Krooninen sairaus

tiivistelmä

integrointi ihmisen papilloomaviruksen (HPV) DNA isännän genomiin on kriittinen etiologisista tapahtuma etenemistä normaalista kohdunkaula intraepiteliaalisten kasvain, ja lopulta invasiivisen kohdunkaulan syövän. Kuitenkin on ollut vähän työtä, miten HPV integraatio tila liittyy hoitotulokseen kohdunkaulan karsinoomien. Nykyisessä tutkimuksessa, HPV E2 ja E6-geenin kopio luvut mitattiin 111 kohdunkaulan syövän kudoksissa käyttäen reaaliaikaista QPCR. Integraatio kuvioita jaettiin neljään ryhmään: yhden kopion-integroitu episomaalista osat (ryhmä 1), yksi kopio integroitu ilman episomaalista komponentit (ryhmä 2), monen kopion tandem toistoa-integroidut (ryhmä 3), ja alhainen HPV (ryhmä 4) ryhmää . Uusiutumisen-ennustavat malli rakennettiin käyttäen monimuuttuja Coxin suhteellisten riskien mallia luokitella potilaita eri riskiryhmät tautivapaan elinajan (DFS). Mallia sisäisesti validoitu käyttäen bootstrap rs. Oligonukleotidi microarray-analyysi suoritettiin arvioimiseksi geeniekspressiomalleja suhteessa eri integraation ryhmiä. DFS oli huonompi järjestyksessä potilaiden ryhmässä 4, ryhmä 2/3, ja ryhmä 1. Monimuuttuja-analyysi osoitti, että histologinen, kliinisessä vaiheessa ryhmä, ja integraatio kuvio olivat merkittäviä ennustavat tekijät huono DFS. Nykyinen ennustetekijöiden malli ennustaa taudin uusiutumisen riski, jonka pinta-ala alle vastaanotin toimii ominaiskäyrä (AUC) 0,74 (Bootstrap korjattu, 0,71). Yhteenvetona nämä tiedot viittaavat siihen, että HPV integraatio malli on voimakas ennustetekijä varten räätälöityjä kohdunkaulan syövän hoitoon.

Citation: Shin HJ, Joo J, Yoon JH, Yoo CW, Kim JY (2014) fyysinen tila HPV integrointi Kohdunkaulan syöpä liittyy hoito tulokset hoidettujen potilaiden Sädehoito. PLoS ONE 9 (1): e78995. doi: 10,1371 /journal.pone.0078995

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 12 elokuu 2013; Hyväksytty: 25 syyskuu 2013; Julkaistu: 10 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Center, Goyang, Korea (Grant 1310300 ja 1110033). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

integrointi ihmisen papilloomaviruksen (HPV) DNA on pidetty kriittinen tapahtuma prosessissa kohdunkaulan syövän synnyn. HPV-DNA havaitaan olevan läsnä integroituneempien isäntäsoluissa yhä useammin normaalista kohdunkaulan epiteelin intraepithelial neoplasioihin, ja kohdunkaulan syöpä kohdunkaula [1], [2], [3]. On kuitenkin olemassa raportteja, jotka osoittavat episomaalista HPV-DNA on läsnä huomattavassa osassa invasiivisen kohdunkaulan syövistä, mikä viittaa siihen, integrointi ei aina vaadita maligni kehittyminen [4], [5]. Yhden kopion HPV integraatio tuottaa häiriöitä E1 tai E2 avoimen lukukehyksen (ORF) [2], [4],. Vaihtoehtoisesti, integrointi useita kopioita HPV voi esiintyä head-to-tail tandem-toistojen [6], [7]. Kun tämä tapahtuu, vain viruksen kopion reunustavien solujen DNA häiritään E1 tai E2-aluetta, kun taas sisäinen kopiot on ehjä E1 ja E2 avointa lukukehystä (ORF: n). Kun taas menetys E2 ORF voi vapauttaa transkription E6 ja E7, on mahdollista, että ehjä E2 ORF: t, jotka on todettu, jossa monen kopion tandem HPV integroitu genomeja, voi ilmaista ja toistamiseen transkriptionaalisen säätelyn E6 /E7. Nykyisessä tutkimuksessa arvioimme ennustetekijöiden merkitystä eri HPV integraation kaavoja DFS kohdunkaulan syöpään. Mikrosiruanalyysi käytettiin sitten vertailla eroja yhteensä geeniekspressiota näiden erilaisten integraatio kuvioita.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasominaisuudet

Tutkimus hyväksyi Institutional Review Board National Cancer Center, Koreassa, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. 111 perättäistä potilasta rekrytoitiin heinäkuusta 2003 heinäkuu 2008 diagnosoitu HPV 16, 18 tai 58 positiivinen okasolusyöpä, adeno-, tai adenosquamous karsinooma kohdunkaula. Kliininen ominaisuudet näistä potilaista on esitetty taulukossa 1. Diagnostic työ-up mukana rectosigmoidoscopy kaikilla potilailla, magneettikuvaus (MRI) lantion ± vatsa 110 potilasta, ja joko positroniemissiotomografia (PET) skannaus tai PET /TT (tietokonetomografia) skannaa 93 potilaalta. Kaikki hoidettiin sädehoidon joka koostuu ulkoisen säteen sädehoito (EBRT) ja korkea-brakyterapia. Aikana EBRT samanaikainen viikoittain sisplatiini 40 mg /m

2 annettiin kaikille potilaille lukuunottamatta 9 potilasta, joilla oli huono suorituskyky mittakaavassa. Valmistumisen jälkeen ensisijainen hoito, potilaita seurattiin 3 kuukauden välein ensimmäisten 2 vuotta, 4 kuukauden välein kolmannen vuoden aikana, ja 6 kuukauden välein sen jälkeen. Yksityiskohdat sädehoidon on kuvattu aikaisemmin [8].

Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio HPV E6- ja E2-geenit

Extraction, vahvistus, ja genotyypin DNA suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [8]. Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI Prism 7900HT System ja TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, CA). Alukkeet ja koettimet on suunniteltu spesifisen monistamisen E2 saranan alueita, joiden tiedetään häiriintyy useimmin prosessin aikana viruksen integraation [2]. Sekvenssi tiedot kustakin käytettyjen alukkeiden ovat saatavilla taulukossa S1. Viisikymmentä nanogrammaa kohde-DNA: ta kustakin biopsianäytteen kohden käytettiin reaktiossa, ja standardikäyrät tuotettiin monistamisen laimennussarja 10

6 -10

3 kopiota klooni HPV-DNA pBR322. Vähintään kolme ei-mallin valvontaa reaktioseokset mukana kussakin kokeessa, ja kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

luokitus kohdunkaulan kasvaimet, joilla on fyysinen tila HPV-genomien

perusteella suhteellinen kopio numerot E2 ja E6, potilaat luokiteltiin 4 ryhmään; Yhden copy-integroitu episomaalista osat (ryhmä 1) ja ilman episomaaliseen komponentit (ryhmä 2), monen kopion tandem toistoa-integroidut (ryhmä 3), ja alhainen HPV (ryhmä 4) ryhmää. Ryhmä 1 kasvaimet sisältävät vielä episomaalisesta HPV kanssa vahvistus sekä E6- ja E2 vaikka taso E2 vähenevät. Ryhmä 2 kasvaimia ei ole E2 vahvistusta. Ryhmä 3 kasvaimet ovat yhtä tasoa E2 ja E6, joka osoittaa monen kopion tandem toistuvaa HPV yhdentymistä. Ryhmä 4 kasvaimia ei ole E2 ja E6 monistuksissa. Nämä neljä ryhmää olivat lopulta uudelleen luokiteltu kolmeen ryhmään niiden eri kliinisiin tuloksiin (ryhmä 1 verrattuna ryhmiin 2/3 vs. ryhmä 4).

mikrosiruanalyysi

Microarray-analyysi suoritettiin 39 potilasta, joilta juuri jäädytetty kasvainnäytteestä voitaisiin saada. Vain potilaat HPV16 tartunnan sisällytettiin microarray kokeilu heterogeenisuuden välttämiseksi aiheuttamien eri HPV genotyyppejä. Tämän seurauksena, 14, 9, 12, ja 4 näytteitä integraation groups1 4, vastaavasti, analysoitiin käyttäen ihmisen koko geenin ilmentymisen microarray 44K v.1.0 (Agilent Technologies, Inc., Palo Aito, CA). Kaikki numeeriset tiedot olivat normalisoitu kohti paikalla ja per-chip normalisointi (intensiteetti riippuva normalisointi), ja per-geeni normalisointi (mediaanituloihin) käyttäen GeneSpring 7.3.1. Rank-lineaariset trendianalyysin käytettiin testaamaan lineaarinen kehitys geeniekspressioiden eri integraatio kuvioita tilata kliinisiä tuloksia. Permutation menetelmällä 250.000 uusien näytteiden suoritettiin arvioimiseksi vastaaviin

p

-arvo. Ilmaisu tasot log2 mittakaavassa käytettiin analyysissä, ja väärä löytö määrä (FDR) [9] säädettiin 0,05. Microarray tiedot on talletettu Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ja ovat käytettävissä Gene Expression Omnibus sarjanumero GSE49288.

Tilastollinen analyysi

Demografiset ja kliinisiä piirteitä esitetään laskee ja prosentit kategorinen muuttujia, ja mediaani ja vaihteluväli jatkuvia muuttujia. Jakautumista erot ryhmien arvioitiin käyttäen Pearsonin Chi-square test tai Fisherin testiä. Spearmanin listalla korrelaatio saatiin mittaamaan yhdistyksen välillä HPV viruskuorman ja kopioida numeroita. Erot Kopiomääränä ryhmien välillä testattiin käyttämällä Kruskal-Wallisin testiä. Monimuuttujasäätimessä Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin ennustamaan DFS säätämisen jälkeen vaikutuksia muiden mahdollisten sekoittavien tekijöiden, kuten iän, vaihe ryhmä, imusolmukestatuksesta, histologinen, ja histologinen tyyppi. Lopullinen malli valittiin perustuen tuloksen univariable analyysin sekä vastikkeena kliinisen tai biologisen merkityksen muuttujia. Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SAS versiossa 9,1 (Cary, NC) ja R tilasto-ohjelmalla, versio 2.12. Kaikki raportoidut

p

-arvot ovat kaksipuolisia.

validointi ennustemallissa käyttäen bootstrap resampling

Syrjinnän kyky monimuuttuja Coxin malli ennustamaan 2 vuotta taudista ilmaiseksi eloonjäänti arvioitiin käyttämällä C tilastotieto, konkordanssi toimenpide analoginen ala vastaanotin toimii (ROC) käyrä. Kalibrointi Mallin arvioitiin käyttämällä Hosmer-Lemeshowin tyyppinen chi-neliö testi vertaamalla erotus havaittu ja ennustettu 2 vuotta eloonjäämisluvut jonka kehitti mallin potilaille kuhunkin tuloluokkaan. Perustuen ennustettu eloonjäämisaste, kolme ryhmää muodostettiin jakamalla potilaita kolmannekseen. Ero elossapysymisaikajakaumat näistä kolmesta ryhmästä verrattiin käyttäen log-rank-testi. Ennustavan mallin validoitiin käyttäen 1000 bootstrap näytteiden sisäisenä validointi korjata ylöspäin bias arvioitaessa C tilastotieto johtuu uudelleen korvaamalla data.

Tulokset

E6 ja E2-geenin kopio numeroita ja integraatio kuvio

luokitus potilaiden perusteella suhteellinen määrä E2: n ja E6-kopiomäärästä johti 31, 24, 37, ja 14 potilasta ryhmässä 1-4, vastaavasti. Kynnys (Ct) suhteet E2 /E6 potilailta kussakin ryhmässä esitetty sirontakuvaajan (Fig. 1). 5 potilaalla oli unclassifiable kuvioita. E6 ja E2 kopio numerot myönteisesti korrelaation group3 (r = 0,83,

p

0,0001) ja group1 (r = 0,43,

p = 0,02

), mutta ei group2 ( r = 0,008,

p

= 0,97) eikä ryhmässä 4 (r = 0,26,

p = 0,37

).

E2 /E6 Ct suhteet potilaiden kunkin ryhmän on esitetty pisteinä pistekaviossa. Poikittaispalkit edustavat mediaanin kanssa kvartiilivälejä.

Univariable ja monimuuttuja-analyysi hoitotulokseen

aikana seurannan, 33 potilasta (29,7%) kehittyi taudin etenemistä lukien 25 etäispesäkkeitä tai 10 paikallista toistuminen. Näistä potilaista kolme olivat molemmat. Kolmetoista potilasta kuoli ja kuolinsyy 2 potilaiden joukossa oli sydän- ja verisuonitautien ja tuntemattomia, vastaavasti. Heidät sensuroidaan kuolinpäivä. Potilaita seurattiin mediaani 29 kuukautta (vaihteluväli 2-67 kuukautta). Mediaani aika seuranta-potilaiden uusiutumatta oli 36 kuukautta (vaihteluväli, 6-67 kuukautta). Kun neljä ryhmää valittiin uudelleen luokiteltiin kolmeen ryhmään, DFS nopeus potilaiden ryhmässä 1 oli korkein, jonka jälkeen ryhmät 2/3 ja ryhmä 4 laskevassa järjestyksessä. Vaaroja suhteet (HR) ja luottamusväli oli 1,90, luottamusväli (CI) 0,70-5,15,

p

= 0,207 ryhmä 2/3 vastaan ​​ryhmä 1, HR 3,52, CI 1,11-11,14,

p

= 0. 032 ryhmässä 4 vastaan ​​ryhmä 1, vastaavasti (

p

= 0,083 log-rank testi, Fig. 2 ja taulukko 2) univariable analyysiin. Muita merkittäviä prognostisia parametrit DFS mukana vaiheessa ryhmä, solmukohtien etäpesäkkeitä, histologinen, histologisen tyypin, ja tupakointi univariable analyysi. Monimuuttuja-analyysi, integraatio malli (yleinen

p

= 0,014; ryhmä 2/3 verrattuna ryhmiin 1,

p

= 0,03, HR 3,15, CI 1,12-8,9; ryhmä 4 vs . ryhmä 1,

p

= 0,004, HR 6,78, CI 1,86-24,79), histologinen, kliinisessä vaiheessa ryhmä, ja ikä edelleen merkittäviä (taulukko 2).

Ryhmä 1; Yhden kopion HPV integrointi episomaaliset komponenttien, ryhmä 2; Yhden kopion HPV integraatio ilman episomaaliset komponentteja, ryhmä 3; Monikopioiset tandem toistuva integraatio, Group 4; alhainen HPV.

Suorituskyky tuloksiin ennustavat mallit ja sisäinen validointi

C-tilastollinen malli ennustaa 2 vuotta eloonjääminen oli 74% (95% CI , 65% -83%) ja bootstrap validoitu C-tilastoa oli 71%. Hosmer-Lemeshowin tyyppinen Chi-square Testimuuttuja oli 9.02 vastaaviin

p

= 0,435 mikä osoittaa hyvän istuvuuden. Log-rank-testi aiheutti huomattavan ero elossapysymisaikajakaumat kolmen potilasryhmät määritelty ennustettu eloonjäämisaste (

p

0,0005) (Fig. 3 ja taulukko 3).

Microarray analyysi 39 kohdunkaulan syövän näytteitä

654 geenejä valittiin osoittaa merkittävästi erilaisia ​​ilmaisuja keskuudessa integraatio ryhmien luokiteltu fyysistä tilaa HPV-DNA (ryhmä 1 verrattuna ryhmiin 2 /3 vs. RYHMÄ4). Koska potilaiden eloonjäämisluvut yleensä laskevan group1 4, geenejä, joissa havaittiin kiinnekohta suuntaus niiden ekspressiotasoja tutkittiin. Tämän seurauksena keskimääräinen ilmauksia 429 geenien joukossa osoitettiin olevan asteittaista lisäämistä (241) tai vähennys (188) suuruusluokkaa group1 4 (Fig. 4). Jälkeen todellinen valinta perustuu perheen viisas virheprosentti (Bonferroni korjaus) alle 5%, transmembraani- modulaattorit soluadheesion kuten klaudiini, occludin, ja syndekaani pysyi geenit, jotka osoittavat merkittävää laskua ryhmästä 1 4. Regulators pienten GTPaasia -välitteisen signaalitransduktion kuten solunjakautumista ohjaus proteiini 42 (Cdc42) efektoriproteiinit, Rho GTPaasi aktivoivat proteiinit, ja p21 (Cdc42 /Rac) aktivoitujen kinaasi 2 (PAK2) myös merkittävästi vähentynyt. Nämä geenit ovat tunnetusti tärkeä rooli uudelleenjärjestely aktiini rasitukseen liittyviä säikeitä, tarttuvuus solusta soluun, solun soluväliaineen. Niistä geenit yhä suuntaus lausekkeen group1 4 olivat transkription sääntelyviranomaisten, kuten MYC liittyvän tekijän X (MAX) ja tuumorinekroositekijä (TNF). Lisäksi oli molekyylit liittyvät kromatiinin remontin kuten AT-rikas interaktiivinen domain 1A (SWI-like), AT-rikas interaktiivinen domain 4B (RBP1 kaltainen, BRCAA1), ja chromodomain helikaasia DNA: ta sitova proteiini. Biologisiin toimintoihin näistä geeneistä tutkittiin käyttäen DAVID bioinformatiikan Resources versio 6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Yksityiskohtaiset tiedot geenien ja

p

-arvon lineaarisen trendin on lueteltu taulukossa S2. Gene ontologia analyysi tämän työkalun avulla osoittaa, että ilmentymistaso liittyvien geenien keratinosyyttien ja T-lymfosyyttien erilaistuminen oli hyvin alhainen ryhmässä 4. Erityisesti, retinoidi-X-reseptori alfa (NM_002957) pieneni merkitsevästi ryhmässä 4, kun se oli korkeimmin ilmaisivat ryhmän 1 (tietoja ei esitetty). Tämä tukee havainto puutteesta epiteelin erilaistumista kasvaimissa matalalla HPV-DNA.

Keskustelu

Nykyisessä tutkimuksessa ennusteen arvioinnissa fyysisen tilan HPV tutkittiin paikallisesti kehittynyt kohdunkaulan kasvaimia. Tutkimuksemme osoittaa, että kohdunkaulan kasvaimia episomaaliset komponentit on ylivoimainen jälkeisen sädehoidon eloonjääminen verrattuna niihin, joilla puhtaasti integroituneen HPV. Todettiin myös, että ennuste kohdunkaulan syöpä on merkittävästi vähentynyt kasvaimissa havaittavan tason HPV-DNA: ta.

Aiemmin on osoitettu, että invasiivisia kasvaimia ei aina koostuvat soluista 100% integroitu HPV-DNA. On noin 17~20% potilaista, joilla kohdunkaulan syöpä sekavin episomaalisia ja integroituneempien HPV [4], [5] tai jopa episomaalisia muotoja vain 7%: lla potilaista [4]. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että fyysistä tilaa HPV kohdunkaulan syöpä liittyy hoitotuloksia [4], [10], [11]. Viral integraatio kuviot on arvioinut eteläisen blottauksella E1 /E2-sivusto [10] tai in situ viruksen DNA signaalin vahvistus menetelmä [11] tai molemmat näistä menetelmistä [4].

suhteelliset määrät E2 ja E6 käytettiin tässä tutkimuksessa, ja yllättäen havaittiin, että yksi kolmasosa (37/111) näytteistä oli monen kopion HPV yhdentymistä. Läsnäolo monen kopion HPV tandem repeat genomien kasvainten tiedetään tuottaa rengasreplikaatiomekanismia menetelmä HPV [12]. Vaikka ennusteen potilaiden sekä irtonumeromyynti HPV integraatio ilman episomaaliset komponentteja ja monen kopion tandem toistetaan integraatio oli huono Tutkimuksessamme biologista merkitystä tämän havainnon on selvennettävä.

Vaikka HPV genotyypityksen ja tiukka reaali time PCR oli 14 potilasta, joilla havaita HPV E2 ja E6 niiden kasvaimia, jotka osoittivat pahin selviytymisprosentti 4 integraatio ryhmiä. On mahdollista, että kasvaimia ilman HPV-DNA voi edustaa, joissa on enemmän ominaisuuksia syövän kantasoluja, joista puuttuu epiteelin erilaistumista, jossa virusreplikaation on rajoitettava epäonnistuneen HPV replikaatiota [13]. Sopusoinnussa tämän hypoteesin, microarray-analyysi osoitti heikkoa ilmentymistä liittyvien geenien keratinosyyttien ja T-lymfosyyttien erilaistumiseen. Lisäksi näiden tietojen perusteella, oletetaan myös, että ryhmien välisen erot chromatin remodeling saattaa indusoida ero esiintyvien eri geenejä. Erityisesti molekyylit liittyvät Rho-GTPaasina signalointi voi myötävaikuttaa osaksi metastaattisen fenotyypin kautta heikkeneminen soluadheesion ja morfologisia muutos kuten EMT (epiteelin-mesenkymaalitransitioon) kasvaimissa huono eloonjäämisluvut ehdotetulla tavalla edellisessä tutkimuksessa [14] . Lisää tutkimuksia on tehtävä todistaa tätä ajatusta.

Nykyiset tiedot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien työstä, joka on kuvattu korkea viruskuorma (HC2test; Digene Corp) oli voimakkaasti yhteydessä hyvän ennusteen kun potilaalla on pienempi viruskuorma pärjäsi paljon huonommin sädehoidon jälkeen [8]. Yhteenvetona, olemme päättäneet HPV integraatio kuvioita käyttämällä uutta kvantitatiivinen PCR-menetelmällä analysoida stoikiometria HPV E2 ja E6 ja määrittää niiden suhdetta jälkeisen säteilyn kliinisistä tuloksista. Integraatio kuvioita todettiin siten olla vahva ennustetekijä osoittavat hyvä korrelaatio muiden tunnettujen ennustetekijöiden kuten vaiheessa imusolmukestatuksesta, histologisen tyypin ja erilaistumista tila. Lisätutkimuksia käyttämällä suurempia näyte numeroita ja muita tarkastusmenetelmien HPV integraation malleja kohdunkaulan syövän tarvitaan vahvistamaan näitä havaintoja.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Primer ja koetinsekvenssit E2 ja E6-geenin real-time PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0078995.s001

(DOC)

Taulukko S2.

Geenit joka osoitti kasvava (a) ja laskeva (b) lineaarinen suuntaus group1 kohteeseen RYHMÄ4; Nimi, toiminto, fold muutos (FC) geenien ja p-arvo lineaarisen trendin on esitetty kohdassa geeni ontologian luokitus.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0078995.s002

(DOC)