoreihin 1 ja 2 teko suoraan kasvainsoluihin sitomalla ja aktivoimalla adiponektiini reseptoreita ja loppupään signalointireitteihin [5]. Adiponectin jolla on anti-angiogeneesin ja tuumorin vastaista kyky, mikä tapahtuu läpi kaspaasi-välitteistä endoteelisolujen apoptoosia [8]. Se voi myös estää maksan kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden tukahduttamalla kasvaimen angiogeneesiä ja vähen- tämisessä ROCK /IP10 /matriksin metalloproteinaasi (MMP) -9 reitti [9].

kuitenkin adiponectin on mahdollinen markkeri eturauhassyövän etenemisen [ ,,,0],10]. Kondrosarkoomasoluissa, se välittää siirtymisen ihmisen kondrosarkoomasoluissa jonka transkription säätelyä alpha2beta1 integriinin ja aktivointi AdipoR reseptorin, AMPK, p38 ja NF-KB: n reittejä [11]. Kuitenkin, sen rooli keuhkosyövän on edelleen epäselvä [12,13]. Petridou et ai. kertoi, että kiertävä adiponectin tasoja ei korreloi keuhkosyövän vaiheissa [14]. Ilmaisu on adiponectin reseptori 1 on suotuisa ennustetekijä keuhkosyöpään [15].

Curcumin (diferuloylmethane), luonnollinen yhdiste uutetaan

Curcuma longa

, on käytetty antiikin ajoista lähtien Orient kuin parantava aine eri sairauksia. Curcumin on useita farmakologisia vaikutuksia, kuten tulehduksia [16], antioksidantti [16], mikrobilääkkeiden [17], ja syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [18-21]. Sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista ilmenevät aikana solujen lisääntymistä, invaasiota, etäpesäke, apoptoosin, ja angiogeneesi [22]. Esimerkiksi curcumin voi aiheuttaa solujen apoptoosin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [23,24]. Molekyyli perusteella sen syöpää vaikutuksen katsotaan johtuvan sen vaikutus useita tavoitteita, kuten transkriptiotekijät, kasvunsääteet, adheesiomolekyylien, apoptoottiset geenit, angiogeneesi sääntelyviranomaisten, ja solujen molekyylejä [25]. Vaikka curcumin estää keuhkosyöpäsolua muuttoliikettä ja invaasiota kautta Ras-1 tai Wnt /B-kateniinin polkuja, sääntelyn mekanismi curcumin keuhkosyövässä on tuntematon.

Useimmat keuhkosyöpätapauksista diagnosoitu pitkälle edenneessä vaiheessa, kun hoito on suhteellisen tehoton. Miten laajentaa tällä hetkellä saatavilla kemoterapeuttisten hoitojen kanssa adjunctive rohdosvalmisteita, mikä saattaa vähentää sivuvaikutuksia ja toksisuutta vaarantamatta terapeuttista tehoa, on tullut suosittu lähestymistapa viime vuosikymmeninä. Curcumin on yksi tällainen mahdollinen ehdokas. Tässä tutkimuksessa selvitettiin ja ennustavia roolit adiponectin in NSCLC. Käyttämällä

in vitro

A549 soluviljelmässä ja eläinmallin, osoitimme mahdollista roolia curcumin hoitoon keuhkosyöpään. Tarkka molekyylitason mekanismi curcumin välittämisessä adiponectin vaikutus tutkittiin. Näin ollen potentiaalin curcumin adjuvanttina aineena keuhkosyövän hoidossa tutkitaan myös.

Tulokset

Demografiset tiedot ja adiponektiini ilmaisun pienisoluista keuhkosyöpää

Niistä 77 NSCLC potilasta tässä tutkimuksessa 58 (75%) oli histologisesti varmennettu adenokarsinooma ja 19 (25%) oli levyepiteelikarsinooma. Heidän keski-ikänsä oli 61,6 ± 10,3 vuotta (vaihteluväli 36-78 vuotta). Adiponectin ekspressiota ei korreloi kasvaimen (T), imusolmukkeiden (N), ja vaiheet. NSCLC potilailla, joilla on etäpesäkkeitä oli merkittävästi korkeammat adiponectin ilmentymisen suhteen (taulukko 1). Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että NSCLC potilaat, joilla on alhainen adiponectin ilmaus suhde oli merkitsevästi pidempi elinaika kuin ne, joilla on korkea adiponectin ilmaus suhde (

p

= 0,015) (kuvio 1). Monimuuttuja-oikaistu riskisuhteita laskettiin Cox regressio kanssa lisämuuttujaa sukupuolen (mies vs. nainen), etäpesäke, kasvain, imusolmuke osallistuminen, ja vaiheet (taulukko 2). Korkean adiponectin lauseke ryhmä oli 2,40 kertaa suurempi kuolleisuusriski (

p

= 0,04) kuin matalan ilmaisua ryhmässä.

Expression tasoja adiponectin, adiponektiini reseptoreihin, ja MMP-pienisoluista keuhkosyöpää

ekspressiotasot adiponectin, adiponektiini reseptoreita, ja MMP NSCLC potilaat analysoitiin (kuvio 2). Immunohistokemiallinen värjäys ja Western blotting keuhkosyöpään kudosten osoitti voimistunutta ilmentymistä adiponektiini ja adiponektiini reseptori 1 keuhkosyöpä kudosta kuin normaalissa keuhkokudoksessa (kuvio 2A-2C). Kaikki MMP lisääntyivät myös keuhkosyöpä kudosta kuin normaalissa keuhkokudoksessa (kuvio 2D-2F).

(A) Näytteet (keuhkosyöpä ja vastaava normaalin viereisen keuhkojen kudoksiin) analysoitiin vasta-aineita adiponektiini , adiponectin reseptori 1, ja adiponektiini reseptori 2 immunohistokemiallisella värjäyksellä (DAB värjäys ja hematoksyliinillä counterstaining). Negatiivisia kontrolleja varten, vasta-aine oli korvattu kontrolli-lgG. (B-C) Expression tasot adiponektiini, adiponektiini reseptori 1, ja adiponektiini reseptori 2 kolme paria keuhkosyövän ja normaaleissa kudoksissa analysoitiin western-blottauksella. (D-F) gelatiinitsymografialla käytettiin analysoimaan toiminnan MMP-2 /MMP-9, MMP-1 /MMP-3 ja MMP-13 /MMP-14. *

p

0,05 vs. normaali keuhkojen kudosta, jossa edustavat tiedot kolmesta eri potilasta NSCLC. T, kasvain; N, normaali; ADN, Adiponectin; AdipoR1, adiponectin reseptori 1; AdipoR2, adiponektiini reseptorin 2.

Sytotoksinen vaikutus kurkumiinista ilmentymisen adiponektiini ja adiponektiini reseptoreihin A549-soluissa

A549-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla curcumin. MTT-määritystä paljasti, että curcumin oli sytotoksinen vaikutus A549 solulinjoissa pitoisuuksina 75 uM (kuvio 3A). Western blotting paljasti myös, että ilmaus adiponectin A549-soluissa laski merkittävästi, kurkuma pitoisuus on 50 uM (kuvio 3B). Proteiini ilmentyminen adiponektiini reseptorin 1 ja adiponektiini reseptori 2 eivät muuttuneet curcumin hoitoon myös suurilla pitoisuuksilla. Transfektiota A549-solujen kanssa adiponectin vektori tai pieni häiritsevä RNA (siRNA) plasmidi onnistuneesti korottaa tai vaiennettu ilmentymisen adiponektiini, kuten on osoitettu polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ja Western blotting (kuvio 3C ja 3D).

(A) Solujen elinkelpoisuus analysoitiin MTT-määritystä. Sytotoksinen vaikutus curcumin oli ilmeinen pitoisuuksina 75 uM. (B) ekspressio tasot adiponektiini, adiponektiini reseptori 1, ja adiponektiini reseptori 2 A549-solut analysoitiin Western blot -menetelmällä eri curcumin pitoisuuksina. (C-D) Ulkoisia induktion ja vaiennettu adiponektiini ilmaisun A549-soluja. Adiponectin mRNA /proteiinin ilmentyminen A549-solujen määrä nousi merkittävästi kun eksogeeninen adiponectin ilmaisun analysoituna reaaliaikainen PCR. Adiponectin ilme väheni merkittävästi sen jälkeen, siRNA-välitteisen adiponectin hiljentäminen. NC-siRNA toimi negatiivisena kontrollina. Edustavia kuvia kolmen erillisen kokeen. *

p

0,05 vs. kontrolli. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

vaikutukset kurkuma ja adiponektiini muuttavaa ja invasiivisia kyky A549-solut

Cellular muuttoliikettä analysoitiin haavan tyhjästä määrityksen, kun invasiivisuus määritettiin Matrigel-pinnoitettu Boyden kammion määrityksessä. Verrattuna kontrolliryhmään, vaeltavien ja invasiivisia kyky A549-solut oli merkitsevästi inhiboi curcumin hoito annoksesta riippuvaisella tavalla (

p

0,05) (kuvio 4A ja 4B). Toisaalta, rekombinantti adiponectin lisäsi invasiivisia ja muuttavien kyky A549-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (

p

0,05) (kuvio 4C ja 4D).

(A) Cellular muuttoliike määritettiin käyttäen tyhjästä haava määritystä ja analysoitiin käyttäen Wimasis WimScratch ohjelmisto. Vaeltavien kyky A549-solut inhiboitui merkittävästi lisäämällä curcumin annostus verrattuna kontrolliryhmään (

p

0,05). (B) invasiivisuus määritettiin Matrigel kuorrutettu Boyden kammion määrityksessä. Curcumin vähensi invasiivisia kykyä A549-solut (

p

0,05), kun curcumin pitoisuus oli 25 uM. (C-D) soveltaminen rekombinantin adiponectin (rADN) lisäsi merkittävästi muuttavien ja invasiivisia kyky A549-solut (

p

0,05). Tulokset kolmen erillisen kokeen näkyvät; määritykset tehtiin kolmena kappaleena.

Regulatory roolit adiponectin reseptorin-1 ja adiponektiini reseptori 2 maahanmuutto- ja invasiivisuus A549-solujen

A549-soluja transfektoitiin adiponectin siRNA, adiponectin reseptori 1 siRNA, ja adiponektiini reseptori 2 siRNA plasmidi. Plasmiditransfektiolla vähensi ekspressiotasot adiponektiini, adiponektiini reseptori 1, ja adiponektiini reseptori 2 A549-solut, kuten vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio 5A-5C). Hiljentäminen adiponectin ilmaisua ei vaikuttanut ilmaus molempien adiponektiini reseptorin 1 ja reseptori 2, mutta hiljentää ilmaus adiponectin reseptori 1 estetty vaikutus adiponectin, mikä tehosti muuttavien ja invasiivisia kyky A549-solut. Kuitenkin hiljentäminen ilmaus adiponectin reseptori 2 ei antagonisoinut adiponectin maahanmuutto- ja invasiivisuus A549-soluissa (kuvio 5D ja 5E).

(A-C) Ilmaisulla tasot adiponectin, adiponectin reseptori 1, ja adiponektiini reseptori 2 analysoitiin western-blottauksella transfektion jälkeen adiponectin vektorilla tai hiljentämiseltä siADN, siAdipoR1, ja siAdipoR2. (D-E) Minkään vaeltavia ja invasiivisia kyky A549-solut estyi jälkeen hiljentäminen on adiponectin reseptorin 1 ilme transfektiolla siAdipoR1.

Regulatory polkuja curcumin vuonna adiponectin ilmaisun

A549-soluja käsiteltiin eri estäjien, mukaan lukien inhibiittorit PI3K /AKT ja MAP-kinaasin reitit {PI3K (LY294002; 10 uM), AKT (API-59, 3 pM), ja MAPK-estäjät [PD98059 (10 pM) , SB203580 (10 uM), ja SP600125 (10 uM) ja ERK, p38-MAPK, ja JNK, vastaavasti]}, 1 h ja myöhemmin kurkumiini (50 uM) 24 tunnin ajan. ERK: n ja p38-reitin inhibiittorit estivät estävää vaikutusta kurkumiinista adiponectin ilmentymistä (kuvio 6A). Lisäksi yhdistelmä-DNA-adiponectin lisääntynyt ilmentyminen AKT (kuvio 6B). Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) osoitti, että adiponectin säädellä NF-KB: n ilmentymisen kautta AKT-reitin aktivaation (kuvio 6C).

(A) A549-soluja käsiteltiin erilaisilla PI3K /AKT ja MAP-kinaasireitin estäjät {(PI3K (LY294002; 10 uM), AKT (API-59, 3 uM), MAPK-inhibiittorit [PD98059 (10 uM), SB203580 (10 uM), ja SP600125 (10 uM) ja ERK, p38-MAPK, ja JNK, vastaavasti] } 1 tunti ja myöhemmin kurkumiini (50 uM) 24 tunnin ajan. Adiponectin ilmentyminen analysoitiin western blot -menetelmällä. (B) AKT ilmentyminen analysoitiin western-blottauksella eri pitoisuuksilla rekombinaation adiponektiinin. (C) aktiivisuus p65 /p50 A549-solujen analysoitiin EMSA hoidon jälkeen yhdistelmä-adiponectin tai AKT-estäjällä (API-59, 3 uM), tässä järjestyksessä.

Co-immunosaostuksella (Co-IP) määritys

Tämä testi osoitti, että adiponectin koostui monomeerin, dimeerin ja multimeeri (kuvio 7A). Curcumin ja hiljentäminen adiponektiini transfektio vähennetty onnistuneesti ilmaus adiponektiini monomeerin ja dimeerin. Curcumin myös vähensi p65 ilmaus, mikä näkyy Co-IP ja EMSA määrityksissä (kuvio 7B ja 7C). Parannettu adiponectin ilme transfektiolla adiponectin lisäsi myös NF-KB: n ilmentymistä. Adiponectin voi translokoituvat sen tumaan sitomaan ydin- p65.

(A) A549-soluja käsiteltiin curcumin, vaiennetaan tai transfektoitu adiponektiini hajotettiin ja adiponektiini oli mukana immunosaostettiin käyttäen adiponectin vasta-ainetta. Immunoblottaus mainituilla vasta-aineilla vahvistivat yhteistyössä saostumisen adiponektiini monomeerin, dimeerin ja multimeeri. (B) Co-immunosaostus suoritettiin käyttäen anti-adiponektiini ja anti-p65-vasta-aineita. P65-eluaatti erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattu vastaavien vasta-aineiden, jotka osoittivat huomattavaa yhdistys adiponectin kanssa p65 komponentti. (C) NF-KB: n yli-ilmentyminen tai vaiennettu adiponectin määritettiin EMSA. Adiponectin lisäsi tumaansiirtymiseen p65 /p50 ja NF-KB: n aktivoitumisen, mutta hiljentäminen adiponectin ilme oli päinvastainen vaikutus.

In vivo

ja

in vitro

vaikutus adiponectin on MMP ilmaisun

transfektio adiponectin menestyksekkäästi lisäsi ilmaisun MMP-2, -9, -1, ja -14 A549-soluissa. Kuitenkin MMP-3 ja -13 ei muutu parannettu tai vaiennettu adiponectin ilmentymistä (kuvio 8).

gelatiinitsymografialla käytettiin analysoitiin toimintaa MMP-2 /MMP-9, MMP- 1 /MMP-3 ja MMP-13 /MMP-14. (A-F) toiminta MMP-9, -1, ja -14 korotettiin jälkeen yli-ilmentyminen adiponektiini ja väheni vaiennettaisi adiponectin. MMP-3 ja -13 ei muuttanut riippumatta adiponectin kasvattamiselle tai hiljentäminen.

In vivo

vaikutus curcumin kasvaimen kasvua ja ilmentymistä adiponektiini ja MMP: iden

Curcumin hoito vähensi

in vivo

kasvaimen kasvua ja adiponektiini ilmaisun verrattuna verrokkiryhmään (DMSO) (

p

0,05) (kuvio 9A ja 9B), mutta ilmentyminen molemmat adiponektiini reseptorin 1 ja reseptori 2 ei muuttunut (kuvio 9C). Curcumin hoito myös merkittävästi vähentynyt tasot kaikki MMP paitsi MMP-1, joka pysyi vaikuttamattomissa, verrattuna verrokkiryhmään (kuvio 9D-9F).

(A) Kasvaimen koot kurkuma-käsitellyistä hiiristä oli väheni merkittävästi verrattuna kontrolliryhmään jälkeen 14 päivää. (B) Kasvaimen adiponectin ilmentymisen kurkuma-käsiteltyjen hiirten laski huomattavasti verrattuna kontrolliryhmään. (C) Expression molempien adiponektiini reseptorin 1 ja reseptori 2 curcumin saaneilla hiirillä ei muuttunut

in vivo

. (D-F) Expression MMP-2, -9, -3, -13, ja -14 vähennettiin kanssa curcumin käsittely

in vivo

. MMP-1 ilmentyminen ei muuttunut.

Keskustelu

Kemoterapia on edelleen ensisijainen hoito kehittynyt keuhkosyöpä [26], vaikka täsmähoitoihin on suositumpi. Vakavia haittavaikutuksia solunsalpaajahoitoa yleensä rajoittaa niiden kliinistä soveltamista. Niinpä lääkärit ovat yhä kiinnostunut kasviperäisten koska viime vuosikymmeninä, koska sen turvallisuutta ja tehoa adjuvanttihoitona. Curcumin, fenoliyhdisteellä johdettu kasvi

Curcuma longa

, on käytetty jo vuosisatoja sen tulehdusta, chemopreventive, ja mahdollisten kemoterapeuttisten ominaisuuksia. Till päivämäärä, nykyinen näyttö osoittaa, että curcumin voi estää syöpäsolujen lisääntymistä, transformaatio, ja hyökkäys [27]. Tämä tutkimus osoitti, että curcumin voi estää muuttavien ja invasiivisen kapasiteetti A549-solut

in vitro

annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi Kurkumiini myös vähensi

in vivo

kasvaimen kasvua.

Kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden on monimutkainen monivaiheinen prosessi, johon kiinnittyminen, hajoaminen Ympäröivän väliaineen muuttoliike, leviämisen, ja angiogeneesin [ ,,,0],28]. Curcumin hallussaan korkea luonnollinen haarapesäkkeiden kyky. Se voi vähentää hyökkäystä B16F-10 melanoomasoluja estämällä MMP-2 ja MMP-9 ja parantaa ilmentymistä antimetastaattista proteiinien (E-kadheriinin ja kudosten inhibiittoreita MMP-2) [29,30]. Kun ksenografti kasvain malli eturauhasen tai rintasyöpä, kurkumiini osoittivat myös korkean antimetastaattista vaikutusta estämällä MMP-9, NF-KB: n ja syklo-oksigenaasi-2 [31,32]. Tässä tutkimuksessa curcumin voi estää migraation ja invaasion A549 on annosriippuvaisesti

in vitro

. Meidän ksenograftimallia A549, curcumin voidaan merkittävästi vähentää kasvaimen kasvua ja sillä on samanlainen tukahduttava vaikutus ilmentymisen MMP, paitsi MMP-1 ja -13.

Rasvakudos pidetään hormonitoimintaa järjestelmä, joka voi erittävät paljon hormonit ja sytokiinit, jotka tunnetaan adipocytokines [33]. Adiponectin edustaa runsain rasvakudoksesta proteiinia insuliiniherkistävä, tulehdusta, ja anti-aterogeenisiä ominaisuuksia [34,35]. Lisäksi adiponectin voi olla rooli kehittymistä ja etenemistä eri pahanlaatuisia kasvaimia [35]. Seerumin adiponektiinin taso on käänteisesti yhteydessä riski lihavuuteen liittyviä maligniteetteja, mukaan lukien rinta-, kohdun limakalvon, ja eturauhasen syöpiä, mutta se korreloi positiivisesti mahasyövän ja leukemia [35].

Kuitenkin ennustetekijöiden rooli verenkiertoelimistön adiponectin keuhkosyövässä yhä kiistanalainen [12,14]. Tässä raportissa adiponectin ilmaisu ei korreloi keuhkosyöpään TN ja vaiheet. Keuhkosyöpä potilailla, joilla on alhainen adiponectin ilme suhde osoitti pidempi elinaika kuin ne, joilla on korkea ilme. Siten adiponectin ilme voi olla ennustetekijä NSCLC.

Tässä tutkimuksessa olemme myös osoittaneet, että NSCLC potilaat metastasiaa on huomattavasti suurempi adiponectin ilmaus suhde kuin ilman etäpesäkkeitä. Yli-ilmentyminen adiponectin transfektoimalla voi lisätä invasiivinen ja metastaattinen kyky A549-solut, kenties aktivointi MMP (1, 9, 14). Adiponectin voi estää paksusuolen [36,37] ja maksan [37] syöpäsolun maahanmuuttoa vaan edistää eturauhasen ja kohtukarsinooma kasvua. Siksi rooli adiponectin karsinogeneesis- vaihtelee eri syöpäsolutyyppien.

Toistaiseksi kolme adiponectin reseptoreita on tunnistettu: kaksi tärkeintä reseptorit AdipoR1 ja AdipoR2 ja yksi samanlaista reseptoria kadheriinin perheen. AdipoR1 ja AdipoR2 ovat seitsemän transmembraaninen proteiineja, jotka voivat toimia välittäjinä rasvahapon hapettumisen ja glukoosin ottoa kautta adiponectin sitova. Toiminnalliset adiponectin reseptorit ilmentyvät tavallisesti keuhkojen epiteelisoluissa. Käyttäen immunohistokemiallista värjäystä, Jamshid et ai. osoittaneet, että ilmaus AdipoR1 ja AdipoR2 on pienempi NSCLC kudoksessa kuin normaalissa keuhkokudoksessa. Tässä osoitimme lisääntynyt AdipoR1 proteiinin ilmentymisen ja immunohistokemiallisella värjäyksellä NSCLC kudoksissa. Hiljentäminen AdipoR1 lauseke voi estää vaikutuksen adiponectin maahanmuutto- ja invasiivisuus ja A549-solut. Tukkiminen AdipoR2 ilmaisua ei vaikuttanut muuttavia kykyä A549-solut.

Curcumin on tullut tehokas adjuvantti aine syövän hoidossa, koska se voi moduloivat useiden transkriptiotekijöiden ja niiden signalointireiteissä [38]. Se voi aiheuttaa solujen apoptoosin aktivoitumisen kautta p38-reitin keuhkosyövän ja munasarjasyövän kasvaimen [39]. Kuitenkin sääntelyn rooli curcumin vuonna adiponectin ilme on epäselvä. Osoitimme, että curcumin estää adiponectin ilmaisun p38 ja ERK polkuja. Lisäksi adiponectin voi aktivoituvat AKT reitin, joka on mukana myös NF-KB: n väylän keuhkosyöpä.

Lopuksi adiponectin voi olla uusi potentiaali prognostinen merkkiaine NSCLC. Paitsi klassinen kemoterapiaa,

in vivo

ja

in vitro

tulokset samansuuntaiset curcumin voidaan käyttää adjuvanttina aineena keuhkosyövän hoidossa tulevaisuudessa. Kuitenkin huono imeytyminen, aineenvaihdunta, ja hyötyosuus curcumin saattaa rajoittaa sen kliinistä sovellusta. Useita On valmistettu, jotka sisältävät nanohiukkasia, liposomit, misellit, ja fosfolipidikomplekseina, mikä voi lisätä hyötyosuutta ja edistää enää liikkeeseen, parempi läpäisevyys ja kestävyys aineenvaihduntaa Kurkumiinin [40].

Materiaalit ja menetelmät

Kasvain näytekokoelmatodistuksen

NSCLC ja vastaavat normaaleissa kudoksissa kerättiin 77 potilasta, joille tehtiin kirurginen resektio vuosien 2004 ja 2011 Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, Kaohsiung Medical University Hospital. Kudosnäytteet pantiin välittömästi nestetyppeen kuljetusta laboratorioon ja sitten varastoidaan -80 ° C pakastin, kunnes RNA: n eristys ja proteiinin uuttamalla. Täydellinen lavastus menettelyjä, kuten Rintakehän röntgenkuvaus, bronkoskopia, tietokonetomografia aivojen ja rintaontelon, sonography, ja luun gammakuvaus, suoritettiin tarkasti määrittämään kasvaimen ominaisuuksista mukaan TNM kansainvälisen Välivarastointi System keuhkosyöpään [41]. Kaikki potilaat seurattiin vasta maaliskuussa 2012. Yksityiskohtaiset tiedot heidän demografiset ja Eloonjääntitulokset päivitettiin.

Ethics selvitys

koahsiung lääketieteellisen yliopiston sairaalan Institutional Review Board for Research hyväksyi tutkimussuunnitelman (KMUH -IRB-990357). Kaikki osallistujat edellyttäen kirjallinen lupa.

RNA ja reaaliaikaisen PCR

Yhteensä RNA eristettiin pakastetusta keuhkojen kasvain kudoksia NSCLC potilaiden ja vastaavassa normaalissa viereisen keuhkojen kudoksiin. RNA eristettiin normaalista keuhkokudoksesta, keuhkojen kasvain kudos, ja keuhkosyövän solut analysoitiin käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä, joka suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [42]. Seuraavat alukkeet reaaliaikainen PCR suunniteltiin käyttäen Primer Express -ohjelmiston (RealQuant, Roche, Mannheim, Saksa) julkaistujen sekvenssit: ihmisen adiponectin sensealuke: 5′-GGT GAT GGC AGA GAT GGC AC-3 ’ja adiponektiini antisensealuketta : 5’- GCC TTG TCC TTC TTG AAG AG-3 ’ja ihmisen GAPDH sensealuke: 5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′ ja GAPDH antisense-aluketta: 5’-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3 ’ .

Fluoresenssi tiedot hankittiin lopussa laajennuksen. Sulata analyysi tehtiin kaikkien tuotteiden määrittämiseksi spesifisyyden vahvistusta. Lisäksi, PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesissa 1% agaroosigeeleillä, jotka vahvistavat läsnäolo oikea juova kokoja. Suhteellinen ilmentyminen laskettiin suhde ilmaisua keuhkosyöpä kudosta verrattuna ilmentymisen normaalissa vieruskudos (kasvainleesion /normaali kudos 1, korkea ilmentyminen, ja 1, alhainen ilmaus) [42-44 ].

Immuno-histokemiallisella

Kasvaimen näytteet leikeltiin ihmisen keuhkokudoksesta, kiinnitettiin 4%: n puskuroituun formaliiniliuokseen yön yli, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 um paksuus osissa. Parafiini leikkeet de-paraffinized ksyleenillä ja värjättiin anti-ihmisen adiponectin (GeneTex, Irvine, CA, USA), adiponectin reseptori 1 (AdipoR1), ja adiponektiini reseptori 2 (AdipoR2) (Santa Cruz, CA, USA). Kun oli pesty fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), leikkeitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sillä värireaktiot, diaminobentsidiinillä (DAB) käytettiin ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiivisia kontrolleja varten, vasta-aine oli korvattu kontrolli-lgG.

Western blotting

Western blottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [42], jonka jälkeen kalvot käsiteltiin PBS: llä, joka sisälsi 0,05% Tween 20: tä ja 2% rasvatonta maitoa, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin erikseen hiiren anti-humaani adiponektiini (GeneTex, Irvine, CA, USA), AdipoR1, AdipoR2, p65, p50, MMP (2, 9, 1, 3, 13, 14) (Santa Cruz, CA, USA), histoni H1, AKT /Pakt, P38 /pP38 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), ja β-aktiini (Abcam, Cambridge, MA, USA) 1 h. Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua kaniinin anti-vuohi tai hiiri-IgG huoneenlämpötilassa. Immunodetektio suoritettiin käyttäen kemiluminesenssi reagenssia plus NEN ja altistuminen Biomax MR Film (Kodak, Rochester, NY, USA).

Culture NSCLC-solujen

Lung A549-soluja (ATCC CCL-185) viljeltiin pulloissa, jotka sisälsivät F12K kasvualustaan, jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2.

vaimentaminen ilmentymisen adiponektiini, adiponektiini reseptori 1, ja adiponektiini reseptori 2 A549-solut

siRNA, joka on kaksijuosteista 21-nukleotidin RNA-sekvenssi, joka on homologinen kohdegeenin oli käytetyt hiljentää ilmaus AdipoR1, ja AdipoR2. Ihmisen adiponectin siRNA sensealuke: 5′-GUG UGG GAU UGG AGA CUU ATT-3 ’ja antisense-aluketta: 5’UAA GUC UCC AAU CCC ACA CTT’-3 (Santa Cruz, CA); ihmisen AdipoR1 siRNA sense-aluke: 5′-GGA CAA CGA CUA UCU GCU ACA-3 ’ja antisense-aluke: 5′-UCU AGC AGA UAG UCG UUG UCC-3′; ja AdipoR2 siRNA sensealuke: 5’-GGA GUU UCG UUU CAU GAU CGG-3 ’ja antisense-aluketta: 5′-CCG AUC elokuu AAA CGA AAC UCC-3’ käytettiin (Sigma-Aldrich, Singapore).

äänenvaimennusvaikutus siRNA transfektion arvioitiin reaaliaikainen PCR ja immunoblottauksella. Lyhyesti, soluja kasvatettiin kuusi kuoppalevylle ja transfektoitiin väliaikaisesti 20 nM siRNA käyttäen 8μL SIPORT Amine (Ambion, Austin, TX, USA) yhteensä transfektion tilavuuteen 0,5 ml. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 5 h, 1,5 ml normaalin kasvun alustaa lisättiin ja soluja inkuboitiin 48 tuntia.

MTT-määritys solun elinkelpoisuuden

MTT määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [42].

in vitro

muuttoliike /invaasion analyysien

vaeltavia kyky solujen rittää yksikerroksista paljaaksitulo määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [42]. Konfluenttien Solut haavoittui raaputtamalla 100 ui pipetin kärki, joka denuded kaistale Yksikerrospaketin joka oli 300 um. Pesimme kulttuuri kahdesti PBS: llä ja lisättiin 5% FBS mediana. 24 tunnin kuluttua solut muuttivat hiertyneelle alueelle ja valokuvattiin. Alueet analysoitiin käyttämällä Wimasis WimScratch ohjelmisto, uuden sukupolven web-pohjainen kuva työkalu solujen vaeltamiseen analyysiä. Reunan tunnistus tekniikat voivat helposti tunnistaa etureunan ja aukon alueen. Käyttäjät voivat ladata kuvia ja analysointi alkaa automaattisesti.

Cellular hyökkäystä kvantitoitiin käyttäen modifioitua Matrigel Boyden kammion määrityksessä. BioCoat Matrigel hyökkäys kammion (BD Biosciences, Bedford, MA) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. -Soluja (4 x 10

4) seerumivapaassa media ympättiin Matrigel-päällystetty suodattimia. Alakammioissa, 5% FBS: ää lisättiin kemoattraktantti. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, membraani pestiin lyhyesti PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Yläpuoli kalvon pyyhittiin varovasti pumpulitupolla. Membraani värjättiin sitten käyttämällä hematoksyliinillä ja poistetaan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.