Krooninen sairaus

tiivistelmä

Bortetsomibi /PS-341 /Velcade, proteasomin estäjä, on laajalti käytetty hoitoon useita myelooma. Vaikka useat mekanismit sytotoksisuus lääkkeen ehdotettiin, todellinen mekanismi on edelleen heikko. Meidän tavoitteena oli tunnistaa vaikuttavien geenien sytotoksisuus Bortetsomibi fissioreaktiossa hiiva

S.pombe

, että lääke estää tämän organismin solun jakautumisen syklin kuin proteasomin mutantteja. Niistä 2815 geeneistä seulottiin (joka kattaa 56% koko ORF), 19 geenejä, joiden poistot aiheuttaa voimakasta synteettistä kuolleisuutta kanssa Bortetsomibi, tunnistettiin. Tuotteet on 19 geenien mukana neljä ubikitiinipromoottori entsyymejä ja yksi ydin- proteasomin tekijä, ja 13 heistä ovat säilyneet ihmisillä. Tuloksemme antavat hyödyllistä tietoa ymmärtämiseksi toiminnasta Bortetsomibi solujen sisällä.

Citation: Takeda K, Mori A, Yanagida M (2011) tunnistaminen vaikuttavien geenien myrkyllisyyden Anti-Cancer Drug Bortetsomibi Genome-Wide seulonta

S. pombe

. PLoS ONE 6 (7): e22021. doi: 10,1371 /journal.pone.0022021

Editor: Michael Polymenis, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 08 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Takeda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: KT oli taloudellista tukea tutkimusta myöntäminen Astellas Foundation for Research Metabolic Disorders (https://www.astellas.com/jp/byoutai/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ubikitiini /proteasomireitillä reitti on merkittävä proteolyyttinen koneet soluissa ja on keskeinen roolit solunjakautumisen aikana, apoptoosin, jne [1]. Näin ollen, tämän reitin pidetään vahva potentiaalinen kohde kliinisen hoidon sairauksia, kuten syöpää, ja kemikaaleja, jotka moduloivat ubikitiinipromoottori /proteasomi-reitin on tutkittu intensiivisesti [2], [3]. Bortetsomibi /PS-341 /Velcade on peptidi, boronihappo, joka estää kymotrypsiinin kaltainen aktiivisuus beta 5 alayksikköä proteasomin

in vitro

. Bortetsomibi on vahva potentiaali antituumorivaikutuksia in

in vitro

ja eläinkokeista ja on kehitetty kuin syöpälääke hoitoon useita myelooma ja muut syövät [3], [4]. Inhiboivaa proteasomista aiheuttaa dalmatialaistäpläisiä. Näin ollen, useita mekanismeja sytotoksisuuden Bortetsomibi on ehdotettu, kuten inhibitio anti-apoptoottisten proteiinien stabilointi p53, häiriöitä solusyklin etenemisen, jne [5]. Lisätä tietämystä mekanismeja anti-kasvain ja haittavaikutuksia Bortetsomibi, se hyödyttää geenien tunnistamiseksi, joissa on sytotoksisuutta tämän lääkkeen. Edelläkävijä pyrittäessä määrittelemään tällaisia ​​geenejä raportoivat Lightcap ryhmä vuonna 2010 [6].

Ydinfissioon hiiva

Schizosaccharomycespomben

on yksinkertainen yksisoluinen eukaryoottien ja sitä on käytetty mallina organismi perus solubiologian, koska sen geneettinen jäljitettävyyden ja sen samankaltaisuus korkeampien eukaryoottien. Kirjasto 2815 geeniä poistettu kantoja on saatavilla genominlaajuisten tutkimukset lääkeaineen herkkyys [7], [8], [9].

Täällä pyritty tunnistamaan evolutionally säilyneitä vaikuttavien geenien sytotoksisuuteen Bortetsomibi hyödyntämällä geenin-poisto kirjasto

S. pombe

ja vakiintunut menetelmä suorittamaan genominlaajuisten synteettinen tappava seulonta kanssa Bortetsomibi. Niistä 2815 geenit seulottu, poistetaan kannat 19 geenien oli voimakas synteettinen kuolleisuutta kanssa Bortetsomibi (esim geenejä jäljempänä nimetty synteettinen tappava kanssa Bortetsomibi, SLB). Niistä 19 SLB geenit, 13 ovat säilyneet hiivasta ihmisen ja sisällyttää tekijöiden vuorovaikutusta ubikitiini /proteasomin riippuvainen proteolyysin, kromatiinin hiljentäminen, ydin- /sytoplasmisen kuljetus, aminohappo ja vitamiini aineenvaihduntaa, vesicular kaupan, RNA aineenvaihduntaa jne

tulokset

Mitoottista pidätyksen ja epäonnistumisen kromosomi eriytymistä aiheuttama Bortetsomibi

Huomasimme, että Bortetsomibi (LC Laboratories) esti leviämisen

S. pombe

, kun MG132, aito proteasomin estäjä nisäkässoluissa ei estänyt proliferaatiota (kuvio S1). Sitten tutkittiin taso poly-ubikitinoitu proteiinien läsnä ollessa tai poissa ollessa Bortetsomibi (kuva S1). Log-vaiheen viljelmät kerättiin 0, 4, ja 9 tuntia, kun on lisätty 1 mM Bortetsomibi ja yhteensä proteiinit uutettiin immunoblot-analyysillä. Läsnä ollessa Bortetsomibi, poly-ubikitinoituja proteiinien kertynyt aika-riippuvaisella tavalla. Siksi, päättelimme, että Bortetsomibi estää tehokkaasti solujen lisääntymistä ja proteolyyttinen aktiivisuus proteasomin

S. pombe

.

Lämpötila mutantteja proteasomeja komponenttien (

mts3-1

varten Rpn12 of 19S sääntelyn hiukkas- ja

mts2-1

varten Rpt2 of 19S sääntelyn hiukkasen ) on pidätetty M vaiheessa johtuen eston hajoamisen mitoosi sääntelyviranomaisten kuten CDC13 (sykliini) [10], [11]. Tämä havainto sai meidät tutkimaan yksityiskohtaisesti, miten Bortetsomibi vaikuttaa solusyklin. Kun olet lisännyt Bortetsomibi puoliväliin log-vaiheen viljelmiä, solujen pitoisuudet ja elinkelpoisuus mitattiin ajan kuluessa (kuvio 1A). Solujen lisääntyminen lopulta lakkasi ja elinkelpoisuus aleni 21, 10, ja 4,7% 4, 6, ja 9 tuntia lisäämisen jälkeen Bortetsomibi. Ilman Bortetsomibi solut jatkettiin jakamalla ja jatkuva kannattavuus. Tutkia, miten solusyklin vaikuttivat Bortetsomibi, kromatiinin DNA, mikrotubulukset, ja kara napa elimet (SPB: homologinen sentrosomimäärän) visualisoitiin vihreää tai punaista fluoresoivaa proteiinia koodauksen histoni H2A (for chromatin), alfa-tubuliinin (microtuble) ja Sid4 proteiini (SPB, hiiva vastaava sentrosomimäärän, esitetty piste kuviossa 1C) vastaavasti. Suhde solujen ylikondensoitunut kromosomien ja metafaasissa karat oli suurin (30%) 1 tunnin kuluttua Bortetsomibi lisäksi laskivat sen jälkeen (kuvio 1 B ja 1 C-a). Koska suhde metafaasisoluihin väheni, suhde solut siirtymään tumaan kasvoi (kuvio 1 C-b), jossa sisko kromatidia ei erotettu, ja tuma siirtymään päässä keskustasta. Koska suhde ”joutuneiden ytimien” oli korkeimmillaan 4 h ja laski sen jälkeen, tumattomaan solut ja solut jättiläinen tuma kasvoi (kuvio 1 B ja C-c). Tämä oli todennäköisesti seurausta sytokineesin valmistuu solut joutuneita tuma. Niinpä läsnäollessa Bortetsomibi solut lyhyesti pidätettiin metafaasissa, pysty erottamaan sisar-kromatidia, ja kannattavuus oli menetetty. Nämä fenotyyppejä aiheuttama Bortetsomibi ovat käytännössä samanlaiset mitoottisiin aiheuttamia vikoja

mts2-1

, lämpöherkkä mutaatio Rpt2 alayksikössä 19S hiukkasen [10]. Kun kyseessä on

mts3-1

mutaatio (Rpn12 of 19S), metafaasissa pidätys fenotyyppi on ankarampi; 75% soluista lyhyesti pidätettiin metafaasissa [11]. Molemmissa tapauksissa metafaasissa pidätys on ajallinen ja tuma siirretään myöhemmin esitetyllä tavalla tapauksessa bortetsomibihoidon. Koska vika metafaasivaiheen /Anaphase siirtyminen johtuu proteolyysin inhibition, ubikitinoituja substraatteja Proteasomin kuten CDC13 (sykliini) pitäisi kertyä [12]. Tämän tutkimiseksi soluihin, jotka ektooppisesti ilmaistu heksa-histidiini (His6) hännitetty ubikitiini valmistettiin ja viljeltiin läsnä tai poissa ollessa Bortetsomibi 4 h 26 ° C: ssa. Proteiinit uutetaan sitten molemmissa kulttuureissa denaturoivissa olosuhteissa 6 M guanidiini-HCl: a, ja tuloksena uutteet sovellettu TALON helmiä (Clontech), jotka absorboivat His6 tunnisteen, puhdistaa ubikitinoituja-proteiineja. TALON puhdistettiin proteiinit analysoitiin immunoblot käyttämällä vasta-ainetta CDC13 (kuvio 1 D). Läsnä ollessa Bortetsomibi, multi-ubikitinoituja CDC13 havaittiin, kuten on raportoitu lämpötila-mutantteja Proteasomin [12]. Nämä tulokset osoittivat, että kemiallisen inhibiittorin proteasomia voidaan käyttää korvaamaan ts proteasomin mutantteja. Tämä lääke voi olla hyödyllistä analysoida fenotyypit proteasomin-vika alhaisessa lämpötilassa, esimerkiksi meioosi tai kokeissa, joissa lämpöisku- vasteita tulisi välttää. Siksi annoimme Bortetsomibi edelleen geneettisen seulonnan tunnistaa geenejä, jotka vaikuttavat proteasomaalisten toimintahäiriö fenotyyppi.

(A) Bortetsomibi (1 mM) esti solujen lisääntymistä. Pitoisuudet soluissa ja elinkyvyt esittelyyn. BZ: Bortetsomibi (B) Bortetsomibi (1 mM) esti normaalin etenemisen M vaihe. Käyrä osoittaa suhde solujen metafaasivaiheeseen karat ja ylikondensoitunut kromosomien (sininen, solut kuvassa 1C-

), solut joutuneiden tuma (punainen, kuva 1C-

b

), solut ilman tuma ja jättiläinen tuma (oranssi, kuva 1C-

c

), ja solujen kromosomi repiä septumin (vihreä, kuva 1C-

d

, ja

e

). (C) kromosomit, mikrotubulukset, ja SPB havaittiin läsnä Bortetsomibi. Soluja, jotka osoittivat mitoosi poikkeavuuksia kirjeenvaihtaja kuviossa 2B on esitetty a-e (ylempi paneeli: + BZ). Kuvia tavallisen solunjakautumisen esitetään alempi paneeli (-BZ). Bar = 10 um (D) Poly-ubikitinoituja sykliini /CDC13 kertynyt läsnä Bortetsomibi. Katso teksti yksityiskohtia.

Proteasome liittyvät mutantit ovat yliherkkiä Bortetsomibi

Ennen kokonaisarvioinnin, tutkimme miten Bortetsomibi sytotoksisuus vaikuttaa mutaatiot liittyvät ubikitiinipromoottori /proteasomin järjestelmään. Verrattuna villityypin viisi proteasomin liittyvien mutanttien seuraavasti:

mts2-1

,

mts3-1

,

pts1-727

(mutatoitu beta 5 alayksikön 20S monimutkainen [13]),

ump1-620

(mutatoitu 20S kypsymistekijä Ump1 [13]), ja

Δcut8

(geeni-deleetiomutanttia

cut8

+

tarvittaviin toimiin ydinvoiman lokalisoinnin proteasomin [14], [15]). Kutakin kantaa inkuboitiin rikas KYLLÄ agar levy muodostaa pesäke ja sitten täplittäin agarmaljoille, jotka sisälsivät 0, 100, 250 tai 500 uM Bortetsomibi avustamana robottijärjestelmästä (roottori, Singer, UK). Jälkeen 3 päivää inkuboinnin 26 ° C: ssa, pesäkkeiden muodostumisen mahdollisuuden kunkin tahra arvioitiin (kuvio 2A ja B). Villityypin muodostivat pesäkkeitä kaikki levyt, kun taas proteasomin liittyvät mutantit olivat puutteellisia pesäkkeitä muodostuminen Bortetsomibi levyille (

Δcut8

100 uM ja toiset 500 uM). Selkeä yliherkkyyttä

Δcut8

bortetsomibille johti meidät hyväksymään edellä kuvatun menetelmän edelleen genominlaajuisten seulonta synteettisten tappavan mutantteja Bortetsomibi.

(A) strategia synteettisiä tappava seulontaan ( B) Mutants komponenttien ubikitiinipromoottori /proteasomireitillä reitin ovat yliherkkiä Bortetsomibi. Kahdeksan pesäkettä kutakin kantaa oli replika-maljattiin agarmaljoille, eri pitoisuuksilla Bortetsomibi ja inkuboitiin 3 päivää 26 ° C: ssa. (C) Tiivistelmä synteettisiä tappavan seulonnan kanssa Bortetsomibi. Katso teksti yksityiskohtia. (D) validointi eristetyn mutanttien, joissa oli kasvuhäiriöt 100 uM Bortetsomibi tunnistamalla 5-kertainen sarjalaimennoksia vegetatiivisen solujen kasvuun.

Genominlaajuiset synteettinen-tappavien seulonnan Bortetsomibi

tunnistamiseksi vaikuttavien geenien sytotoksisuutta bortetsomibia

S. pombe

seuloimme 2815 geeni-häviämämutantit synteettisille kasvun estoa KYLLÄ agarmaljoille kanssa Bortetsomibi käyttämällä robotti-avusteisen replica plating. Primäärisestä seulonnasta, 59, 62, ja 135 kantaa eristettiin, joka oli kasvuhäiriöt media 100, 250, ja 500 uM Bortetsomibi, vastaavasti. Ei ollut mitään selkeää Bortetsomibi kestävä mutantti, joka kasvoi nopeammin kuin villikannan 500 uM Bortetsomibi välineellä. Yhteenveto seulonta on esitetty kuviossa 2C (esimerkkejä raaka tulokset seulontaan ja listan geenit on esitetty kuvassa S2 ja taulukko S1). 59 kantoja, jotka oli kasvuhäiriöt 100 uM Bortetsomibi testattiin uudelleen pipetoimalla 5-kertainen sarjalaimennoksia log-vaiheen viljelmiä kummastakin kannasta (10 solujen 6250 soluihin) päälle KYLLÄ levyt ja ilman Bortetsomibi (kuvio 2D). Suoritimme nämä retests kahtena kappaleena. Tämän seurauksena 19 geeni-häviämämutantit toistettavasti osoitti kasvun vikoja KYLLÄ levyjen 100gM Bortetsomibi. Seitsemäntoista ja 12 kannat osoittivat kasvuhäiriöt 250 ja 500 uM Bortetsomibi, vastaavasti. Loput mutanttien ei osoittanut selkeää kasvuhäiriöt kanssa Bortetsomibi on tiputtelua testissä. Mikään mutantit testattiin pienemmillä annoksilla (1 nM-10pM) bortetsomibin osoitti merkittävää kasvuhäiriöt (kuva S3). Siksi hyväksyimme 100 uM pitoisuuden Bortetsomibi yliherkkyydestä seulontaan

S.pombe

mutanttien meidän olevassa tutkimuksessa, vaikka edellisessä ja samanlainen tutkimus ihmisen soluja, 4.-7-nM pitoisuus Bortetsomibi käytetyt seulontaan [6].

19 geenit kasvoi selvästi vikoja 100pM Bortetsomibi levyt tiputtelua testissä luokiteltiin mukaan toiminto: viisi kuului ubikitiinipromoottori /proteasomireitillä polku, neljä ydinaseiden /chromatin proteiineja ja ydinvoiman kuljetus, kolme vesicular liikennettä, kolme aminohappoon ja vitamiineja aineenvaihduntaa, kolme RNA aineenvaihduntaa, ja proteiinikinaasi A: n (taulukko 1). Taulukossa 1 luetellaan järjestelmällinen nimet, ensisijainen nimet (tarvittaessa), orastava hiiva

Saccharomyces cerevisiae

ja ihmisen ortologeja, ja lyhyt kuvaus kustakin SLB geenin. Niistä 19 SLB geenit, 13 geenit on raportoitu olevan potentiaalisia ortologeihin ihmisissä.

Keskustelu

Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että Bortetsomibi, estäjä proteasomin laajalti käytetty anti-syöpälääkkeen, estää tehokkaasti leviämisen

S.pombe

ja indusoi mitoosi pidätys sekä lämpöherkkä mutaatioiden proteasomaalisten alayksiköiden. Yhdeksäntoista geenideleetion mutantit tunnistetaan genominlaajuisia seulonta olla synteettisiä tappava kanssa Bortetsomibi.

Huolimatta vahvasta vaikutuksesta Bortetsomibi pidättämään solusykliä, toinen proteasomin estäjä, MG132, oli heikompi estovaikutusta proliferaation tässä tutkimuksessa. MG132 on kuitenkin raportoitu estävän protesome riippuvaisen proteolyysin solulysaatin

S.pombe

, mikä osoittaa, että proteasomin on

S.pombe

on herkkä tämän inhibiittorin [16]. In

S. cerevisiae

, MG132 käytetään estämään proteolyysiä

in vivo

alle geenin poistaminen PDR5, suuret lääkeaineen effluksipumpun, joka saattaa tehokkaasti erittää MG132 solusta [17].

S.pombe

omistaa kaksi PDR5 ortologit, Pdr1 ja Bfr1. Ero vaikutuksia Bortetsomibi ja MG132 saattaa johtua niiden erot solujen läpäisevyys tai tehoa erittyminen huumeiden effluksipumppujen. Bortetsomibi voi olla hyödyllinen väline tutkia ubikitiinipromoottori /proteasomireitillä väylän

S.pombe

.

Suoritimme synteettinen-tappavia näytön geenien tunnistamiseksi, jotka vaikuttavat herkkyys bortetsomibi käyttäen 2815 geeni-deleetiomutantteja

S. pombe

. Yhdeksäntoista deleetiomutantteja tunnistettiin, joilla on vaikea kasvuhäiriöt indusoi 100 uM Bortetsomibi (lueteltu taulukossa 1 ja kuva 3). Viisi vastuullisen geenien (nimetty SLB) olivat ubikitiini /proteasomin liittyvä: pof3, cul3, mug30, ubp16 ja cut8. Heidän synteettinen kuolleisuutta kanssa Bortetsomibi saattavat selittyä kautta lääkkeen estävä vaikutus vastaan ​​proteasomin. Esimerkiksi ubikitiini ligaasit tarjoavat substraatteja proteasomi jotta vähenemässä molemmat saattavat aiheuttaa vakavia synteettisiä vaikutuksia. Toiset ei ole raportoitu liittyvän proteasomi toiminto. Kuitenkin jotkut SLB geenit voivat edelleen selittää kautta proteasomin toimintoja. Kolmen vesicular kaupan SLB geenejä (sec28, ftp105, ja ryh1), puutteet Erittymisreittiin vedota ER (Endoplasmakalvosto) stressi, jotka voivat parantaa vaatimus proteasomiaktiivisuus [18]. Yksi vesicular kaupan SLB geenejä, ftp105, koodaa Golgi paikallistamiseksi proteiinia, joka oli raportoitu vuorovaikutuksessa deubiquitinase Usp5 ja vaadita Golgi’n Usp5 [19]. Ihmisen ortologi Ftp105 on C17orf28 /DMC1 (alassäädetty useita syövät), mahdollinen tuumorisuppressori [20]. Siksi synteettinen kuolleisuutta ftp105 poistoa Bortetsomibi tutkitaan edelleen tulevaisuudessa. Ryh1 raportoitiin äskettäin säännellä TORC 2 (rapamysiinin kohde kompleksin 2) on

S.pombe

[21]. Joka koskee ydinaseiden SLB proteiineja, enemmän proteasomin saattaa olla tarpeen, jos kromatiinin dynamiikkaa vaarantuu deleetiomutantteja kromatiinin sääntelyviranomaisten, kuten ydin- proteasomin tiedetään osaltaan chromatin asetuksia kuten DNA-vaurioiden korjaus, DNA: n kahdentuminen, ja transkriptio [15], [22 ], [23], [24]. Yksi ydin- SLB geenituotteiden on Rik1, komponentti CLRK ubikitiinipromoottori ligaasia monimutkaisia ​​tarvitaan kromatiinin hiljentäminen [25], [26]. Vaikka substraatteja CLRK ubikitiinipromoottori ligaasilla ei tunneta, se voi olla utelias kokeilu tutkia Bortetsomibi vaikuttaa DNA chromatin hiljentäminen. PKA oli raportoitu liittyvän metafaasissa /Anaphase asetusten fissio hiiva ja Xenopus-muna järjestelmät

in vitro

[12], [27], [28]. Kun taas jotkut muut SLB geenejä, kuten vitamiini metaboliset tekijät, on vaikea selittää, ne saattavat olla osallisina yksi hyvin erilaisia ​​solujen toimintoja proteasomin. Bortetsomibi voi mahdollisesti olla tavoitteita kuin proteasomin soluissa on

S. pombe

. Siten arviointi SLB geenien ilmeisesti liity ubikitiinipromoottori /proteasomin olisi syytä katsoa muihin kohteisiin. Yhdistelmä SLB geenin poistamisen ja proteasomaalisten lämpöherkkiä mutaatiot on hyötyä arvioida, onko synteettinen kuolleisuutta johtuu esto proteasomin tai muihin häiriöiden aiheuttamia Bortetsomibi. Jos synteettinen kuolleisuutta johtuu esto proteasomin, kaksinkertainen mutantti SLB geenin ja proteasomin odotetaan näyttävän paljon ankarammat fenotyyppi kuin yhden proteasomaalisten mutantti. Itse asiassa, mutantin

cut8

, joka on SLB geeni, osoittaa synteettisen kuolleisuutta on proteasomaalista mutaatioita

mts2-1

ja

mts3-1

[14]. Vaikka olisi pidettävä mielessä, että Bortetsomibi on toinen kohde, esillä olevat tulokset ovat potentiaalisesti merkittäviä vaikutuksia perus- proteasomin biologian avaamalla mahdollisuuksia löytää uusia ja odottamattomia suhteita proteasomista ja muiden solureiteillä. Samanlainen genominlaajuisten näytön ihmisen soluissa ehdotti, että proteiini käännökset, ER /Golgin koulutusjakson, DNA vahinkosaneeraus koulutusjakson, ja sääntely Myc ja polyamiinit osallistuvat Bortetsomibi-solukuolema [6]. Havainnot Tämän tutkimuksen äskettäin viittaavat siihen, että geenit osallistuvat vitamiinin ja aminohappo metaboliareitteihin, kromatiinin hiljentäminen, ydin- /sytoplasma shuttling, ja cAMP-reitin liittyvät proteasomin fissioreaktiossa hiiva

S.pombe

. Siksi edelleen on pyrittävä ymmärtämään mekanismeja synteettisen kuolleisuutta näitä odottamattomia SLB geenin deleetioiden kanssa Bortetsomibi.

Kolmetoista säilyneitä SLB geenit näkyvät punaisella.

Havaitsimme 13 säilytetyn SLB geenit mahdollisesti kiinnostavia lisätutkimuksiin. Kuten edellä Tulokset, 4-7 nM Bortetsomibi käytettiin näytön vaikuttavien geenien sytotoksisuus Bortetsomibi syöpäsolulinjoissa, ja 100 uM Bortetsomibi käytettiin

S.pombe

mutantti seulonta esillä olevassa tutkimuksessa . Ero Bortetsomibi herkkyys saattaa heijastaa eroa biologian näiden eliöiden, kuten huumeiden läpäisevyyttä ja lääkkeen erittymistä. Yleensä hiivasolut ovat vastustuskykyisempiä häiriöitä kemiallisella inhibiittorit. Siksi ihmisen ortologeihin konservoituneiden SLB geenien olisi tutkittava pienet häiriöt-RNA onko heidän Knockdown vaikuttaa selviytymiskykyä ihmissolujen alemmilla annoksilla Bortetsomibi. Jos sama synteettinen vaikutuksia esiintyy ihmisen soluissa, kuten SLB geenit on potentiaalia innovaatio uusien hoitojen tai diagnooseja. Jos esimerkiksi kemiallisia estäjiä Näiden konservoituneiden SLB tuotteita kehitetään kyseisiä kemikaaleja on ehdokkaita käyttää cocktail hoidon Bortetsomibi. Toisaalta, jos potilaalla on geneettisesti heikko tausta johtuen nämä SLB ortologeihin saattaa olla vakavia haittavaikutuksia, kun Bortetsomibi annon. Siten lisäselvityksiä SLB ortologeihin ihmisen odotetaan tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Strain, keskikokoinen, kulttuuri, ja lääkehoitoja

S. pombe

heterothallic haploids 972

h

–

ja 975

h

+

ja niiden johdannaisia ​​käytettiin. Täydellinen rikas YE, YES ja minimaalinen EMM2 mediaa käytettiin [29]. Kantaliuoksia Bortetsomibi (LC Laboratories, Woburn, MA) valmistettiin DMSO: hon ja huumeiden lisättiin nestemäistä kulttuuriin tai agaralustalla osoitettu pitoisuus.

Synthetic tappava seulonta

genominlaajuisten seulonta, otimme poistamisen kirjaston

S. pombe

haploid ostettu Bioneer Corp. (Korea). Ohjaus villityypin kannat ovat ED666 (

h

+ ade6-M210 Ura4-D18 leu1-32

) ja ED668 (

h

+ ade6-M216 Ura4-D18 leu1-32

), joka hankittiin myös Bioneer Corp. haploid geeni-poisto kirjasto palvelee glyserolikantaliuokset 96-kuoppalevyillä. Ensinnäkin, 5 ui kutakin varasto deleetiokanta bongattiin päälle YES levyt 96-kuoppalevylle käyttäen laboratorion automaatiojärjestelmä BioMek FX (Beckman Coulter, Brea, CA). 3 päivän inkuboinnin 26 ° C, pesäke Kunkin kannan poimittiin ylös ja huomasi toiselle KYLLÄ levy (katsotaan äiti levyt) käyttäen roottoria robottia (Singer Instruments, UK). Yksi pesäke quadruplicated tarkistaa toistettavuutta. Äidiltä levyt, täplikäs pesäkkeet jälleen nouto ja täplittäin YES levyille, jotka sisälsivät 0, 100, 250, ja 500 uM Bortetsomibi, vastaavasti. Laikullinen levyt eri pitoisuuksia lääkkeen inkuboitiin 3 päivää 26 ° C: ssa ja pesäkkeiden muodostuminen kunkin kannan arvioitiin. Sillä validointi ensisijaisen seulonta, Bortetsomibi herkkyydet valittujen kantojen päässä seulontakokeista testattu uudelleen käyttämällä tiputtelua testejä.

Immunoblotvärjäys ja proteiinien puhdistuksessa

immunoblottausanalyysillä, koko proteiinit eristettiin käyttäen trikloorietikkahappoa (TCA) menetelmällä. Identtiset määrät proteiineja erotettiin SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Anti-poly-Ubiquitin (FK-2, hiiri monoklonaalinen, MBL, Japani), anti-alfa-tubuliinin (TAT1, hiiri monoklonaalinen, lahja Dr. Gull) ja anti-CDC13 (kaniinin polyklonaalinen) käytettiin ensisijaisena vasta-aineita. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita ja ECL chemiluminescence-järjestelmän (GE Healthcare) käytettiin monistamaan signaali ilmentymisen. Puhdistamaan ubikitinoituja proteiineja, edellä kuvattu menetelmää sovellettiin pienin muutoksin [15].

loisteputki mikroskopia

Kaikki kuvat hankittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia asetus Axioplan 2 (Zeiss, Saksa). Menetelmät rakentaminen GFP tai RFP fuusioidun geenin aiemmin kuvattu [30].

tukeminen Information

Kuva S1.

Bortetsomibi estää leviämisen

S.pombe

. (A) Bortetsomibi ja MG-132 lisättiin log-vaiheen kulttuurin

S. pombe

ilmoitettuina pitoisuuksina ja soluproliferaatiota tutkittiin 8 tuntia. Fold-kasvaa 8 tunnin kuluttua lääkkeen lisäksi on esitetty Y-akselilla. (B) tasot poly-ubikitinoituja proteiinit tutkittiin, kun läsnä (+) tai puuttumista (-) 1 mM Bortetsomibi. Poly-ubikitinoituja proteiinien kertynyt ajasta riippuva tavalla lisäämisen jälkeen Bortetsomibi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0022021.s001

(TIF)

Kuva S2.

Esimerkki seulontaan on esitetty. Kuten tekstissä on kuvattu, jokainen pesäke kunkin geenin-deleetiokannan nähtiin kullekin (A1, A2 …) on KYLLÄ agarmaljoille, joissa oli 0, 100, 250, ja 500 uM Bortetsomibi. Seuloa 2815 kantoja, 31 sarjaa nämä levyt valmistettiin. Kun oli inkuboitu 26 ° C: ssa 3 päivää, pesäkkeen muodostumiseen arvioitiin. Villityypin kannat nähtiin asemiin H2 ja H3 (valkoinen katkoviiva). Kannat täplittäin A3, B8, B10, ja C10 valittiin ehdokkaiksi osoittaa vakavaa kasvuhäiriöt 100 uM Bortetsomibi ja testattiin uudelleen sarjalaimentamalla tiputtelua.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0022021.s002

(TIF )

Kuva S3.

Herkkyys alentaa annosta Bortetsomibi. Pesäkkeiden muodostumista kyky viiden slb mutanttien tutkittiin YES-agaralustalla, joka sisälsi 0, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM, 10 uM ja 100 uM Bortetsomibi kuten on kuvattu kuviossa 2 (D). Alle 10 uM Bortetsomibi, merkittävää kasvua vika ei havaittu.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0022021.s003

(TIF) B Taulukko S1.

Luettelo geenejä, jotka tunnistettiin osoittaa kasvun vika läsnä oli 100, 250 ja 500 uM Bortetsomibi ensisijaisesta seulonnan.

doi: 10,1371 /journal.pone.0022021.s004

(XLS) B

Kiitokset

Olemme suuressa velassa Dr. Colin Gordon toimittamiseksi

S. pombe

kantoja ja tohtori Keith Gull toimittamisesta vasta-aineita.