Krooninen sairaus

tiivistelmä

Up-säännelty Sirtuin 1 (SIRT1), NAD

+ -riippuvaista luokan III histonideasetylaasi, deasetyloi p53 ja estää sen transkriptionaalisen aktiivisuuden, joka johtaa solun eloonjääntiin. SIRT1 yli-ilmentyminen on raportoitu ennustaa huono säilyminen joissakin maligniteettien, mukaan lukien mahasyöpä. Kuitenkin kasvaimen kasvua estävän vaikutuksen SIRT1 inhibition pysyy vaikeasti mahasyövän. Täällä, tutkimme antitumor mekanismeihin Sirtuin estäjä, tenovin-6, seitsemässä ihmisen mahasyövän solulinjoja (neljä solulinjat villiin

TP53

, kaksi mutantti-tyypin

TP53

, ja yksi nolla

TP53

). Mielenkiintoista, tenovin-6 aiheuttaman apoptoosin kaikissa solulinjoissa, paitsi ne, joilla on villin tyypin

TP53,

mutta myös mutantti-tyyppinen ja null versioita, mukana ylössäätöä kuoleman reseptori 5 (DR5). Vuonna KatoIII solulinjassa (

TP53

-null), DR5 Äänenvaimennusjärjestelmä vaimensi merkittävästi tenovin-6: n indusoiman apoptoosin, mikä viittaa siihen, että keskeinen mekanismi takana sen antituumorivaikutukset perustuu aktivointi kuoleman reseptorin signaalireitin. Vaikka Endoplasmakalvosto aiheuttamaa stressiä Sirtuin estäjien raportoitu indusoivan DR5 ylössäätöä muissa syöpäsolulinjoissa, emme löytäneet selvä aktivointi siihen liittyvien molekyylien, kuten ATF6, PERK, ja CHOP, mahasyövän käsitellyissä soluissa tenovin- 6. Tenovin-6 yhdistettynä doketakseliin tai SN-38 aiheutti lievää tai kohtalaista synergistinen sytotoksinen mahalaukun syöpäsoluja. Lopuksi tenovin-6 on voimakas antituumorivaikutus ihmisen mahasyövän soluihin DR5 säätelyä ylöspäin. Tuloksemme pitäisi olla apua tulevaa kliinistä kehitystä Sirtuin estäjien.

Citation: Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) antituumorivaikutukset on Sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, vastaan ​​Mahalaukun Syöpäsolut kautta Death Receptor 5 Up-asetus. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10,1371 /journal.pone.0102831

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 lokakuu 2013; Hyväksytty: 23 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 17 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Hirai et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-tukea opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (ja IH). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi tärkeimmistä syistä syöpäkuolemien maailmassa [1], [2]. Vaikka eri chemotherapies pitkälle mahasyövän on kehitetty, ennuste on edelleen huono ja uusia syöpälääkkeiden mahasyövän tarvitaan. Mahalaukun syöpä on biologisesti ja geneettisesti heterogeeninen syöpä, johon sisältyy lukuisia geneettisiä muutoksia ja epigeneettiset alternations [3]. Näistä poikkeavuuksia

TP53

tuumorisuppressorigeeniä tärkeä rooli kasvainten synnyssä [4], [5]. Noin 30%: lla mahalaukun syöpä on

TP53

mutaatio [6]. Jopa syöpäsolujen villityypin (wt)

TP53

, on raportoitu, että funktio

TP53

vaimennetaan negatiiviseen säätelyyn, mukaan lukien ubikitinaation, metylaatio, ja deasetylaatio [7], [8]. Tässä yhteydessä olisi lupaava strategia olettaa, että inhibitio Näiden alipaineensäätöventtiileillä tulokset kasvaimen vastaisten vaikutusten aktivaation kautta p53: paino

TP53

syöpiä. Hiiren double minuutti 2 (MDM2) on merkittävä fysiologinen antagonisti p53 [7]. Olemme aiemmin raportoitu, että MDM2-inhibiittori, nutlin-3, osoitti tehokkaita antituumori- vaikutuksia vastaan ​​mahalaukun syövän solujen aktivaation kautta p53-reitin [9].

Sirtuin 1 (SIRT1), NAD

+ – riippuvaista histonideasetylaasi (HDAC), on erilaisia ​​toimintoja mukana chromatin vaiennettu, pitkäikäisyys, ja genomin vakauteen. Se löytyy tumaan ja toimii anturi solujen metabolisen tilan säilymiseen ja vanhenemista alle genotoksinen ja oksidatiivisen stressin [10], [11]. Lisäksi histonin deasetylointi, nämä toiminnot osittain riippuvaisia ​​deasetyloinnilla erilaisia ​​ei-histoni-proteiinien, jotka sisältävät transkriptiotekijöitä: p53, forkhead laatikko (FOXO) proteiinit, tumatekijä KB: n, c-MYC, N-MYC, E2F1, ja hypoksia-indusoituva transkriptiotekijät (HIF) 1α /2α; chromatin liittyvät entsyymit: histoni liasetyylitransferaasi, p300, DNA-riippuvaisen kinaasialayksikön Ku80, ja TIP60; DNA korjaus elementit: Ku70, RAD51, ja NBS1; ja solu-signalointi tekijät: STAT3, β-kateniinin, ja Smad7 [11] – [13]. SIRT1 fysiologisesti vuorovaikutuksessa p53 ja vaimentaa sen toimintojen kautta deasetylaatiolla sen C-päätteen Lys382 jäännös [12]. Yliekspressio SIRT1 on monissa syövissä, kuten mahan ja paksusuolen [10], [14], ja on raportoitu toimia kasvaimen promoottori. SIRT2 on yksi sytoplasmisen NAD

+ – riippuvainen histonideasetylaasien ja deasetyloi histoni H3 lysiinin 56 (H3K56) ja α-tubuliinin. On myös yhtä kuin histoni substraattien FOXO1, FOXO3, ja p53 kanssa SIRT1 [11]. Kuitenkin tarkka rooli SIRT2 edelleen heikko syövän biologian.

Tätä taustaa vasten me tutkimme, tenovin-6, pienimolekyylinen yhdiste, joka estää SIRT1 ja SIRT2 toiminnot [15], [16], kohdistama antituumorivaikutukset aktivoimalla p53-reitin mahalaukun syöpäsoluja. Viime aikoina on raportoitu, että SIRT estäjät sääteli kuoleman reseptori 5 (DR5), jäsen tuumorinekroositekijän reseptorin perhe, joissakin syöpien [17], [18]. Olemme lisäksi tutkineet osallistumisen tämän reseptorin antituumorivaikutuksen tenovin-6 mahasyövän. Lisäksi tutkimme synergian tenovin-6 tavanomaisten sytotoksisten lääkkeiden tulevaa kliinistä kehitystä mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Seven mahasyövän solu linjat käytettiin: neljä solulinjoissa paino

TP53

(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), kaksi solulinjaa, jossa mutantti-tyyppi (mt)

TP53

(NUGC-3, STKM-1), ja yksi solulinja null

TP53

(KatoIII) [19] – [21]. Solulinjoja, joissa paino

TP53

(MCF-7 rintasyöpä, HEK293 ihmisen alkion munuaissoluja) ja MRC-5 ihmisen normaaleja fibroblasteja sisältyvät kontrolleina tässä tutkimuksessa. MKN-45, NUGC-4, KatoIII, ja MRC-5-solulinjat saatiin RIKEN BRC Cell Bank (Tsukuba, Japani). SNU-1 ja MCF-7-solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). NUGC-3 ja HEK293 solulinjat saatiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani). STKM-1 ja STKM-2 solulinjat ystävällisesti Dr. Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japani).

Kemikaalit

Tenovin-6 hankittiin Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Dosetakseli, SN-38, sisplatiini, 5-fluoriurasiili (5-FU), doksorubisiini ja thapsigargin saatiin Wako (Osaka, Japani). Ne liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) pitoisuutena 20 mM ja alikvootteja säilytettiin -20 ° C: ssa. Kantaliuokset laimennettiin haluttuun lopulliset pitoisuudet kanssa kasvualustaan ​​ennen käyttöä.

Vasta-aineet ja Western blot-analyysi

SDS-polyaclylamidegel elektroforeesi ja Western blotting suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [22]. Ensisijainen ja toissijainen vasta olivat seuraavat. Kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​SIRT1 (D739), asetyloitu (Ac) -p53 (Lys382), fosforyloitiin (Phospho) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubuliinin (Lys40), kuoleman reseptori 5 (DR5), Fas -associated kuolemandomeeni (FADD), lohkaistaan ​​poly (ADP) -ribose polymeraasi (PARP) (Asp214) ja hiiren monoklonaalisia vasta-aineita p21

Waf /CIP1

(DCS60), histoni H3 (96C10) , β-aktiini (8H10D10), α tubuliinia (DM1A) ja C /EBP-homologin proteiinia (CHOP) (L63F7), ja kanin monoklonaalisia vasta-aineita TRAIL (C92B9), kaspaasi-3 (8G10), inositoli vaativa entsyymin (IRE ) 1α (14C10), ja fosfo-RNA-riippuvaisen proteiinikinaasin kaltainen solulimakalvoston kinaasi (PERK) (16F8) saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine p53 (BP53-12) ostettiin Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monoklonaalinen vasta-aine oli yhtiöltä Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO), ja anti-aktivoiva transkriptiotekijä 6 (ATF6) monoklonaalinen vasta-aine (70B1413.1) oli Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Kanin polyklonaalinen vasta-aine Ac-histoni H3 (Lys 18) oli Merckiltä Millipore (Bedford, MA). Molemmat piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua anti-hiiri-IgG lampaan anti-kani-lgG-aasi seerumia olivat GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Vasta-aineen sitoutumista havaittiin käyttämällä ECL Prime Western blotting Detection System (GE Healthcare) mukaisesti valmistajan protokollaa. Signaali-intensiteetti kvantifioitiin käyttäen EZ-capture II kemiluminesenssin kuvantamisjärjestelmä (Atto, Tokio, Japani).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-analyysi

SIRT1

ja

SIRT2

geenien ilmentyminen

RNA-näytteet uutetaan solulysaatista käyttämällä korkean Pure RNA Isolation kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa), mukaisesti valmistajan ohjeita. Sen jälkeen, kun genominen DNA poistettiin DNaasi, cDNA valmistettiin käyttäen High Capacity RNA-to-cDNA-kittiä (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Alukkeita ja TaqMan koetin

SIRT1

ja

SIRT2

saatiin Applied Biosystems (määritys ID: Hs01009005 ja Hs00247263, vastaavasti), ja ne,

18S ribosomaalisen RNA: n (18S rRNA)

suunniteltiin ja syntetisoitiin Sigma-Aldrich olivat seuraavat: 5′-AACCCGTTGAACCCCATTCG (forward-aluke), 5′-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (käänteinen aluke), 5′-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (koetin). Reaktiot suoritettiin kolminkertaisina standardiolosuhteissa lämpösykliolosuhteita, käyttäen 30 ng cDNA, 900 nM alukkeita, 250 nM antureista, ja Taqman Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) mukaisesti valmistajan protokollan.

-RNA: t uutetaan soluista analysoitiin suhteelliset määrät kohdegeenin (

SIRT1, SIRT2

) ja viite-geeni (

18S rRNA

) kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR.

WST-8 solujen elinkelpoisuuden määritykset

WST-8 kolorimetrisiä määrityksiä suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japani) mukaisesti valmistajan protokollaa. Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

3 solua per kuoppa 100 ui elatusainetta 24 tunnin ajan, käsitellään tenovin-6: ssa 72 tuntia, inkuboitiin, kun läsnä on WST-8, ja sitten analysoitiin kanssa iMark mikrolevynlukijalla (Bio-Rad, Hercules, CA).

apoptoosin analysointi virtaussytometrialla

Solut siirrostettiin 60 mm: n maljoille tiheydellä 5 x 10

5 maljaa kohti. Inkuboinnin jälkeen tenovin-6 (10 uM) tai vastaava määrä DMSO: ta 72 tuntia, solut varovasti nostetaan Accutasella (US Biotechnologies, Parker Ford PA) huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Sitten solut pestiin kerran fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Apoptoottisia soluja havaittiin kaksinkertainen propidiumjodidilla (PI) ja fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -merkattua anneksiini V käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, Brea, CA) mukaisesti valmistajan protokollaa. Virtaussytometrianalyysin sitten suoritettiin FACS Calibur virtaussytometrillä (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ja CellQuest ohjelmistojen (BD Biosciences).

siRNA kohdistaminen

DR5

siRNA kohdistaminen DR5 suunniteltiin käyttäen siDirect ohjelmistoa (https://sidirect2.rnai.jp/), kuten on raportoitu aiemmin [22]. siRNA transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), mukaisesti valmistajan ohjeita. Ohjaus siRNA oli keinotekoinen sekvenssi suunniteltu on vähiten homologisia ihmisen ja hiiren geeneistä. Sense- ja antisense-juosteet siRNA käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: DR5, 5′-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 ’(sense), 5′-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3′ (antisense); ohjaus siRNA, 5’-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 ’(sense), 5′-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3’ (antisense).

vaikutusten analyysi siRNA solujen kasvuun ja elinkykyyn, solut maljattiin alhaisella tiheys (1 x 10

3 solua per kuoppa) 96-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät 100 ui RPMI 1640 väliainetta, jossa 10% vasikan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich). Elinkelpoisuus transfektoitujen solujen arvioitiin 72 ja 120 h kuluttua transfektion WST-8 määrityksessä.

Combination index

Voit selvittää tenovin-6 voi parantaa antituumorivaikutukset tavanomaisten kemoterapia-aineiden, me käytetyt yhdistelmä indeksi (CI) ja isobologrammia lasketaan CalcuSyn- ohjelmistoa (Cambridge, UK), mukaisesti Chou ja Talalay mediaanivaikutus periaate [23]. Tässä analyysissä CI 1,3 osoittaa antagonismia; CI = 1.1-1.3 kohtalainen vihamielisyys; CI = 0,9-1,1 lisävaikutus; CI = 0,8-0,9 lievää synergiaa; CI = 0,6-0,8 kohtalainen synergiaa; CI = 0,4-0,6 synergiaa; ja CI = 0,2-0,4 epätehokkaalla.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin vähintään kolme kertaa. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD). Erojen merkitsevyyden määritettiin Studentin t-testillä ja Dunnettin testillä.

p

-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Expression of SIRT1, SIRT2, ja asetyloidut (Ac) -p53 mahasyövän solulinjoissa

ensin tutkittiin ekspressiotasoja SIRT1, SIRT2, ja Ac-p53 seitsemän mahasyövässä solulinjoissa. Käytimme HEK293 solujen positiivisen kontrollin ja SIRT1 /2, ja MCF-7-solut, joita käsiteltiin doksorubisiinia positiivisen kontrollin Ac-p53 [24]. Kaikki mahasyövän solulinjat lukuun ottamatta NUGC-4 ja STKM-1-solut ilmensivät runsaita tasoja SIRT1 proteiinia, ja SIRT2 ekspressiotasot olivat alhaiset kaikissa solulinjoissa lukuun ottamatta MKN-45-soluja (kuvio 1A). Ac-p53 ekspressiotasot olivat hyvin alhaiset kaikissa mahasyövän solulinjoissa paino

TP53

.

V: n ilmentyminen SIRT1, SIRT2, p53, Ac-p53, ja fosfori-53 seitsemän mahasyövän solulinjoissa ja MRC-5-fibroblasteja tutkittiin Western-blottauksella. Semi-kvantitointi Western blotting densitometrisesti mukana normalisoinnin p-aktiini tasot. MCF-7 *: MCF-7-soluja käsiteltiin doksorubisiini (1 uM, 24 h). B: n ilmentyminen

SIRT1

mRNA ja

SIRT2

mRNA mahalaukun syöpäsoluja. Tasot

SIRT1

mRNA: ta ja

SIRT2

mRNA määritettiin mahalaukun syövän solujen ja MRC-5-fibroblasteja kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitu tasolle

18S

rRNA . mRNA-tasot on esitetty suhteessa kuin MRC-5-fibroblasteja.

analysoitiin geenin ilmentymisen

SIRT1

ja

SIRT2

reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä. MKN-45-solut osoittivat

SIRT1

geenin ilmentymisen, joka oli noin 2,5 kertaa suurempi kuin fibroblasteissa, mutta muita mahalaukun syövän solulinjat eivät (kuvio 1 B). In NUGC-4-soluja, taso geenin ilmentymisen

SIRT1

oli alhainen, kuten SIRT1 proteiinia. MKN-45-solut osoittivat hieman korkea

SIRT2

geenin ilmentymisen, kun taas muut solulinjat osoittivat melko alhainen ekspressiotasoja.

Tenovin-6 estivät kasvun mahalaukun syöpäsolujen

Jotta vahvista tenovin-6 aktiivisuus, tutkimme onko tenovin-6 vaikutti asetylaatio histoni H3 ja α-tubuliinin. Tenovin-6 lisäsi asetylointi histonien kolme (MKN-45, NUGC-4, ja KatoIII) neljän mahasyövän testatuissa solulinjoissa, mikä osoittaa inhibitiota SIRT1 deasetyloinnin aktiivisuuden (kuvio 2A). Ac-α-tubuliinin lisääntyi vain yhdellä solulinjassa (MKN-45) käsiteltiin tenovin-6, joten esto SIRT2 deasetylaation aktiivisuutta ei voitu lopullisesti esitetty mahalaukun syöpäsoluja.

V: Mahasyöpää soluja viljelty tenovin-6 (10 uM) eri ajanjaksoja ja analysoitiin tasojen SIRT1, SIRT2, Ac-H3, ja Ac-α-tubuliinin Western-blottauksella. B: Tenovin-6 esti kasvua mahasyövän solujen riippumatta

TP53

tila. Kaikki kokeet arvioitiin WST-8 määritys ja toteutetaan kolmena kappaleena. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. C: WST-8-määritys suoritettiin MRC-5-solut verrata myrkyllisyyden tenovin-6 syöpäsolulinjoilla. Kasvun inhibitio tenovin-6 NUGC-4-soluissa oli merkittävästi suurempi kuin MRC-5-soluissa. Erojen merkitsevyyden arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä.

Seuraavaksi arvioidaan mahdollisen kasvaimen vastaisen vaikutuksen tenovin-6 vastaan ​​mahalaukun syöpäsoluja. Kukin mahasyövän solulinja viljeltiin, kun läsnä on tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20, ja 50 uM) kolmen päivän ajan. Annoksesta riippuvaa kasvun estämistä havaittiin kaikissa solulinjoissa, paitsi ne, joilla paino

TP53

mutta myös mt ja nolla versiot (kuvio 2B). Heidän IC

50-arvot vaihtelivat 2,34-4,28 uM. Lisäksi, WST-8-määritys suoritettiin ihmisen fibroblastisolulinjan MRC-5 (IC

50: 6,09 uM) verrata myrkyllisyyden tenovin-6 syöpään solulinjoja. Elinkelpoisuuden NUGC-4-soluja käsiteltiin tenovin-6 oli merkittävästi alhaisempi kuin MRC-5-soluissa, kuten on esitetty kuviossa 2C.

Tenovin-6 indusoi apoptoottista solukuolemaa mahasyövän soluissa

Kuten kuviossa 3A on esitetty, ja S1, tenovin-6 käsittely lisäsi p53 ja p21 paino-

TP53

soluja (MKN45 ja NUGC-4). Up-regulation of Ac-p53 esitetty MKN-45-soluissa, mutta ei NUGC-4-soluja. Lisääntynyt p21 ilmentymistä havaittiin myös mt

TP53

soluja (NUGC-3). Sitä vastoin, bcl-2: n ilmentymisen ei muutu lähes kaikissa neljässä mahasyövän solulinjoissa. Lisäykset DR5 ja pilkotun PARP ilmaisun havaittiin kaikissa testatuissa solulinjoissa. Ekspressiotasot TRAIL, jotka toimivat ligandina kytkimen kuoleman signalointi, oli hieman lisääntynyt kaikissa solulinjoissa, mutta ilmaus FADD tärkeä sovitin, ei vaikuttanut tenovin-6.

: Aika-tietenkin analyysi p53, sen loppupään molekyylin p21

Waf /CIP1

, ja apoptoosiin liittyvien molekyylien mahalaukun syövän soluissa, joita käsiteltiin tenovin-6 (10 uM). Suhteellinen intensiteetti proteiinien ilmentyminen on esitetty kuviossa S1. Tenovin-6 indusoi ilmentymistä Ac-p53 ja p21

Waf /CIP1

, mutta ei Bcl-2. DR5 ilmentyminen voimakkaasti indusoi tenovin-6. TRAIL, ja pilkotaan PARP oli hieman lisääntynyt, mutta FADD ilmentyminen ei muuttunut. Dupletti DR5 osoittaa sen esiaste (ylemmän kaistan) ja kypsä isoformit (alempi kaista). B: Neljä solulinjoja käsiteltiin tenovin-6 (10 uM) tai ajoneuvon hallinnan 72 tuntia, double-värjättiin FITC-anneksiini V ja PI, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Tilastollinen merkitys ryhmien välisiä eroja arvioitiin käyttäen Studentin t-testiä. *

p

0,01; **

p

0,05.

tutki tenovin-6 laski elinkelpoisuuden mahasyövän solujen indusoimalla apoptoottisen solukuoleman. Syövän solut altistettiin sen konsentraatiolla 10 uM tai vastaava määrä kontrolli ajoneuvon (DMSO) 72 tuntia, ja sitten värjättiin FITC-anneksiini V: n ja PI. Ne analysoitiin virtaussytometrialla: solujen negatiivinen sekä anneksiini V ja PI katsottiin olevan ei-apoptoottiset solut positiivisia anneksiini V: vain pidettiin aikaisin apoptoottisia, ja positiivisten solujen sekä anneksiini V ja PI katsottiin myöhässä apoptoottisten tai nekroottisen. Altistuminen MKN-45-solujen tenovin-6 lisäsi jakeet varhaisen ja myöhäisen vaiheen apoptoosin 2,8%: sta 52,1%: iin ja 1,8%: sta 18,5%: iin (kuvio 3B). Samanlaisia ​​kasvaa väestön alussa ja lopussa vaiheissa apoptoosin havaittiin muissa solulinjoissa (NUGC-4, NUGC-3, ja KatoIII). Tenovin-6 aiheuttaman apoptoosin kaikissa testatuissa solulinjoissa, riippumatta

TP53

tila.

vaikutus

DR5

Knockdown on tenovin-6-aiheuttaman apoptoosin

Seuraavaksi tarkistaa, onko

DR5

hiljentäminen vaikuttaa tenovin-6: n indusoiman apoptoosin, solujen elinkelpoisuuden ja apoptoottista korko analysoitiin WST-8 määritys ja virtaussytometria, vastaavasti,

TP53

-null KatoIII soluja. Inhibitio DR5-ilmentymisen tiettyjä siRNA (kuvio 4A) vähensi merkittävästi tenovin-6-indusoidun solukuoleman ja apoptoosin KatoIII soluissa (kuvio 4B ja 4C). Käytimme kolmea eri siRNA meidän alustavassa kokeessa, ja saimme samanlaisia ​​tuloksia tahansa siRNA.

V: KatoIII solut transfektoitiin 1 nM siRNA ohjaus tai siRNA vastaan ​​DR5 mRNA. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 5 uM tenovin-6: ssa 24 tuntia. Western blotting osoitti alas-säätely DR5 siRNA transfektiolla. Dupletti DR5 osoittaa sen esiaste (ylemmän kaistan) ja kypsä isoformit (alempi kaista). B: Solut transfektoitiin 1 nM siRNA ohjaus- tai DR5 siRNA 48 h, käsiteltiin 0,2, 1, ja 5 uM tenovin-6: ssa 72 tuntia ja sitten suoritettiin solujen elinkelpoisuuden mittauksia WST-8-määrityksessä. Tilastollinen merkitys ryhmien välisiä eroja arvioitiin käyttäen Studentin t-testiä. *

p

0,01; **

p

0,05. C: vaikutus DR5 Knockdown on tenovin-6 aiheuttaman apoptoosin analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä PI värjäystä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tilastollinen merkitys ryhmien välisiä eroja arvioitiin käyttäen Studentin t-testiä.

Tutkimme aktivointi Endoplasmakalvosto (ER) stressi reitin, joka liittyy DR5 ylössäätöä, kuten aiemmin raportoitu [ ,,,0],17]. CHOP on yksi indusoi DR5 ja ylävirtaan apoptoosin, ja usein vapautuu ER stressiä. Kuten on esitetty kuviossa 5A ja 5B, vaikka CHOP oli hieman ajan säädellään tenovin-6 hoidon kaikki neljä mahasyövän solulinjat, lisääntynyt tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kuin kontrolli käsitellyissä soluissa thapsigargin, joka on selektiivinen sarcoplasmic /Endoplasmakalvosto Ca

2+ – ATPaasit ja laajalti käytetty solujen ER stressor [25], [26]. Toisaalta käsiä, IRE1, joka on ER-stressi-anturin ja se sijaitsee ylävirtaan CHOP, oli hieman ajan säädellään tenovin-6 kohtelu kaikissa solulinjoissa, mutta ei fosforyloitu PERK ja ATF6. [27], [28]. Näytti epätodennäköiseltä, että tenovin-6 aiheutti ER stressin johtaa DR5 induktion meidän mahalaukun syöpäsoluja.

V: Proteiinien ilmentäminen liittyy ER stressiä mahasyövän solulinjoissa ennen ja jälkeen hoidon 10pM tenovin-6 . Thapsigargin 3 uM annettiin HEK293-solut kontrollina. Dupletti DR5 osoittaa sen esiaste ja kypsä isoformit. B: suhteellinen intensiteetti ilmentymisen CHOP solulinjoissa testattu näkyy. Tilastollinen merkitys ryhmien välisiä eroja arvioitiin käyttäen Dunnettin testillä.

antituumorivaikutus of tenovin-6 yhdistettynä kemoterapia-aineiden

Lopuksi tutkittiin, tenovin-6 parannettu antituumorivaikutuksen vaikutukset kemoterapeuttisten aineiden, kuten doketakselin, SN-38, sisplatiini, ja 5-FU, mahasyövän solulinjoissa. Neljä solu- linjat paino

TP53

(MKN-45, NUGC-4), mt

TP53

(NUGC-3), ja null

TP53

(KatoIII) käsiteltiin näillä aineilla yksin tai yhdistelmänä, jossa on kaksi annosta (2 ja 5 uM) tenovin-6. Pitoisuudet olivat 0,25 nM dosetakselin, 1 nM SN-38, 0,5 tai 1 uM sisplatiinia ja 0,25 uM 5-FU. Kuten on esitetty taulukossa 1 (ja kuviossa S2), doketakseli ja SN-38 osoittivat lievää tai kohtalaista synergistinen vaikutus tenovin-6 hoidon kolmen solulinjoissa, ja sisplatiinin kanssa tenovin-6 osoitti kohtalaista synergististä vaikutusta kahdessa solulinjassa, kun taas 5-FU yhdistettynä tenovin-6 osoitti pienempi vaikutus kuin muut aineet. Tutkimme ilmentymiä DR5 antamisen jälkeen tenovin-6 kemoterapeuttisten aineiden. DR5 ylössäätöä by tenovin-6 tehostui yhdistelmällä dosetakseliliuosta MKN-45-solut (kuva S3).

Keskustelu

osoittaneet, että tenovin-6 osoitti voimakasta antituumorivaikutuksen aktiivisuus liittyy apoptoottisen solukuoleman ihmisen mahasyövän solujen paino

TP53

sekä ne, joilla mt

TP53

. Useita erityisiä inhibiittorit sirtuins, kuten sirtinol, suramiini, salermide, ja thiobarbiturates, oli raportoitu estävän solukasvua erityyppisiä syöpiä [29]. Useimmat tutkijat kuvattu antituumorivaikutukset Sirtuin estäjien solulinjoissa paino

TP53

[15], [29] – [31], ja johtuu näiden aktivoitumista apoptoosia asetyloimalla p53. Samaan aikaan useita raportteja julkaistiin viime vuosina, jotka osoittivat antitumor toimintaa Sirtuin estäjien solulinjoissa mt

TP53

kautta p53-riippumatonta reittejä [17], [18]. Osoitimme, että DR5 Knockdown lievensi antituumorivaikutukset tenovin-6

TP53

-null mahalaukun syöpäsoluja. Aktivointi kuoleman reseptorin signaalireitin kautta lisäävä säätely DR5 on keskeinen rooli tenovin-6-solukuolema, kuten edellä muita raportteja Sirtuin estäjiä.

On raportoitu, että salermide parannettu DR5 ilme ja indusoi apoptoosia ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, jotka kantavat mt

TP53

[17]. Tässä kertomuksessa samanaikainen vaimentaminen

SIRT1

ja

SIRT2

sekä salermide sääteli DR5, mukana säätely ylöspäin ER stressiin liittyvät proteiinit, kuten ATF4 ja CHOP. Nämä tulokset viittaavat siihen, ER stressi oli mukana tässä DR5 induktio. Me arveltu, että tenovin-6 johti myös kasvua DR5 ilmentymisen aktivaation kautta ER stressin välittämän PERK, IRE1, ATF6, ja CHOP. Kuitenkin vastoin odotuksia, signaalireitin ER stressin aktivoidaan tenovin-6 ei ilmeisesti havaittu. Kuitenkin on selvästi osoitettu, että DR5 indusoitiin tenovin-6. On muitakin polkuja CHOP-välitteisen DR5 ylössäätöä: reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), c-Jun NH

2-terminaali kinaasin (JNK) reitin, p38 mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi koulutusjakson, ja niin edelleen [ ,,,0],32] – [38]. Emme kuitenkaan ole tutkinut näitä reittejä tähän, koska emme voineet tunnistaa CHOP aktivoitumista tutkimuksessamme. Tuloksemme viittaavat siihen, että muut p53- ja CHOP-riippumattomia reittejä osallistua tenovin-6-indusoidun DR5 ilmentymisen mahalaukun syövän soluissa.

osoittivat, että tenovin-6 indusoi apoptoottista solukuolemaa aktivaation kautta DR5 kautta. Kuitenkin p53 ja CHOP väyliä näytti todennäköisesti mukana tässä DR5 induktio, ja mekanismi DR5 ylössäätöä edelleen epäselvä. Olemme viime aikoina tutkittu antituumorivaikutukset tenovin-6 useissa koolonsyöpäsolulinjaa, ja löysi sen voimakas antituumorivaikutuksia useimmissa on säätely ylöspäin DR5 samoin [39]. Kuitenkin Caco2 koolonkarsinoomasoluissa (mt

TP53

), apoptoottinen solukuoleman tenovin-6 oli vähemmän ilmeinen ja DR5 ilme ei ollut vahvasti sääteli. Caco2 solu on raportoitu ilmaista korkea lämpösokkiproteiinit tunnettu vaimennin DR5 [40] – [43]. Tämä suhde tulee tutkia edelleen tulevaisuudessa. SIRT1 voi deasetyloida histoni H4 lysiiniä 16 (H4K16) sekä H3K9, H3K14, ja H1K26, jotka liittyvät läheisesti geenien [11]. Lisäksi sillä on monia vastaava ei-histoni substraatit: transkriptiotekijöitä, DNA: n korjautumiseen koneiden osia, tumareseptorit, histoni-modifioivia entsyymejä, ja solusignalointimolekyylien, kuten muualla on kuvattu [11] – [13]. Nämä lukuisat ja monimutkaiset yhteenliittymien SIRT1 aktiivisuuden vaikuttavat eri biologisia toimintoja, kuten geenin ilmentymisen säätelyyn ja DNA-vaurion korjaamiseen. Syöpäsolut yleensä vaatia näiden toimintojen SIRT1 selviytyäkseen, lisääntyä, ja korjaa katastrofaalisia genomista vahinkoja. Viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet kyky tenovin-6 aiheuttaa erilaistumista ja estävän autophagy osana antineoplastisten vaikutuksia leukemiasolujen [44], [45]. Se voi riippua syöpäsolujen käyttäytymistä kuinka tenovin-6 vaikuttaa neoplastisia aktiivisuutta. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään välistä yhteyttä tenovin-6-välitteistä kuolemaa reitti ja monimutkainen roolit SIRT1.

tutkittiin vaikutukset yhdistyvät dosetakselia, SN-38, sisplatiini, ja 5-FU tenovin -6 koska ne on laajalti käytetty hoitoon potilailla, joilla on edennyt mahasyöpä [46], [47]. Lievä tai kohtalainen synergiavaikutuksen doketakselin ja SN-38 kanssa tenovin-6 mahasyövän solulinjoissa, riippumatta

TP53

tila, ei löytynyt.

Vaikka hoidot yhdistelmähoidon Doketakselin ja Sirtuin estäjiä ei ole raportoitu, yhdistelmiä doketakseli ja muut HDAC-inhibiittorit kuten trikostatiini A ja suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA) on raportoitu olevan synergistisiä vaikutuksia liittyviä kaspaasi aktivointia tai tubuliinin asetylointi useissa syöpäsolulinjoissa [48] – [50] . Tutkimuksessamme on edelleen epäselvää, jos tubuliinin asetylaatio by tenovin-6 aina vaikuttanut antituumorivaikutuksen, koska tubuliinia asetylaatio osoitettiin vain yhdessä solulinjassa. SN-38 (aktiivinen muoto irinotekaanin) on DNA-topoisomeraasi I: n estäjä, joka toimii ainoastaan ​​S-vaiheen ja häiritsee DNA: n replikaatiota ja solunjakautumista [51], [52]. HDAC-inhibiittorit indusoivat asetylointi histonien ja löysää kromatiinirakenteeseen, jolloin topoisomeraasiestäjä voi helposti hakea DNA, helpottaa DNA-vaurioita [51], [53]. Lisäksi merkittävä kasvu ROS: n syntyminen on raportoitu pienisoluinen keuhkosyöpä solut, kun samanaikainen altistuminen SAHA ja topotekaani (a kamptotekiinin) [51]. Lisääntynyt teho hoito yhdistetään tenovin-6 ja SN-38 saattaa johtua osuuskunta sääntelyä DNA-vaurioita vastaus.

etuna yhdistettynä hoidon tenovin-6 ja sisplatiini tai 5-FU oli pienempi kuin muiden aineiden mahalaukun syövän soluissa, vaikka useat raportit ovat osoittaneet parantamiseksi apoptoosin yhdistettynä sisplatiinin tai 5-FU: n ja muiden HDAC-inhibiittorit muiden kasvainten [54] – [57].

osalta myrkyllisyys arviointi tenovin-6, käytimme fibroblastisolulinjaa kuin vaihtoehtoiset ei-tuumorigeenisiä soluja ennustaa toksisuutta normaaleja soluja, jotka koskevat edellistä raportit [15], [18]. Se oli vaikea löytää sopivaa tavanomaista valvontaa varten vertailevia tutkimuksia, ja näin ollen lopullisesti tarvitaan tutkimusta myrkyllisyyden tenovin-6 (yhdessä syöpälääkkeitä)

in vivo

käyttäen eläin- ksenograftimalleissa.

voidaan todeta, että Sirtuin estäjä, tenovin-6, osoitti vankan antituumorivaikutus ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Tämä oli riippumaton

TP53

tila ja indusoitiin kautta lisäävä säätely DR5. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään mekanismia, jolla tenovin-6 säätelee DR5 ilme.