Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer etäpesäke aiheuttaa suurimman syöpään liittyvien kuolemien takia huono vaste syöpähoitoihin. Molecular ymmärtäminen etäpesäkkeiden liittyvän lääkeresistensseihin edelleen heikko niukkuuden vuoksi käytettävissä olevien kasvainkudoksen. Eristäminen verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) perifeerisestä verestä potilaiden on tullut varteenotettava vaihtoehto lähde kasvain kudos, joka voidaan altistaa molekulaarinen. Kuitenkin ongelmia matalan puhtauden ja herkkyys on haitannut hyväksyminen kliiniseen käytäntöön. Kirjoittajat raportoivat uutta menetelmää kaapata ja molekyylibiologian menetelmiä CTC eristettiin kastraatiotason kestävästä eturauhassyöpäpotilaalla (CRPC) vastaanottava taksaania kemoterapiaa. Olemme kehittäneet geometrisesti parannettu ero immunosieppaus (GEDI) mikrofluidilaitetta, joka yhdistää anti-eturauhasen kalvon (PSMA), vasta-aine, jossa on 3D-geometrian, joka kaappaa CTC samalla minimoiden ei-spesifinen leukosyyttien adheesion. Leimaus GEDI-kaapattu CTC (määritelty ehjä, nukleoiduissa PSMA + /CD45- solut) paljasti mediaani 54 solua millilitraa tunnistettu CRPC potilaista ja 3 Terveillä luovuttajilla. Suora vertailu kaupallisesti saatavilla CellSearch® paljasti 2-400 kertaa suurempi herkkyys saavutetaan GEDI laitteen. Konfokaalimikroskopia potilaan johdettujen GEDI-kiinni CTC tunnistanut TMPRSS2: ERG fuusioproteiini, kun taas sekvensointi tunnistaa tietyn androgeenireseptorin pistemutaatio (T868A) verinäytteistä piikkeinä vain 50 PC C4-2 soluja. On-chip hoitoon potilaasta johdettujen CTC dosetakseliannoksella ja paklitakselin sallitaan seurata lääkkeen kohde-sitoutumisen avulla mikrotubulusten niputtamista. CTC eristetty dosetakseli-resistenttien CRPC potilaista ei osoittanut mitään todisteita lääkeaineen. Nämä mittaukset ovat ensimmäinen funktionaalisia määrityksiä huumeisiin tavoite sitoutuminen elävä verenkierrossa olevia kasvainsoluja ja siksi on mahdollista, jotta pituus- seurannan tavoitevaste ja ilmoittaa uusien syöpälääkkeiden.

Citation: Kirby BJ, Jodari M, Loftus MS, Gakhar G, Pratt ED, Chanel-Vos C, et al. (2012) Functional karakterisointi verenkierrossa olevia kasvainsoluja, joilla on eturauhasen-Cancer-Specific mikrofluidilaite. PLoS ONE 7 (4): e35976. doi: 10,1371 /journal.pone.0035976

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 joulukuu 2011; Hyväksytty: 23 maaliskuu 2012; Julkaistu: 27 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Kirby et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Yhdysvaltain National Institutes of Health (R01 CA137020-01 ja U54 CA143876) (PG), NIH Physical Sciences Oncology Center at Cornell (BK, PG DN), New York Office of Science, Technology and Research ( BK), Weill Cornell Clinical and Translational Science Center (DN, PG BK) luovuutta palkinnon Eturauhassyöpä Foundation (PG ja DN) ja tuki Urogenitaalinen Oncology Research Fund (DN). CCV on saaja NRSA tutkijatohtorin. EP ja SS tukivat National Science Foundation Graduate Research Yhteisöt. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: BK, PG, ST ja DN paljastaa konsultointi tuloja Sanofi USA. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki Plos One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

kehitys etäpesäkkeitä potilailla, joilla on kiinteä kasvain pahanlaatuinen kasvain uskotaan johtuvan kasvainsolujen pääsyn verenkiertoelimistön ja vaeltavat kaukaisiin elimiin, jossa he ekstravasoitumaan ja lisääntyvät [1] – [3]. Vaikka verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) ovat harvinaisia-niin vähän kuin yksi solu per 100 miljoonaa verisolujen [3], [4], molekyyli- ja toiminnalliset analyysit CTC voivat tuottaa suurempaa ymmärrystä biologian syövän etäpesäkkeiden, auttaa tunnistamaan uusia terapeuttisia tavoitteet, ja mahdollistaa kliininen korrelaatiot seurata potilailla, jotka saavat hoitoa [5]. Erilaisia ​​tekniikoita on kehitetty parantamaan havaitsemista ja pyydystäminen CTC perifeerisestä verestä. Näitä ovat heysgradienttisentrifugoinnilla immu- helmi erottaminen käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita, kohdistaminen epiteelisolujen-pinta-antigeeneja, solujen lajittelu käyttämällä virtaussytometriaa, suodatus perustuu koko erottaminen [6] ja mikrofluidilaitteissa. Vaikka edistysaskeleet CTC talteenotto on tehty, alhainen taajuus CTC syöpäpotilailla, heterogeenisuudestaan ​​puute elinspesifiseen kaapata lähestymistapoja, ja plastisuus CTC väestöstä on rajallinen kyky vangita ja seurata kaikkia CTC [2] , [6]. Tällä hetkellä, epiteelisolujen-adheesiomolekyyli (EpCAM), edustaa antigeenin valinta useimpien mikrofluidilaitteiden, jotka on kehitetty kuvaamaan verenkierrossa olevia kasvainsoluja [7] – [10].

kuitenkin saatu todisteita ehdottaa, että ilmaus EpCAM aikana syövän etenemisen ja erityisesti vuonna epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon ole hyvin tunnettu, herättää huolta siitä universaalisuus tämän antigeenin Immunocapture järjestelmiin [11], [12]. EpCAM on raportoitu olevan onkogeeninen [13] ja korreloi proliferaation solulinjoissa [14]; se kuitenkin vaimentua aikana EMT [1], ja EMT markkereita on osoitettu olevan tärkeämpiä kuin epiteelin markkereita esim sytokeratiinista ennustettaessa syövän etenemisessä [15]. Näin ollen, vaikka EpCAM on selvästi hyödyllinen tunnistamisessa CTC väestö monissa syövissä, harhat liittyvät EpCAM rikastamiseen ei toistaiseksi tunneta.

Lisäksi epävarmuutta pinta-antigeenejä, spesifisyys Immunocapture verestä sekoitti ei-spesifinen adheesio-ominaisuudet leukosyyttien useimmilla vasta-aineen pinnoille. Koska läsnäolo lukuisia valkosolujen veressä noin 10

4-10

5:01 suhde nähden CTC, immunospesifisellä pinnat rikastuttaa CTC mutta voi eristää niitä saastuttamaan leukosyyteistä kokonaan. Tunnistaminen CTC edellyttää lisävaiheita ja usein värjäys DAPI läsnäolon varmistamiseksi ehjä tumassa ja immunovärjäämällä läsnäolon tunnistamiseksi epiteelin markkereita (eli sytokeratiini) ja puute leukocytic markkerin CD45. Tällaiset Immunovärjäyksen on tunnistanut perheen kriteerit, jotka korreloivat CTC määrä potilaan ennusteeseen [16], mutta se edellyttää, että kiinnitys ja värjäys olla keskeinen CTC tunnistamista, kuten kaupallisessa CellSearch® järjestelmä [17], [18]. Vaikka luettelointi CTC potilailta, joilla on edennyt eturauhassyöpä saavat kemoterapiaa käyttäen kaupallisesti saatavilla CTC talteenottojärjestelmä jonka CellSearch® osoitti hyödylliseksi prognostinen indikaattori elossaololuku [17], [18] ja luettelointi parhaillaan tutkitaan useissa kliinisissä tutkimuksissa läsnäolo kontaminoivien valkosoluja estää loppupään hyödyllisyyttä CTC siirtolaitteiden, että määritykset, jotka perustuvat RNA tai proteiini kvantifiointiin on sotkettu tarve kiinnitykseen ja materiaalin leukocytic alkuperää.

helpottamiseksi korkean hyötysuhteen kaapata eturauhasen CTC, olemme kehittäneet prototyypin mikrofluidilaitetta joka käyttää lähestymistapaa, joka kutsumme geometrisesti parannettu ero Immunocapture (GEDI). Tämä laite yhdistää geometria, joka vähentää pyydystäminen kontaminoivien leukosyyttien tuottamalla koko riippuvaisen solu- seinän törmäyksiä. Yhdistämme geometrisen lähestymistavan eturauhasspesifinen Immunocapture pinnalle käyttämällä J591 monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa solunulkoinen domeeni prostataspesifisen kalvo (PSMA) [10]. PSMA on solun pinnan peptidaasi erittäin ilmaiseman pahanlaatuiset eturauhasen epiteelisolujen. PSMA on houkutteleva kohde eturauhassyövän CTC talteenotto, koska se ilmentyy lähes kaikissa eturauhassyövän solut ja ilmaisun kasvaa kastraation jälkeen. Raportoimme tässä yksityiskohtaisesti osoitus useiden käyttöjen GEDI väline, mukaan luettuna vertailu CTC luettelointi kanssa CellSearch®, havaitsemiseen tietyn AR mutaation verinäytteistä piikkeinä vain 50 solua; tunnistamista TMPRSS2-ERG fuusio immunovärjäyksellä, ja

ex-vivo

arviointi CTC herkkyys taksaanin hoitoon käytetään mikrotubulusten niputtamista markkerina huumeista kohde sitoutumista.

Materiaalit ja menetelmät

laitteen Fabrication

Kaikki laitteet valmistus suoritettiin Cornell nanomittakaava Science and Technology Facility (Ithaca, NY). Standard valolitografiatekniikoita käytettiin määrittämään joukko kuvioita piikiekkojen. Kiekot kaiverrettu happiplasmalla syvä reaktiivisen ioni etsaaja (Uniaxis SLR770) syvyys 100 um, ja puhdistetaan käyttäen rikkihappoa ja vetyperoksidia ennen vasta-aineen pinnan funktionalisoinnin. J591 monoklonaalinen vasta-aine (valmistaja Lonza plc (Slough, Englanti) ja BZL Biologics, inc.) Immobilisoitiin laitteen pinnat MPTMS-GMBS-NeutrAvidin-biotiini kemia [10]. Polydimetyylisiloksaani (PDMS) arkkia (05:01 base:curing aine), noin 3 mm: n paksuinen, polymeroitiin 18 tuntia 60 ° C: ssa ja leikataan muodostamaan kuoria GEDI laitteen. PDMS levy puristetaan laitteen yläosaa mukautetun jigi luoda suljetun kanavia asuttuja post paneelit. Tulo- ja reiät luotiin biopsiastanssia, ja 23-mittari metalliputkia työnnettiin PDMS yhdistää tulo- ja kanavia ulkoinen letku. Laitteet esikäsiteltiin 50/50 isopropanoli /vesiseokseen, ja sitten huuhdeltiin deionisoidulla vedellä ja PBS ennen kokeita.

Näytteenotto ja Mikrofluidistiikan Capture

Oheislaitteet verinäytteet kerättiin putkiin, jotka sisälsivät natriumia sitraatti antikoagulanttia (Becton-Dickinson) terveiltä vapaaehtoisilta ja Metastasoivassa kastraatiotason kestävät eturauhassyöpä alla kliininen protokolla nimeltä ”analyysi verenkierrossa olevia kasvainsoluja eturauhassyövässä. Hoitojen vastaus taksaaneja: pilottitutkimus ”, joka hyväksyi Institutional Review Board (IRB) on Weill Cornell Medical College Cornellin yliopistosta. Verta saatiin potilailla eikä terveillä luovuttajilla kirjallinen lupa, joka oli myös hyväksynyt IRB komitea of Weill Cornell Medical College Cornellin yliopistosta. Kuten aikaisemmin on kuvattu [10], 1 ml verta kustakin näytteestä käsiteltiin läpi GEDI sirun 24 h veren piirtää työntämällä veri laitteen läpi tilavuusvirtausnopeudella 1 ml /hr (Chemyx ruiskupumpulla).

Soluvärjäys ja analyysi

solulinjoja käytettiin näissä kokeissa ohjauslaitteet värjäystä tai teräviä kokeet ovat: ihmisen leukemia solulinjassa U937, ja ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa PC-3, LNCaP ja C4-2. Kaikki solulinjat hankittiin ATCC. Post-talteenotto, solut kiinnitettiin on-chip kanssa PHEMO kiinnitysainetta 37 ° C: ssa (PHEMO puskuri: PIPES happo, HEPES happo, EGTA dinatriumsuolaa, Mg-Cl2-6H

20, 10% DMSO), gluteraldehydi, ja 3,7% formaldehydiä. Sitten solut estettiin (10% normaalia vuohen seerumia – Jackson Immuno Research) ja immunovärjättiin FITC-konjugoitua humanisoidun mAb J591 havaita PSMA ilmentymisen. Monoklonaalinen hiiren anti-CD-45 (BD Biosciences), jota seurasi AlexaFluor568 leimattua vuohen anti-hiiri-(Invitrogen) ja hiiren anti-EpCAM-konjugoitu suoraan AlexaFluor647 (Biolegend). Havaitsemiseksi solunsisäisten antigeenien, solut tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) PBS: ssä ja värjättiin käyttämällä rotan anti-alfa-tubuliinin (YL1 /2, Millipore) ja kanin anti-ERG monoklonaalinen vasta-aine (klooni EPR 3864; Epitomics, Burlingame, CA). Anti-ERG-aine oli antelias lahja Dr. Mark Rubin (Weill Cornell Medical College, New York, NY). Kaikki primaaristen vasta-aineiden inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä; sekundäärisiä vasta-aineita värjättiin huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. DAPI käytettiin DNA counterstaining. GEDI laitteet asennettiin peitelaseja kanssa Mowiol ja säilytettiin -20 ° C: ssa ennen analyysiä.

CTC laskentaa

Blinded CTC laskentaa seuraavan vasta-aineen leimaus suoritettiin käyttämällä Zeiss LSM-700 pisteen skannaus -konfokaalimikroskoopilla, joissa on 405-, 488-, 555- ja 632-nm laser linjat. Kaikki PSMA + /CD45- nukleoiduissa solut tunnistettiin CTC. Ensimmäinen validointi CTC numerointitaso suoritettiin kaksi riippumatonta, sokaisi testaajille. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit vasta-suorituskyvyn ja värjäystä Jokaisessa kokeessa: U937 ihmisen leukemiasolujen (CD45 + /PSMA- /EpCAM-), ja ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (C4-2 ja LNCaP: PSMA + /CD45- /EpCAM + ja PC-3 (PSMA- /Cd45- /EpCAM himmeä). Yksittäiset

z

-stacks hankittiin käyttäen 100X /NA 1,46 ja 63x /NA 1,3 Plan-Apo Zeiss tavoitteet ohjaa Zen ohjelmisto (Zeiss) ja esitti kuten enimmäisvoimakkuutta ennusteet.

RNA

jälkeen solun talteenottopotentiaaliin GEDI laite huuhdeltiin juoksuttamalla PBS 30 min nopeudella 1 ml /h. Solut hajotettiin 700 ul: RLT hajotuspuskuria, jota oli täydennetty 1% β-merkaptoetanolia virtausnopeudella 15 ml /h. lysaatti kerättiin ja RNA uutettiin käyttäen QiagenRNEasy Micro Plus -kittiä (Qiagen Inc, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

ex-vivo lääkehoitoon ja analyysi

ex vivo

lääkehoitoa kokeissa verinäyte kunkin potilaan jaettiin ja 1 ml lennätettiin kaikkiin kolmeen GEDI laitteiden samanaikaisesti. Jälkeen CTC talteenotto ja sen jälkeen PBS: llä pestä, kukin GEDI mikrolaite varovasti asetettiin viljelymaljalle RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 2% seerumia ja johon oli lisätty joko 0,1% DMSO-kontrollin tai paklitakselin konsentraatioissa 100 nM tai 1 uM, ja niitä inkuboitiin 37 ° C 24 tunnin ajan. Lopussa hoidon GEDI kuvankaappausten solut kiinnitettiin PHEMO puskuria ja käsiteltyjen multiplex konfokaalimikroskopia seuraavat immunovärjäämällä eri solun pinnalla ja sytoplasman vasta esitetyllä. Kaikki CTC (PSMA + /CD45- /DAPI +) arvioitiin läsnäolon mikrotubulusten nippujen todisteena tehokas lääke-kohde sitoutumista. Prosenttia CTC todisteet mikrotubulusten niputtamista laskettiin. Kaikissa analysoidut näytteet, niputtaminen käynyt selväksi, että eri muoto, leveys, suunta ja lisääntynyt fluoresenssin voimakkuus mikrotubulusten nippujen verrattuna mikrotubulusten käsittelemättömät solut. Lisäksi käytimme DAPI vastavärinä onko jollakin mitoosi tai apoptoottisten tumien seuraavat lääkehoitoa.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin vertaamaan keskiarvo CTC laskee saatu CRPC potilailla ja terveillä luovuttajia. Käytimme epäparametrinen (Wilcoxonin rank) analyysi, kuten CTC laskee eivät osoittaneet normaalijakaumaa. Tilastollinen merkittävyys määriteltiin α = 0.05.

Tulokset

luonnehtivat laitteen suorituskyky (kuvio 1A), päätimme solu talteenottoaste kanssa PSMA-positiivisten syöpäsolujen. Olemme määritetään solujen talteenotto funktiona vaihteleva mAb J591 pitoisuuksina (1,5-20 ug /ml) käyttäen leikkausjännitys suuruudet edustavat niitä kokema funktionalisoitu laitteen pinnoille (+0,08-+0,24 Pa). Nämä kokeet paljastivat annosriippuvainen nousu solussa ottaa jopa mAb pitoisuuteen 10 ug /ml, jota käytetään kaikissa myöhemmissä kokeissa (kuvio 1 B).

(A) GEDI laite yleiskatsaus. Myötäpäivään ylhäältä vasemmalta: kaavamaisen verenvirtausta laite, kuva pii laitteen silikonitiivisteellä, pinta functionalization järjestelmään. (B) Solujen talteenotto suorituskykyä funktiona leikkausjännitys ja vasta-ainepitoisuus. Titrauskäyrät anti-PSMA J591-vasta-aineen standardoitu geometria osoittavat optimaalisen vasta-aineen pitoisuuden solujen talteenotto.

Vaikka J591-vasta-aine on spesifinen PSMA-ilmentäviä soluja, ei-spesifinen leukosyyttien adheesio on ollut suuri ongelma kaikille veripohjaisten Immunocapture tekniikoita. Minimoida Leukosyyttiadheesion teimme parametrinen tutkimus luonnehtia törmäysaste (CPR; törmäys rivillä) funktiona solukoko ja este offset. Törmäys alk joissakin näistä siirtymiä näytteille terävä sulku mukaan solukoko, kuten kuviossa 2A; joten valitsimme este offset (7 um), joka luo terävä sulku solun halkaisija 14 um. Fysiikkaa kuvaava tämä sulku kuvaa parhaiten koosta riippuva solu- pathlines (kuvio 2A), jotka osoittavat, miten suuria soluja kokea toistuvia törmäys taas pieniä soluja erillään esteitä ja paeta talteenotto. Sitten testattiin tämän hypoteesin mittaamalla talteenotto LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa (kuvio 2B). Tässä kokeessa piikki LNCaP lennätettiin J591-funktionalisoidun laitteita, jotka oli 7 um offset (GEDI)

verrattuna

ne, jotka olivat ilman siirtymiä (suora). Vaikka nämä laitteet on sama pinta-ala-tilavuus-suhde, GEDI geometria huomattavasti lisääntynyt solujen pyyntitehokkuudesta mitattuna vangiksi ja luetteli solujen normalisoitu tulo solujen määrää.

(A) Vasen: Ylös näkymä mikrofluidisten este array array geometriset parametrit. Δ = este offset. Λ = esteen välimatka suuntaan suurin virtaus. Γ = esteen välimatka suuntaan kohtisuorassa bulk flow. 2

r

= este halkaisija. Tehostaa (harmaa) tarkoittavat nesteen virtauksen. Pathlines (eri värejä): llä lentoradat solujen eri halkaisijat. Este array välit ja suunta parametrit määritellään. Oikea: nopeus soluseinän törmäykset solujen kautta kulkeviin array on vahva funktio offset-parametri matriisi; GEDI suunnittelumetodologia merkitsee käytöstä offset-parametrin, joka johtaa koko riippuvan törmäys hinnat. Tulokset ennustettu läpi geometrian vasemmalla näkyvät aivan viivalla; neljän erityisen solun kokoa johtaa tuloksiin merkitään neljä värillisiä pisteitä tässä kaaviossa. Muut geometriset johtaa erilaisiin tuloksiin, näkyy aivan pilkullinen ja katkoviivat. (B) Suora pakkoja tai paneelit, pieni siirtymät (kulta laatikot) johtaa alempaan pyyntitehokkuudesta (vasemmalla) ja koko riippumattomuus (oikealla). Huolella valittu siirtymät (magenta ruutuun) johtaa korkeaan talteenottoaste (vasemmalla) ja koko riippuvuus (oikealla). Talteenottoaste vasemmalla verrata GEDI (7 um offset) ja suora (ei offset) geometriaa suorituskykyä mitattuna LNCaP talteenottotehokkuutta on J591-funktionalisoidun laitteita. Hinnat suorassa kuvata simuloitu törmäyksen hinnat näissä geometriaa. Molemmat kokeelliset tulokset on sama pinta-ala-tilavuus-suhde. (C) Laitteet, joissa sama pinta-alan ja tilavuuden suhde antaa hyvin erilaisia ​​tuloksia: suora taulukot johtaa törmäykset että pienentyä, kun veri kulkee laitteen läpi; GEDI taulukot johtaa törmäykset, jotka lisäävät kanssa kulkevat laitteen.

Koska riippuvuus solun lentoradan solun halkaisija, törmäys hinnat ovat monimutkainen funktio sekä solu- halkaisijan ja taulukkoparametreja kuten rivi vastikkeiden . Törmäys Hinta per rivi (CPR) on vahva funktio rivin offset, näytteille katkoksia, koko riippuvuutta, ja käynnistyksen vaikutukset liittyvät rajallinen jonon pituus (kuvio 2C). Dramaattinen ero suorituskykyä eri malleja on taipumisesta johtuvat hiukkasten-in huonosti valittu geometrioita, taipuma aiheuttaa solujen kääntää päälle virtaviivaistaa jotka eivät tule läheisyyteen myöhemmin esteitä, kun taas hyvin valittu geometrioita, taipuma syyt solujen kääntää päälle virtaviivaistaa jotka eivät tule läheisyyteen myöhemmin esteitä. Näin törmäysaste kasvaa solujen edetä läpi laitteeseen GEDI suunnitteluun, ja vähennykset huonosti valittu malleja, kuten suora paneelit (kuvio 2C). Tämä sulku avulla käyttäjä tunnistaa raja välillä hematosyytteihin ( 14 um) ja solun väestön kokevat maksimi törmäykset ( 15 pm).

Cell talteenotto, kuvantaminen, ja luettelointi CTC alkaen metastaattisen eturauhassyöpäpotilaalla

Seuraavaksi käytimme GEDI laitteen kaapata ja karakterisoida verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) verestä metastasoituneen CRPC. Yksi ml ääreisverenkierron lennettiin laitteen läpi, jää solut kiinnitettiin ja immunovärjättiin PSMA, CD45, EpCAM ja DAPI ja vangitut solut analysoitiin konfokaalimikroskopialla. CTC määriteltiin ehjä, ytimiä PSMA + /CD45- soluihin. Edustavia esimerkkejä CTC ja valkosolut on esitetty kuviossa 3A. Mielenkiintoista, PSMA + solut oli vaihteleva EpCAM värjäystä, jotka vaihtelevat erittäin positiivisesta heikko negatiivinen kannalta EpCAM fluoresenssin voimakkuus. Vuonna potilasalaryhmässä, me kvantitoitiin prosenttiosuus PSMA-kiinni CTC jotka olivat EpCAM positiivisia. Havaitsimme, että 40-70% of GEDI-kiinni CTC oli positiivisia molemmille markkereita, mediaanin ollessa 60% (tuloksia ei ole esitetty). Kontrollit vasta-aineen suorituskyvyn olivat mukana jokaisessa kokeessa käytetään kahta eturauhassyövän jotka ilmentävät eri PSMA ja EpCAM (C4-2: PSMA + /EpCAM + /CD45- ja PC3: PSMA- /EpCAM- /CD45-) ja CD45 + leukemiasolujen U937 (kuvio S1A).

(A) kuvat ovat kiertävien tuumorisolujen otettuja GEDI laite 1 ml verta eturauhasen syöpäpotilailla. CTC kuvautuvat laitteen ja eritellään seuraavat immunovärjäämällä DAPI, PSMA, CD45, ja EpCAM. Ehjä, tumallisia soluja, jotka ovat PSMA + /CD45- tunnistetaan CTC. Valkosolut on tunnistettu DAPI + /PSMA- /CD45 + (alarivissä, nuoli). Huomaa heterogeenisuus EpCAM ilmentymistä PSMA + solupopulaation (ylhäällä ja alhaalla riviä, EpCAM-, keskimmäinen rivi, EpCAM +). Mitta-asteikko: 10 um. (B) Taudista erityinen GEDI kaapata CTC. CTC luettelointi (CTC /ml) suoritettiin käyttäen verestä terveiltä luovuttajilta (mediaani = 3) ja CRPC potilasta (mediaani = 54). (P 0,001, Wilcoxonin) (C) vertailu CTC numerointitaso välillä GEDI-based- ja CellSearch®-pohjainen kaapata. Tämä Vertailu suoritettiin käyttäen saman päivän verta ammentaa 25 yksittäisten CRPC potilasta. * Tarkoittaa että CellSearch-pohjainen luettelointi tehtiin 1 viikko ennen GEDI-pohjainen luettelointi; ∉ ilmaisee saman potilaan joiden veren vedettiin kahdella erillisellä ajankohtina kolmen kuukauden välein (veri ei tehdä 14 esiintynyt 3 kk kuluttua veri ei tehdä 19); # Osoittaa samalla potilaalla, joiden veren vedettiin kahdella erillisellä ajankohtina 1 vuosi välein (veri ei tehdä 22 esiintyessä 1 vuosi ennen veren piirtää nro 23).

käsitellyn veren saatu 10 terveiltä luovuttajilta (valvonta ) ja 30 Metastasoivassa CRPC käyttäen GEDI laitetta. Mediaani määrä CTC /ml havaitaan oli 3 (vaihteluväli 0-22) ja 54 (0 ja 1200), vastaavasti (p 0,001; Kuva 3B). Seuraavaksi suoritetaan suora vertailu CTC talteenoton ja luettelointi vertaamalla GEDI mikrolaitteessa FDA-hyväksytty EpCAM-pohjainen CellSearch® CTC Testaa samana päivänä otetut verinäytteet 25 CRPC potilaista (kuvio 3C). Olemme havainneet 2-400-kertainen määrä CTC /ml raportoitu GEDI mikrolaitteessa suhteessa CellSearch ® CTC Test (kuvio 3C;

p

0,0001, lasketaan Wilcoxonin testi), ja heikko korrelaatio (

r

= 0,44; harha poistetaan Cookin etäisyys rajoitus) välisen GEDI CTC laskee ja CellSearch® (kuva S2).

Molecular karakterisointi jää solut: Detection of yksittäinen pistemutaatio androgeenireseptorin ja ilmentyminen TMPRSS2-ERG fuusio piikki soluissa ja CTC

Sen arvioimiseksi, onko voisimme molecularly luonnehtia GEDI-kiinni CTC, suoritimme proof-of-periaatteen kokeita, joissa eturauhasen syöpä solut oli lisätty 1 ml verta terveestä luovuttajasta, vangiksi laitteen ja analysoitiin läsnäolo androgeenireseptorin (AR) pistemutaatioiden tai ekspressiota TMPRSS2: ERG-geenin fuusioproteiinia. Havaitsemaan T868A (ACT-GCT) yhden pisteen mutaation AR-ligandia sitova domeeni [19], 50 C4-2-soluja lisättiin 1 ml: aan terveen luovuttajan veren läpi virrannut GEDI laitteen, ja RNA uutettiin suoraan lysis laitteen, jota seuraa cDNA-sekvensointi (kuvio 4A). Samanaikaisesti, sekvensointi suoritettiin RNA: sta 1 ml: aan samaa luovuttajan verta käsitellään samalla tavalla (negatiivinen kontrolli) ja RNA: ta 50 C4-2-solujen (positiivinen kontrolli). Kuten odotettua, T868A-mutaatio havaittiin selvästi, että C4-2-soluissa (kuvio 4A, ylä- ja keskimmäinen ruutu), mutta puuttuu negatiivisen kontrollin. Pistemutaatio havaittiin myös, että sekoitettu verinäyte, jossa mutantti-piikin (A) osuus on 70% läsnä olevan nukleotidin tässä asennossa ja villityypin (T) 30%. Tämä tulos on sopusoinnussa aiemmin raportoitu solun talteenotto puhtaus osuus 68% saadaan fluoresoivasti leimattuja syöpäsolujen oli lisätty 1 ml ääreisveren terveeltä luovuttajalta ja läpi virrannut GEDI mikrolaitteessa [10].

(A ) Captured soluilla erittäin puhdasta, joiden avulla voidaan määrittää yhden pistemutaatioiden. T868A (ACT-GCT, Thr-Ala) AR yhden pisteen mutaation havaitaan RNA: ta 50 C4-2-solut oli lisätty 1 ml terveen luovuttajan verta ja vangiksi GEDI laitteen (kolmas rivi, nuoli). Sequencing tulokset 1 ml verta samalta terveen luovuttajan (ylärivi) tai 50 C4-2 soluviljelytutkimuksista (keskimmäinen rivi) on myös kuvattu. (B) toinen TMPRSS2: ERG fuusioproteiini havaitaan GEDI-kiinni CTC peräisin CRPC potilaalle. PSMA-kiinni CTC värjättiin laitteessa anti-ERG vasta-aine. Edustavia esimerkkejä kolme PSMA + /CD45- CTC on esitetty, kaksi, jotka ovat positiivisia ERG. Mittaviivat: 10 mikronia.

Lisäksi, läsnä ollessa TMPRSS2: ERG fuusioproteiini voitiin havaita immunovärjäys kanin monoklonaalista anti-ERG-vasta-ainetta [20] ja fuusio-positiivisia Vcap eturauhassyöpä solut vangiksi laitteen ja analysoitiin multiplex konfokaalimikroskopiaa (kuva S3). Samanlaisia ​​analyysi GEDI-kaapattu CTC peräisin CRPC potilas paljasti sekä ERG positiivisia ja ERG negatiivisia soluja, kun taas CD45 + valkosolut olivat negatiivisia ERG proteiinia (kuvio S3, paneeli C), mikä osoittaa spesifisyyttä ERG värjäyksen eturauhassyövän johdettujen soluja.

Funktionaaliset määritykset: tubuliinin niputtamista altistuessaan taksaaneja

Koska erittäin puhdasta ja elinkelpoisuus GEDI-kiinni CTC, me seuraavaksi testata hypoteesia, jonka CTC kemosensitiivisyys että taksaaneja seuraaviin

ex vivo

kohtelu GEDI mikrolaitteessa voisi ennustaa potilaan kliininen hoitovaste. Taksaanit (paklitakseli, doketakseli ja kabatsitakseli), joita yleisesti käytetään CRPC potilaille [21] – [23] teko vakauttamalla mikrotubulusten polymeerejä ja indusoimalla mikrotubulusten nippuja. Mikrotubulusproteiinit niputtaminen on helposti havaittavissa Immunofluoresenssivärjäystä johtuen niiden lisääntynyt fluoresenssi-intensiteetin, eri muoto ja sytoplasman organisaatio katsottaessa maksimi signaalin projektio [24]. Mikrotubulusproteiinit niputtaminen on ensimmäinen tapahtuma aiheuttama taksaania hoito, jolloin alavirran mitoosi pidätyksen ja apoptoottisen solukuoleman, ja on sen vuoksi sopiva merkkiaine tehokkaita taksaanin huumeiden tavoite sitoutumista.

ensimmäinen määrittää optimaalisen pitoisuuden ja keston

ex vivo

sirulla hoitoon potilaasta johdettujen CTC, me piikki 200 C4-2 solut 1 ml verta terveeltä luovuttajalta, käsitellään näytteen GEDI laite, ja sitten inkuboidaan vangitut solut laitteen 24 tuntia väliaineessa, joka sisälsi 100 nM tai 1 uM doketakselin (DTX) 37 ° C: ssa. Doketakselihoidon 100 nM selvä mikrotubulia nippujen jää C4-2 soluissa (kuvio 5A, keskimmäinen paneeli nuolet), toisin kuin hieno ja monimutkainen mikrotubulusverkoston käsittelemättömän GEDI-kaapattu soluja (kuvio 5A, yläpaneeli). Hoito 1 uM DTX johti vahvaa mikrotubulusten niputtamisesta ja induktio apoptoottisten tapahtumien (kuvio 5A, alapaneeli nuolenpäät). Apoptoottiset tapahtumia määritettiin läsnäolo kirkkaan ja hajanainen ytimeksi menetys tubuliinin värjäystä. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 48 tunnin ajan, on-chip,

ex vivo

hoitoon (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset, sekä se, että AUC seerumin dosetakselin pitoisuus potilaille annettiin 55-100 mg /m

2 dosetakselia on suunnilleen yhtä suuri kuin 1,5-5 tuntia mg /l [25], johti meidät valitsemaan 24 hr käsittelemällä 100 nM taksaanin (1,92 tuntia mg /l), jotta voitaisiin arvioida

ex vivo

vasteen potilaasta johdettujen CTC.

Tubulin vaste taksaania hoitoa voidaan arvioida GEDI-kiinni-soluja. (A) C4-2 eturauhassyövän solut piikki 200 solua /ml terveitä-luovuttajan kokoverestä. Yksi ml piikki verta sitten virtasi kaikissa kolmessa GEDI laitteita. Captured soluja inkuboitiin kunkin laitteen 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan joko DMSO-kontrollin (ylempi kuva) tai DTX 100 nM (keskimmäinen paneeli) tai 1 uM (alempi paneeli). Sen jälkeen lääkehoitoa, solut kiinnitettiin ja käsitellään immunofluoresenssivärjäyksen käyttämällä vasta-aineita tubuliinia ja CD45. DAPI käytettiin DNA vastavärinä arvioida ydin- eheys. Huomaa hieno ja monimutkainen mikrotubulusverkoston että DMSO-kontrollin (yläpaneeli) ja erillisten mikrotubulusten nippujen DTX käsitelty laitteet (nuolet, keskimmäinen ja alhaalla paneelit). Apoptoottiset tumat havaittu suuremmilla DTX pitoisuuksina (nuolenkärki, alapaneeli). (B) GEDI-kiinni CTC verestä on CRPC potilaan hoidettiin

ex vivo

on GEDI laitteen 100 nM DTX (yläpaneeli) tai lisäämällä 100 nM PTX (alapaneeli) 37 ° C 24 tunnin ajan. Sen jälkeen huumehoidon PSMA-kaapattu solut kiinnitettiin ja käsitellään immunofluoresenssivärjäyksen kuten (A), johon on lisätty sytokeratiini-18 vaihtoehtona epiteelin merkki. Tässä potilaan läsnäolo häiriöttömät mikrotubulusverkon seuraavat DTX hoidon (yläpaneeli) osoittaa tehokkuuden puute huumeiden tavoite sitoutumista. Sen sijaan lisäämällä PTX johti mikrotubulusten niputtamista (alapaneeli).

useita määrityksiä on tehty näyttämään mahdollisuuksia funktionaalisella määrityksellä kuvatussa laitteessa. Näissä tapauksissa soluja jää laitteeseen hoidettiin

ex vivo

kanssa DTX ja /tai PTX 24 tunnin (kuviot 5B ja S3). Nämä korostavat kyky suorittaa funktionaalisia määrityksiä siru ja määritys huumeiden tavoite sitoutuminen potilailla yhteydessä niiden kliinisen vasteen. Kato, kuten puute todisteita mikrotubulusten niputtaminen tai apoptoottisten tumien seuraavat

ex vivo

DTX hoitoa voitaisiin havaittu joillakin potilailla. Kuvio S4C on potilas, joka ei reagoinut, jonka mikrotubulusten määrityksessä, sopusoinnussa tämän potilaan puute kliininen vaste käyttäen vakiintuneita RECIST ja PSAWG2 kriteerit. Tämä vastaus oli usein heterogeeninen sisällä jää solupopulaation; Kuva.