PLoS ONE: mutaatio analyysi RAD51C ja RAD51D Geenit korkean riskin munasarjasyöpä Hoitohenkilökunta Tsekin tasavalta
tiivistelmä
Viimeaikaiset tutkimukset ovat antaneet, että
RAD51C
ja
RAD51D
geenejä, jotka koodaavat olennaisia proteiineja mukana homologinen rekombinaatio, ovat munasarjasyöpä (OC) alttiusgeenit jotka voivat selittää geneettisiä riskejä korkean riskin potilailla. Suoritimme mutaation analyysi 171 korkean riskin
BRCA1
ja
BRCA2
negatiivinen OC potilaita, arvioida taajuus perinnöllinen
RAD51C
ja
RAD51D
variantit Czech väestöstä. Analyysissä mukana suoralla sekvensoinnilla, korkearesoluutioisia sulaminen ja useita ligaation riippuvaa -koetinanalyysi. Havaitsimme kaksi (1,2%) ja kolme (1,8%) inaktivoivat ituradan mutaatioita kummassakin vastaavat geenit, joista kaksi (c.379_380insG, p.P127Rfs * 28
RAD51C
ja c.879delG, p.C294Vfs * 16
RAD51D
) olivat uusia. Mielenkiintoista, ohjeellinen perhe syöpä historia ei ollut läsnä neljä harjoittajille. Lisäksi aikojen OC diagnoosit tunnistaa mutaation kantajia olivat huomattavasti alhaisemmat kuin raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa (neljä harjoittajat olivat nuorempia kuin 45 vuotta). Edelleen, me myös kuvattu harvinaisia missense variantteja, kaksi
RAD51C
ja toinen
RAD51D
joiden kliininen merkitys on vielä varmistettava. Truncating mutaatioita ja harvinainen missense variantit varmistanut OC potilailla ei ole havaittu 1226 kontrollinäytteestä. Vaikka kumulatiivinen taajuus
RAD51C
ja
RAD51D
lyhennetty mutaatioita potilaidemme oli pienempi kuin
BRCA1
ja
BRCA2
geenejä, se voi selittää OC herkkyys noin 3% korkean riskin OC potilailla. Siksi
RAD51C
ja
RAD51D
analyysi tulisi osaksi kattava usean geenin havaitseminen korkean riskin OC potilaalla, joista varhain alkanut OC potilaat ilman perheen syövän historia.
Citation: Janatova M, Soukupova J, Stribrna J, Kleiblova P, Vocka M, Boudova P, et ai. (2015) Mutation analyysi
RAD51C
ja
RAD51D
Geenit riskialttiista munasarjasyöpä Hoitohenkilökunta Tšekistä. PLoS ONE 10 (6): e0127711. doi: 10,1371 /journal.pone.0127711
Academic Editor: Klaus Brusgaard, Odense University hospital, TANSKA
vastaanotettu: 23 tammikuu 2015; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2015; Julkaistu: 09 kesäkuu 2015
Copyright: © 2015 Janatova et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään
Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.
Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat sisäisen Grant Agency, Ministry of Health, Tsekin tasavalta, NT13343, (https://www.mzcr.cz/Cizinci/) ; PP, Kaarlen yliopisto, PRVOUK-P27 /LF1 /1, (https://www.cuni.cz/UKEN-1.html); MJ, Kaarlen yliopisto, SVV-UK 3362-2014, (https://www.cuni.cz/UKEN-1.html); PB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Munasarjasyöpä (OC) se on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti, vaikka se on vain 3% naisten syövistä maailmanlaajuisesti. Sen epäsuotuisa ennuste liittyvä suuri osa myöhäisvaiheen diagnoosi riveissä OC neljänteen joukossa yleisin syöpään liittyvien kuolinsyy naisväestöstä [1]. Sen esiintyvyys Tšekissä on 23 /100,000 yksilöitä ja kuolleisuutta määrät 15 /100,000 yksilöt [2].
Tärkein riskitekijä on perheen OC historia. On oletettu, että perinnöllinen alttius kattaa vähintään 10% OC tapauksista [3]. Siksi tunnistaminen nainen kuljettaa patogeenisen mutaatioita OC-alttiusgeenit on tärkeä tehtävä, jonka avulla räätälöityjä OC ehkäisy korkean riskin väestöä. Valtaosa perinnöllinen OC (HOC) tapaukset ovat myös liittyy lisääntynyt riski sairastua rintasyöpään (BC) ja yleisimmät patogeeninen mutaatiot perinnöllinen rinta ja /tai munasarjan (HbOC) syöpä perheitä vaikuttaa
BRCA1
geeni ja vähäisemmässä määrin myös
BRCA2
[4]. Molemmat geenit on tärkeä rooli korjaus DNA double-säikeen katkoksia (DDSB). Äskettäin lisägeenit kuvattiin liittyy HOC, muun muassa
RAD51
paralogeihin
RAD51C
ja
RAD51D
.
Molemmat geenit koodaavat proteiineja osallistuvien genomin vakautta huolto- ja ne osallistuvat homologisen rekombinaation välittämää DDSB korjaus [5,6]. Alustavat tutkimukset raportoitu
RAD51C
geeni (MIM: 602774) kuin toinen Fanconin anemia (FA) geeni nimettiin
FANCO
koska sen kaksialleelisten ituradan mutaatioita havaittiin potilaalla, jolla FA kaltainen fenotyyppi, joka vastaa että komplementaatioryhmä O [7]. Uraauurtavaa työtä Meindl et al. osoittivat, että
RAD51C
on OC alttius geenin mutaatiosta taajuudella 1,3% HbOC potilailla [8]. Sittemmin lisätutkimuksia ovat osoittaneet roolin
RAD51C
geenin OC kehityksen enintään 2,5% korkean riskin HbOC perheiden [9,10,11,12] lukien harvinainen suuria genomisia uudelleenjärjestelyjä [13] .
tutkimus Loveday et al. kertoi, että ituradan mutaatioita
RAD51D
geeni (MIM: 602954) antavat alttius OC 0,9% HbOC perheiden (pääasiallisesti useampia tapauksessa OC) ja arvioitu suhteellinen riski (RR) 6,3 varten OC ja 1,32 BC [14]. Useat muut tutkimukset ovat vahvistaneet sen asemaa OC alttiuteen [15,16,17,18].
Vaikka erikseen harvinainen, yhteen kaikki kohtalaisen penetrance geenit voivat osaltaan huomattavan osan OC riskin; kuitenkin niiden taajuudet vaihtelevat eri populaatioissa [19]. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, kuinka usein ituradan mutaatioiden
RAD51C
ja
RAD51D
keskuudessa suuren riskin OC Czech potilaiden negatiivisesti testataan
BRCA1
ja
BRCA2
mutaatiot.
Methods
Potilaat
Analysoimme 171 DNA-näytteet (saatu ääreisveren) alkaen
BRCA1
ja
BRCA2
negatiivinen OC potilaiden kerätään meidän instituutissa vuodesta 2000 vuoteen 2013. He kuuluivat joko familiaalinen ryhmä (N = 62) tai ryhmä, jolla ei perhettä syövän historia (N = 109; taulukko 1) [20]. Vertailuryhmä koostui nimettömiksi DNA-näytteitä on saatu 1226 yksilöiden lukien 756 syöpäsolujen yksilöitä ja 470 verenluovuttajia, kuten aiemmin on kuvattu [21,22].
Kaikki potilaat ja hallintalaitteet olivat Keski-eurooppalaista syntyperää Tsekin peräisin Prahan alueen. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea General yliopistollisen sairaalan Prahassa ja kaikki osallistujat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa kanssa varastoituja DNA /RNA-näytteet tutkimustarkoituksiin.
Mutaatio analyysi
kaikki yksittäiset koodaus eksonia (jossa introni-eksoni rajat) erotettu suuri introni alueilla
RAD51C
geeni PCR-monistettiin (alukkeet luetellaan S1 taulukko) ja analysoitiin korkean resoluution sulamisen (HRM) analyysi Light Cycler 480 (Roche) käyttäen HOT FirePol EvaGreen HRM Mix (Solis Biodyne) mukaan valmistajan ohjeiden.
vaihtoehdot näytteissä poikkeavaan sulamisen profiili vahvistettiin suoralla sekvensoinnilla erillisistä PCR-reaktioissa käyttämällä BigDye v3.1 on ABI3130 (Applied Biosystems).
Kaikki koodaavat eksonit (mukaan lukien introni-eksoni rajoja), jotka muodostavat neljä eksoni klustereita
RAD51D
geeni monistettiin PCR: llä ja analysoitiin suoralla sekvensoinnilla (PCR ja sekvensointialukkeita luetellaan S1 taulukko).
Kaikki eksonit tunnistettuihin mutaatiot seulottiin 1226 kontrollinäytteiden jota HRM analyysin ja variantti näytteet varmistettiin sekvensoimalla.
Detection of suuri genomista uudelleenjärjestelyt (LGRs) B
P260-A1 Kit käytettiin multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus (MLPA) analyysi
RAD51C
mukaan valmistajan protokollaa. Monistetut tuotteet erotettiin ABI3130 ja analysoitiin MRC Coffalyser ohjelmisto (MRC Holland). MLPA Kitti
RAD51D
analyysi ei ollut saatavissa mitään toimittajan aikaan analyysin.
cDNA analyysi
Sen määrittämiseksi vaikutuksen introni muunnoksessa c. 1026 + 5_1026 + 7delGTA reunustavat intronia-eksonin rajan
RAD51C
suoritimme cDNA-analyysi. Kokonais-RNA eristettiin laskimoverestä käänteiskopioitiin cDNA käyttäen SuperScript III käänteistranskriptaasia (Life Technologies) valmistajan protokollaa. PCR-fragmentti ulottuen mukana alue monistettiin (alukkeet ovat S1 taulukko). PCR-tuote, joka sisältää villin tyypin ja poikkeava fragmentit sekvensoitiin, jotta luonnehtimaan poikkeavaan silmukoivat.
In silico
analyysi
patogeenisyys missensemutaatio varianttien arvioitiin käyttäen SEULOA , PolyPhen, Kohdista GVGD, ja CADD pisteet työkaluja kuten aiemmin on kuvattu [21,22]. Taajuudet tunnistettujen variantit varmistanut NHLBI Exome sekvensointiprojektista (ESP, https://esp.gs.washington.edu/drupal/) ja 1000 Genomes (https://www.1000genomes.org/) tietokannat.
tulokset
Patogeenisia mutaatiot johtavat katkaisu valkuaistuotteiden havaittiin viidessä 171 (3%) korkean riskin OC potilasta, kaksi (1,2%) vuonna
RAD51C
ja kolme ( 1,8%) vuonna
RAD51D
(taulukko 2). Kaksi patogeeniset muutokset olivat uusia. Ei LGR havaittiin
RAD51C
geeni, mutta emme voineet jättää läsnäoloa LGRs
RAD51D
geeni, joka ei analysoitu koska MLPA Kit oli poissa aika analyysin. Mikään tunnistettu muutoksia havaittiin 1226 ei-syöpä valvontaa. Ikä, diagnoosi ja suvussa syöpiä mutaatiot ”Kantaja on esitetty taulukossa 2.
A novel c.379_380insG (p.P127Rfs * 28) muunnos
RAD51C
löytyi nuoren OC potilas kuoli 12 kuukautta diagnoosin mucinous adenokarsinooma. Toinen
RAD51C
lyhennetty variantti oli jatkos-sivuston muuttaminen, c.1026 + 5_1026 + 7delGTA, jonka tunnuksena potilaalla, joka kehittyi kohtukarsinooma seitsemän vuotta diagnoosin munasarjojen vakavasta adenokarsinooma. Patogeeninen potentiaali muutos osoitettiin cDNA analyysi, joka paljasti poikkeavaan eksonin 8 ohitus, joka johti runko-shift ja ennenaikainen päättyminen translaatiotuotteen (p.R322Sfs * 22; kuvio 1). Tämä variantti on aiemmin raportoitu kerran ohjaus ja potilaan, tässä järjestyksessä, Loveday
et al
. ja tutkimuksessa, jonka Golmard
et al
. [10,11].
elektroforeesi (vasemmalla) PCR-tuotteiden monistettiin alukkeilla sijaitsee eksonissa 5 ja 3 ’UTR-sekvenssin (S1 taulukko) esittää kaksi tuotetta potilaan No.1273 verrattuna villin tyypin kontrolli (C) näytettä. Sekvensointi kromatogrammi potilaan PCR-tuote osoittaa, että läsnä poikkeavasti saumattu mRNA eksonin 8 ohituksen.
Ainoa lyhennetty mutaatio kuvattu toistuvasti tutkimuksessamme oli c.694C T (p.R232 *) in
RAD51D
, löytyy kaksi etuyhteydetöntä nuorta OC sairastavien potilaiden vakavien adenokarsinooma eikä perhettä syöpä historiaa. Aikaisempi diagnosoitu potilas kuoli OC levittäminen 10 vuotta diagnoosin jälkeen. Tämä variantti on aiemmin kuvattu Espanjan ja Amerikan HbOC potilaat [18,16]. Romaani
RAD51D
mutaatio, c.879delG (p.C294Vfs * 16), löydettiin OC potilaalle tytär kärsii BC ja OC päällekkäisyydet.
lisäksi lyhennetty variantteja, me löydetty kolme harvinainen missensemutaatio variantteja (taulukko 2). C.641G A (p.R214H) mutaatio
RAD51C
äskettäin tunnistettu BC naaras Afrikkalainen alkuperä [12] ja kuvata riski on vähäinen muunnos perustuu hänen suvussa, joka on sopusoinnussa ohjelmisto ennusteita. Toinen harvinainen missensemutaatio variantti c.947A G (p.H316R) oli uusi; kuitenkin, nämä molemmat muutokset
RAD51C
ennustettiin ei-patogeeninen. Ainoa harvinainen variantti- c.629C T (p.A210V) -jos
RAD51D
oli kuvattu aiemmin [18] ja sen ennustettu patogeenisia (taulukko 2).
Muut havaittu sekvenssivariantit esitetään dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) tai HGMD (https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/start.php) tietokantojen polymorfismit luetellaan S3 taulukossa.
keskustelu
Havaitsimme ituradan lyhennetty mutaatioita
RAD51C
ja
RAD51D
geenejä 1,2% ja 1,8% analysoitu korkea- riskin yksilöitä, vastaavasti, mikä on sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten [23,24]. Tutkimuksemme antaa lisää todisteita siitä, että molemmat geenit antavat rajoitetun mutta kliinisesti merkittävä osuus OC herkkyys.
Ensimmäinen tutkimuksissa raportoitiin vahingollisia lyhennetty mutaatioita
RAD51C
ja
RAD51D
geenejä pääasiassa in HbOC perheet kaksi tai useampia OC tapauksia [8,14]. Kuitenkin löysimme suurin osa (neljä viidestä selvästi vahingollisia mutaatioita, taulukko 2) alaryhmässä 109
BRCA1
ja
BRCA2
negatiivinen OC potilailla, joilla ei BC tai OC suvussa. Tämä on yhtäpitävä myöhemmissä tutkimuksissa, joissa selvitettiin
RAD51C
ja
RAD51D
mutaatiot valitsematon väestöstä OC potilaista [25,16]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kattava geenitestausta
RAD51C
ja
RAD51D
geenien OC potilaita ei pitäisi rajoittaa ainoastaan korkean riskin OC potilailla, joilla oli selvästi suvussa, ja analyysin kaikista OC potilaita tulee harkita riippumatta perheen syövän historiasta ja alkamisiällä [26].
keskimääräinen iät OC puhkeamista naisille
RAD51C
ja
RAD51D
mutaatioita julkaistu aikaisemmissa tutkimuksissa oli 60 vuotta ja
RAD51C
(tarkistetaan [23]) ja 56,6 vuotta varten
RAD51D
(S4 taulukko). Sopik
et al
. Ehdotettu ennaltaehkäisevää leikkausta siirretään vasta, kun luonnollinen vaihdevuodet. Kuitenkin tutkimuksessamme keskimääräinen vuotiaita OC ilmaantunut kantajia katkaisemisen variantteja oli 26,0 vuotta ja
RAD51C
(25 ja 27 vuotta, vastaavasti) ja 48,7 vuotta varten
RAD51D
(37, 43 ja 66 vuotta, vastaavasti). Vaikka pieni määrä mutaation kantajia voivat vaikuttaa tämän havainnon, oletamme, että se, että neljä viidestä harjoittajien patogeenisten mutaatioita
RAD51C
ja
RAD51D
geenit olivat naisilla ennen vaihdevuosia alle 45 vuotta saattaa olla kliinistä merkitystä. Näin ollen lisätutkimuksia harjoittajien molemmat geenit ovat tarpeen arvioida kliininen suosituksia riskiä alentavina kahdenvälistä salpingo munasarjan poisto (RR-BSO) ja vasta sen jälkeen, aikaisintaan puhkeamista OC perheen tulee ottaa huomioon. Äskettäin, Baker et ai. raportoitu RR-BSO in 39-vuotias nainen BC potilas kuljettaa
RAD51D
mutaation perheen useita BC (mutta ei OC) tapauksia [24].
Tutkimuksessamme vain yksi proband, kuljettavat patogeeninen
RAD51C
mutaatio, näytetään perheen syövän historia, joka sisälsi OC ja BC tapauksissa. Koska aiemmat tutkimukset raportoitu riski ei lisäänny BC varten harjoittajille, myöhemmissä tutkimuksissa on kuvattu muutamia
RAD51C
ja
RAD51D
lyhennetty mutaatioita BC vain perheiden [13,27,28,18,24]. Vaikka nämä mutaatiot näyttävät olevan hyvin harvinaisia BC potilailla, ne ovat luultavasti vastuussa tietyistä BC alttiutta. Sukutauluista mutaation kantajia ovat muun syöpätapausta (kohdun limakalvon, leukemia, kilpirauhanen), jonka yhdessä mutaatioiden olisi edelleen analysoitava yksityiskohtaisesti.
Meillä on myös tunnistettu kolme harvinaisia missense muutoksiin molemmat geenit (taulukko 2, S2 Taulukko). Vain c.629C T, p.A210V harvinainen missense muunnos
RAD51D
geeni ennustettiin olevan vahingollisia johdonmukaisesti kaikissa käytetty ohjelmisto ennustelaitteet. Kuitenkin sen patogeenisyys ei voida vahvistaa ilman erottelua ja /tai toiminnallisia analyysejä. Valitettavasti emme pystyneet suorittamaan yhteistyössä eriytyminen analyysi muissa perheen sukulaisia.
penetrance mutaatioita kohtalainen penetrance geenien ei ole helppo arvioida [29]. Aluksi, Meindl et ai. raportoitu täydellinen erottelu
RAD51C
mutaatioita HbOC perheiden [8]. Lisätutkimukset arvioitu suhteellinen riski (RR) OC mutaation kantajia on
RAD51C
(RR = 5,9) ja
RAD51D
(RR = 6,3) [10,14]. Pelttari
et al
. löysi kerroinsuhde (OR) ja Suomen perustaja mutaatioita jokaisessa geenin valitsematon väestö on 6,3 ja 7,1, vastaavasti [30,15]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että OC riski ylittää kynnyksen maltillinen penetrance geenien
RAD51C
ja
RAD51D
mutaatioita harjoittajien ja molemmat geenit ole kliinistä merkitystä diagnostisia testejä ja ennaltaehkäiseviä toimia varten harjoittajille, johon osallistuvat sekä OC ja BC hallinta. Jatkotutkimukset ja meta-analyysit Julkaistujen tietojen eri populaatioiden maailmanlaajuisesti tarvitaan arvioida penetrance in
RAD51C
ja
RAD51D
mutaation kantajia vakuuttavasti.
kliininen hyöty tunnistaminen
RAD51C
ja
RAD51D
mutaation kantajia ei rajoitu ennustamiseen syöpäalttiutta vain. Molemmat proteiinit ovat osallisena DNA-vaurioita signalointi ja DDSB korjaus toiminnallisesti yhteistoiminnassa BRCA1 ja BRCA2 prosesseissa homologisen rekombinaation (HR). Epäonnistuminen tämän korjaukseen liittyvä reitti, joita voitaisiin odottaa syöpäpotilailla kuljettavat ituradan patogeenisiä mutaatioita
RAD51C
ja
RAD51D
herkistää syöpäsolut PARP-inhibiittorit; Siksi potilaat kuljettaa ituradan
RAD51C
ja
RAD51D
mutaatiot voivat hyötyä tästä terapia [14].
Yhteenvetona me kuvattu uusi patogeeninen variantit
RAD51C
ja
RAD51D
ja osoitti, että lyhennetty mutaatiot molemmat geenit voisi löytyä 3% korkean riskin Tsekin OC potilailla. Tuloksemme osoittavat, että puhkeamista OC mutaation kantajia voi olla nuorempi kuin odotettiin. Ehdotamme, että mutaatio analyysi
RAD51C
ja
RAD51D
tulisi osaksi kattava usean geenin paneeli testaus korkean riskin OC potilailla. Kuitenkin lisätutkimuksia eri populaatioissa voi auttaa parantamaan arvioita kliinistä vaikutusta ituradan mutaation kantajia ja seuraavien määrittämiseksi sopiva seulonta, seuranta, tai ehkäiseviä strategioita.
tukeminen Information
S1 Taulukko . PCR-alukesekvenssit.
Yhteenveto Käytetyt PCR-alukkeet sekvensointiin, cDNA: n ja HRM analyysit.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0127711.s001
(DOCX)
S2 Taulukko.
In silico
ennuste missensemutaatio variantteja.
Ennustaminen analyysi, harvinaiset missense variantit
RAD51C
ja
RAD51D
geenien ja taajuus näiden muunnelmia exome sekvensointi 1000 genomit projekteja.
doi: 10,1371 /journal.pone.0127711.s002
(DOCX)
S3 Taulukko.
RAD51C
ja
RAD51D
sekvenssivariantit.
Aiemmin kuvattujen muutosten (polymorfismien, introni variantit) löytyy meidän tutkimuksessa.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0127711.s003
(DOCX)
S4 Taulukko. Ominaisuudet potilaista kuljettaa
RAD51D
patogeenisia mutaatio.
Iät alkamisesta 21 OC potilaista ja 15 BC potilaat kuljettavat
RAD51D
mutaatioita tutkimuksissa toistaiseksi julkaistu.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0127711.s004
(DOCX) B
Kiitokset
omistettu kollegamme ja ystävä, Petr Pohlreich, joka kuoli, kun käsikirjoitus oltiin kirjoitettu.
Kiitämme Marie Epsteinova ja Marketa Dostalova erinomaisesta teknistä tukea ja potilaan ja hänen perheensä osuudelle tässä tutkimuksessa.