Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA topoisomeraasi I (TOP1) tasot useiden ihmisen kasvainten ovat suuremmat kuin normaaleissa kudoksissa. TOP1 inhibiittorit ovat laajalti käytössä hoidettaessa tavanomaista hoitoa kestävä munasarjojen syöpien. Kuitenkin potilaille saattaa kehittyä resistenssi TOP1 estäjiä, jotka vaikeuttavat kemoterapiaa menestys. Tässä tutkimuksessa selvitimme liittyviä mekanismeja kehittämiseen kamptotesiinin (CPT) vastus munasarjasyöpiä ja tunnistettu evodiaminiyhdisteet (EVO), luonnontuote, jolla TOP1 estävä aktiivisuus, joka voittaa vastus. Korrelaatiot keskuudessa TOP1 tasoilla, syöpä lavastus, ja kokonaiseloonjääminen (OS) analysoitiin. Vaikutus EVO CPT kestävä munasarjasyöpään arvioitiin

in vitro

ja

in vivo

. TOP1 oli yhteydessä huonoon ennusteeseen munasarjasyöpiä (

p

= 0,024). EVO: n indusoiman apoptoosin, joka havaittiin käyttäen virtaussytometria ja terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin dUTP nick end merkinnät (TUNEL) määritys. Kasvaimen koko pieneni merkittävästi EVO hoitoryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (

p

0,01) vierassiirrännänmallissa hiirimallissa. Lääkkeiden vaikutuksia kohdistaminen TOP1 varten ennusteen ja hoidon CPT kestäviä munasarjasyöpään ennakoidaan. EVO TOP1 voidaan kehittää antiproliferatiivisesti voittamiseksi CPT vastarinnan munasarjojen syöpiä.

Citation: Lee Y-C, Lee C-H, Tsai H-P, H-W, Lee C-M, Wu J-C, et al. (2015) Targeting topoisomeraasi I ja ennusteita Therapeutics camptothecin hylkivät munasarjasyöpä. PLoS ONE 10 (7): e0132579. doi: 10,1371 /journal.pone.0132579

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 21. 2015 Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 24 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Science Council, Taiwan (NSC101-2320-B-038-023), Ministry of Health Welfare (MOHW104-TDU-B-212-113001), ja Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital (101TMU-SHH-10).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

munasarjasyöpä ei ole erityisiä merkkejä tai oireita ja diagnosoidaan yleensä edennyt pitkälle, joten se kaikkein tappava gynekologinen syöpä länsimaissa [1]. Standard kemoterapiaa munasarjasyövän liittyy usein chemoresistance, joka on merkittävä este onnistuneelle syövän hoitoon [2] ja toisen linjan kemoterapia-vaihtoehto on suositeltava. Stokastinen mutaatiot valinnan aiheuttamien paineen, juokseva geneettisiä muutoksia aiheuttama erikoistunut strooman ja stemness syöpäsolujen ehdotettiin selittää eloonjäämistä solunsalpaajaresistentti solujen kemoterapian aikana [3]. Tunnistaminen molekyylitason biomarkkereita ennustamiseen lääkeaineen herkkyys ja kestävyys on ratkaiseva potilaan ennusteet.

TOP1 geenikopiomäärä, mRNA-tasolla, proteiinin taso, ja entsyymin aktiivisuus ilmoitetaan liittyvän huonoon ennusteeseen syövän hoidossa [4 ]. Perustamisesta rooli TOP1 ilmentymisen munasarjasyöpä voi helpottaa kehittämään tehokkaampia hoitostrategioita. Notch polku ja DNA topoisomeraasi I (TOP1) estäjät on laajasti käytetty sisplatiinin kestävä munasarjasyöpiä [5]. Kuitenkin, potilaat voivat kehittää TOP1 estäjä vastus, mikä haittaa menestys hoidon [6]. Käyttö yhdistelmähoidon yli single-aine kemoterapiaan johtaa parempaan tulosten munasarjasyöpä [7]. Kemoterapian aiheuttama haittavaikutuksia lievennetään jälkeen käyttämällä luonnollisia tuotteita, kuten polyphyllin D [8], emodin [9] tai Rosa roxburghii Tratt [10], kun taas antituumorivaikutus ja immunomodulaarisia toimintoja noudatetaan [11].

aktivointi 5 ’AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) ja sen jälkeen suppressio mTOR toiminta voi aiheuttaa suojaavia autophagy, joka antaa chemoresistance kasvainsoluihin [12]. Siksi esto AMPK liittyvien autophagy voi parantaa antituumorivaikutukset kohdistaman kemoterapia-aineiden [4,13]. TOP1 estäjä kamptotesiinin (CPT) voi aiheuttaa autophagy ja vähentää apoptoosin kautta AMPK-TSC2-mTOR väylän paksu- ja peräsuolisyövän [14]. Lisäksi, Topotekaani on raportoitu indusoivan cytoprotective autophagy villityypin p53 soluissa, mutta ei mutantti-p53 tai p53-knockout-soluja [15]. Ihmisen A2780 munasarjasyöpäsoluja on analysoitu p53 mutaatioiden ja luokiteltu p53 villityypin solulinjan [16]; Siksi tämä solulinja odotetaan helposti kehittää chemoresistance kautta AMPK välittämän autophagy. Tämä vaikutusmekanismi Human A2780 tarjoaa potentiaalia strategian seulontaan TOP1 estäjiä matalan suojaava autophagy aktivaatioaktiivisuus syöpien villin tyypin p53.

evodiaminiyhdisteet (EVO), joka on kinoliinikeltaista alkaloidi, alun perin eristetty alkaen

Evodia rutaecarpa

(Juss.), on raportoitu olevan monia fysiologisia toimintoja, kuten vasorelaksaatiota, laihdutuslääkkeet, syövänvastainen, antibakteerinen, antiviraalinen, ja anti-inflammatorisia vaikutuksia [17]. Synteettinen EVO johdannaisia ​​on kehitetty tehokkaita antituumoriaineita [18]. Tämä tutkimus tunnettu liittyvät mekanismit CPT-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja. Luonnollinen tuote EVO näkyy TOP1 estävä aktiivisuus että voitti CPT vastus munasarjojen A2780 soluissa. Tuloksemme antaa oivalluksia kasvu lääkeherkkyysmenetelmien CPT vastustuskykyisten munasarjasyöpäsoluja käytön jälkeen EVO liittyviä alkaloideja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

(

S

) – (+) – CPT (C9911), evodiaminiyhdisteet (E3531), natriumbikarbonaattia, dimetyylisulfoksidi (DMSO), 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), propium jodidi (PI), ja Hochest 33342 ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), trypsiinin, naudan sikiön seerumia (FBS), L-glutamiinia, ja natriumpyruvaattia hankittiin Gibco-BRL: ltä (Grand Island, NY, USA). Vasta-aine vastaan ​​sykliini D1 ostettiin Ventana (Tucson, AZ, USA). γ-H2A.X, AMPK, fosfo-AMPK, asetyyli-CoA-karboksylaasi (ACC), fosfo-ACC, ja glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Ki-67 kanin monoklonaalinen primaarinen vasta-aine hankittiin muodossa DAKO (MIB-5, Tanska). Comet Assay Kit saatiin Trevigen (Gaithersburg, MD, USA). Yleinen Layer Medium (GLM) kapasiteetti siru saatiin Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Lentivirusvektoreita (LVS), lusiferaasi (Luc) ja vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) vektoreita, ja beetle lusiferiini saatiin Promegalta (Madison, WI, USA). iView Universal DAB Detection kit saatiin Ventana (Tucson, AZ, USA). In situ Cell Death Detection Kit, POD, saatiin Roche Applied Science (Penzberg, Saksa).

Ethics

ihmiskoe: kudokset käytimme saatiin Taipei Medical University Hospital ja Wan Fang Hospital jälkeen Institutional Review Board hyväksyntä (WFH-IRB-99049). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Eläinten Tutkimus: Kaikki hiiri tutkimukset suoritettiin ohjeiden mukaisesti ja ennakkohyväksyntää Institutional Animal Care ja käyttö komitean Taipei Medical University. IACUC hyväksymistä No: LAC-99-0302. Eläimiä lopettaa humaanilla isofluraanilla.

näytteet

Formaliinifiksoidusta parafinoidut kirurgisista näytteistä käytettiin immunohistokemiallista (IHC) värjäys. Histologista diagnoosi suoritettiin WHO: n luokituksen. Kudossiruina koostui 180 munasarjojen pinnan epiteelisolujen karsinoomat: 61 seroosinen karsinoomat, 35 mucinous karsinoomat, 42 endomet- karsinoomat, ja 42 kirkas solu karsinoomat. Tähän tutkimukseen, 2 patologit (Chi Long Chen ja Chii-Hong Lee) seulotaan histologinen kohdissa ja valittujen alueiden edustavan syöpäsoluja. Yksi kudoksen ydin (1,5 mm halkaisijaltaan) kustakin näytteestä käytettiin detektiotasot (Ventana Benchmark GX, Tucson, AZ, USA).

Soluviljely

A2780 viljeltiin DMEM ja CPT kestävä A2780

R2000 munasarjasyöpäsoluja [19] kasvatettiin RPMI 1640, jotka sisälsi 10% FBS, 4 mM L-glutamiini, 4,5 g /l glukoosia, 1 mM natriumpyruvaattia ja 1,5 g /l natriumbikarbonaattia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

Western blot-analyysi

Proteiininäytteet erotettiin käyttäen natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin sähkön päälle polyvinylideenidifluoridi (PVDF), joita inkuboitiin primäärisellä vasta-aineella 4 ° C: ssa yön yli, ja sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua toissijainen immunoglobuliini G (IgG) -vasta-ainetta. Immunoreaktiivisia bändit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL) reagenssit PerkinElmer [20].

solunelinkykyisyysmääritys

Soluja (10

4 solua /kuoppa) viljeltiin on 96- kuoppalevyllä täydennetty viljelyalustaan. Soluja käsiteltiin tai käsittelemätöntä 48 tuntia, ja MTT-kantaliuos (5 mg MTT /ml fosfaattipuskuroitua suolaliuosta [PBS]) lisättiin kasvattamalla 2 tuntia. Absorbanssi mitattiin käyttämällä spektrofotometriä 560 nm: ssä. Tyhjä liuos, joka sisältää vain DMSO: ta pidettiin käsittelyssä ohjaus [21].

Virtaussytometria

Soluja käsiteltiin testiyhdisteiden kanssa 0-24 tuntia, sitten ne trypsinoitiin, pelletoitiin ja pestiin PBS: ssä . Cell näytteet analysoitiin käyttäen FACS Canto-II virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Anneksiini-V: n ja propidiumjodidin (PI) kaksinkertainen värjäys suoritettiin valmistajan protokollan [22].

Solusyklianalyysiä

Solut ympättiin tiheydellä 2 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja synkronoitu maljaamalla RPMI1640: ssa 24 h solusyklin analyysi. Soluja inkuboitiin 2 ml: aan täydellistä RPMI 1640, jossa 5 uM EVO ja 10 uM CPT 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin trypsiinillä ja pestiin kerran PBS: llä. Ennen virtaussytometria, soluja inkuboitiin 10 ug /ml RNaasi A: ta 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Sitten solut värjättiin 5 ug /ml Hochest 33342 ja 20 ug /ml PI: ssa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä [23]. Kymmenentuhatta solua näytettä kohti analysoitiin BD FACSCalibur virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Solusyklin analysoitiin MODFIT ohjelmistoa.

DNA rentoutumista määrityksessä

inhiboiva vaikutus EVO on superkierteisen DNA-juosteessa rikkoutuminen aiheuttama TOP1 arvioitiin. Plasmidi-DNA (200 ng) inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan 20 ui reaktioliuosta (40 mM Tris-asetaattia, 100 mM NaCl, 2,5 mM MgCl

2, ja 0,1 mM EDTA; pH 7,5), että läsnäolo ja poissaolo on 0-5 uM estäjä; 0,5 yksikköä TOP1 entsyymiä lisättiin reaktion käynnistämiseksi 30 minuuttia [24]. TOP1 aiheuttama DNA-säikeen rikkoutuminen osoitettiin muuntaminen kovalenttisesti suljettu rengasmainen kaksijuosteinen superkierteisen DNA rento muotoon.

Comet määritys (yksisoluiset geelielektroforeesin) B

määrittämiseksi laajuus DNA vaurioita solujen, komeetta määritykset suoritettiin Trevigen CometAssay kitin pienin muutoksin. A2780

R2000 soluja käsiteltiin TOP1 estäjiä 1 h. Lopullinen solutiheys oli noin 15000 solua /ml. Solususpensio sekoitettiin sitten alhaisessa lämpötilassa sulavaa agaroosia 37 ° C: ssa ja siirrettiin sen jälkeen objektilaseille. Leikkeitä elektroforeesi huoneenlämpötilassa ja sitten värjättiin SYBR Green I 5 min. Jokaisena dia, solutumissa tutkittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Yksittäiset hännän hetkiä laskettiin kuva-analyysi-ohjelmisto (Comet määritys Ohjelmistoprojekti, https://www.casp.of.pl/). Tail hetket laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: tail hetkellä = hännän DNA% (DNA: n prosenttiosuus häntää) x hännän pituus (pituus hännän) [24]. Keskiarvo ± keskivirhe (SE) laskettiin vähintään 50 solua kussakin testiryhmässä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen 2-tailed paritonta Studentin

t

testiä.

Computational molekyyli- telakka

X-ray kiderakenne ihmisen TOP1-DNA-kompleksi on haettu Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/pdb) telakointi tutkimuksiin. Lisäämisen jälkeen vetyatomia, saatu proteiini-DNA-kompleksi rakenne, käytettiin telakointisimulaatioiden. Chem3D 6.0 -ohjelmisto (CambridgeSoft, Cambridge, MA, USA) käytettiin rakentamiseen 3D-rakenteen EVO. Lisäksi tällainen rakenne optimoitiin pohjalta energian minimointia käyttämällä MM2 voimakenttä ja vähintään tehollisarvo (RMS) gradientti 0,05 telakointisimulaatioiden tehtiin käyttämällä GOLD ohjelmaa (versio 3.1) Silicon Graphics Octane työasema dual 270 MHz MIPS R12000 prosessorit. GOLD Ohjelma käyttää geneettistä algoritmia (GA) suorittaa joustavasti ligandia telakointisimulaatioiden. Hehkutus parametrit vetysidoksen ja van der Waals vuorovaikutuksia asetettiin 4,0 ja 2,5 Å, vastaavasti. GoldScore sopivuuskerroin haettiin teki telakointi aiheuttaa käyttämällä ulkoista energiapolitiikkaa WT = 1,375 [24].

Analyytti määrityksessä pintaplasmaresonanssin (SPR) Tunnistinsirussa

Human (h) TOP1 kytkettiin carboxylmethylated dekstraanin pinnalle GLM kapasiteetti siru protokollan mukaan kuvattu Bio-Rad ProteOn One Shot Kinetics Kit Käyttöohje pienin muutoksin. Liuokset EVO ja plasmidi-DNA valmistettiin suodatettiin ja josta kaasut oli poistettu reaktiopuskuria. Kaikki sitova kokeet suoritettiin 25 ° C: ssa jatkuvasti virtausnopeudella 100 ul /min ja TOP1 reaktiopuskuria (40 mM Tris-asetaatti [pH 7,5], 2,5 mM MgCl

2, 100 mM NaCl: a, ja 1 mM EDTA). Sitoutumisaffiniteettia proteiinien arvioitiin käyttämällä tasapainodissosiaatiovakiot (KD). KD määritettiin perusteella vakaan tilan affiniteetin istuva analyysi käyttämällä tuloksia ProteOn Manager 2.0 (Bio-Rad) [24].

Tuotanto lusiferaasin (Luc) /vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) A2780

R2000 soluja

in vivo

tutkimuksissa A2780

R2000 solut infektoitiin LVS sisältävien Luc tai GFP joka johtui sytomegalovirus promoottori. Kun istutetaan SCID-hiiriin, Luc- tai GFP-leimattuja A2780

R2000 soluja voidaan seurata käyttämällä

in vivo

bioluminesenssin kuvantamiseen, ja GFP-positiiviset solut voidaan eristää käyttäen virtauksen lajittelijan. Lyhyesti, A2780

R2000 soluja viljeltiin 6-kuoppaisilla levyillä siten, että ne saavutetaan 20% -40%: n konfluenssiin. Erityinen tiitteri median korjattu LV-tuottavia soluja lisättiin viljeltyihin soluihin. Levyjä sentrifugoitiin 1200 x

g

1 tunti. Välittömästi sentrifugoinnin jälkeen, 2 ml erityisten solujen väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyt sijoitettiin inkubaattoriin. Kaksi päivää sen jälkeen, kun spinokulaatiolla, GFP: n ilmentymisen tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla. GFP-positiiviset solut lajiteltiin käyttäen nontransduced solujen negatiivisena kontrollina [25].

Hiiri malleja leimatun kasvainten

A2780

R2000 soluja (10

6) sekoitettiin 500 ui DMEM: ä, ja ihon alle ympättiin 4 viikon ikäisiä SCID-hiirissä. Jälkeen 7 päivää, hiirille annettiin intraperitoneaalisesti (IP) EVO injektiot (100 mg /kg) (5 hiirtä ryhmää kohti). Kasvaimen koko mitattiin käyttäen jarrusatulat 3 päivän välein, ja bioluminisenssimääri- kasvainten oli kuvataan useilla noninvasive IVIS-200 optinen järjestelmä (Xenogen, Alameda, CA, USA) ja Living Image Ohjelma (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Hiiret intraperitoneaalisesti 300 ui PBS: ää, joka sisälsi 10 mg /ml beetle lusiferiinin (Promega, Madison, WI, USA) ennen kuin ne saivat isofluraani-välitteisen anestesian. Määrällisiä bioluminesenssi intensiteetti (qBI) määritettiin koko fotonivuon sekunnissa [26]. Lopussa kokeen, hiiret lopetettiin, ja kasvaimet leikattiin irti ja punnittiin. Kaikki hiiri kokeet suoritettiin ohjeiden mukaisesti ja ennakkohyväksyntää Institutional Animal Care ja käyttö komitean Taipei Medical University. Kaikki Leikkaus suoritetaan isofluraani välittämän anestesian, ja pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Immunohistocytochemistry

Immunohistocytochemical ja terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin dUTP nick end merkinnät (TUNEL) munasarjasyöpä soluja, korjattu viikolla 4, suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Formaliinikiinnitetyt kudokset upotettiin parafiiniin, leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Vertailemista varten kaksi luokitusmenetelmää, opiskelijan

t

testi tilastollinen analyysi.

Tulokset

yli-ilmentyminen TOP1 korreloi pitkälle ja huonon ennusteen munasarjojen syöpä

selvitettävä, TOP1 ilmentyminen munasarjasyöpää oli yhteydessä huonoon säilymiseen. Kudoksille 156 munasarjasyöpä potilasta tutkittiin käyttäen IHC värjäystä. Vasta-spesifisyys ja pisteytys kriteerit määriteltiin ja laukoi tasojen 0-3 (kuvio 1A). Tutkimme 30 sarjaa Hyväksytty näytteiden primääri munasarjojen kasvain ja normaaleissa kudoksissa. TOP1 ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi kasvaimet kuin normaaleissa kudoksissa, kuten arvioidaan käyttäen IHC (kuvio 1 B,

p

0,001). Me tutkimme seuraavaksi suhdetta TOP1 ekspressiotasot ja kokonaiselinaika (OS), joka määritellään potilaalla on munasarjasyöpä voi kuolla suoraan tästä taudista tai liity syy. Kaiken kaikkiaan 110 156 potilasta oli korkea TOP1 ekspressiotasot (pistein on 2+ tai 3+), ja loput 46 potilailla oli alhainen TOP1 ekspressiotasoja (pistein 0 tai 1+). Lisäksi potilailla, joilla on korkea TOP1 ekspressiotasot oli huono OS verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen TOP1 ekspressiotasoja. Tutkimme panos TOP1 mRNA lauseke OS munasarjasyöpä potilaiden käyttäen KM piirturi (https://kmplot.com/analysis/), jossa arvioitiin vaikutuksen 22277 geenien säilymiselle 1464 munasarjasyöpä potilaille. Tausta tietokanta perustettiin käyttäen geenien ilmentyminen tietojen ja selviytymisen tietoja 1436 potilasta, jotka oli ladattu Gene Expression Omnibus (GEO, Affymetrix HGU133A ja HGU133 + 2 mikrosiruja). OS-analyysi osoitti, että korkea TOP1 mRNA ilmaisu osoitti huono selviytyminen munasarjasyöpä potilaiden (riskisuhde (HR): 1,28,

p

= 0,00062) (S1 Kuva). Tulokset osoittivat, että korkea TOP1 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä huonoon ennusteeseen (log-rank

p

= 0,024, Kuva 1C). Lisäksi χ

2 analyysin välillä TOP1 tasojen ja kliinis ominaisuudet potilaista osoitti, että TOP1 yli-ilmentymisen munasarjasyöpää liittyi kansainvälisen liiton gynekologien ja synnytyslääkärit (FIGO) vaihe (

p

0,044; S1 Taulukko). Vuonna univariate analyysissä korkea TOP1 lauseke (HR: 2,465; 95%: n luottamusväli (CI): 1,139-5,335;

p =

0.022, taulukko 1), kasvain vaihe (HR: 8,843; 95% CI: +4,200-18,619;

p

0,0001, taulukko 1) ja kasvaimen uusiutumisen (HR: 0,453; 95% CI: 0,243-0,841;

p =

0,012; taulukko 1) olivat kaikki merkitsevästi korreloi OS. Lisäksi Tautivapaa elossaolo (DFS), aika hoidon jälkeen, jona ei tautia todettu, liittyi myös TOP1 ilme (HR: 1,939; 95% CI: 1,018-3,695;

p =

0,044 ), syöpä vaihe (HR: 5,669; 95% CI: +3,143-10,225;

p

0,0001), kemoterapian (HR: 1,774; 95% CI: 0,999-3,151;

p =

0,050), ja toistuminen (HR: 7,775; 95% CI: +4,515-13,391;

p

0,0001). Vuonna Monimuuttuja-analyysissä OS oli käänteisesti yhteydessä TOP1 ilme (HR: 2.290; 95% CI: 1,055-4,971;

p

= 0,036); kasvain vaiheessa (HR: 0,071; 95% CI: +0,030-+0,167;

p

0,0001); ja kemoterapia (HR: 0,330; 95% CI: 0,151-0,721;

p =

0,005), ja DFS oli kääntäen liittävät TOP1 ilme (HR: 2,223; 95% CI: 1,150-4,299;

p =

0,018), syöpä vaihe (HR: 0,150; 95% CI: ,072-,310;

p

0,001), ja toistuminen (HR: 7,685; 95% CI: +4,294-13,753;

p

0,001, taulukko 1). Tässä tutkimuksessa tulokset osoittivat yhdistyksen välillä TOP1 ilmaisun ja syövän etenemistä.

(A) Oikea, määrällinen mukaan ydin- IHC TOP1 ilmaisun munasarjojen kasvaimet verrattuna pariksi normaaleissa kudoksissa. Vasen, edustavat kuvat IHC värjäytymisen ilmentävien solujen TOP1 30 pariksi yksilöiden kasvain ja normaaleissa kudoksissa; Tulokset laskettiin käyttäen kaavaa värjäytymisen intensiteetti × prosenttiosuus värjättyjen solujen. (B) Kymmeniä 0-3 + osoittaa TOP1 tasoa edustava munasarjasyövän kudoksiin. (C) Kaplan-Meier (KM) juoni eloonjäämisaste 155 munasarjasyöpä potilaille, kerrostunut sen perusteella TOP1 tasoja. (D) KM käyrä taudista vapaan eloonjäämisen 155 munasarjasyöpäpotilaalle, kerrostunut perusteella TOP1 tasoilla.

EVO sitoutuu TOP1 ja estää sen DNA katalyysi aktiviteetti

EVO on TOP1 estäjä, joka sitoutuu TOP1-DNA-kompleksi sivustoja. Tietokoneavusteinen molekyyli mallia käytettiin arvioimaan telakointi EVO on TOP1. Vaikka EVO hallussaan epätasaisen rakenne, tämä yhdiste voi interkalatoi vuonna välejä DNA perustaa muodostaa π-π pinottava (kuvio 2A). SPR-koe suoritettiin sen määrittämiseksi, sitoutumisaffiniteetin ja edelleen luonnehtia lääkeainetta sitovia. Rekombinantti hTOP1 kovalenttisesti kytketty mikropiirin pinnalla, yhdistelmä pUC19-plasmidi-DNA (1,0 ug /ml), ja EVO (0-2 uM), määritetään, että virtausnopeus analyytin anturin läpi siru, ja resonanssi yksikön (RU) kasvoi pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 2B), jonka KD-arvo 6,92 x 10

-22 laskettuna ProteOn Manager 2.0. Virtausnopeus analyytin ilman pUC19-DNA ei lisännyt RU. Tulokset muodostavat sitoutumisen EVO on TOP1. Edelleen vahvistaa hTOP1-estävä aktiivisuus EVO, käytimme hTOP1 aiheuttama superkierteistä PBS (SK +) plasmidi rentoutumista määritysjärjestelmään. Superkierteisen DNA liikkui nopeammin agaroosigeeleillä kuin ei rento rengasmainen DNA, kuten on esitetty ohjaus- (kaistat 1 ja 2). EVO esti hTOP1 katalyyttinen rentoutuminen (kaistat 3-5; 1-5 uM) pitoisuutena riippuvalla tavalla (kuvio 2C), kun taas se ei yksinään aiheuta muutosta DNA topologiassa (kaista 6).

( A) Tietokoneavusteinen molekyylimallinnusta EVO laiteliitännälle TOP1. (B) Pintaplasmoniresonanssianalyysi sensorigrammin vuorovaikutuksen immobilisoitua rekombinantti ihmisen (h) TOP1 ja EVO (0-2 uM). Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta. (C) EVO esti DNA käynnissä hTOP1 aiheuttama muuntaminen superkierteisen DNA rento suljettu rengasmainen DNA. pUC19 (0,2 ug) plasmidi-DNA: ta inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min hTOP1 läsnä ollessa EVO (0-5 uM).

EVO esillä sytotoksinen vaikutus CPT-resistenttejä A2780

R2000 soluja

Vertasimme herkkyydet CPT-resistenttien solujen (A2780

R2000) ja vanhempien soluja (A2780) ja kemoterapeuttisen lääkkeen, CPT, ja EVO. A2780

R2000 soluja osoittivat suuremman vastuksen sytotoksisia vaikutuksia CPT kuin näytteillä A2780-soluja (noin 19-kertainen korkea, kuvio 3A). EVO aiheutti samanlaisia ​​sytotoksisia vaikutuksia A2780 ja A2780

R2000 solujen IC

50-arvot 2,18 ja 2,38 uM, vastaavasti (taulukko 2). Nämä tiedot osoittavat, että CPT-resistenttejä munasarjasyöpä solut ovat herkempiä EVO kuin CPT. Lisäksi apoptoottiset jae jälkeen EVO ja CPT hoito määritettiin käyttäen FITC /PI virtaussytometria. EVO laukaisema apoptoosin A2780

R2000 soluja tapahtui ajan riippuvaisella tavalla (20,24% 12 h, 26,53% 24 h, ja 37,89% 48 h) (kuvio 3B). Hoito elinkelpoisten solujen TOP1 estäjät voivat vahingoittaa DNA ja saada reagoiva korjausmekanismeja. Komeetta määritys suoritettiin seuraamaan EVO aiheuttaman DNA-vaurion ja A2780

R2000 soluja. EVO hoito (25 uM) 1 tunti tuotetaan parannettu DNA pyrstön, mikä viittaa elektroforeettinen liikkuvuus DNA-fragmenttien. Käänteisesti ytimet valvonta- ja CPT-käsitellyistä soluista esitteli kompakti pyöreä alue fluoresenssin, ilman DNA häntää havaitaan. DNA taukoja edustaa pyrstön alue laskettiin ja verrattiin (

p

0,05, vs. käsittelemättömät solut, käyttämällä Studentin

t

testi) (kuvio 3C ja 3D). Fosforylaatio histoni H2A.X (γ-H2A.X), biomarkkereiden DNA double-säikeen katkoksia, havaittiin soluissa lisätarkastuksia. Immunoblot-määritys suoritettiin vahvistamaan vaikutusta EVO on γ-H2A.X tasoja, ja tulokset osoittivat, että EVO lisäsi γ-H2A.X proteiinin tasot pitoisuudesta riippuvalla tavalla 6 h hoidon jälkeen. Verrattuna CPT hoitoa, 0-10 uM EVO hoito lisäsi merkittävästi suhteellista γ-H2A.X tasot (kuvio 3E). GAPDH jatkuvasti ilmaisua käytettiin sisäisenä kontrollina.

(A) elinkelpoisuus A2780 ja A2780

R2000 soluissa arvioitiin 48 tunnin kuluttua hoidon kamptotesiinin (CPT) tai EVO käyttämällä MTT-määritystä, ja IC

50-arvot määritettiin. (B) FITC /PI virtaussytometrillä A2780

R2000 soluja käsiteltiin EVO (10 uM) ja 12-48 tuntia verrattuna soluihin käsiteltiin CPT (10 uM) ja 12-48h. (C). EVO aiheuttama DNA-vaurioita A2780

R2000 soluja. Solut olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin CPT ja EVO (25 uM) 1 tunti ja analysoitiin sitten käyttämällä neutraalia comet, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Kuvat ovat (200 x). (D) Histogrammi häntää hetkellä piirretty kunkin hoidon edellytys.

p

arvojen vertailuja (merkitty *) olivat 0,05 määritettiin käyttämällä 2-tailed Opiskelijan

t

testiä. (E) γ-H2A.X tasot jälkeen EVO tai CPT hoitoa A2780

R2000 soluja. Soluja käsiteltiin (0-10 uM) 6 tuntia, ja solulysaatit immunoblotattiin vastaisella vasta-aineella γ-H2A.X. GAPDH jatkuvasti ilmaisua käytettiin sisäisen valvonnan.

EVO aiheuttama G

1 vaiheen pysähtymisen ja hitaus AMPK aktivaation CPT kestävä A2780

R2000 soluja

Distribution soluja 3 vaihetta (G

0 /G

1, S, ja G

2 /M) solusyklin määritettiin käyttämällä virtaussytometria-analyysi, ja osuus vanhempien A2780 solut oli 64,84 ± 0,63, 27,27 ± 0,33, ja 7,94 ± 0,36, tässä järjestyksessä. EVO hoito (5 uM 48 tuntia) kasvattanut solujen G

2 /M vaiheessa (25,82 ± 1,38,

p

0,05). Osuus A2780

R2000 soluja G

0 /G

1, S, ja G2 /M vaiheissa oli 53,2 ± 0,36, 15,93 ± 0,66, ja 28,20 ± 1,16, tässä järjestyksessä. EVO hoito kasvattanut solujen G

0 /G

1 vaihe (58,7 ± 0,24,

p

0,01), kun taas mitään merkittävää muutosta ei havaittu osuus solujen G

2 /M vaiheessa (30,53 ± 0,19) (kuvio 4A). EVO indusoi G

2 /M pidätys vanhempien A2780 soluissa, kun taas se indusoi menetys G

2 /M pidätyksen ja vahvistus G

1 pidätys CPT kestävä A2780

R2000 soluja. Ero solusyklin jakelun CPT (S2 ​​kuvassa) ja EVO hoitoja havaittiin CPT-resistenttien solujen verrattuna sen vanhempien soluja. Lääkeresistenssin oli raportoitu liittyvän tiiviimmän AMPK aktiivisuutta. Sen määrittämiseksi, onko AMPK aktivoidaan A2780

R2000, solut käsiteltiin CPT (10 uM) ja 0-3 tuntia, ja sitten Western-blottaus suoritettiin tutkimaan määrän vaikuttavaa fosforyloitua muotoa AMPK (fosfo-Thr172 ). CPT hoito tehostetun fosfo-AMPK tasoilla A2780

R2000-soluissa (kuvio 4B, vasemmalla). Lisäksi fosfo- AMPK tason jälkeen EVO hoidon 0-3 h arvioitiin. EVO hoito ei aiheuttanut pysyviä fosfo-AMPK tasoja (kuvio 4B, oikealla), mikä viittaa siihen, että A2780

R2000 soluja käyttää erilaisia ​​vasteita verrattuna niiden vanhempien A2780 soluissa, sen jälkeen CPT ja EVO hoitoja. CPT ja EVO hoitoja paljastui yhtäpitävät AMPK myötävirtaan kohde, fosfori-asetyyli-CoA karboksylaasi (ACC) A2780

R2000 soluissa (kuvio 4C).

(A) Cell cycle jakaumat A2780 ja A2780

R2000 soluja jälkeen EVO hoidon (5 uM) 48 tuntia. Muutokset solusyklin arvioitiin sen perusteella, virtaussytometrian tuloksia. Tiedot ovat edustajia useita kokeita samanlaisin tuloksin. (B) Immunoblotti AMPK fosforylaation jälkeen EVO (10 uM) hoito 0-3 tuntia. (C) Immunoblotti fosfo-ACC jälkeen EVO (10 uM) hoitoa 0-24.

Lisäksi altistuminen A2780

R2000 solut 10pM CPT tai EVO 0- 24 h tuotettu vaste asiakkuutta fosforylaatioon c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) (Thr183 /Tyr185) ja ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) 1/2 (Thr202 /Tyr204) eri ajoitukset. JNK fosforylaatio aloitettu 3 h seuraavat CPT hoidon ja sinnikkäästi nousi jopa 24 tuntia, kun taas EVO hoito ei lisännyt fosfo-JNK. Fosforylaatiota ERK aloitettu 6 h seuraavat CPT hoidon ja sinnikkäästi nousi 24 h, kun taas EVO hoito ei lisännyt fosfo-ERK. Kumpikaan CPT eikä EVO hoito tehostetun fosforylaatiota (Thr180 /Tyr182) ja A2780

R2000 soluja (S3 kuvassa).

EVO esti soluproliferaatiota vierassiirrännänmallissa hiirimallissa

in vivo

tutkimuksissa A2780

R2000 soluja, jotka ilmentävät Luc tai GFP-geenit eristettiin ja rikastettu virtauksen lajittelija ja sitten ruiskutetaan ihonalaisessa SCID-hiirten (10

6 solua /hiiri) vahvistaa munasarjasyöpä ksenograftimallissa. Seitsemän päivän kuluttua soluistutusryhmä, hiiret satunnaistettiin kontrollina tai käsitellyissä ryhmissä (100 mg /kg, IP EVO hoito).