Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mahasyöpää kasvaa alle hapenpuuteympäristössä. HIF-1α tiedetään olevan tärkeä rooli säätelyssä reaktiivisten hapen lajien (ROS) mitokondrioissa hypoksisissa olosuhteissa. Olemme aiemmin perustettu HIF-1α taintumisen (KD) solut ja ohjaus (SC) solujen 58As9 mahasyövän solulinjassa. Tässä tutkimuksessa olemme paljasti, että KD soluja, mutta ei SC soluja, indusoi apoptoosia hypoksian olosuhteissa (1% O

2) johtuu liiallisesta tuotannon ROS. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi osoitti, että ilmaukset kymmenen geenejä, jotka ovat mukana valvontamekanismit ROS (mukaan lukien Warburg vaikutus, mitophagy, elektroninsiirtoketju [ETC] muutos ja ROS puhdistusjärjestelmä), säädeltiin HIF-1α. Lisäksi edistämällä glukoosin oton glukoosi plus insuliini (GI) käsittely tehosti apoptoottisen vaikutuksen, joka oli mukana vielä ROS tuotanto hypoksinen KD soluissa. Western-blot-analyysi osoitti, että kalvomainen ilmentymistä GLUT1 KD-soluissa nostettiin glukoosi ja /tai insuliinin hoitoja, mikä osoittaa, että GI aiheuttama glukoosin oton välittyy lisääntynyt translokaatiota GLUT1 solukalvon. Lopuksi, kasvaimen vastainen vaikutus HIF-1α pudotus (KD) plus GI arvioitiin käyttäen ksenograftimallissa, jossa hapenpuuteympäristössä luonnollisesti olemassa. Tämän seurauksena, GI käsittely esti voimakkaasti kasvua KD kasvainten jolloin solujen apoptoosia indusoituvan voimakkaasti verrattuna kontrolliin hoitoon. Sen sijaan, kasvua SC ilmentävien kasvainten HIF-1α ei vaikuta GI hoitoon. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että HIF-1α inhibition ja GI voi olla ihanteellinen hoito, koska apoptoosin vuoksi tuhoaminen ROS homeostaasin indusoi spesifisesti mahasyövän, joka kasvaa alle hapenpuuteympäristössä, mutta ei normaalin kudoksen alla aerobisissa olosuhteissa.

Citation: Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) apoptoottisen vaikutus HIF-1α estäminen Yhdistettynä glukoosi plus insuliinihoitoa on mahasyövän Hypoksisissa toimitusehdot. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10,1371 /journal.pone.0137257

Editor: Ester Hammond, University of Oxford, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 30 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 13 elokuu 2015; Julkaistu: 04 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

hapenpuuteympäristössä on merkittävä kiinteissä kasvaimissa, joissa se kiihdyttää niiden pahanlaatuinen käyttäytymistä [1-4]. Kuten muutkin kiinteät kasvaimet, mahalaukun syövän tiedetään ottamaan laajoja hypoksian sisällä kasvain [5-7]. Hypoksinen olosuhteet aiheuttaa useita biologisia tapahtumia, kuten angiogeneesin, paikallinen invaasio, metastaaseja radio- tai chemoresistance ja muuttunut energia-aineenvaihduntaa monin karsinoomat, mikä johtaa huonoon ennusteeseen potilailla [2-4].

transkriptiotekijä hypoksia-indusoituva tekijä 1 (HIF-1) on tärkein välittäjä solun sopeutumisen hypoksia [8-10]. HIF-1 on heterodimeerinen proteiini, joka koostuu konstitutiivisesti β-alayksikön (HIF-1β) ja hypoksia-indusoituva α (HIF-1α) alayksikön [8-10]. HIF-1α alayksikkö hajoaa kautta Ubikitiini-proteasomireitillä alla normoksia. Sen sijaan alle hypoksia, HIF-1α on vakiintunut ja dimerisoituu kanssa HIF-1β vuorovaikutuksessa CBP /p300, joka sitten sitoutuu hypoksiavaste elementti (HRE) on promoottorialueen satojen kohdegeenien [11-16]. Nämä aiemmat raportit ovat johtaneet tunnustamista HIF-1α keskeisenä säädin patogeneesissä kiinteää syöpää.

reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), kuten superoksidianionia (O

2

– ), vetyperoksidi (H

2O

2), ja hydroksyyliradikaali (HO •), koostuvat radikaali ja ei-radikaali hapen lajeja muodostuu osittainen alentaminen hapen. Solunsisäiset ROS kertyvät pääosin mitokondrioissa by oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS), joka on prosessi, jota suorittaa elektroninsiirtoketju (ETC) [17]. Kun ROS hukuttaa solujen antioksidantti puolustusjärjestelmää, oksidatiivisen stressin tapahtuu. Liiallinen oksidatiivisen stressin aiheuttaa ROS-välitteisen vahingosta nukleiinihappojen, proteiinien ja lipidien ja johtaa solukuolemaan [17, 18].

HIF-1α on raportoitu valvoa ROS hypoksisissa olosuhteissa läpi useita mekanismeja mukaan lukien muuntamiseen aineenvaihduntaa OXPHOS glykolyysin, joka kutsutaan Warburg vaikutus [19-23], induktio mitokondrioiden selektiivisen autophagy (nimetty mitophagy) [24, 25], ETC muutokseen, jonka alayksikkö kytkin sytokromi c oksidaasi (COX) [26] ja ROS scavengers [27]. Vuonna metaboloitumisreitin Warburg vaikutus, HIF-1α ensin aktivoi transkription

GLUT1

kasvattaa glukoosin sisäänottoa soluihin. Glukoosi sitten metaboloituu pyruvaatti toiminnallaan glykolyyttisen entsyymin jäsentä, jotka ovat tunnettuja kohteita HIF-1α [28, 29]. Aerobisissa olosuhteissa, pyruvaatti muunnetaan asetyyli-CoA (AcCoA) by pyruvaattidehydrogenaasi (PDH) tuloa trikarboksyylihappo (TCA) kierto. Sitä vastoin syöpäsoluja altistetaan hypoksia, pyruvaatti shuntataan pois mitokondrioissa, jolloin HIF-1α ylössäätelee ilmaus PDK1 estävän PDH aktiivisuutta. Sen jälkeen LDHA vaihtoehtoisesti muuntaa pyruvaatin laktaatti ja MCT4 kuljettaa laktaatti ulos solusta. Nämä geenit ovat myös säätelee HIF-1α [16, 30, 31]. Hypoksia indusoi mitophagy estää liiallisen ROS tuotanto, jolla vaurioitunut mitokondriot eliminoituvat lysosomaalisen ruoansulatusta [24, 25]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että HIF-1α aktivoi nuotinnosten koodaavat geenit BNIP3 ja BNIP3L, olennaisia ​​tekijöitä mitophagy prosessissa [32]. Toinen tutkimus raportoi, että HIF-1α säätelee COX4 alayksikkö vaihtaa aktivoimalla transkription ETC liittyvien geenien COX4-2 ja LON, mitokondrio proteaasi, joka tarvitaan COX4-1 hajoamista hypoksia [26]. COX4 alayksikkö kytkin ilmoitettiin tärkeä askel ROS homeostaasiin, koska sen rooli optimoinnissa tehokkuuteen hengityksen hypoksiaolosuhteissa [26]. ROS scavenger MnSOD tiedetään muuntaa superoksidiradikaalien vetyperoksidin. Aikaisempi tutkimus on raportoitu, että MnSOD on voimistunut hypoksiassa, vaikka onko tämä säätelyä välittävät HIF-1α ei ole vielä esitetty. [27] Äskettäin toinen raportti osoitti mielenkiintoinen havainto, että alkion fibroblastit (MEF) ja hypoksinen HIF-1α-null hiiret kuolivat johtuu liiallisesta ROS tuotantoa, kun taas MEF pelastettiin käsittelemällä hapettumisenestoaine N asetyyli-L-kysteiini (NAC) [ ,,,0],33]. Yhdessä nämä raportit osoittavat, että HIF-1α on keskeinen rooli järjestämisessä mitokondrion ROS tuotanto elävissä soluissa hypoksiaolosuhteissa.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin luomaan terapeuttisen malli osoittaa, että hypoksian indusoiman apoptoosin kautta ylituotanto ROS voidaan ottaa käyttöön HIF-1α puutteellisia mahalaukun syöpäsoluja. Alussa määritetään, onko hypoksia indusoi solukuoleman liiallinen ROS tuotanto HIF-1α taintumisen (KD) soluja. Sen jälkeen olemme käsitelleet hypoteesia, jonka käyttöönotto korkean glukoosipitoisuus käsittelemällä KD insuliinin kanssa voi tehostaa apoptoottista vaikutusta. Lopuksi käyttäen -tuumoriksenografti malli, ehdotimme, että HIF-1α esto yhdistettynä glukoosin plus insuliini (GI) hoito voi olla mahdollinen hoito mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely olosuhteet ja reagenssit

mahasyöpä solulinja 58As9 luovutti ystävällisesti Dr. K. Yanagihara (National Cancer Center Hospital East, Chiba, Japani) joulukuuta vuonna 2009. 58As9 solulinja perustettiin alun perin peräisin scirrhous mahalaukun karsinooma-solulinjaa HSC-58 [34]. Tämä solulinja sitten edelleen todennettu 24. helmikuuta

th, 2015 mukaan JCRB Cell Bank (Osaka, Japani). Toinen mahasyöpä solulinja, MKN74 ostettiin Cell Bank, RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japani). Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin stabiileja HIF-1α pudotus solujen KD: n ja 74-KD, joka vahvistettiin transfektio siRNA plasmidi RNAi-sekvenssit osaksi 58As9 ja MKN74 soluista, kuten aikaisemmin on kuvattu [7, 35]. Sekvenssit siRNA kohdistaminen HIF-1α ja ohjaus salattu siRNA suunniteltiin seuraavasti: HIF-1α siRNA KD tai 74-KD (5′-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ’) ja kamppailu siRNA SC tai 74- SC (5’-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 ’). Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 ug /ml kanamysiiniä (Meiji, Tokio, Japani ) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä. Soluja viljeltiin joko happiolosuhteissa (20% O

2 ja 5% CO

2 ilmassa) tai hypoksinen olosuhteet (1% O

2, 5% CO

2 ja 94% N

2) happiniukkaan kammioon (ASTEC, Fukuoka, Japani) ja käsiteltiin sitten NAC (Sigma-Aldrich) ja insuliini (Wako, Osaka, Japani), jonka lopulliseksi pitoisuudeksi 5 mM ja 500 ng /ml, vastaavasti. Konsentraatio korkean glukoosin alusta valmistettiin lisäämällä 45% D – (+) – glukoosi-liuosta (Sigma-Aldrich) ja lopullinen konsentraatio määritettiin olevan 10 g /l, joka on 5 kertaa suurempi kuin normaalissa RPMI-1640-väliaine.

solunelinkykyisyysmääritys

solujen elinkelpoisuuden normoksia tai hypoksia arvioitiin trypaanisinivärin syrjäytymisen määrityksissä. Arvioimiseksi lääkehoidon vaikutuksia, kuten NAC, korkea glukoosi ja /tai insuliinin solujen elävyys, 1 x 10

5-solut ympättiin 6 cm kulttuurin ruokia. Solut jossa eri lääkeaineilla käsitellyt ilmoitettuina pitoisuuksina ja viljeltiin normoksia tai hypoksia 24 h 96 h. Lopussa Inkubaation kelluva ja kiinnittyneet solut kerättiin ja pelletoitiin sentrifugoimalla (3000 rpm, 5 min). Solut suspendoitiin uudelleen 90 ui täydellistä alustaa, sekoitetaan 10 ui 0,4% trypan blue-liuoksella ja laskettiin hemosytometrillä mikroskoopilla. Solujen kuolleisuus määritettiin suhde kuolleiden solujen määrä /solujen kokonaismäärästä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja itsenäisesti toistettiin ainakin kolme kertaa.

Western blot-analyysi

kokosolulysaateista viljellyistä soluista ja ksenograftikasvaimina hiiriä valmistettiin käyttäen lyysipuskuria, joka koostuu 150 mmol /L NaCl, 50 mmol /L Tris-HCI (pH 7,6), 0,5% Triton X-100, ja proteaasiestäjäseostabletit sekoitus (Roche, Mannheim, Saksa). Solulysaatteja sytosolifraktion ja solukalvofraktio valmistettiin käyttäen Sytokromi c vapauttaminen Apoptosis Assay Kit ja solukalvon Protein Extraction Kit (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Alikvootit, jotka sisältävät 30 ug proteiinia elektroforeettisesti erotettiin 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) ja siirrettiin Amersham Hybond-ECL-kalvolle (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) on siirto-puskurissa. Kun oli salvattu 5% ihon maitoa 30 min, kaivoa inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: anti-HIF-1α (1: 1000 laimennus, Abcam, Cambridge, UK), anti-katkaistuun kaspaasi 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-sytokromi c: (1 : 500 laimennos, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100000 laimennus, Abcam), ja anti-β-aktiini (1: 10000 laimennos; Sigma-Aldrich, Inc.). Inkuboinnin vastaavan toissijaisen vasta, signaalit kehitettiin käyttäen Amershamin ECL Plus Western blotting Detection System (GE Healthcare).

Detection solunsisäisten ROS virtaussytometrialla

Solunsisäinen ROS arvot arvioitiin käyttämällä Total ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, KD, SC, soluja viljellään olosuhteissa, jotka joko normoksia tai hypoksia lääkkeellä tai ilman käsittelyä (eli NAC, korkea glukoosi ja /tai insuliini) 24 h, 48 h ja 72 h. 74-KD ja 74-SC myös viljellä olosuhteissa joko normoksia tai hypoksia 24, 48, ja 72 tuntia ilman lääkehoitoa. Solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen ROS havaitseminen ratkaisu. ROS fluoresenssi havaittiin FACS Calibur-virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, San Jose, CA) ja analysoitiin Cell Quest ohjelma. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Keskimääräinen fluoresenssi ROS määritettiin automaattisesti ja esitetään GEO tarkoittaa.

Yhteensä RNA ja kvantitatiivinen RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin solulinjoista käyttämällä Isogen RNA Kit ( Nippon Gene, Osaka, Japani). Yksi ug RNA: ta muutettiin cDNA käyttäen ReverTra Ace (Toyobo) käänteistranskriptioreaktion kit. CDNA: ta käytettiin templaattina PCR: ssä. Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (RT-qPCR) suoritettiin avulla Valon Cycler välinejärjestelmä (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa) käyttäen Light-PCR-laite-FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche). Kymmenen geeniä, jotka analysoitiin RT-qPCR olivat seuraavat: glukoosi transporter 1 (

GLUT1

), aldolaasi C (

ALDOC

), pyruvaattidehydrogenaasikinaasi 1 (

PDK1

), laktaattidehydrogenaasin A (

LDHA

) ja monokarboksylaatti kuljetin 4 (

MCT4

), Bcl-2 /adenovirus EIP 19-kDa vuorovaikutuksessa proteiini 3 (

BNIP3

), BINP3 kuten (

BNIP3L

), mitokondrioiden mangaani superoksididismutaasi (

MnSOD

), mitokondrio proteaasi

LON

ja sytokromioksidaasi alayksikköä 4-2 (

Cox4 – 2

). Alukkeet suunniteltiin mukaan raportoitu cDNA-sekvenssit (GenBank, Bethesda, MD) (taulukko 1). Suorittamisen jälkeen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 3 min, PCR-monistus suoritettiin 50 sykliä 15 s denaturaatio 95 ° C: ssa, 5 s, pariutuminen 60 ° C: ssa ja 10 s pidennys 72 ° C: ssa. Määrälliset arvot normalisoitiin β-aktiini (

ACTB

) ilmentymistä (taulukko 1). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja itsenäisesti toistettiin ainakin kolme kertaa.

glukoosi oton määritystä

glukoosin sisäänottoa viljellyissä soluissa määritettiin käyttämällä 2-deoksiglukoosi (2DG) Uptake mittaus Kit (COSMO BIO Co. Ltd., Tokio, Japani). Lyhyesti, soluja viljeltiin alle seerumia edellytys 6 h, jonka jälkeen edelleen viljelyä 18 h säännöllisesti väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan normoksia tai hypoksia. Sen jälkeen soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 500 ng /ml insuliinia 18 min. Lopuksi soluja käsiteltiin 2DG 20 minuutin ajan ja altistettiin mittaus 2DG oton mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja keskiarvot laskettiin.

Eläinkokeet

Eläinten pöytäkirjat hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komiteat Saga University (protokolla 24-008-0 ) ja sopeutui ARRIVE suuntaviivat eläinten käyttöä tutkimuksessa. Naaras 4 viikkoa vanhoja, joilta puuttuu kateenkorva BALB /cA Jcl hiiriä (nu /nu) saatiin Nihon Crea Co. (Osaka, Japani). Eläimiä erityisiä-patogeenivapaissa olosuhteissa. Ne saivat steriiliä ruokaa ja autoklavoitiin veden kanssa 12 tunnin valo-pimeä-sykli. Hiiret, joita oli totutettu ympäristön 7 päivää ennen kokeita. KD tai SC soluja (3 x 10

6) injektoitiin subkutaanisesti selän hiirien (n = 9 kullekin solulinja). Kymmenen päivän kuluttua subkutaanisen inokulaation ksenografteista molempien solujen tuli käsin kosketeltava. Yhdeksän hiirillä, joilla on KD tai SC -ksenografteja sitten jaettiin kolmeen ryhmään hoitoon glukoosilla (8 g /kg /päivä, Sigma), glukoosi ja insuliini (GI) (1 yksikkö per 3 g glukoosia /päivä, Wako) tai fosfaattipuskuroituun suolaliuosta (PBS) kontrollina hoitoon. Kukin näistä lääkkeistä annettiin intraperitoneaalisesti kolmeen hiiriin (kuusi kasvaimia yhteensä) 24 tunnin välein alkaen päivästä 1 päivään 11. Tänä aikana, kasvaimet mitattiin 2 kohtisuoraan mitat tämä paksuudeltaan joka neljäs päivä. Kasvaimen koko (

T

) arvioitiin suurin leikattu alue ja määritetään seuraavalla kaavalla:

T

= π /4 x

×

b

, jossa

on lyhyempi akseli (mm) ja

b

on pidempi akseli (mm). Hiiret tapettiin 12 päivää sen jälkeen, kun lääkehoitojen ja kasvaimet kerättiin myöhempää kokeilua.

halkaistut kaspaasi 3 immunohistokemia ja arviointiin apoptoosin

in vivo

pakastetut kasvaimia upotettu Tissue-Tek lokakuu Yhdiste. Nämä lohkot leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä. Antigeenin haku, kalvot kuumennettiin Tris-EDTA-puskuriin (pH 9,0), mikroaaltouunissa (500 W) 5 minuuttia. Sitten leikkeitä inkuboitiin anti-katkaistuun kaspaasi 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja DAKO Envision + System (Dako Cytomation, Glostrup, Tanska) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Signaalit visualisoitiin diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (0,02%). Arviointia varten apoptoosin, halkaistut kaspaasi 3-positiivisten solujen kanssa ruskeaväritteiset tumat laskettiin viidellä klo 400x suurennuksella ja keskimääräinen laskettiin. Immuunihistokemialliset ilmentyminen pilkkoa kaspaasi 3 oli sokeasti tarkastelee ja arvioi sertifioitu patologi (Dr. AN).

Tilastollinen

Aineisto analysoitiin ANOVA käyttämällä Prism 5 ohjelmistopaketti ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Sillä vertailuun kahden, erot Keskiarvot laskettiin Studentin

t-

testi ja Mann-Whitney

U

testi. Vertailua joukossa kolme tai useampia ryhmiä, Bonferronin post hoc testit tehtiin yksisuuntainen ANOVA. Arvo p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM.

Tulokset

HIF-1α Knockdown aiheuttamaa apoptoottista solukuolemaa alla hypoksia 58As9 mahasyövässä solujen

HIF-1α ilme oli arvioitava vakaa HIF-1α taintumisen (KD) solujen ja SC (kontrollina solulinja) solujen. Western blot-analyysi osoitti, että HIF-1α ilmentyminen oli täysin tippuu alas KD soluissa 8 tunnin kuluttua hypoksiaolosuhteissa verrattuna sc-solujen (kuvio 1A). Solu kuolleisuus arvioitiin 24 tunnin kuluttua 96 tunnin ajan normoksia ja hypoksiaa. Kuolleisuus oli korkeampi KD soluissa kuin SC punasolut normoksia 24 96 tuntia, mutta erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (kuvio 1 B). Sitä vastoin solun kuolleisuus KD soluissa voimakkaasti lisääntyneet hypoksia ja merkittävästi suurempi kuin havaittu SC-soluilla 72 ja 96 tuntia (kuvio 1C). Western blot-analyysi osoitti, että katkaistun kaspaasi 3 sekä sytosolin sytokromi c kohosivat KD soluissa, mutta ei SC soluissa hypoksiaolosuhteissa 8 tuntia (kuvio 1D ja 1E). Hypoksian solukuolema vahvistettiin myös muissa HIF-1α Knockdown mahalaukun syöpäsolujen 74-KD (S1 Kuva). Nämä tulokset osoittivat, että hypoksian voimakkaasti indusoi apoptoosin HIF-1α Knockdown solulinjassa KD.

(A) Western blot analyysi HIF-1α ilmentyminen suoritettiin SC tai KD soluja normoksia (20% O

2) ja hypoksia (1% O

2). Sisäinen merkki β-aktiini (β-act) oli yhtä ilmentyy kaikissa soluissa. (B), (C) Solujen kuolleisuus arvioitiin käyttäen SC soluja tai KD soluja normoksia (B) ja hypoksia (C) 0 h 96 h. Kuolleisuus verrattiin kohtaavat SC solujen ja KD soluja. N.S. .: ole merkittävä, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001. (D), (E) Western blot-analyysi (D) lohkaistiin kaspaasi 3 ja (E) sytosolin sytokromi c SC tai KD soluja normoksia ja hypoksia 8 tuntia.

Huuhtelu ROS kääntänyt apoptoottinen fenotyyppi havaittu HIF-1α knockdown solujen

solunsisäinen ROS taso arvioitiin ja verrattiin joukossa KD ja SC soluja. ROS taso kasvoi ajasta riippuva tavalla KD soluissa hypoksiaolosuhteissa, kun taso oli heikosti koholla SC soluissa (kuvio 2A). ROS tasolla KD-soluissa oli merkittävästi korkeampi hypoksiassa, ja 24-72 tuntia kuin SC-soluissa (kuvio 2A). ROS tasot arvioitiin myös 74-SC-solujen ja 74-KD soluja (S2 Kuva). ROS tasot eivät eroa 74-SC ja 74-KD-soluilla normoksia (S2A kuvio). Kuitenkin alle hypoksia, ROS tasot olivat merkittävästi korkeammat 74-KD soluissa kuin 74-SC soluja 48 72 tuntia (S2B kuvio). NAC, antioksidantti, vähensi ROS tasolla KD soluissa hypoksiaolosuhteissa 48 72 tuntia (kuvio 2B). Sen arvioimiseksi, onko ROS tuotanto aiheuttaa hypoksian indusoiman solukuoleman KD Solujen kuolleisuus tai ilman NAC arvioitiin KD soluja normoksia ja hypoksiaa. NAC hoito ei vaikuttanut nopeus solukuoleman KD punasolut normoksia (kuvio 2C). Sen sijaan, NAC hoito vähensi solukuolemaa KD soluja hypoksia ja 48-96 tuntia (kuvio 2D).

(A) ROS-tasot arvioitiin käyttämällä KD: n ja SC-soluja hypoksia 0 h 72 h. (B) ROS taso analysoitiin hypoksisiin KD soluissa tai ilman 5 mM NAC hoitoa 0-72 tuntia. (C) Solujen kuolleisuus arvioitiin KD soluissa tai ilman NAC alla normoksia (C) ja hypoksia (D) 0 h 96 h. KD-NAC (-): NAC-käsittelemätön KD soluihin, KD-NAC (+): NAC-käsiteltyjen KD soluissa. *: P 0,05, ***: p 0,001.

HIF-1α Knockdown vähensi hypoksinen induktion eri geenien säätelyyn ROS tuotanto

Tutkiakseen hypoksian indusoiman ROS kertymistä HIF-1α pudotus solujen mRNA: n ekspressio kymmenen geenien, jotka ovat mukana ROS ohjausmekanismi (

GLUT1

,

ALDOC

,

PDK1

,

LDHA

,

MCT4

,

BNIP3

,

BNIP3L

,

LON

,

COX4-2

ja

MnSOD

) analysoitiin käyttämällä RT-qPCR. Hypoksista induktio geenin ilmentyminen arvioitiin kertaiseksi induktio (FI). FIS kymmenessä geenit olivat merkittävästi alhaisemmat KD soluissa kuin SC-soluissa (kuvio 3). Lisäksi, kun rajoitettu hypoksisissa olosuhteissa, ilmentymisen tasojen kaikkien kymmenen geenit olivat merkittävästi alhaisemmat KD soluissa kuin SC-solut. Nämä tulokset osoittivat, että HIF-1α pudotus merkittävästi vähentynyt hypoksian indusoima kymmenen geenejä. Toisaalta, alle normoksia, ilmaus PDK1 ja BNIP3L oli merkitsevästi pienempi KD soluissa kuin SC soluissa. Päinvastoin, ekspressiotasot LON ja COX4-2 olivat merkittävästi korkeammat KD soluissa verrattuna SC-soluihin.

mRNA: n ekspression on GLUT1, ALDOC, PDK1, LDHA, MCT4, BNIP3, BNIP3L, LON , COX4-2 ja MnSOD kvantitatiivisesti arvioitava normoksia (mustat palkit) ja hypoksia (valkoiset pylväät) 24 tuntia. Ekspressiotasot on esitetty kaaviossa. Taitteen induktio (FI) arvioitiin ilmaus suhde hypoksian /normoksia ja esitetään pohjalle kuvaajat. Ilmentymistasojen kymmenen geenien KD soluja verrattuna ilmentymistasoihin SC soluja sekä normoksia ja hypoksiaa. ns: ei merkittävää, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001.

glukoosi ja insuliini hoitojen parannettu apoptoottisen solukuoleman KD soluissa hypoksiaolosuhteissa

tutkimme seuraavaksi edistäminen glukoosin otto vaikuttaa hypoksian aiheuttaman apoptoosin KD soluissa. Solun elinkelpoisuus arvioitiin KD ja SC soluissa hoitoja ohjaus (PBS), korkea glukoosi, insuliini tai runsaasti glukoosia plus insuliini (GI). Hypoksia-solukuolema arvioitiin taajuusmuuttajan. Solu kuolleisuus hypoksiaolosuhteissa verrattiin välillä verrokkihoito ja muut hoidot molemmissa solulinjoissa (kuvio 4). SC soluissa, ei merkittäviä eroja FI ja solujen kuolleisuus hypoksiaolosuhteissa havaittu joukossa jonkin hoidoista (kuvio 4A). Vuonna KD solujen FI kasvatti merkittävästi hypoksian kaikissa käsittelyissä. Erityisesti GI käsittely tuotti korkeimman FI kaikkien hoitojen (kuvio 4B). Solun kuolleisuus hypoksiaolosuhteissa oli merkitsevästi korkeampi GI-käsiteltyjen solujen kuin kontrolliryhmässä-käsiteltyjen solujen (kuvio 4B). Tutkia, onko hoidot vaikuttanut ROS tuotanto, ROS taso analysoitiin KD soluissa. Verrattuna happiolosuhteissa, ROS taso oli merkittävästi koholla KD soluja hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 4C). Hypoksiaolosuhteissa, ROS taso KD soluissa lisääntyi merkitsevästi korkea glukoosi, insuliini ja GI hoitoa verrattuna ohjata hoitoon. Korkeimman ROS taso positiivisesti havaittiin GI-käsiteltyjen KD-soluissa (kuvio 4C).

FI kennon kuolleisuus määritettiin kuoleman suhde hypoksian /normoksia. Solun kuolleisuus PBS-käsitellyn (kontrolli), korkea glukoosi ja /tai insuliinia käsiteltyjen SC-solujen (A) ja KD-soluja (B) on piirretty. FI-arvo esitetään pohjassa. Solu kuolleisuus hypoksisissa olosuhteet verrokkihoito verrattiin korkea glukoosi, insuliini ja GI hoitoa. (C) Solunsisäinen ROS tason valvonta-käsitelty, korkea glukoosi ja /tai insuliinihoitoa saaneista KD solut piirretään kuvaaja. ROS tasot KD solut käsiteltiin kontrolli-hoidon jälkeen verrattiin normoksia (mustat palkit) ja hypoksia (valkoiset pylväät). ROS taso hypoksisten KD solut kontrollikäsittely edelleen verrattiin korkea glukoosi, insuliini ja GI hoitoa. ns: ei merkittävää, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001.

arviointi glukoosin oton jälkeen insuliinihoitoa

glukoosin oton kyky analysoitiin joka 2DG sisällyttäminen tutkimus. SC ja KD soluja normoksia, The 2DG inkorporaatio merkittävästi kohonnut jonka 2DG hoitoa verrattuna käsittelemättömiin soluihin. 2DG sisällyttäminen lisäsi edelleen lisäksi insuliinihoitoa sekä soluissa (kuvio 5A). Verrattuna normoksia, hypoksia voimakkaammin edistänyt 2DG sisäänottoa SC solujen kanssa tai ilman insuliinia (kuvio 5B). Samanlaisia ​​havaintoja havaittiin KD soluissa hypoksiaolosuhteissa (kuvio 5B). Kuitenkin alle hypoksia, vähemmän 2DG otettiin osaksi KD soluihin kuin SC solujen kanssa tai ilman ylimääräisiä insuliinihoito (kuvio 5B). Arvioida mekanismi insuliinista riippuvaisen glukoosin oton, kalvomainen ilmentyminen GLUT1 analysoitiin KD soluja normoksia ja hypoksiaa. Under normoksia, kalvomainen GLUT1 ilmentyminen koholla runsaasti glukoosia ja /tai insuliinihoitoa verrattuna, että ilman hoitoa (kuvio 5C). Verrattuna tilanteeseen, alle normoksia, hypoksiaolosuhteissa, kalvomainen GLUT1 ilmentymistä kohonnut kaikissa käsittelyissä. Lisäksi ekspressio lisääntyi runsaasti glukoosia ja /tai insuliinihoito verrattuna, että mitään hoitoa (kuvio 5C). Erityisesti kalvo GLUT1 ekspressio voimakkaimmin kasvoi runsaasti glukoosia ja insuliinia (GI) käsittely hypoksia KD-soluissa (kuvio 5C). Toisaalta, ilmaus toisen GLUT perheen, GLUT3, on heikosti havaittiin KD-soluissa, ja tätä havaintoa ei muuteta näiden joukossa erilaisia ​​hoitoja (tuloksia ei ole esitetty). Tässä tutkimuksessa GLUT2 ja GLUT4 ei ilmaistu KD soluissa.

(A), (B) toinen 2DG oton tason SC soluissa tai KD soluja tai ilman insuliinihoitoa arvioitiin alle normoksia (A) ja hypoksia (B). (C) Western blot analyysi kalvo GLUT1 (54 kDa) ilmaisun KD solujen ohjaus, korkea glukoosi ja /tai insuliinin hoitoja alla sekä normoksia ja hypoksiaa kuten. ***: P 0,001.

HIF-1α Knockdown plus GI hoito suppressoi voimakkaasti kasvua kasvaimen nude-hiirissä

Lopuksi määritimme

in vivo

vaikutus GI hoidon KD ja SC tuumoriksenografteissa. Kuvio 6A osoittaa kokeellisen suunnittelun ksenograftin hiirimallissa. Kymmenen päivän kuluttua ihon alle rokotus SC tai KD soluja, ksenograftit kasvatettiin selkään nude-hiirten. Tässä vaiheessa, Western blot-analyysi vahvisti HIF-1α ilmentymistä SC kasvaimissa, mutta ei KD kasvaimissa (kuvio 6B). Sen jälkeen kolme lääkettä, joka koostuu PBS: ää, glukoosia tai GI, injektoitiin intraperitoneaalisesti nude-hiirillä, joilla on SC tai KD kasvain (päivittäin päivästä 1 päivään 11). Edustaja kuvia kasvaimen kantavien hiirten, jotka oli käsitelty PBS: llä (SC-PBS: llä ja KD-PBS), glukoosi (SC-glukoosi ja KD-glukoosi) tai GI (SC-GI ja KD-GI) on esitetty kuviossa 6C . KD-glukoosi ja KD-GI kasvaimet näytti olevan pienempi kuin muut tuumorit. Kuvio 6D osoitti kasvukäyrän 6 kasvaimia. Koot KD-glukoosi ja KD-GI kasvaimet olivat merkittävästi pienempiä kuin KD-PBS kasvain päivänä 12. KD-GI kasvain oli pienin. Toisaalta, SC hiirillä ei ollut merkittävää eroa koko SC-PBS, SC-glukoosi ja SC-GI kasvaimet (kuvio 6D). Immunohistokemiallinen analyysi pilkottiin kaspaasi 3 suoritettiin arvioimaan indusoiman apoptoosin glukoosia tai GI hoitoon. Positiivinen ilmaus pilkkoa caspase3 oli usein havaittiin KD-glukoosi ja KD-GI kasvaimet (kuvio 6E). Kuitenkin kaikki KD kasvaimia esiintyi jonkin verran katkaistun kaspaasi 3 (kuvio 6F). Sitä vastoin ei ollut merkittävää eroa ilmentymisen pilkottiin kaspaasi 3 joukosta SC-PBS, SC-glukoosi ja SC-GI kasvaimia. Vuonna KD kasvaimia, positiivinen ilmaisu katkaistun caspase3 oli merkitsevästi korkeampi KD-PBS kasvain kuin SC-PBS kasvain. Lisäksi ilmaisu katkaistun caspase3 oli merkitsevästi korkeampi KD-glukoosi tai KD-GI kasvaimia kuin KD-PBS kasvain. Korkeimmat ilmentyminen havaittiin KD-GI kasvain.

(A) Kokeellinen aikataulu glukoosi (G) tai glukoosi plus insuliini (GI) kohtelu tuumoriksenograftien. Alkuperäinen vatsaonteloon (i.p.) injektiota kontrolli-PBS tai glukoosi, GI osoitetaan tyhjä kolmio. I.p. injektiot on merkitty nuolilla. Kasvaimet korjattu päivänä 12 on merkitty verkkomainen kolmio. (B) Western blot analyysi HIF-1α, että ksenografteissa SC-solujen (SC kasvain) ja KD-solut (KD kasvain). (C) Kuvat ovat SC tai KD kasvaimia hoidettiin PBS, glukoosi tai GI. Käsitellyt kasvaimet nimettiin SC-PBS, SC-glukoosi, SC-GI, KD-PBS, KD-glukoosi ja KD-GI. (D) koko 6 kasvainten päivästä 1 päivään 12 piirrettiin kaaviossa esitetyllä tavalla.