Krooninen sairaus

tiivistelmä

työllisyys anti-kasvutekijän reseptorin (EGFR) vasta edustaa selkäranka terapeuttisia vaihtoehtoja metastasoituneen kolorektaalisyövän (metastasoituneen kolorektaalisyövän). Kuitenkin tämä hoito on heikosti tehokkaita tai tehottomia valitsemattomat potilailla. Mutaatiot KRAS, BRAF ja PIK3CA geenit ovat viime aikoina tullut paras ennakoiva tekijät matala /poissa vastaus EGFR-täsmähoitoihin. Koska tarvitaan tehokkaita hoitovaihtoehtoja metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaille on tehty kyseiset mutaatiot, tässä lyhyessä raportissa tarkastelimme kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus proteaasinestäjä gabeksaatilla mesilate, yksin ja yhdessä anti-EGFR monoklonaalinen vasta-aine setuksimabi, paneelissa ihmisen CRC solulinjoja kätkeminen eri ilmentymiskuvio villityypin /mutatoitunut KRAS, BRAF ja PIK3CA geenejä. Saadut tulokset osoittivat, että gabeksaatilla mesilate inhiboi merkittävästi kasvua, invasiivisia mahdollisia ja kasvaimen angiogeneesissä kaikissa CRC solut Tässä tutkimuksessa käytetyt (mukaan lukien ne, kätkeminen dual KRAS /PIK3CA tai BRAF /PIK3CA mutaatio), kun taas setuksimabi vaikuttaa näitä parametreja vain CRC solujen KRAS, BRAF ja PIK3CA villin tyypin. Huomattavaa on, että kasvaimen kasvua estävä teho gabeksaatilla mesilate ja setuksimabi yhdistettynä havaittiin olevan ei parempia kuin mitä havaittiin gabeksaatilla mesilate monoterapialla. Kaiken kaikkiaan nämä alustavat tulokset viittaavat siihen, että gabeksaatilla mesilate voisi olla lupaava terapeuttinen vaihtoehto metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaille, erityisesti niille harboring KRAS, BRAF ja PIK3CA mutaatioita, joko monoterapiana tai lisäksi standardin solunsalpaajahoitojen. Lisätutkimukset paremmin selvittämiseksi gabeksaatilla mesilate vaikutusmekanismi in CRC solut siis perusteltua.

Citation: Brandi G, Tavolari S, De Rosa F, Di Girolamo S, Agostini V, Barbera MA, et al. (2012) Teho kasvaimiin tehokkuus proteaasinestäjä gabeksaatilla mesilate in koolonkarsinoomasoluissa Harbouring KRAS, BRAF ja PIK3CA mutaatioiden. PLoS ONE 7 (7): e41347. doi: 10,1371 /journal.pone.0041347

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ”, Italia

vastaanotettu: 17 helmikuu 2012; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 24 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Brandi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viimeisten viidentoista vuoden aikana käyttöön osoitteessa ainakin kuusi keskeistä huumeita (oksaliplatiinia, irinotekaania, kapesitabiini, bevasitsumabi, setuksimabi ja panitumumabi), kun ”aikakauden” 5-fluorourasiilin ainoana lääkkeenä, on parantunut kokonaiselinajan mediaani metastaattisen kolorektaalisyövän (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) potilasta korkeintaan 24 kuukautta [ ,,,0],1], [2]. Työllisyysaste anti-kasvutekijän reseptorin (EGFR) vasta-aineet panitumumabin ja setuksimabi, joko monoterapiana tai lisäksi standardin kemoterapiahoitojen edustaa selkäranka hoitovaihtoehtoja hoitoon metastasoituneen kolorektaalisyövän. Kuitenkin satunnaistetuissa kontrolloiduissa kokeissa on saatu vakuuttavia todisteita siitä, että EGFR-täsmähoitoihin on heikosti tehokkaita tai tehottomia valitsemattomat metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaalla. Viime vuosina aktivoivat mutaatiot kodoneissa 12 ja 13 KRAS onkogeenin (KRAS

G12V ja KRAS

G13D) ovat nousseet paras ennakoiva tekijät matala /poissa vaste anti-EGFR Näiden potilaiden joko ensimmäisellä tai myöhempi linjat hoidon [3] – [5]. Tästä syystä metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaat ovat nyt profiloitu KRAS-mutaatio ja työllisyyden setuksimabin ja panitumumabi rajoittuu tällä hetkellä vain nuo varustettujen KRAS villityypin suositusten mukaisesti Euroopan Medical viraston ja American Society of Clinical Oncology [6] . Vaikka läsnäolo villin tyypin KRAS näyttää olevan edellytys vaste EGFR-täsmähoitoihin, jopa 50-65% on metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaat eivät hyötyä tästä hoitoa, koska ylimääräinen luontainen resistenssimekanismeja [7]. Tässä suhteessa osallistuminen BRAF

V600E ja PIK3CA

H1074R on eksonissa 20 mutaatioita epäonnistuminen sellainen hoito on viime aikoina noussut [7] – [11]. Koska ei ole tehokasta täsmähoitoihin, löytämään uusia terapeuttisia vaihtoehtoja metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaalla on mutatoitunut KRAS, BRAF ja PIK3CA geenejä edustaa näin ollen voimakas alueen tutkimuksessa.

proteaasi-inhibiittorin gabeksaatilla mesilate on osoitettu käyttämään merkittävää kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta CRC-soluissa, sekä in vitro että in vivo [12]. Kuitenkin vaikutus tämän lääkkeen, yksin tai yhdessä setuksimabin, ihmisen CRC soluissa kätkeminen eri ekspressiokuviota villin tyypin /mutatoitunut KRAS, BRAF ja PIK3CA edelleen epävakaa. Tämä tutkimus pyrkii Tutkimme hypoteesia.

Tulokset

alustavasti valittu paneelin ihmisen CRC solujen kätkeminen eri ekspressiokuviota villin tyypin /mutatoitunut KRAS, BRAF ja PIK3CA geenejä. Tätä varten, joka perustuu Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer (KOSMINEN) tietokantaan (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/) ja tutkimus Jhawer et al. [13], CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT-116 CRC-solut valittiin (katso taulukko 1 niiden vastaavien KRAS, BRAF ja PIK3CA tila). Erityisesti ei CRC solulinjan yhdessä esiintyvät KRAS ja BRAF mutaatiot löydettiin ja mukana tässä tutkimuksessa, mukaan aiempien raporttien esittää mallia molemminpuolisen poissulkemisen KRAS ja BRAF-mutaatio ihmisen CRC [14]. Vaikutus gabeksaatilla mesilate, yksin ja yhdessä setuksimabin, sitten tutkittiin päälle CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT-116 solujen kasvua, invasiivisia potentiaali ja kasvaimen aiheuttamaa angiogeneesiä , koska ne edustaa kolmea perusprosesseihin syövän synnyssä ja etenemisessä.

kuten kuviossa 1, 24 ja 48 tuntia ja setuksimabihoidon (100 ug /ml) todettiin vaikuttavan solujen elinkelpoisuuden ainoastaan CRC -solut villin tyypin KRAS, BRAF ja PIK3CA geenit (CACO-2 ja SW48), odotetusti. Sitä vastoin gabeksaatilla mesilate (0,1-1 mM) indusoi huomattavasti aikaa ja annoksesta riippuvaa laskua tämän parametrin kaikissa CRC solulinjoja mukana tutkimuksessa (CACO-2: IC

50 48 tuntia = 0,31 ± 0,01; SW48 : IC

50 48 tuntia = 0,33 ± 0,01; HT-29: IC

50 48 tuntia = 0,55 ± 0,03 mM; Colo205: IC

50 48 tuntia = 0,46 ± 0,02; SW480: IC

50 48 tuntia = 0,45 ± 0,02 mM; SW620: IC

50 48 tuntia = 0,39 ± 0,02; RKO: IC

50 48 tuntia = 0,49 ± 0,01 mM; LS174T: IC

50 48 tuntia = 0,59 ± 0,03; HCT-116: IC

50 48 tuntia = 0,56 ± 0,0 3 mM). Havaitsimme, että vaikutus sai aikaan solujen elinkelpoisuuden gabeksaatilla mesilate yksinään oli samanlainen kuin havaittiin, kun tämä lääke annettiin yhdistelmänä setuksimabin 100 ug /ml (kuva 1).

Arviointi MTT: llä on CACO-2 , SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT-116 solujen elinkykyä 24 ja 48 h setuksimabihoidon 100 ug /ml ja gabeksaatilla mesilate 0,1-1 mM, yksin ja yhdessä. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin. Kunkin solulinjan, keskiarvo käsittelemättömien näytteiden oletettiin 100% ja keskiarvot käsiteltyjen solujen esitettiin graafisesti prosentteina suhteessa niiden verrokkeihin. Cetux: setuksimabi; GM: gabeksaatilla mesilaattina. * P 0,05; ** P 0,001; *** P: ei merkittävää.

Seuraavaksi tutkimme vaikutus näiden kahden lääkkeiden CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT- 116 invasiivisuus. Hoito 6 h gabeksaatilla mesilate 1 mM vähensi invasiivisen potentiaalin kaikki CRC solulinjat testattiin (CACO-02:53%, SW48:42%, HT-29:45%, Colo205:43%; SW480:55% , SW620:69%, RKO: 63%; LS174T: 54%, HCT-116:52%) (kuvio 2). Erityisesti, kuten lasku ei johtunut sytotoksisen vaikutuksen tämän lääkkeen, joka on vahvistettu Rinnakkaisessa kokeessa, jossa ei ole merkittävää muutosta solujen elinkelpoisuuden kontrollin ja käsiteltyjen välillä soluja havaittiin tähän aikaan hoidon (tuloksia ei ole esitetty). Toisaalta, 6 tuntia ja setuksimabihoidon 100 ug /ml ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia CRC solun invasiivisia mahdollisia, paitsi CACO-2 ja SW48-solut, joissa 25% ja 22% inhibitio havaittiin, vastaavasti. Jälleen kun tämä lääke käytettiin yhdistelmänä gabeksaatilla mesilate, vaikutus sai aikaan oli samanlainen kuin havaittiin gabeksaatilla mesilate monoterapialla (kuva 2).

arviointi Boyden kammio invaasiomääritys CaCO-2, SW48 , HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT-116 invasiivisia potentiaali jälkeen 6 tuntia ja setuksimabihoidon 100 ug /ml ja gabeksaatilla mesilate 1 mM, yksin ja yhdessä. Kunkin solulinjan, keskiarvo käsittelemättömien näytteiden oletettiin 100% ja keskiarvot käsiteltyjen solujen esitettiin graafisesti prosentteina suhteessa niiden verrokkeihin. Valokuvia tunkeutuvat solut edustavat kolmen erillisen kokeen vastaavia löydöksiä. Cetux: setuksimabi; GM: gabeksaatilla mesilaattina. Mitta-asteikko: 50 um. * P 0,05; *** P: ei merkittävää.

Lisäksi arvioimme vaikutus setuksimabin ja gabeksaatilla mesilate kasvainten aiheuttamaa angiogeneesiä. Erittäin voimakas estävä vaikutus tämän parametrin havaittiin, kun tarkastelimme toimintaa gabeksaatilla mesilaattina yksin. Itse asiassa 24 tunnin inkubointi EA.hy926-solujen elatusaine on CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT-116-solujen, aiemmin hoidettu 6 tuntia tämän lääkeaineen annoksena 1 mM, estää lähes täysin endoteelin solujen erilaistumista kapillaari-rakenteita, kuten on esitetty, että läsnä on toisiinsa verkon anastomosing solujen vertailunäytteet sekä pallomaisia ​​soluja, eristetty tai yhteen pienissä möhkäleitä, ja käsiteltiin niitä (kuvio 3 ). Myös tämän parametrin, setuksimabi yksin (100 ug /ml) todettiin olevan kohtalaisen tehokkaita vain CRC solulinjoissa villin tyypin KRAS, BRAF ja PIK3CA geenit (esto-putken muodostumiseen indeksi, 22% ja 20% CACO-2 ja SW48-solut, vastaavasti). Vahvan eston kasvaimen aiheuttamaa angiogeneesiä gabeksaatilla mesilate yksin annoksella 1 mM, vaikutus tämän lääkkeen yksinään ja yhdistelmänä setuksimabin arvioitiin myös annoksella 0,1 ja 0,5 mM. Kuitenkin myös näillä annoksilla, anti-angiogeeninen vaikutus näkyviin gabeksaatilla mesilate plus setuksimabi ollut parempi kuin mitä havaittiin gabeksaatilla mesilate palveluksessa monoterapialla (tuloksia ei ole esitetty).

arviointi in vitro Matrigel angiogeneesimääritys ja EA.hy926 endoteelisolujen solujen erilaistumista kapillaari-rakenteita, kun 24 tunnin inkubaation jälkeen esikäsitelty väliaine on CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT-116-solujen, aiemmin hoidettu 6 hrs Setuksimabihoitoa 100 ug /ml ja gabeksaatilla mesilate 1 mM, yksin ja yhdessä. Putken muodostumiseen indeksi arvioitiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Kunkin solulinjan, keskiarvo käsittelemättömien näytteiden oletettiin 100% ja keskiarvot käsiteltyjen solujen esitettiin graafisesti prosentteina suhteessa niiden verrokkeihin. Valokuvia edustavat kolmen erillisen kokeen vastaavia löydöksiä. Cetux: setuksimabi; GM: gabeksaatilla mesilaattina. Mitta-asteikko: 50 um. * P 0,05; ** P 0,001; *** P: ei merkittävää.

Kaiken kaikkiaan nämä havainnot lisäksi vahvistaa vasteen puute setuksimabista CRC solujen KRAS, BRAF ja PIK3CA mutaatiot osoittavat, että gabeksaatilla mesilate pystyy käyttämään merkittävää kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta CRC -solut joko villin tyypin tai mutantit KRAS, BRAF ja PIK3CA geenejä, joiden teho verrattavissa niihin, kun sitä käytetään yhdessä anti-EGFR-vasta-aineita.

keskustelu

Henkilökohtainen hoito on houkutteleva tavoite onkologian. Tähän mennessä syöpä Genomikartoituksen on tullut tehokas työkalu tunnistaa syöpään liittyvien mutaatioiden ja valita potilaita, jotka voisivat hyötyä erityistä terapeuttista hoito. Tässä yhteydessä analyysi KRAS-mutaatio on nopeasti kasvanut terapeuttinen indeksi EGFR kohdistetun hoidon metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilailla rajoittaen tämän hoidon vain nuo harboring KRAS villityypin. Vaikka lisävalidointia tarvitaan ennen mahdollista soveltaminen kliinisissä käytännöissä, on käynyt selväksi, että BRAF ja PIK3CA ylimääräisiä genotyypityksen voisi merkittävästi parantaa objektiivinen hoitovaste näillä potilailla. Todellakin, aktivoimalla KRAS, BRAF ja PIK3CA mutaatiot pystyvät kiertämään EGFR farmakologinen esto, jolloin tuloksena on konstitutiivisen aktivaation mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin ja AKT polkuja, tiedetään olevan keskeinen rooli syövän synnyssä ja etenemiseen [15]. Mitä terapeuttiset yhteydet, tämä viittaa siihen, että myös metastasoitunutta kolorektaalisyöpää sairastavien potilaiden mutatoitunut BRAF ja PIK3CA geenien saa vähän tai ei lainkaan hyötyä EGFR-täsmähoitoihin. Erityisesti KRAS, BRAF ja PIK3CA mutaatiot ovat yleisesti käytössä (jopa 50-60% kokonaisuudessaan) CRC potilailla [14]. Tästä syystä löytämään uusia hoitovaihtoehtoja tehokkaita metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilailla, joissa on tällaisia ​​mutaatioita edustaa tällä hetkellä intensiivisesti alueen tutkimuksen [11], [16] – [18].

proteaasinestäjä gabeksaatilla mesilate on huume rutiininomaisesti kliinisessä käytössä Italiassa, Japanissa ja Koreassa akuutin haimatulehduksen ja yleistynyt suonensisäinen hyytyminen, sekä ennaltaehkäisyyn jälkeisen endoskooppinen retrogradinen kolangiopankreatikografia haimatulehdus [19], [20]. Erityisesti gabeksaatilla mesilate toksikologiset on testattu ihmisillä ja vakavia sivuvaikutuksia ovat harvoin kuvattu. Mielenkiintoista on, että edellinen prekliinisissä tutkimuksissa, tämä lääke osoittanut voimakas kasvaimia estävä aktiivisuus, kuten estämällä CRC ensisijaisen kasvaimen kasvua ja metastaaseja nude-hiirissä [12].

Tämä prekliinisen tutkimuksen tavoitteena oli selvittää oletetun kasvaimia torjuvaa tehoa gabeksaatilla mesilate, yksin ja yhdessä anti-EGFR monoklonaalinen vasta-aine setuksimabi, paneelissa ihmisen CRC solulinjojen kätkeminen eri ekspressiokuviota villin tyypin /mutatoitunut KRAS, BRAF ja PIK3CA geenejä. Saadut tulokset (paitsi vahvistaa puute vastaus Setuksimabin CRC soluissa, joissa on tällaisia ​​mutaatioita) osoitti, että gabeksaatilla mesilate on voinut käyttää laajaa kasvaimen kasvua estävän vaikutuksen tällaisissa soluissa, pystyy merkittävästi vaikuttaa solujen elinkykyyn, invasiivisia potentiaali ja kasvaimen aiheuttamaa angiogeneesiä kaikissa testatuissa solulinjoissa tässä tutkimuksessa, mukaan lukien ne, kätkeminen dual KRAS /PIK3CA tai BRAF /PIK3CA mutaatio. Tehokkuus gabeksaatilla mesilate monoterapialla havaittiin olevan verrattavissa niihin, kun tämä lääke on käytetty yhdistelmänä setuksimabin, mikä tarkoittaa, että kasvaimen kasvua estävä tehokkuus näiden lääkkeiden yhdistelmää ei ollut ylivoimainen kuin gabeksaatilla mesilate palveluksessa monoterapialla.

Erityisesti solujen kasvua, joka invasiivisia potentiaali ja kasvaimen angiogeneesissä ovat kolme keskeistä prosesseja syövän kehitystä ja metastatisation, mikä edustaa houkutteleva kohde syövän hoitoon. Koska itse asiassa, monet terapeuttisia strategioita, jotka perustuvat integraation selektiivisiä näistä reiteistä ovat nyt laajalti tutkitaan prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa. Tässä yhteydessä otetaan huomioon myös hyvät toksikologiset, alustavat tulokset osoittivat tämän lyhyen raportin mukaan gabeksaatilla mesilate voisi olla lupaava terapeuttinen vaihtoehto metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaille, varsinkin nuo laakeri mutatoitunut KRAS, BRAF ja PIK3CA geenejä, joko mono-hoito tai lisäksi standardin solunsalpaajahoitojen. Lisätutkimukset paremmin selvittämiseksi gabeksaatilla mesilate vaikutusmekanismi in CRC solut siis perusteltua.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja Cell Culture

Ihmisen CRC solulinjat HT-29 , LS174T ja HCT-116, samoin kuin ihmisen immortalisoituja endoteelisolujen kaltainen EA.hy926-solulinjaa, saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). RKO, CACO-2, SW480 ja SW48, SW620 ja Colo205 ihmisen CRC solulinjat olivat antelias lahja Dr. Luigi Ricciardiello (osasto Kliininen Sant’Orsola-Malpighi sairaala, University of Bologna, Bologna, Italia) ja Prof. Massimo Derenzini (kliininen laitos säteily- ja Histopatologisten Sciences, Sant’Orsola-Malpighi sairaala, University of Bologna, Bologna, Italia), tässä järjestyksessä. Kaikkia solulinjoja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen Elatusaine, jossa oli 4,5 g /l glukoosia (Euroclone, Milano, Italia), johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua FBS (Euroclone), 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 ja siirrostettiin rutiinisti käyttämällä trypsiini-EDTA: ta 0,025% (Sigma-Aldrich). Kutakin solulinjaa käytetty tässä tutkimuksessa, solulinja varmennustesti arvioimalla DNA lyhyitä tandem-toisto (STR) profiilin suoritettiin, jotta voidaan sulkea pois saastumisesta tai virheellisen tunnistuksen muiden solulinjojen.

lääkehoitojen

gabeksaatilla mesilate (Foy, Sanofi Aventis, Milano, Italia) ja setuksimabi (Erbitux, (Merck, Darmstadt, Saksa) laimennettiin väliaineen saamiseksi tarvittava loppupitoisuus ennen kutakin koetta. sekä huumeet, annokset palveluksessa (100 ug /ml setuksimabia ja 0,1-1 mM gabeksaatilla mesilaattina) valittiin mukaan aikaisempien in vitro tutkimuksissa [12], [13], [21], [22]. Kuten gabeksaatilla mesilate on raportoitu olevan huonontunut seerumin albumiini [23], kaikki kokeet suoritettiin seerumittomassa väliaineessa. kokeissa suoritettiin elatusaine CRC solulinjojen soluja käsiteltiin lääkkeillä, yksinään ja yhdistelmänä, 6 tuntia ja sitten väliaine kerättiin, sentrifugoitiin 500 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa solujen ja jätteiden poistamiseksi ja pakastettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

solunelinkykyisyysmääritys

solujen elinkelpoisuus kokeet suoritettiin 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT). Lyhyesti, Caco-2-, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT-116-soluja (1 x 10

4 solua /kuoppa) maljattiin 96-kuoppaisen levyn nelinkertaisena ja sallittu kiinnittyä 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin setuksimabin ja kasvavilla pitoisuuksilla gabeksaatilla mesilate 24 ja 48 tuntia. Lopussa inkuboinnin MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan. Formatsaanikiteet kiteet liuotetaan sitten DMSO: hon lisäämällä. Absorbanssi mitattiin sitten 570 nm: ssä 96-kuoppaisella spektrofotometrinen mikrolevyjen lukijaa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kutakin solulinjaa, IC

50-arvo laskettiin epälineaarisella regressioanalyysillä PRISM 5.01 ohjelmistoversio (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Chemoinvasion Pitoisuus

invasiivisia potentiaali CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT-116-solut arvioitiin chemoinvasion määritys [24]. Lyhyesti, polyvinyylipyrrolidoni-vapaa polykarbonaatti suodattimet (Millipore, Co. Cork, Irlanti) ja 12 um huokosia päällystettiin matrigeelin (Sigma-Aldrich). Tuore DMEM täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS pantiin alempaan kammioon kemoatrak- ja 1 x 10

5 solut ympätään sitten ylempään kammioon ja inkuboitiin 6 h gabeksaatilla mesilate ja setuksimabi, yksin ja yhdessä, 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2. Lopussa inkuboinnin, ei tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä pinnalta suodattimia. Tunkeutuvat solut alapinnan kiinnitettiin sitten 1 min etanolissa 95%, ja värjättiin 10 minuutin ajan 0,5% w /v toluidiinisininen. Vuonna migraatiokokeessa, sama menettely invaasiomääritys seurasi, paitsi että suodattimet oli päällystetty gelatiinilla (Sigma-Aldrich). Kuvat on otettu Olympus CKX41 käännettyä mikroskooppia (Olympus Italia, Milano, Italia), joka on varustettu Olympus C5060-ADU kamera (Olympus Italia). Kunkin näytteen, neljä satunnainen optinen kentät x 200 koko suurennuksen analysoitiin ja keskimääräinen lukumäärä hyökkäävän solujen laskettiin seuraavasti: keskimääräinen lukumäärä hyökkäävän solua /lukumäärän keskiarvo vastaavan vaeltavien solujen.

In vitro Angiogeneesi Pitoisuus

in vitro angiogeneesi arvioitiin endoteelisolujen solujen erilaistumista kapillaarimaisen rakenteiden Matrigel. Lyhyesti, kasvutekijää rikastettu matrigeeliin (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) pantiin jääkylmään 24-kuoppalevylle ja jätettiin polymeroitua 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. EA.hy926 endoteelisolujen (1,2 x 10

5 /kuoppa) maljattiin sitten ja inkuboitiin 24 tunnin ajan yhtä suuren määrän CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T ja HCT -116 kunnostettu alusta, saatu edellä kuvatulla tavalla, valmistaja ja menetelmät osassa. Syöpäsolun väliaine on todellakin käytetään yleisesti in vitro angiogeneesin määrityksissä matkivat mitä tapahtuu in vivo kasvaimen angiogeneesiä [25]. Lopussa Inkuboinnin kolmiulotteisen organisaatio havaittiin läpi ylösalaisin faasikontrasti- valomikroskoopilla. Valokuvia neljästä kentästä edustaja kustakin näytteestä saatu x 200 yhteensä suurennus Olympus CKX41 käännettyä mikroskooppia (Olympus Italia), joka on varustettu Olympus C5060-ADU kamera (Olympus Italia). Semi-kvantitatiivinen mittaus kapillaari-rakenteita (putken muodostumiseen indeksi) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [26].

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina keskiarvo ± S.D. Tiedot analysoitiin ANOVA seurasi Bonferronin post hoc testi käyttäen PRISM 5,01 ohjelmistoversio (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Center for Applied Biomedical Research (CRBA, Sant’Orsola-Malpighi sairaala, University of Bologna, Bologna, Italia ) tarjoamiseksi tilat tässä tutkimuksessa ja Dr. Carla Bini (Department of Medicine and Public Health, University of Bologna, Bologna, Italia) solulinjan todennus.