Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

etäpesäke paikallisiin imusolmukkeisiin kautta imusuonten avainasemassa syövän etenemiseen. Kasvaimen imusuonten tiedetään edistävän imusuonten etäpesäkkeitä, ja endoteelikasvutekijä C (VEGF-C) on kriittinen aktivaattori kasvaimen imusuonten prosessin aikana etäpesäkkeiden. Olemme aiemmin tunnistettu periostin kuin invasion- ja angiogeneesiä edistävää tekijä pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC). Tässä tutkimuksessa olemme löytäneet uuden roolin periostin kasvaimen imusuonten.

menetelmät ja havainnot

Periostin yli-ilmentymisen voimistunut VEGF-C mRNA ilmaisun HNSCC soluissa. Käyttämällä vakioitua elatusainetta periostin yli-ilmentäviä HNSCC soluissa, tutkimme putken muodostumiseen imusuonten endoteelisoluissa. Vakioitu väliaine periostin yli-ilmentäviä soluja edistänyt putken muodostumiseen. Jos haluat tietää korrelaatio periostin ja VEGF-C, vertasimme Periostin ilmaisutapoja VEGF-C ilmentymisen 54 HNSCC tapauksissa immunohistokemiallisesti. Periostin ilmentyminen korreloi hyvin VEGF-C ilmentymisen HNSCC tapauksissa. Lisäksi korrelaatio periostin ja VEGF-C: n eritystä havaittiin seerumin HNSCC potilaista. Mielenkiintoista on, periostin itse edistetään putken muodostumiseen imusuonten endoteelisoluissa riippumatta VEGF-C. Periostin-edistänyt lymfangiogeneesiä välitti Src ja Akt-aktiivisuutta. Itse mahdollinen korrelaatio periostin ja imusuonten tilaansa periostin-yliekspressoivassa ksenograftikasvaimissa ja HNSCC tapauksissa havaittiin.

Johtopäätökset

havainnot viittaavat siihen, että periostin sekä itse periostin aiheuttama säätelyä VEGF-C voi edistää imusuonten. Ehdotamme, että periostin voi olla markkeri ennuste pahanlaatuisia käyttäytymistä HNSCC ja potentiaalinen kohde tulevaisuudessa terapeuttisen intervention estää kasvainten lymfaattiseen hyökkäyksen ja imusuonten in HNSCC potilailla.

Citation: Kudo Y, Iizuka S, Yoshida M Nguyen PT, Siriwardena SBSM, Tsunematsu T, et ai. (2012) Periostin suoraan ja epäsuorasti Edistää Kasvain lymfangiogeneesiä pään ja kaulan syöpä. PLoS ONE 7 (8): e44488. doi: 10,1371 /journal.pone.0044488

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ”, Italia

vastaanotettu: 19 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 03 elokuu 2012; Julkaistu: 30 elokuu 2012

Copyright: © Kudo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-tukea opetus-, tiede- ja Japanin kulttuuri (Y. Kudo ja T. Takata), Research Fellowship nuorten tutkijoiden ja erinomainen nuorten tutkijoiden Overseas Käy Program Japan Society for Promotion of Science (S. Iizuka), ja Kurozumi Memorial Foundation avustus (Y. Kudo). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijä Masahiro Maeda työskentelee Immuno-Biological Laboratories, Co., Ltd. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

miljoonia ihmisiä kuolee vuosittain metastaattinen. Etäpesäke tapahtuu kautta veri- tai imusuonten tai suoraan kudoksiin ja kehon onteloita. Vaikka biokemialliset mekanismit etäpesäkkeiden ovat huonosti, prosessi ajatellaan olevan systemaattinen sijasta random [1]. Alueelliset imusolmukkeet ovat usein ensimmäinen sivustoja leviäminen, mikä johtuu oletettavasti kasvainsolujen salaojitus kautta ennestään tuovissa imusuonten ja /tai vasta muodostetun imukapillaareihin [2], [3]. Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on yksi yleisimpiä ihmisen syövän, joiden vuotuinen ilmaantuvuus yli 500000 tapauksissa maailmanlaajuisesti [4]. Kirjallisuudessa esitetään, että tärkein syy korkea kuolleisuus on, että tauti on usein ole diagnosoitu tai käsitelty ennen kuin se on edennyt pitkälle. Huolimatta aggressiivinen, monitieteinen hoitomuodot, kuten ennen leikkausta tai leikkauksen jälkeisiä kemoterapian ja /tai sädehoidon kanssa korjaavassa kirurgiassa, 5-vuoden pysyvyys HNSCC ei ole parantunut merkittävästi viimeisten 20 vuoden aikana [5]. Kuten useimmat muut epiteelin syövät, HNSCC kehittyy monivaiheinen prosessi kertyy useita geneettisiä ja epigeneettiset muutokset. Tärkein prognostinen indikaattori HNSCC potilaille on etäpesäke kohdunkaulan imusolmukkeisiin tai kaukaisiin elimiin [6]. Olemme aiemmin perustaneet HNSCC solulinjassa etäispesäkkeellisestä imusolmukkeesta [7] ja käytti

in vitro

invaasiomääritys eristää erittäin invasiivisia klooni tästä solulinjasta [8]. Sitten verrataan transkription profiileja vanhemman HNSCC solujen ja erittäin invasiivinen klooni microarray-analyysi ja tunnistaa periostin (osteoblastien-kerroin 2), kuten geenin kaikkein ekspressoituu differentiaalisesti invasiivisissa klooni [9]. Periostin on erittyvä proteiini, joka on ehdotettu toimimaan soluadheesiomolekyyli pre-osteoblastien ja osallistua osteoblastien rekrytointi, kiinnitys, ja levittää [10], [11]. Periostin yliekspressio tehostettu hyökkäys ja ankkurista riippumaton kasvu HNSCC soluissa [9]. Mielenkiintoista, periostin yli-ilmentäviä soluja aggressiivisesti invasiivisia ja spontaanisti etäpesäkkeitä kaulan imusolmukkeisiin ja keuhkoihin ortotrooppinen hiirimallissa HNSCC [9]. Bao et ai. osoitti myös, että koolonisyöpäsolulinja alhainen metastaattista potentiaalia näkyvät silmiinpistävän nopeutetussa kasvaimen metastaattista kasvua eläimen ksenograftimallia etäpesäkkeiden kun käsitelty yliekspressoimaan periostin [12]. Nämä havainnot osoittavat, että periostin yliekspressio voivat olla yhteisiä eri syöpätyyppejä, ja että periostin voivat olla tärkeitä tuumorin invaasio. Periostin on aikaisemmin osoitettu stimuloivan metastaattista kasvua angiogeneesin [12], [13] ja parantaa VEGF-reseptori Flk-1 /KDR ilmentymistä endoteelisoluissa kautta integriini a vp 3-FAK-välitteisen signalointireitin [13]; Lisäksi rekombinantti periostin hiussuonten muodostumista

in vitro

[14]. Tärkeää on, että kliinisissä tutkimuksissa periostin ekspression ihmisen syövissä ovat osoittaneet, että lisääntynyt ilmentyminen periostin korreloi määrän kasvaimen verisuonten ja etäpesäkkeitä [14]. Toisaalta, edellinen immunohistokemialliset tutkimukset osoittivat mahdollista korrelaatiota periostin ilmaisun ja imusolmuke etäpesäke syövän tapauksissa [15]. Ei ole kuitenkaan mitään tutkimusta roolista periostin kasvaimen imusuonten. Tässä tutkimuksessa osoitamme uusi toiminta periostin: suora ja epäsuora edistäminen kasvaimen imusuonten.

Tulokset

VEGF-C voimistuvan periostin yli-ilmentyminen edistää putken muodostumista imusuonten endoteelisolujen

aikaisemmin tunnistettu periostin kuin invaasio-edistäjänä vertaamalla geeniekspressioprofiilien vanhemman HNSCC solut (MSCC-1) ja erittäin invasiivinen klooni (MSCC-INV1) [9] (kuvio 1A). VEGF-C oli myös voimistussäädellään erittäin invasiivinen klooni microarray-analyysi (kuvio 1A). Lisääntynyt VEGF-C ilmentymisen MSCC-INV1 solujen suhteessa emosoluina havaittiin (kuvio 1 B). Lisäksi edellisessä mikrosiruanalyysi verrata geeniekspressioprofiili ja ohjaimen välillä periostin yli-ilmentäviä HNSCC solujen VEGF-C yläreguloituja periostin yli-ilmentäviä soluja [9]. Täällä vahvisti, että kohdunulkoinen yliekspressio periostin voimistunut VEGF-C ilmaisu (kuvio 1 B). Sekä periostin ja VEGF-C havaittiin vakioitua elatusainetta periostin yli-ilmentäviä soluja, mutta ei määräysvaltaa soluja (kuvio 1 B). VEGF-C: n tiedetään olevan kriittinen aktivaattori kasvaimen imusuonten prosessin aikana etäpesäkkeiden. Siksi tutkimme putken muodostumiseen imusuonten endoteelisolujen lisäämällä väliaine tyhjästä vektori-transfektoidut solut tai periostin yli-ilmentäviä soluja TR-LE soluissa. TR-LE-soluja aikaisemmin perustettiin kuolemattomaksi rotan imusuonten endoteelisolujen linjan [16]. Esikäsitelty väliaine periostin yli-ilmentäviä soluja merkittävästi edistää putken muodostumista TR-LE-soluja (kuvio 1C ja 1D).

(A) Schema esittää strategian tunnistaa Periostin ja VEGF-C vertaamalla geeniekspressioprofiili välillä emo (MSCC-1 solut) ja erittäin invasiivisia klooni (MSCC-INV1 solut). (B) suurempi ekspressio VEGF-C: solujen mRNA: n erittäin invasiivinen klooni MSCC-INV1 ja VEGF-C-ilmentymisen periostin yli-ilmentäviä soluja. HSC4 soluja ilman periostin ilmaisu transdusoitiin käyttäen retroviruksen koodaava plasmidi heksa-histidiini-merkitty periostin. Periostin ja VEGF-C-mRNA: n ekspressiotasot MSCC-1-soluissa, MSCC-INV1 soluja, tyhjällä vektorilla transfektoidut HSC4 soluja (tyhjä), ja periostin yli-ilmentäviä HSC4 soluja (His-periostin) tutkittiin RT-PCR: llä. GAPDH ilmentyminen käytettiin latauskontrollina. Esikäsitelty väliaine kerättiin tyhjä vektori transfektoitiin HSC4 soluja (tyhjä) ja periostin yli-ilmentäviä HSC4 soluja (His-periostin) sen jälkeen, kun oli inkuboitu 4 päivää. Elatusaine konsentroitiin ja analysoitiin western-blottauksella ekspressioon His-periostin ja VEGF-C: n elatusaineessa. (C) vakioitua elatusainetta periostin yli-ilmentäviä soluja edistää putken muodostumista imusuonten endoteelisolujen. Putken muodostumiseen TR-LE soluissa lisäämällä väliaine peräisin periostin yli-ilmentäviä soluja. TR-LE-solut ympättiin Matrigel-päällystettyihin kuoppiin läsnä vakioitua elatusainetta tyhjän vektorin-transfektoiduissa (kontrolli CM) tai periostin yliekspressoivia (periostin CM) HSC4 soluja. Kun oli inkuboitu 0-9 tunnin ajan, pituudet putken kaltaisia ​​rakenteita muodostuu arvioitiin. Kuvassa solujen inkuboinnin jälkeen 9 tuntia. (D) Kaavio esittää putken tulokset jälkeen 0-9 tunnin inkuboinnin valvonta- CM tai periostin CM. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS 3 erilliselle kokeelle.

vaikutuksen osoittamiseksi, että periostin aiheuttama VEGF-C ekspressiota putken muodostumiseen, käytimme VEGF-reseptori 3 (VEGFR-3) estäjä MAZ51, joka on raportoitu estävät sekä VEGF-C- ja VEGF-D-indusoitua fosforylaatiota VEGFR-3 PAE-solujen [17]. TR-LE solujen tiedetään ilmentävän VEGFR-3 [16]. Olemme vahvistaneet, että MAZ51 selvästi esti VEGF-C-aiheuttama putken muodostumiseen (kuvio S2A ja S2B). MAZ51 suuresti esti putken muodostumiseen aiheuttama kunnostetun alustan välillä periostin yli-ilmentäviä soluja (kuvio S2A ja S2B). Esto putken muodostumisen MAZ51 sisään väliaine tyhjän vektorin-transfektoiduissa soluissa havaittiin myös. Tämä inhibitio voi olla osuus VEGF-C: n eritys imusuonten endoteelisoluissa itse. Inhiboivaa vaikutusta MAZ51 oli alhainen käsitellyissä soluissa saadun sopeutetun elatusaineen tyhjän vektorin-transfektoiduissa soluissa (kuvio S2C). Nämä havainnot osoittavat, että periostin voivat edistää imusuonten kautta säätelyä VEGF-C.

korrelaatio periostin ilmentymisen VEGF-C ja imusuonten asema kliinisissä syövän tapauksissa

Voit selvittää korrelaatio periostin ja VEGF -C ekspressiotasot kliinisissä syöpätapausta, vertasimme periostin ilmaisutapoja VEGF-C ilmentymisen 54 HNSCC tapauksissa immunohistokemiallisella analyysillä. Olemme määritelleet luokittelu periostin ja VEGF-C värjäys niinkin korkea (yli 10% syöpäsolujen osoittaa ++ tai +++ intensiteetti) tai matala (ei värjäystä tai alle 10% syöpäsoluja osoittaa + intensiteetti). Sillä kriteeri 10% positiivisia soluja, pidimme HNSCC tapauksia, joissa on alle 10% syöpäsoluja osoittaa heikko /polttoväli immunopositivity oli sama kuin HNSCC tapauksessa ilman positiivista värjäytymistä. Kuviossa 2A esitetään edustava kyseessä on korkean ilmentymisen sekä periostin ja VEGF-C. Sekä Periostin ja VEGF-C-ilmentymistä havaittiin solulimassa HNSCC soluja (kuvio 2A). Itse asiassa useimmissa tapauksissa korkea ilmentymisen periostin tai VEGF-C näkyi voimakas ja diffuusi immunopositivity, kuten on esitetty kuviossa 2A ja useimmissa tapauksissa on alhainen ekspressio periostin tai VEGF-C ei osoittanut immunopositivity kuten kuviossa S3A. Vain muutama tapaus osoitti heterogeenisen värjäytymistä (kuvio S3B). Sillä heterogeeninen värjäys, olemme täysin arvioitu määrä värjäytyneiden solujen ja niiden värjäytymisen intensiteetti tarkastamalla vähintään kymmenen aloilla, kuten pinnallinen, Keski- ja syvä invasiivisia alueilla kasvain. Niistä 54 HNSCC tapauksissa korkea ilmentyminen periostin havaittiin 39 (72,2%) tapauksessa ja korkea ekspressio VEGF-C 37 (68,5%) tapauksessa (kuvio 2B). Kolmekymmentä kolme 39 (84,6%) HNSCC tapauksissa periostin ilme ilmaistu VEGF-C; tämä korrelaatio oli tilastollisesti merkitsevä (P 0,001).

(A) immunohistokemiallinen värjäys periostin ja VEGF-C: HNSCC tapauksissa. Edustavia HNSCC tapaukset (korkea ja matala suurennus), jossa periostin ja VEGF-C-ilme on esitetty. Mittakaava pylväs näkyy kunkin kuvan. (B) Kaavio esittää VEGF-C ilmentymisen asemaa HNSCC tapauksissa korkea tai matala ilmentymisen periostin. (C) seerumi taso periostin ja VEGF-C 81 HNSCC potilailla tutkittiin ELISA: lla. Seerumin periostin ja VEGF-C verrattiin kasvaimen vaiheessa. Kaavio näyttää prosentteina periostin tai VEGF-C positiivisia tapauksia eri kasvain vaiheessa (vaiheesta 1-4). (D) seerumi taso periostin ja VEGF-C verrattiin imusolmuke etäpesäke. Kaavio näyttää prosentteina periostin tai VEGF-C positiivisia tapauksia tapauksissa tai ilman imusolmuke etäpesäke (E) seerumi taso periostin verrattiin seerumin VEGF-C. Kaavio näyttää prosentteina VEGF-C positiivisia tapauksia tapauksissa periostin positiivinen tai negatiivinen.

Koska sekä periostin ja VEGF-C erittyy proteiineja, tutkimme seerumin periostin ja VEGF-C HNSCC potilaita ELISA. Tässä tutkimuksessa käytettiin perifeerisen veren kerättiin 81 HNSCC syöpäpotilailla. Nämä tapaukset olivat erilaisia ​​tapauksia käytetään immunohistokemiallisessa tutkimuksessa. Kliiniset tiedot kuten imusolmuke etäpesäke, kasvain vaiheessa ja TNM luokittelu kerättiin kirurgisen kirjaa potilaista (taulukko S2). Näytteissä 5 terveiden valvonta, periostin seerumin taso oli 0 ng /ml ja VEGF-C-seerumin tason alle 11,0 ng /ml (tuloksia ei ole esitetty). Periostin havaittiin 11,4 ng /ml Esikäsitelty väliaine MSCC-INV1 soluja. Näiden tulosten perusteella, joka on periostin-positiivinen tapaus määriteltiin joiden seerumin periostin tasolla 0 ng /ml ja VEGF-C-positiivinen tapaus olevan seerumin VEGF-C-tason ≥12.0 ng /ml. Prosenttiosuus periostin-positiivisia tapauksia kasvoi vaiheessa etenemistä ja imusolmuke etäpesäke (kuvio 2C ja 2D). Tiedot seerumin periostin ja VEGF-C: n ja kliiniset tiedot HNSCC potilaista on lueteltu taulukossa S2. Prosenttiosuus VEGF-C-positiivisia tapauksia myös lisääntynyt kanssa vaiheessa etenemistä ja imusolmuke etäpesäke (kuvio 2C ja 2D). Mielenkiintoista, 32,4% ja periostin-positiivisia tapauksia vaan ainoastaan ​​18,2% of periostin-negatiivisten tapaukset olivat VEGF-C-positiivisia (kuvio 2E).

Periostin suoraan edistää putken muodostumista lymfaattisilla endoteelisolujen

kuten edellä on esitetty, olemme huomanneet, että periostin ilmentyminen korreloi hyvin VEGF-C-ilmentymisen. Periostin on aiemmin osoitettu edistävän angiogeneesiä, kuten on osoitettu useita havaintoja: (i) periostin parantaa VEGF-reseptori Flk-1 /KDR ilmentymistä endoteelisoluissa kautta integriini a vp 3-FAK-välitteisen signalointireitin [13], (ii) yhdistelmä-DNA-periostin hiussuonten muodostumista [12], ja (iii) lisääntyneen ekspression periostin korreloi verisuonten lukumäärä ja etäpesäkkeiden HNSCC [14]. Toisaalta, kliinis-patologinen tutkimukset osoittivat, että periostin oli hyvin korreloi imusolmuke etäpesäke erilaisissa syövissä [15]. Nämä havainnot saivat meidät oletuksen, että periostin saattavat vaikuttaa suoraan ja imusuonten endoteelisolujen samanlaisissa verisuonten endoteelisoluihin. Siksi me tutkimme, periostin voisi suoraan edistää imusuonten. Olemme tutkineet vaikutus periostin on putken muodostumisen TR-LE soluissa. Aiemmissa raporteissa 100 ng /ml rekombinanttia periostin proteiinia käytettiin

in vitro

kokeiluja [12], [13]. Shao et ai. tutkitaan Flk1 ilmaisu käsittelyn jälkeen rekombinantti periostin (0, 50, 100 ja 250 ng /ml). 100 ng /ml periostin huomattavan ilmen- tymisen lisääntymisen Flk1 ilmaisua, he käyttivät 100 ng /ml periostin opinnoissaan. Meidän ELISA-analyysi, olemme havainneet 11,4 ng /ml periostin in vakioitua elatusainetta MSCC-INV1 soluja. Lisäksi olemme havainneet 0-15,1 ng /ml periostin seerumissa HNSCC potilaan (taulukko S2). Vaikka 100 ng /ml periostin näyttää olevan korkea pitoisuus, ajattelimme, että pitoisuus periostin saattaa olla suurempi paikallinen kasvaimen alueella kuin seerumissa. Lisäksi olemme havainneet, että periostin edistetään putken muodostumiseen pitoisuutena riippuvaisella tavalla (0, 50, 100 ja 200 ng /ml) (kuvio S4), ja vaikutus on 100 ng /ml periostin on putken muodostumiseen on huomattava (kuvio 3A -C ja kuvio S4). Vaikka 100 ng /ml periostin näyttää olevan korkeampi verrattuna fysiologisen tason, käytimme 100 ng /ml periostin seuraavissa tutkimuksissa. 100 ng /ml VEGF-C käytettiin positiivisena kontrollina imusuonten. Useissa eri tutkimuksissa, 100 ng /ml VEGF-C käytettiin

in vitro

kokeissa [18] – [20]. Mielenkiintoista on, että hoito rekombinantilla periostin edistetään putken muodostumiseen suhteessa mitään hoitoa (kuvio 3A ja 3B). Yllättäen vaikutus periostin on putken muodostumiseen oli samanlainen kuin VEGF-C (kuvio 3C). Lisäksi, co-hoito periostin ja VEGF-C merkittävästi edistää putken muodostumiseen (kuvio 3D ja 3E).

(A) TR-LE-solut ympättiin matrigeeliä-päällystettyihin kuoppiin, kun läsnä oli periostin (100 tai 200 ng /ml) tai VEGF-C (100 ng /ml). Kun oli inkuboitu 1-9 tunnin ajan, pituudet putken kaltaisia ​​rakenteita muodostuu arvioitiin. Kuviossa on esitetty solut inkuboinnin jälkeen 9 tuntia. (B) Kaavio esittää putken tulokset inkuboinnin jälkeen 1-9 tuntia. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS 3 erilliselle kokeelle. (C) Kaavio esittää putken pisteet suhdeluvut hoidon jälkeen VEGF-C tai periostin 9 tuntia. Putki pistemäärä ohjaus määriteltiin 1,0. (D) TR-LE-solut ympättiin matrigeeliä-päällystettyihin kuoppiin, kun läsnä oli periostin (100 ng /ml), ja VEGF-C: ssa (100 ng /ml). Kun oli inkuboitu 1-9 tunnin ajan, pituudet putken kaltaisia ​​rakenteita muodostuu arvioitiin. Kaavio esittää putken pisteet inkuboinnin jälkeen 1-9 tuntia. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS 3 erilliselle kokeelle. (E) Kaavio esittää putken pisteet suhdeluvut hoidon jälkeen VEGF-C ja periostin 9 tuntia. Putki pistemäärä ohjaus määriteltiin 1,0. (F) Periostin edistää Src ja Akt fosforylaation. Veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun muodot Src, Akt, ERK, ja FAK käsittelyn jälkeen TR-LE-solujen periostin (100 ng /ml) on esitetty Western-blottauksella. p-aktiinin ilmentymistä käytettiin latauskontrollina. (G) pituudet putken kaltaisia ​​rakenteita muodostuu TR-LE-soluja inkuboitiin 1-9 tunnin ajan rekombinantilla periostin (100 ng /ml) kanssa tai ilman SU6656 (400 nM) arvioitiin. Ylempi kuvaaja esittää putken tulokset inkuboinnin jälkeen 1-9 tuntia. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS 3 erilliselle kokeelle. Alempi kaavio osoittaa putken pisteet suhde. Putki pistemäärä ohjaus määriteltiin 1,0. (H) pituudet putken kaltaisia ​​rakenteita muodostuu TR-LE-soluja inkuboitiin 1-9 tunnin ajan rekombinantilla periostin (100 ng /ml) kanssa tai ilman LY294002 (10 uM) arvioitiin. Ylempi kuvaaja esittää putken tulokset inkuboinnin jälkeen 1-9 tuntia. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS 3 erilliselle kokeelle. Alempi kaavio osoittaa putken pisteet suhde. Putki pistemäärä ohjaus määriteltiin 1,0.

Tutkimme miten periostin edistää imusuonten käyttämällä western blottauksella fosforylaation-spesifisten vasta-aineiden aktiivisuuden määrittämiseksi tasot solusignalointimolekyylien, kuten Src, Akt, ERK ja FAK, in periostin saaneilla TR-LE soluissa. Src ja Akt muttei ERK ja FAK aktivoitiin yhdistelmä-periostin käsittely (kuvio 3F). Vahvista roolin Src ja Akt in periostin edistänyt imusuonten, käytimme SU6656 estämään Src-vaikutuksen ja LY294002 estävän Akt-aktiivisuutta. Nämä estäjät inhiboivat periostin aiheuttama putken muodostumisen TR-LE-soluja (kuvio 3G ja 3H), viittaa siihen, että periostin aiheuttama imusuonten saattaa välittää Src ja Akt-aktiivisuutta.

Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus periostin proliferaatioon ja migraatio TR-LE soluissa. Rekombinantti periostin vain hieman edistää solujen kasvua (kuvio 4A), mutta huomattavasti edistänyt muuttoliike (kuvio 4B). Focal adherens, jotka ovat klustereita integriinien kertymistä useiden solun tukirangan ja viestintäproteiinit ympäri integriini sytoplasmadomeeneja, on merkittäviä vaikutuksia solujen vaeltamiseen ja signalointi. Siksi tutkimme vaikutus periostin muodostumista keskipiste kiinnikkeistä. Jaoimme trypsinoitiin TR-LE solujen peitinlaseja päällystetty PBS tai rekombinantin periostin ja värjätä paikallisia tarttumista anti-vinkuliini ainetta ja F-aktiini kanssa phalloidin. TR-LE solujen tehokkaasti kiinnitetty ja nopeasti takaisin niiden morfologia on periostin kuorrutettu peitinlaseja verrattuna PBS-pinnoitettu peitinlaseja (kuvio 4C). Varsinkin TR-LE solut muodostivat lukuisia vinkuliini sisältäviä paikallisia tarttumista on periostin kuorrutettu muttei PBS kuorrutettu peitinlaseja (kuvio 4C). Enhancement putken muodostumisen periostin voi vaikuttaa edistämällä muuttoliike ja lisääntyvä paikallisia tarttumista.

(A) Leviämisen TR-LE solujen jälkeen yhdistelmä-periostin hoidon. -Solut ympättiin fibronektiiniä päällystetty 24-kuoppalevyille 1,5 x 10

4 /kuoppa. Sen jälkeen kun esi-inkuboitu 33 ° C: ssa 24 h, lämpötila muutettiin ja yhdistelmä periostin (100 ng /ml) lisättiin alustaan. Solut trypsinoitiin ja laskettiin 0, 2, 4 tai 6 päivää sen jälkeen, kun on lisätty yhdistelmä-DNA-periostin. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS 3 erilliselle kokeelle. (B) vaikutus periostin solujen migraatio TR-LE soluissa. -Solut ympättiin suodattimet etukäteen päällystetty 10 ug: fibronektiinin. Alempi osastossa oli 0,5 ml: ssa seerumia tai ilman 100 ng /ml yhdistelmä-DNA-periostin. Kun oli inkuboitu 4 tuntia, solut, jotka olivat vaeltaneet alapintaa suodattimien visualisoitiin hematoksyliinillä värjäys ja laskettiin. Määritys toistettiin 3 kertaa. Kuvio esittää soluja, jotka olivat vaeltaneet alapintaan suodattimen (ylempi paneeli). Kaavio osoittaa solujen määrä alemman pinnoille suodattimien kanssa tai ilman periostin (100 ng /ml) (alempi paneeli). (C) TR-LE-solut ympättiin peitinlaseja päällystetty PBS: llä tai yhdistelmä periostin (200 ng /ml) ja annettiin kiinnittyä 60, 120, 180 tai 240 min. Solut värjättiin Alexa Fluor 488-phalloidin vasta-aine ja anti-vinkuliinin-FITC-vasta-ainetta. DNA visualisoitiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) värjäys.

Periostin ilmentyminen korreloi hyvin useissa imusuonten endoteelisoluissa kliinisissä syövän yksilöiden

tietävät roolia periostin kasvaimen lymfangiogeneesiä

in vivo

, varmistimme korrelaatio periostin ilmaisun ja lukumäärän imusuonten on -tuumoriksenografti malli nude-hiirissä. Olemme aiemmin ruiskutetaan ohjaus tai periostin-yliekspressoivassa HNSCC soluja ihon alle nude-hiiriin ja totesi, että istutetut periostin yli-ilmentäviä soluja tuotetaan suhteellisesti suurempi kasvaimen tilavuuden 28 päivän jälkeen kuin teki tyhjän vektorin-transfektoiduissa soluissa [9] (kuva S5). Käytimme nämä tuumorikudoksista (10 ohjaus ja 10 periostin yliekspressoivia kasvaimet) laskea numerot imusuonten ilmentävien Lyve-1, joka nimenomaan havaittu imusuonten sekä ohjaus ja periostin yliekspressoivia kasvaimet (kuvio 5A ja kuvio S4). Mielenkiintoista on, että määrä imusuonten oli merkitsevästi korkeampi periostin yli-ilmentäviä kasvaimia (36,3 ± 11,1) kuin kontrolli kasvaimet (14,95 ± 2,0) (kuvio 5B).

(A) Periostin yli-ilmentäviä (periostin) ja tyhjä vektori transfektoitiin (kontrolli) HSC2 soluja (1 x 10

7 solua) erikseen ruiskutetaan ihon alle 2 sivustoja kussakin 5 nude-hiirten. Sen jälkeen 1 kuukausi, kasvaimet resekoitiin ja värjättiin anti-hiiri-Lyve-1 tunnistavaa vasta-ainetta imusuonia. Edustavia tapauksia immunohistokemiallisella värjäyksellä Lyve-1 hallinnassa ja periostin yliekspressoivia kasvaimet näkyvät. Nuoli osoittaa Lyve-1 positiivisia imusuonten. (B) toinen Lyve-1-positiivisten imusuonten valvonta- ja periostin yli-ilmentäviä kasvaimia laskettiin. Kaavio osoittaa keskimääräinen lukumäärä imusuonten valvonta- ja periostin yliekspressoivia kasvaimia. Palkit esittävät keskiarvoja ja SDS.

Lopuksi tutkimme korrelaatio periostin ilmaisun ja imusuonten asemaa HNSCC tapauksissa immunohistokemiallisesti käyttämällä D2-40 vasta-ainetta. D2-40-vasta-aine tunnistaa spesifisesti imusuonten endoteelisoluissa, mutta ei verisuonia (tuloksia ei ole esitetty). Imusuonten oli jakautunut epätasaisesti koko kasvaimia. Laskimme määrä imusuonten että kasvaimensisäisenä (sisällä kasvain) ja peritumoraalista (1 mm leviämisrintamassa) alueilla. HNSCC tapauksissa periostin ilme yleensä on tavallista enemmän imusuonten sekä kasvaimensisäisenä ja peritumoraalista alueilla (kuvio 6A ja 6B), mutta tämä korrelaatio ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Kuten odotettua, D2-40 immunovärjäykseen korosti läsnäollessa imusuonten hyökkäystä. 54 HNSCC tapauksissa, 27 (50%) oli imusuonien hyökkäyksen kasvainsoluja. Silmiinpistävän, periostin ilmentymistä havaittiin 25 27 HNSCC tapauksissa imusuonten invaasiota (kuvio 6C). Periostin ekspressio korreloi merkitsevästi lymfaattinen invaasio (

P

0,001).

(A) Periostin ja D2-40 ilmentymistasot tutkittiin immunohistokemiallisella värjäyksellä HNSCC tapauksessa näytteitä. Edustava tapauksessa periostin ja D2-40 ilmaisun HNSCC näkyy. Nuoli osoittaa D2-40 positiivinen imusuonten. (B) Kaavio kuvaa vertailu keskimääräinen lukumäärä imusuonten kasvaimensisäisiä, peritumoraalista, ja koko alueita HNSCC tapauksissa korkea tai matala ilmentymisen periostin. (C) Kaavio näyttää tilan imusuonten hyökkäyksen HNSCC tapauksissa korkea tai matala ilmentymisen periostin.

Keskustelu

Yleinen 5 vuoden eloonjäämistodennäköisyys HNSCC, yksi yleisimmistä syövistä, on alhainen, mikä johtuu pääasiassa taipumusta joidenkin kasvainten levittää kautta lymphatics. Todellakin, imusolmuke osallistuminen on yksi vahvimmista köyhien ennustetekijöiden indikaattoreita. Uusimmat tutkimukset, eläinmalleissa osoittavat, että kiinteiden kasvainten voivat stimuloida imusuonten jotka voivat puolestaan ​​edistää kasvaimen leviämistä [21]. Lisäksi imusuonten voi tapahtua vieressä tai sisällä syövät ja korreloi imusolmuke etäpesäke [22], [23]. Olemme aiemmin osoittaneet, että määrä imusuonten sekä kasvaimensisäisenä ja peritumoraalista alueilla oli hyvin liittyy lisääntynyt taipumus solmukohtien etäpesäke HNSCC [24]. Vaikka lymfangiogeneesiä in primaarikasvainten tiedetään ennustaa solmukohtien etäpesäkkeitä, sen mekanismi jää epäselväksi.

aiemmin tunnistettu periostin kuin hyökkäys edistävää tekijää vertaamalla geeniekspressioprofiilien emo- ja erittäin invasiivisia klooni HNSCC soluissa [9] . Periostin, alkuperäiseltä nimeltään osteoblastien kerroin-2 (Osf2), tunnistettiin ensimmäistä kertaa luun, jossa se oli osallisena säätelyssä osteoblastien tarttuvuus ja erilaistumista [10], [25]. Kumulatiivinen näyttöä siitä, että korkea ilmentyminen periostin havaitaan usein erilaisissa syövissä ja korreloi hyvin pahanlaatuinen käytös [15]. Äskettäin periostin on ilmoitettu stimuloida metastaattista kasvua aiheuttamalla angiogeneesin [13], [14]. Periostin kasvainsolujen erittämiä säädöksillä parakriinisesti laajentaa selviytymisen endoteelisolujen ja aiheuttaa uudissuonittumisen, johdonmukaista sen havainnon kanssa, että tehostettu selviytyminen kasvaimensisäisenä endoteelisolujen on kriittinen onnistuneen tuumoriangiogeneesissa [26] – [28]. Edellisessä mikrosiruanalyysi emo- ja erittäin invasiivinen kloonin HNSCC soluja havaittiin, että VEGF-C on voimistunut on erittäin invasiivinen solut [9] (kuvio 1A ja 1 B). Todellakin, periostin yli-ilmentyminen indusoi säätelyä VEGF-C-ilmentymisen HNSCC soluissa ja VEGF-C-proteiini erittyi periostin yli-ilmentäviä HNSCC soluissa (kuvio 1 B). VEGF-C, alkuperäinen Flt-4 /VEGFR-3-ligandin [29], [30], on jäsen VEGF-perheen polypeptidin kasvutekijät, joka käsittää VEGF-A, -B, -C, -D ja parapoxvirus Orf-virus VEGFs [31], [32]. Perustuen sen ilmentyminen profiilin ja sen sitoutumista Flt-4, VEGF-C on liitetty kehittämiseen imunestejärjestelmän [33], [34]. Lisäksi siirtogeenisiä yliekspressio VEGF-C keratiini 14 promoottori indusoi imusuonien laajentuminen ihon [35], ja yhdistelmä-VEGF-C indusoi imusuonten kanan rakkokalvon [36]. Aktivointi VEGF-C /Flt-4-akselin imusuonten endoteelisoluissa voivat helpottaa etäpesäke lisäämällä muodostumista imusuonten sisällä ja ympärillä kasvaimia [37]. VEGF-C /Flt-4 akselin siis ilmaistaan ​​paitsi imusuonten endoteelisoluissa mutta myös erilaisia ​​ihmisen kasvainsoluissa. Kuten odotimme, väliaine mistä periostin-yliekspressoivassa HNSCC solujen edistää putken muodostumiseen imusuonten endoteelisolujen. Lisäksi, VEGFR-3-kinaasi-inhibiittori estivät putken muodostumiseen indusoima kunnostetun alustan välille periostin yli-ilmentäviä soluja, mikä viittaa siihen, että periostin-edistää imusuonten voi johtua osittain lisääntyneestä erityksestä VEGF-C syöpäsolujen (kuvio S2B). Käyttämällä kliinistä näytettä, osoitimme, että periostin ilmentyminen korreloi hyvin VEGF-C-ekspression HNSCC tapauksissa immunohistokemiallisesti ja että seerumin periostin taso korreloi hyvin, että VEGF-C: HNSCC potilailla (kuvio 2E). Tässä tutkimuksessa emme voineet havaita periostin seerumissa 5 normaaleilla terveillä vapaaehtoisilla koehenkilöillä. Aiemmat raportit osoittivat, että villi valikoima seerumin periostin (0,2-194 ng /ml) havaittiin terveillä vapaaehtoisilla [35] – [38]. Siten seerumin periostin normaaleilla terveillä vapaaehtoisilla koehenkilöillä näyttää olevan kiistanalainen, ja se on vielä epäselvää, onko periostin tuotetaan normaalit solut tai ei. Tulevaisuudessa me tutkimme seerumin taso periostin suuri määrä normaalien terveiden vapaaehtoisten. Kuitenkin kaikki raportit, joissa on esillä tutkimus osoitti, että lisääntynyt taso periostin havaittiin syöpäpotilailla [38] – [41]. Tärkeää on, seerumin periostin ja VEGF-C oli hyvin korreloi kasvaimen etenemistä lukien imusolmuke etäpesäke.