Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Topotekaani tuottaa DNA-vaurion joka indusoi autophagy syöpäsoluissa . Tässä tutkimuksessa herkistävät topotekaania koolonkarsinoomasoluissa erilaisilla P53 asema kautta modulaatio autophagy tutkittiin.

Menetelmät /Principal Havainnot

DNA aiheuttaman vaurion topotekaaniin johti cytoprotective autophagy paksusuolen syöpäsolut villin tyypin p53. Kuitenkin solujen mutantti p53 tai p53 tyrmäys, hoito topotekaanin aiheuttama autophagy liittyvää solukuolemaa. Villityypin p53 paksusuolen syöpäsoluja, topotekaaniryhmässä aktivoitu p53, upregulated ilmentymisen sestrin 2, indusoi fosforylaation AMPKα alayksikön Thr172, ja esti mTORC1 kautta. Lisäksi esto autophagy parannettu antituumorivaikutus topotekaanin hoidon villityyppisen p53 paksusuolen syöpäsoluja, mutta lievittää anti-kasvain vaikutus topotekaaniryhmässä p53-knockout-soluissa in vivo.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset viittaavat siihen, että villityypin p53-riippuvainen induktio sytoprotektiivista autophagy on yksi soluvasteita, joka määrittää solun herkkyyttä DNA: ta vaurioittavien lääkkeen topotekaania. Näin ollen meidän tutkimus tarjoaa potentiaalisen terapeuttisen strategian, jossa käytetään yhdistelmä-DNA: ta vaurioittavien aineiden ja autophagy estäjien paksusuolen syöpä villin tyypin p53.

Citation: Li DD, Sun T, Wu XQ, Chen SP, Deng R, Jiang S, et ai. (2012) esto Autophagy herkistää koolonkarsinoomasoluissa villin tyypin p53 mutta ei Mutant p53 topotekaaniin. PLoS ONE 7 (9): e45058. doi: 10,1371 /journal.pone.0045058

Editor: Gian Maria Fimia, Istituto Nazionale per le Malattie Infettive, Italia

vastaanotettu: 13 helmikuu 2012; Hyväksytty: 15 elokuu 2012; Julkaistu: 14 syyskuu 2012

Copyright: © Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (30873085, 30972882, 81101670) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Major Science and Technology Project National Basic Research ohjelma (973 Program) Kiina (2011CB504300) ja Natural Science Foundation of Guangdongin Kiinassa (S2011020002759). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

topotekaani, topoisomeraasi I: n estäjä, joka indusoi DNA-vaurio, hoidetaan paksusuolen syöpä, munasarjasyöpä, keuhkosyöpä, ja kehittynyt kohdunkaulan syöpä [1], [2]. Vaikka DNA: ta vaurioittavien aineiden on hyödynnetty viimeisten 50 vuoden aikana, koska osa potilaista näyttää eri herkkyydet DNA-vahingoittavat lääke jää epäselväksi. Siksi käsityksen soluvasteita laukaistaan ​​DNA: ta vaurioittavien lääkkeiden ja mekanismeja, jotka määrittävät lääkeaineen herkkyys on kriittinen laajentaa hyödyllisyyttä DNA -damaging lääkkeitä syöpien hoitamiseksi.

Autophagy on catabolic mekanismi, joka osallistuu kierrätystä ja liikevaihdon sytoplasman komponenttien [3], [4]. Autophagy voi helpottaa cellular säilymisen tai kuolema vastauksena eri stressiin ärsykkeisiin [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Autophagy myös keskeinen rooli ylläpidossa genomisen vakauden [13], [14], [15] ylläpitämällä aineenvaihduntaa ja eloonjäämisen aikana jännitykset (esim DNA-vaurioita) hyötyvät solujen eloonjäämistä [16]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että autophagy liittyy useita patologisia tiloja, mukaan lukien syöpä [10], tartuntataudit, myopatiat ja hermostoa rappeuttavien häiriöiden, [17], [18], [19]. Koska toiminta autophagy syövissä on monimutkainen ja voi olla vastakkaiset vaikutuksia [7], monet hypoteeseja on ehdotettu asemaa koskevien autophagy syövän. Yksi näistä mahdollisuuksista viittaa siihen, että asema autophagy riippuu vaiheessa kasvaimen kehitystä [20]. Alkuvaiheessa kasvaimen kehitystä, geneettinen todistusaineisto vakaasti osoittaa, että autophagy tukahduttaa kasvaimen aloittamista. Kuitenkin vakuuttava viittaavat myös siihen, että muodostuneen kasvaimen soluihin, mutta se ei ole aloittanut kasvainsoluja, vaativat autophagy ratkaisevana selviytymisreittiin at myöhemmissä vaiheissa kasvaimen kehitystä. Kasvaimet usein asuvat ympäristössä josta puuttui ravinteita, kasvutekijät, ja happi. Siten autophagy on lokalisoitu hypoksinen kasvain alueet, jotka ovat kauimpana ravintoaine syöttävä verisuonten missä se ylläpitää kasvainsolun eloonjäämistä. Toinen hypoteesi ehdottaa, että autophagy säätelee syövän solu- ja kudosspesifisellä tavalla [21], [22]. Monet syöpäsolut tehdään autophagic solukuolemaa jälkeen syöpähoitojen; kuitenkin, autophagy suojaa myös joitakin syöpäsoluja vastaan ​​syöpähoitoihin estämällä apoptoottisia reitin.

p53-tuumorisuppressorin on keskeinen molekyyli vastauksessa DNA-vaurioita. Vastauksena epäsuotuisissa olosuhteissa, kuten genotoksinen, hypoksinen, ja /tai onkogeenisten stressi, p53 nopeasti läpi palautuva translaation jälkeiset modifikaatiot, jotka helpottavat sen vakauttaminen [23]. Tumaan, aktiivisen p53 voi sitoutua promoottoriin alueille ja transaktivoida lukuisia kohdegeenien mukana solusyklin etenemistä, apoptoosin ja /tai aineenvaihduntaan [24]. p53 välittää myös transkription riippumaton kasvain-estävä toiminnot ulkopuolella ytimen [25]. Esimerkiksi soluliman p53 voi relocalise mitokondriot ja laukaista mitokondrion kalvon permeabilisation [26], [27].

syöpä, monet yhteyksiä on autophagy ja p53, joita ei vielä täysin ymmärretä [28]. Eräs tutkimus kertoo, että P53 edistetään autophagy kautta AMP-kinaasi (AMPK) aktivointi ja nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) esto [29]. Kuitenkin, varaamiseen näyttö osoittaa, että P53 kasvain vaimennin voi moduloida autophagy useilla tavoilla riippuen sen solunosasijaintia [25]. Toisaalta p53 on transkriptiotekijä, joka vastaa solujen stressiä ja transaktivoi geenejä, kuten DRAM, sestrins1 ja sestrins2 jotka indusoivat autophagy tai autophagic solukuolemaa [30], [31], [32]. Kuitenkin toisaalta, sytoplasminen mutta ei ydin- p53 voi aktivoida mTOR ja tukahduttaa autophagy [33]. Lisäksi p53 voi myös aiheuttaa autophagy säätelyn LC3 [34]. Kuitenkin ymmärtää, miten nämä vaikutukset saavutetaan edelleen heikko.

Tässä tutkimuksessa raportoimme että villityyppinen p53 voi aktivoida AMPK, estävät mTORC1 ja edistää koolonkarsinoomasoluissa selviytymisen mahdollistamalla cytoprotective autophagy vastauksena topotekaaniin . Lisäksi esto autophagy herkistää koolonkarsinoomasoluissa villityypin p53 topotekaaniin. Sen sijaan, esto autophagy helpotti kasvaimen vastainen vaikutus topotekaaniryhmässä p53-mutantin tai Knockout paksusuolen syövän soluja sekä in vitro että in vivo. Siksi meidän tutkimus osoittaa, että yhdistelmä-DNA-vahingoittavat aineet ja autophagy estäjät voisivat mahdollisesti uutena kemoterapeuttinen lähestymistapa hoitoon koolonkarsinoomasoluissa villin tyypin p53.

Tulokset

topotekaani indusoi autophagy in koolonsyöpäsolulinjaa

pistemäinen LC3 värjäyskuvion on tunnistettu biologinen merkkiaine autophagy [35], [36]. Tutkia, DNA-vaurioittava aine topotekaani voi aiheuttaa autophagy, HCT116, LS-174T ja HT29 ilmentävät LC3 fuusioidaan keltainen fluoresoiva proteiini (YFP-LC3) luotiin. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, käsittelemättömän solujen YFP-LC3 on jakautunut tasaisesti sytosoliin. Kuitenkin topotekaaniin aiheuttama voimakas kertyminen YFP-LC3 pesäkkeitä näissä soluissa. LC3 muunnetaan lipidoitu LC3 (LC3-II), kun muodostumista autophagosome, ja LC3-II siirtyy nopeammin verrattuna nonlipidated LC3-I SDS /PAGE-geelillä [37]. Käytimme tätä eroa siirtyminen edelleen seurata LC3-II tason jälkeen topotekaaniin ja totesi, että ulkonäkö LC3-II indusoitiin korkealla tasolla topotekaaniin erilaisissa koolonsyöpäsolulinjaa (Fig. 1 B ja kuviossa. S1). Aikuinen automaattinen lysosomeihin alistetaan autophagic proteolyysin, mikä johtaa alentuneeseen tasoon autophagic substraattien sekä vähennetään tasoilla autophagosome ja automaattisen lysosomifuusio komponentteja, kuten p62 /SQSTM1 [38], [39]. Edelleen vahvistaa, että autophagic prosessi aiheutettiin topotekaaniin, me havaitsi P62 proteiini Western-blottauksella. Tulokset paljastivat, että P62 oli hajonnut jälkeen topotekaaniin, mikä osoittaa autophagy aiheutettiin näissä koolonkarsinoomasoluissa (Fig. 1 B ja kuviossa. S1).

. HCT116, LS-174T ja HT29-soluja transfektoitiin 24 h ekspressiokonstruktio koodaus LC3 fuusioidaan keltainen fluoresoiva proteiini (YFP-LC3). Sen jälkeen soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 1 ug /ml topotekaanin (TPT) 24 tuntia ja visualisoida -konfokaalimikroskoopilla. B. ilmoitettu solut käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina topotekaanin 24 tuntia. Lysaatit analysoitiin immunoblottauksella The LC3 ja P62-vasta-aineita.

estyminen Autophagy Lisääntynyt herkkyys ihmisen koolonkarsinoomasoluissa villityypin p53, mutta ei Mutant p53 tai p53 Knockout solut topotekaaniin

tutkia topotekaanin aiheuttaman autophagy tarkemmin, RNA-interferenssi käytettiin heikentävistä kaksi tunnettua ydin autophagy proteiineja, beclin1 ja ATG5 (Fig. 2A ja Fig. S2A). Kuten on esitetty kuviossa. 2B ja kuvio. S2B, ehtyminen beclin 1 tai ATG5 siRNA hoito esti tehokkaasti kertymistä LC3-II jälkeen topotekaaniryhmässä, joka osoittaa eston autophagy. Lisäksi esto autophagy että ehtyminen beclin 1 tai ATG5 lisääntynyt topotekaanin aiheuttaman solukuoleman HCT116 ja LS-174T-solulinjojen, jotka ovat p53 villin tyypin ihmisen paksusuolen syövän soluja (Fig. 2C). Nämä tulokset vahvistettiin myös SRB-määrityksellä (Fig. S3A). Nämä tulokset osoittavat, että topotekaaniin aiheuttama toiminnallinen ja cytoprotective autophagy näissä p53 villityypin soluista. Edelleen vahvistaa tulostamme myös esti autophagic polkuun farmakologisen estäjiä. Olemme havainneet, että co-hoito Topotekaanin klorokiinin (CQ), estäjä lysosomaalisen toiminto, joka estää loppuun autophagy lopullisessa vaiheessa, esti tehokkaasti topotekaanin aiheuttaman hajoamisen P62. Tärkeää on, että esto autophagy mukaan CQ myös herkistyneet HCT116-solut topotekaanin aiheuttaman solukuoleman (Fig. 2D ja kuvio. S2C).

. Lysaatit HCT116-soluja, jotka on transfektoitu beclin 1-siRNA tai Atg5- shRNA analysoitiin immunoblottauksella. B. immunoblottauksella analyysit osoittivat, ettei kertymistä LC3-II autophagy-viallinen (so beclin 1-siRNA tai Atg5-shRNA käsitelty) solujen käsittelyn jälkeen 1 ug /ml TPT. C. HCT116 ja LS-174T-ohjaus-soluja, sibeclin 1-soluissa, ja shAtg5-soluja viljeltiin 6000 solua per kuoppa 96-kuoppaisen levyn ja altistettiin eri pitoisuuksia topotekaanin (+0,039-1,25 ug /ml) 72 h. Taso kasvun inhibitio havaittiin käyttämällä MTT-määritystä. Data in C ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3).

P

0,05, Studentin t-testiä. D. HCT116-soluja inkuboitiin 1 ug /ml topotekaani ja /tai 10 ug /ml CQ 24 tuntia. Lysaatit analysoitiin immunoblottauksella kanssa P62-vasta-aineita. HCT116-soluja inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla topotekaanin tai yhdistelmä Topotekaanin ja 10 ug /ml CQ 24 tuntia. Määrä solukuoleman kvantitoitiin käyttäen PI-värjäystä määritys virtaussytometrillä. Data in D ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3). *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin

t

testiä.

Mielenkiintoista, toisin kuin solut villityypin p53, inhibition autophagy jonka CQ p53-mutantin soluissa esti indusoimaa solukuolemaa topotekaaniryhmässä (Fig. 3A). Lisäksi soluissa, joissa p53-geeni oli somaattisesti tyrmätty (HCT116 p53

– /-), inhibition autophagy mukaan CQ hoito esti myös topotekaanin aiheuttaman solukuoleman (Fig. 3B). Samoin inhibitio autophagy mukaan Atg5 ehtyminen ei herkistää HCT116-p53 – /- solujen topotekaani-indusoitua solukuolemaa (Fig. 3C ja kuvio. S3B). Yhteenvetona inhibitio autophagy herkistynyt koolonkarsinoomasoluissa villityypin p53 topotekaaniin; kuitenkin, topotekaani-solukuolema on lieventää p53-knockout-solut, kun autophagy inhibition.

HT29, SW480, ja SW620-soluja inkuboitiin osoitettujen konsentraatioiden topotekaanin tai yhdistelmä Topotekaanin ja 10 ug /ml CQ 24 tuntia. Määrä solukuoleman kvantitoitiin käyttäen PI-värjäystä määritys virtaussytometrillä. Data A ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3). *

P

0,05, **

P

0,01, Studentin

t

testi B. HCT116 p53

+ /+ ja HCT116 p53

– /- soluja viljeltiin 6000 solua per kuoppa 96-kuoppaisen levyn ja altistettiin eri pitoisuuksia TPT (0,0625-2 ug /ml) ja /tai 10 ug /ml CQ 72 tuntia. Taso kasvun inhibitio havaittiin käyttämällä MTT-määritystä. C. Lysaatit HCT116 p53

– /- solut, jotka on transfektoitu vektorilla tai Atg5 shRNA analysoitiin immunoblottauksella. MTT-määritystä käytettiin analysoimaan tason solun kasvun esto. Data in B, C ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3).

P

0,05, Studentin

t

testiä.

topotekaanin aiheuttaman Autophagy välitti p53 aktivaation kautta Sestrin 2 ja AMPK in koolonkarsinoomasoluissa kanssa villityyppinen p53

p53 tuumorisuppressorigeeni on aktivoitu, kun useita eri DNA-vaurioita ja vuorostaan ​​estää solujen proliferaation kautta spesifisten kohdegeenien [40]. Näin ollen meidän vieressä pyrkinyt tutkimaan, ovatko P53 ja sen kohdegeenien osallistui topotekaanin aiheuttaman-autophagy. Kuten odotettua, topotekaaniryhmässä stimuloitu kasvu tason P53 annoksesta riippuvalla tavalla, että HCT116-ja LS174T solulinjat. Lisäksi topotekaaniryhmässä myös lisääntynyt ilmentyminen P53 kohdegeenin, sestrin 2. fosforylaatio AMPK on myös merkittävästi kasvanut jälkeen topotekaani altistuksen (Fig. 4A ja kuvio. S4A). Lisäksi hoito siRNA kohdistamista p53 tai sestrin 2 tehokkaasti kumosi topotekaanin aiheuttaman AMPK aktivointi ja LC3-II kertymistä (Fig. 4B ja kuva. S4b). Nämä havainnot viittaavat siihen, että P53 välittää topotekaanin aiheuttaman autophagy aktivoitumisen kautta sestrin 2 ja AMPK paksusuolen syöpäsoluissa villin tyypin p53.

. HCT116 ja LS-174T-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla TPT 24 tuntia. Tasot P53, sestrin2 ja p-AMPK analysoitiin immunoblottauksella. B. HCT116-solut transfektoitiin p53 tai sestrin 2 siRNA 24 tunnin ajan, käsitellään tai ilman 1 ug /ml TPT vielä 24 h, ja osoitetut proteiinit analysoitiin sitten immunoblottauksella. C. HCT116-solut transfektoitiin LKB1 tai CaMKKβ siRNA: t, käsiteltiin tai ei 1 ug /ml TPT vielä 24 h, ja osoitetut proteiinit detektoitiin immunoblottauksella.

Ca

2 + /kalmoduliinista riippuvan kinaasin β (CaMKKβ) voidaan fosforyloida ja aktivoida AMPK vastauksena lisääntynyt veren kalsiumpitoisuus [41], [42]. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että LKB1 seriini-treoniinikinaasi tarvitaan aktivointi AMPK vasteena korostaa [43]. AMPK voidaan fosforyloida transformoiva kasvutekijä-β-aktivoitu kinaasi 1 (TAK1), joka aktivoi AMPK yhteydessä TRAIL-käsittely [14]. Tutkia, näiden tunnettujen AMPK aktivaattoreita olivat mukana tässä prosessissa, ilmaus LKB1 ja CaMKKβ tippuu alas käyttämällä siRNA. Tulokset osoittivat, että vaikka tehokas ehtyminen LKB1 ja CaMKKβ kumpikaan topotekaanin aiheuttaman AMPK aktivointi eikä LC3-II kertymistä vaikutti (Fig. 4C ja kuviossa. S4C).

Topotekaani indusoi Autophagy kautta AMPK estoa mTORC1 Wild p53 koolonsyöpäsoluihin

AMPK on keskeinen rooli ylläpitää energia homeostaasiin ja autophagy aktivointi [44]. Vaikutuksen tutkimiseksi topotekaanin hoidon AMPK toimintaa, HCT116 ja LS-174T-solut altistettiin topotekaani annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Topotekaaniryhmässä noteably aktivoitu AMPK kahden testattu solulinjoissa villin tyypin p53: n, joka osoittaa fosforylaation AMPKα aktiivisessa jäännös Thr172 (Fig. 5A ja kuvio. S5a). Myös topotekaani indusoi nopean ja jatkuvan aktivoitumisen AMPK, mikä näkyi lisääntyminen fosforylaation asetyyli-CoA-karboksylaasi (ACC), tunnettu AMPK alustaan, on Ser79 (Fig. 5B Fig. S5B). Tutkimukset ovat osoittaneet, että mTOR aistivat muutoksia solujen energia valtion kautta AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK), ja esto mTORC1 mukaan AMPK voi lisätä autophagy [45]. Yhdenmukaisesti näiden tulosten, olemme huomanneet, että topotekaaniryhmässä esti mTORC1 reitti, joka ilmeni alennettua fosforylaation ribosomaalisen proteiinin S6-kinaasi 1 (p70S6K), suora mTORC1 alustan (Fig. 5A ja kuvio. S5a).

HCT116 ja LS-174T-soluja käsiteltiin TPT 24 tuntia. Ilmentymistasojen ilmoitettu proteiinit analysoitiin immunoblottauksella. B. HCT116-soluja käsiteltiin 1 ug /ml TPT varten ilmoitettu kertaa. Solulysaatit analysoitiin immunoblottauksella fosfo-ACC-vasta-aineita. C. Solut käsiteltiin 1 ug /ml TPT ja /tai 20 uM yhdistettä C: ssa 24 h, ja ekspressiotasot ilmoitettu proteiinit analysoitiin immunoblottauksella. D. HCT116-solut transfektoitiin ohjaus- tai AMPKα siRNA 48 tunnin ajan, käsitellään tai ilman 1 ug /ml TPT, ja taso ilmoitetaan proteiinit analysoitiin sen jälkeen immunoblottauksella.

Sen määrittämiseksi, AMPK aktiivisuus oli välttämätöntä topotekaanin aiheuttaman autophagy, me inhiboi AMPK käyttäen farmakologisia estäjää tai RNA-interferenssi. Esikäsittelyssä syöpäsolujen kanssa 20 uM yhdisteen C, joka on voimakas ja selektiivinen AMPK estäjä, estetään tehokkaasti topotekaanin aiheuttaman AMPK aktivointia. Samaan aikaan, topotekaanin aiheuttaman LC3-II kertymistä myös estänyt yhdisteen C hoitoon. Nämä tulokset osoittavat, että autophagy estyi, kun AMPK inhibition (Fig. 5C ja kuvio. S5c). Ehtyminen katalyyttisen α1-alayksikköä AMPK käyttämällä siRNA myös vahvistivat nämä tulokset. Inhibitiota AMPK aktiivisuuden todellakin estetty induktion autophagy, joka ilmeni tasolla LC3-II (Fig. 5D ja kuviossa. S5d). Lisäksi ehtyminen AMPKα palautettu p70S6K toimintaa, joka osoitti, että inhibitio mTORC1 oli helpottunut (Fig. 5D ja Fig. S5d). Nämä tiedot viittaavat siihen, että autophagy indusoitu DNA-vaurioittava aine, topotekaani, riippuu AMPK-estoa mTORC1.

inhibition AMPK aktivointi Lisääntynyt herkkyys ihmisen Colon Cancer Cells Wild-type p53 mutta ei Mutant p53 topotekaaniin

jotta voitaisiin varmistaa, onko AMPK aktiivisuus oli välttämätön solujen elinkelpoisuus jälkeen topotekaaniin syöpäsoluissa villityypin tai mutantti p53, ihmisen paksusuolen syövän soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla topotekaanin läsnä ollessa tai poissa ollessa AMPK estäjä, yhdiste C. Kuten kuviossa. 6, yhdistetty hoito Topotekaanin yhdisteellä C aiheutti tehostettuun sytotoksisuuden ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa villityypin p53 (HCT116 ja LS174-T-solulinjoja). Kuitenkin yhdiste C hoito ei herkistää soluja mutantti p53 (HT29, SW480 ja SW620 solulinjoja) topotekaaniin. Näiden tulosten perusteella, olemme tulleet siihen tulokseen, että aktivointi AMPK toimii keskeisenä välittäjänä induktioon sytoprotektiivista autophagy vastauksena DNA-vaurioita koolonkarsinoomasoluissa sisältävien villikannan p53 mutta ei mutantti p53.

Various soluja viljeltiin 6000-8000 solua per kuoppa 96-kuoppaisen levyn ja altistettiin eri pitoisuuksia TPT (0,15-2,5 ug /ml) ja /tai 10 uM yhdistettä C: ssa 72 tuntia. Taso kasvun inhibitio havaittiin käyttämällä MTT-määritystä. Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3).

P

0,05, Studentin

t

testiä.

Anti-kasvain aktiivisuus Topotekaani yhdessä Autophagy inhibiittorin HCT116 ihmisen paksusuolen syövän Vieraslajisiirteen Malli

tutkia in vivo tehokkuuden autophagy inhibiittorin CQ herkistää villityyppisen p53: n ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa topotekaaniin, ksenograftimallia nude-hiirissä on tuotettu. Kateenkorvattomiin nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti 4 x 10

6 HCT116 p53

+ /+ tai HCT116 p53

– /- syöpäsolut, ja tuloksena kasvainten annettiin kasvaa noin 5 d tuottaa keskimäärin kasvaimen 40 mm

3 ennen lääkehoitoa. Anti-kasvain vaikutuksia topotekaanin, CQ, tai yhdistelmähoito kahden lääkkeen arvioitiin HCT116 p53

+ /+ ja HCT116 p53

– /- ksenograftit. Topotekaani intraperitoneaalisesti kerran 4 d (2 mg /kg), ja CQ intraperitoneaalisesti kerran päivässä (10 mg /kg). Kuten on esitetty kuviossa. 7, viive kasvaimen kasvua havaittiin topotekaaniin yksinään, ja yhdistelmä CQ kanssa topotekaaniin lisäsi kasvaimen vastaisen vaikutus HCT116-p53

+ /+ ksenograftimallissa. Kuitenkin antituumorivaikutus CQ ei tehostaa yhdistelmällä käsittelemällä topotekaanille HCT116-p53

– /- ksenograftimallissa. Päinvastoin, yhdistelmä lääkehoito tuntui heikentää antituumorivaikutuksen topotekaanin tässä mallissa.

Kateenkorvattomia nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti 4 × 10

6 HCT116 p53

+ /+ tai HCT116 p53

– /- syöpäsolut. Kuusi hiirtä jaettiin kuhunkin hoitoryhmään. Kasvainten annettiin kasvaa noin 5 d tuottaa kasvaimen keskimääräinen tilavuus 40 mm

3 ennen lääkehoitoa. Topotekaani intraperitoneaalisesti kerran 4 d (2 mg /kg), ja CQ intraperitoneaalisesti päivittäin (10 mg /kg). Kasvaimen kasvu mitattiin 4 päivän välein menetelmän mukaisesti on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät” osiossa. Tulokset esitetään keskiarvoina ± S.D. (

n

= 6). *

P

0,05, Studentin

t

testiä.

Lisäksi vaikutus AMPK inhibiittoriyhdisteen C yhdistettynä topotekaani on ksenograftimallissa oli tutkitaan. Todettuaan tehokkuus in vitro AMPK estäjän aiheuttama Chemosensiti- topotekaanivaste p53 villin tyypin ihmisen paksusuolen syöpä solujen ksenograftimallia nude-hiirissä syntyi tutkia, onko AMPK esto oli mukana Chemosensiti- topotekaanivaste in vivo. Kuten on esitetty kuviossa. S6, yhdiste C toimineet samanlaisissa tehtävissä kuin CQ yhdistettynä topotekaaniin. Yhdiste C voisi lisätä antituumorivaikutus yhdistettynä topotekaanin HCT116 p53 + /+ muttei p53 – /- ksenograftimallissa.

Siksi tulokset viittaavat siihen, että esto autophagy herkistää koolonkarsinoomasoluissa villityypin p53 DNA: ta vaurioittavien huumeita. Koska AMPK toimii keskeisenä välittäjänä induktioon sytoprotektiivista autophagy vastauksena DNA-vaurioita, esto AMPK voisi myös voimistaa DNA: ta vaurioittavien lääkkeiden koolonkarsinoomasoluissa villin tyypin p53.

Keskustelu

Autophagy on evoluutiossa konservoitunut lysosomaalisen itsensä ruoansulatuksessa. Vaikutukset autophagy kasvainten synnyssä ja syövän hoidossa on paradoksaalinen. On raportoitu, että autophagy pystyy tukahduttamaan kasvaimien syntyyn kautta pitämällä genomista vakautta ja poistaminen P62. Kuitenkin käyttämällä autophagy solua suojaavana mekanismi, kasvainsolut onnistuvat hengissä ankarissa mikroympäristössä. Vastauksena monia syövän vastaisia ​​hoitoja, autophagy indusoidaan pro-selviytymisen strategiaa ihmisen syöpäsoluja tai edistää antituumorivaikutus. Siksi paljon pyrittävä täydentämään mitä päättää soluja suojaavat ja sytosidinen toimintoja autophagy, mikä on olennaista kohdistaminen oikeaan autophagic signalointireittejä joka tekee syövän hoidossa lupaavammalta. Tässä olemme havainneet, että villin tyypin p53-välitteisen AMPK aktivointi johti cytoprotective autophagy vastauksena DNA: ta vaurioittavien lääkkeen topotekaanin ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Estyminen autophagy herkistynyt koolonkarsinoomasoluissa villityypin p53 topotekaaniin; kuitenkin, autophagy inhibitio heikennettyjä kasvaimen vastainen vaikutus topotekaaniryhmässä p53-mutantin tai Knockout paksusuolen syövän soluja sekä in vitro että in vivo. Sen lisäksi tunnetaan mekanismeja, ehdotimme, että p53 voisi moduloida autophagy ja ehdotti, että p53 tila voi määrittää solun kohtalon seuraavat DNA-vaurioita lääkkeen topotekaanin aiheuttaman autophagy ja auttaa ylläpitämään autophagic homeostaasiin.

Mitä syöpä, monet sidos välillä autophagy ja p53. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet kohtalosta autophagic syöpäsolujen vastauksena DNA vaurioita agentti eri p53 tila. Ensimmäinen, osoitamme, että useita koolonsyöpäsolulinjoissa, mukaan lukien p53 villityypin ja p53-mutantti /knockout ihmisen paksusuolen syöpäsoluja, näytteille morfologisia ja biokemiallisia tunnusomaiset piirteet läpikäyvien solujen autophagy käsittelyn jälkeen DNA-vahingoittamatta lääkkeen topotekaania. Lisäksi tukkeutuminen autophagy jonka ehtyminen Atg5 tai beclin 1 RNA häiriöitä tai klorokiinikäsittely, mutta mikä lievensi sytotoksisuutta topotekaanin syöpäsolujen kanssa mutantti p53 tai p53 tyrmäyksellä. Kuten tiedetään, topotekaani ei pitäisi vain tehdä DNA-vaurioita, mutta myös pidättää solut G1 /S pidätyksen tai G2 /M pidätyksen riippuen erillisiä solulinjoissa. Tutkia, onko solukierron pysähtymisen riittää indusoimaan voimistua solukuoleman jälkeen esto autophagy käytimme vinkristiini (VCR) niin erityyppinen syöpälääkkeet vahvista havaintomme. Videonauhuri sitoutuu tubuliinidimeereistä estäen kokoonpanoon mikrotubulusten rakenteita. Häiriöt mikrotubulusten pidättää mitoosia metafaasissa. Tutkimuksessamme vertaamalla videonauhuri hoitoon vain, yhdessä autophagy estäjän ei ole mitään suurta eroa koolonkarsinoomasoluissa asemasta riippumatta p53 (Fig. S7). Tulokset viittasivat siihen, että topotekaania välittämä solukuolema ja cytoprotective autophagy voisi liittyä DNA-vaurioita koolonkarsinoomasoluissa. Meidän aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että autophagy edistää solun kuolemaan CNE2 solujen mutantti p53 ja Hep3B-solut, jotka ovat p53 puutteellisia [46], [47], [48]. Vaikka näyttää järkevä tarkastella p53 sen proapoptoottiset toiminnasta, osoitimme, että laajentaminen solun selviytymisen kautta autophagy induktion oli myös luontainen ominaisuus villityyppisen p53. Tällaisia ​​soluja suojaava toiminto voi liittyä rooliin villityyppisen p53 ja autophagy ylläpitämisessä intrasellulaarisen aineenvaihdunnan homeostaasin. Kuitenkin jotkut syöpäsolujen kanssa mutantti p53 tai p53 Knockout kadonnut tämä prosurvival ominaisuus autophagy. Itse asiassa, tukos autophagy voi edistää syöpäsolujen kuolemaa näissä olosuhteissa. Havaintojemme liittyi kasvava joukko esimerkkejä, mitä on tehtävä autophagy syövän hoidossa ja mikä päättää kohtalo autophagic syöpäsoluja.

mekanismeja, joilla villityyppisen p53 indusoi soluja suojaava autophagy vaikuttavat ensisijaisesti syntyvän transkription valvonta mTOR reitin sääntelyviranomaisten. Todellakin, useat p53 kohdegeenien, kuten AMPK, TSC2, ja PTEN, ovat kaikki tunnettuja negatiivisia säätelijöitä mTORC1. Merkillistä, kaksi p53 kohdegeenien, sestrin1 ja sestrin2, on määritetty kriittiseksi yhteys p53 aktivaation ja mTORC1 toimintaa [31], [49], [50]. Tämän perusteella me arveltu, että villityyppinen p53 ja sen tavoite, sestrin 2, voi aktivoida AMPK, estävät mTORC1 ja edistää solujen eloonjäämistä mahdollistamalla cytoprotective autophagy vastauksena topotekaania. Tietojen perusteella esitetään tässä tutkimuksessa, tämä hypoteesi näyttää oikein. Kuitenkin kaksi tunnettua AMPK aktivaattoreita, LKB1 ja CaMKKβ, eivät olleet vastuussa topotekaanin aiheuttaman aktivaation AMPK ja tuloksena autophagy. Kuten odotettua, AMPK aktivointi ja fosfo-p70S6K esto ei havaittu topotekaaniin p53 mutanttisoluista (Fig. S8). Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että esto AMPK lisääntynyt solujen herkkyys topotekaaniin p53 villityypin syöpäsolut, mutta ei p53 mutanttisoluista. Tuloksemme viittaavat siihen, että villityypin p53 paksusuolen syövän soluja, mutta ei mutantti-p53-soluja, p53 aktivoituu-AMPK toimii keskeisenä välittäjänä induktioon sytoprotektiivista autophagy vasteena DNA-vauriolle.

Kollektiivisesti kohtalo autophagic syöpäsolujen todennäköisesti vaihtelee eri solujen eri p53 tila. Siinä tapauksessa, syöpäsolujen villityypin p53, p53 edistää selviytymistä tekijä AMPK. Tämän seurauksena aktiivinen AMPK voi edistää autophagy suojata syöpäsolujen torjumaan sytotoksisuuden aiheuttama DNA-vaurioittava aine. Toisaalta p53 mutantti tai tappio ei aktivoida AMPK, mutta saattaa edistää muiden ”stressi-aktivoidun proteiinikinaasin” kuten c-Jun NH2-terminaalista kinaasien, pakottaa korkea autophagy hinnat, ja lopulta aiheuttaa autophagic solukuolemaa. Lisäksi olemme vahvistavat, että esto autophagy herkistynyt koolonkarsinoomasoluissa villin tyypin p53, joka toisin esti antituumorivaikutus in ne joilla p53 Knockout DNA vaurioita hoitoon vivo. Näin ollen meidän tutkimus tarjosi mahdollinen hoito strategiaan, jossa yhdistelmä-DNA-vaurioita aineita, joilla on autophagy inhibiittoria käytetään syöpäsolujen villityypin p53, mutta yhdistelmä-DNA-vahingoittamatta huumeiden ja autophagy induktorien voidaan kehittää käyttökelpoinen strategia hoitoon ilmentävien syöpien mutantti p53 tai p53 tyrmäyksellä.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen lausunto

tutkimus ja koemenettelyn hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Sun Yat- sen yliopiston kanssa luvan numero 11002A.

Cell Culture

HCT116, LS174-T, SW480, SW620 ja HT29 kasvatettiin DMEM täydennetty 10% FBS (lämmöllä inaktivoitu 56 ° C 30 min) ja sopivat määrät penisilliiniä ja streptomysiiniä 37 ° C inkubaattorissa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä. HCT116 p53

– /- noomasolulinjasta toimittanut professori Jing-Xuan Pan (Sun-Yat Sen University, Kiina).

konfokaalimikroskopia ja epäsuoralla immunofluoresenssilla

Soluja transfektoitiin ohimenevästi keltainen fluoresoiva proteiini (YFP) leimatun LC3 ekspressiovektoriin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin topotekaania. Jälkeen 24 tunnin topotekaaniin, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja tutkitaan laser-skannaus -konfokaalimikroskoopilla (Olympus, FV-1000).

RNA Häiriöitä

Solut transfektoitiin