Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tahaton laihtuminen syöpäpotilailla on tunnusomaista syöpäkakeksialle. Etiologia kuihtuminen on monitekijäinen katoamis- luurankolihasten ja rasvakudoksessa liittyy korkea systeemisiä akuutin vaiheen proteiinien ja tulehduksellisten sytokiinien. Vaikka lihassurkastumatilaan avoimesti vaikutukset syöpäpotilaan elämänlaatua menetys rasva-toimipisteiden edustaa pitkäkestoista energiaa epätasapaino. Tässä tutkimuksessa rasvan väheneminen tutkittiin Colon-26 malli syöpäkakeksia, joka on laajalti käytetty jyrsijä mallissa tämän oireyhtymän. Tutkimme diurnal ilmaus vuorokausirytmin sääntelyviranomaisten sekä tärkeimmät välittäjiä energia-aineenvaihdunnan ja sytokiinisignaloinnin. Hiiret, joissa on C26 kasvain oli vähemmän rasvakudoksen massaa, kohonnut rasvakudoksen lipolyysiä ja 5-kertainen plasman vapaiden rasvahappojen. Nämä muutokset liittyivät aktivoidaan IL-6 signaloinnin WAT kautta 3-kertainen fosforyloidun STST3 ja korkea SOCS3 geeniekspressiotasot. Lisäksi häiriöiden vuorokausirytmin säätelyyn lipidiaineenvaihdunnan havaittiin myös. Lipid hajoamista ei näyttänyt olevan vaikutusta klassisen PKA-reitin aktivointi lipaasi HSL. ATGL proteiinin tasot olivat koholla 2-kertainen kakektisilla hiirissä, kun taas 4-kertainen nousu fosforyloitiin ACC ja 2-kertainen väheneminen fosforyloidun 4EBP1 havaittiin osoittaa, että rasva-aineenvaihduntaan moduloidaan ATGL AMPK /mTOR reittejä. Tämä tutkimus antaa näyttöä aktivoinnin sytokiinisignaloinnin ja samanaikainen muutoksia vuorokausirytmin ja säätelijöinä Rasva-aineenvaihdunnan WAT of kakektisissa eläimiä.

Citation: Tsoli M, Schweiger M, Vanniasinghe AS, Painter A, Zechner R, Clarke S, et ai. (2014) väheneminen White rasvakudoksen syöpäkakeksialle oireyhtymä liittyy tulehduksellinen Merkinanto ja häiriytyminen Circadian asetusta. PLoS ONE 9 (3): e92966. doi: 10,1371 /journal.pone.0092966

Editor: Harpal Singh Randeva, University of Warwick – Medical School, Iso-Britannia

vastaanotettu: 29 lokakuu 2013; Hyväksytty: 27 helmikuu 2014; Julkaistu 25 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Tsoli et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cancer Institute NSW translationaalisen ohjelman avustus peräsuolen syövän. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kakektisia Colon 26 solut ystävällisesti AMGEN. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

syöpäkakeksialle oireyhtymä (CCS) on usein kokenut kehittynyt syöpäpotilaille on yleisintä haiman, ylemmän ruoansulatuskanavan ja keuhkosyövässä ja osuus lähes 20% syöpään liittyvien sairauksia [1], [2]. Tällä hetkellä ei ole tehokkaita hoitoja tai ennustetekijöiden kokeita osoittaa ne potilaiden riski sairastua kuihtuminen. CCS on monimutkainen aineenvaihduntasairaus ominaista tahaton laihtuminen, rasvakudos ja luuston lihaksen ehtyminen, ruokahaluttomuus ja väsymys. Kakeksia liittyy usein systeeminen tulehdus osoitetaan kohonnut plasman CRP ja vähentää albumiinitasoja [3]. Lisäksi kakektisia syöpäpotilaiden kokevat usein lisääntynyt myrkyllisyys aikana chemo /sädehoidon mikä vähentää elämänlaatua ja näin ollen huonoon säilymiseen [4], [5]. Vaikka tarkkaa mekanismia ei ole vielä täysin selvitetty, on laajalti hyväksytty, että kohonneita sytokiinien, kuten interleukiini-6 (IL-6), tuumorinekroositekijä (TNF) ja muista tekijöistä, kuten sinkki-alfa-2-glykoproteiini (ZAG) laukaista catabolic tapahtumia, jotka edistävät lipidien ehtyminen rasvasta varikkojen ja voimattomuus [6], [7], [8]. Erityisesti IL-6 on liitetty kehittämiseen kakeksian kasvain jyrsijöiden ja menetys rasvakudoksessa syöpäpotilailla [9], [10] sekä suoraan stimuloiva lipolyysiä aikuisilla [11]. Colon-26 (C26) karsinooma on vakiintunut hiirimallissa syöpäkakeksialle seurauksena korkea systeemisiä IL-6. Anto estävien aineiden IL-6 signalointi estävät kuihtumista ja muita ominaisuuksia Kakeksian useissa eläinmalleissa kakeksian kuten Colon 26 [12], [13], [14].

lisäksi toimii eristeenä ja lipidien säiliö aikana metabolisen kysynnän rooli valkoinen rasvakudos (WAT) ulottuu neuroendocrine valvonnan energian homeostaasin, ruokahalun ja immuunijärjestelmän /tulehdusvasteiden. Vaikka liikkeelle lipidien adiposyyteistä tuottamaan energiaa muihin elimiin aikana paaston /kalori rajoitus on ensisijainen tehtävä WAT, se on myös mukana eritystä adipokines ja sytokiinien, monet adipokines esillä päivittäistä vaihtelua plasmassa, jotka voivat vaikuttaa ruokahalu, energia menot ja lisääntymiselle [15]. Käänteisesti distaalinen elimet ohjata lipolyyttinen vs lipogeeniset reittejä WAT kautta hormoneja ja sytokiinejä säädellä rasva-aineenvaihdunnan reittejä ja siten saavuttaa koko kehon energiatasapainon. Siksi menetys WAT massan kehittämisen aikana kakeksian vaikuttaisi useisiin elinjärjestelmiin jälkeen heikentynyt että energiaa runsaasti lipidejä.

eritystä ja aktiivisuus vuorokausivaihtelu sääntelyviranomaisten aineenvaihdunta liittyy elimistön omaa endogeeninen kello vastaamaan ravinteiden tarjonnan aktiivisuus syklit ja ympäristön ärsykkeille [16]. Keskitetty ohjaus vuorokausirytmin välittyy suprakiasmaattinen tuma, jossa auto-säännelty molekyylitason palautemekanismin johon BMAL /Kello sääntelyviranomaisten ja Per /Cry kohdeproteiinit toimii kohdistamaan hermostoputken asetus kellon toimintoihin reuna-elimiin. Ylimääräinen takaisinkytkentäsilmukka käsittää ytimen reseptorin Rev-erbα, joka myös on keskeinen rooli adipogeneesi. Molecular analyysi WAT havaittiin, että -20%: n rasvakudoksen transcriptome osoittaa rytminen diurnal ilmentymiskuvio [17]. Itse asiassa monet ydinvoiman transkriptiotekijöitä kuten peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorien (PPAR), sekä keskeiset energia- homeostatic säädin AMP aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) ja metabolisia entsyymejä (lipoproteiinilipaasi–LPL) näytteille oscillatory profiilit osoittavat monimutkainen vuorokausirytmin kello, energiatase ja ympäristön ärsykkeille [18]. Vuorokausirytmin säätelyhäiriö liittyy suurempi metabolisen oireyhtymän riskin, joka käsittää lihavuuden, insuliiniresistenssin ja sydän- ja verisuonitautien [19], [20]. Hiiri malleja geneettisesti manipuloitu vuorokausirytmin kellon komponenttien Bmal tai Kellonäyttö piirteitä metabolisen oireyhtymän kaltaisia ​​fenotyyppejä tai leanness vastaavasti [21], [22]. Lisäksi kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, kohonnut lihavuuden ja sen komorbiditeetteja yöllä-shift ja jet-jäänyt työntekijät [20], [23].

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että valkoinen rasvakudos on yksi ensimmäisistä elinten vaikuttaa aikana syöpäkakeksialle kanssa WAT ​​ehtyminen usein näkyy ilman avointa lihasmassan menetys [9]. Menetys rasvakudos välittyy pääasiassa lisääntynyt lipolyysiä liittyy Hypermetabolinen valtion ja jossain määrin pienentää rasvan kertymistä [24], [25], [26]. Liikkeelle lipidien varantojen rasvakudos aikana kakeksia välittyy rasvakudos triglyseridilipaasin (ATGL) ja hormoni lipaasin (HSL) [24]. Kriittinen rooli että ATGL pelaa syöpäkakeksialle korostettiin paitsi säilyttämistä rasvan massan, vaan myös puutetta luuston lihasten kuihtumista, vuonna ATGL hiirissä Kakeksiaan indusoivan Lewis-keuhkosyövän tai B16 ihosyövän [24]. Vaikka nämä tutkimukset laajentaa ymmärrystämme osuuden näiden lipaasien tehdä rasvakudoksen eheyden syövän sekä muut aineenvaihdunnan valtioissa [27], signalointi mekanismi, joka aloittaa rasva ehtyminen kuihtuminen edelleen huonosti [28], [29]. Useat kysymykset jäävät ilman vastausta suhteessa siihen hypermetabolista ominaisuuksia – erityisesti lisääntynyt lipolyysiä – ilmenee syöpäkakeksialle. Mitä yhteyksiä tehostetun lipolyysiä ja systeeminen tulehdus liittyy syöpäkakeksialle? Lisääntyy sytokiinisignaloinnin operatiivinen aikana rasvakudos ehtyminen? Miten diurnal ilmaus päällikön sääntelyviranomaisten vuorokausirytmin ja rasva-aineenvaihduntaan vaikuttavat aikana syöpäkakeksialle? Ovatko tavallista päivittäistä tasoa keskeisten anturien ja välittäjiä ravitsemustila ja rasva-aineenvaihdunnan muuttunut WAT?

Tässä tutkimuksessa selvitettiin vaikutuksia kakektisissa paksusuolen-26 karsinooma valkoisella adiposyyttien diurnal rytmiä ja toiminta. Tämä hiirimallissa syöpäkakeksialle on laajalti käytetty tutkimaan kakeksian, koska sillä on samankaltaisia ​​toiminnallisia ja aineenvaihdunnan häiriöt kliinisen vasteen [30]. Me nimenomaan tunnettu vuorokautinen geenien ilmentymistä tärkeitä vuorokausirytmin ohjaus ja rasva-aineenvaihduntaan sekä aktivoinnin tila keskeisten sääntelyviranomaisten energian homeostaasin kahteen vastakkaiseen ajankohtina vuorokausivaihtelusta sykli. Osoitamme näyttöä sytokiinisignaloinnin osilla IL-6 signalointiryöpyn – STST3 ja SOCS3. Lisäksi me raportoimme että stimulointi lipolyyttisten väylän WAT of kakektisissa hiiriä liittyy lisääntynyt ATGL ja perilipin mieluummin kuin PKA /HSL. Tuloksemme tunnistaa mahdollisia cross-talk välillä AMPK, mTOR ja 4EBP1 tärkeinä välittäjinä muuntuneen Rasva-aineenvaihdunnan syöpäkakeksian.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja eläinten tutkimuksen

kakeksian indusoiva Colon 26-solujen (C26) on hiiren paksusuolen adenokarsinooma ja ystävällisesti tarjotaan lahjaksi AMGEN (USA) [31]. C26-solut kasvatettiin ja ylläpidettiin RPMI-alustassa (Invitrogen), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen) ja 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (Invitrogen), 5% CO

2 ympäristössä. Patogeenivapaita 10-12 viikon ikäiset BALB /c * DBA2 (F1 Hybrid) hiiret hankittiin ARC, Perth (Australia), ja pidettiin ympäristön lämpötilan ollessa 22 ° C: ssa 12 tunnin valo sykli (valot 06:00-18:00). Colon 26-soluja istutettiin ihonalaisesti 1 x 10

6 solua /100 ui oikeaan kylkeen hiirillä. Verrokkihiiret injektoitiin 100 ui RPMI-väliainetta, joka sisälsi antibiootteja. Yli 14 päivää inokulaation jälkeen, kehon paino, ruokailu ja kasvaimen mitat kirjattiin päivittäin. Kasvain ja vapaa-ravintokontrolliryhmä hiirillä oli

mielinmäärin

saada ruokaa. Yksi ryhmä ohjaus hiirillä oli saava vastaamaan päivittäisen ruoan saanti kakektisissa C26-laakeri ryhmä. Pair-ruokinta saavutettiin antamalla ei-kasvain, joissa kontrollihiiriin ravinnon vastaavien C26-kasvain omaavilla eläimillä. Hiiret euthanazed niskavenytyksellä ennen sadonkorjuuta lisäkiveksen rasvakudoksesta, jotka jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä. Eläinkokeet suoritettiin Australian käytännesäännöt Care ja käyttö tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten nojalla Animal Research asetuksen (2005) NSW. Vaikutus kasvaimen kasvua ja kehitystä kakeksian eläinten hyvinvointiin katsottiin, asianmukaiset toimenpiteet valvoakseen ja lievittää kärsimystä toteutetaan nojalla protokolla # 2007/006 hyväksymä Animal Welfare komitean Sydney Lounais-alue Health Service.

arviointi Kakeksia ja Biochemical Analysis

Neljäntoista päivän kuluttua kasvainsoluinokulaation, hiiret nukutettiin ketamiini /ksylatsiini ja euthanazed jälkeen veren keräämistä sydänpunktiolla. Nettomääräinen ruhojen mitattiin. Lisäkiveksen rasva kerättiin, punnittiin ja sitten varastoitiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Määräosat saatu plasma verestä kunkin hiiren oli pidetään jäädytettyinä lisäanalyyseihin saakka. Esteröimättömään rasvahappopitoisuus plasmassa kakektisissa eläinten määritettiin entsymaattisesti käyttäen NEFA C Kit (Wako Pure Chemicals /NOVACHEM, Collingwood, VIC, Australia). Triglyseridin pitoisuus plasmassa kakeksian indusoimaan C26 omaavilla eläimillä määritettiin käyttäen kliinisiä Automater analysaattori (Roche Modular E170) valmistajan ohjeiden (Roche).

rasvakudoksen Histologia ja Mikroskopia

WAT näytteet fiksoitiin 10% formaliinilla neutraalissa puskuroidussa liuoksessa (Sigma-Aldrich), upotettiin parafiiniin vaha, ja 5 um: n leikkeitä leikattiin ja asetettiin lasilevyille. Sen jälkeen kuivuminen, leikkeet värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla (H /E) histologista tutkimusta valomikroskopian ja CAST grid-ohjelmisto (Olympus Corp., Albertslund, Tanska). Morfologinen analyysi suoritettiin kudoksen saatu 4 eläintä ryhmää kohti (verrokki, C26-hiirille ja saava). Pinta-ala ja ympärysmitta arvioitiin noin 5-8 näkökenttien eroihin kuvaa kohden eli yhteensä antaa 250 eläintä kohden eli 1000 rasvasolut per koeryhmä.

Lipolysis Isolated WAT Organ Cultures

sukurauhasten rasvatyynyt poistettiin kirurgisesti ja pestiin useita kertoja PBS: llä. Tissue kappaletta (-15 mg) esi-inkuboitiin 2 h DMEM: n läsnä tai poissa ollessa 25 uM Hi-76-0079 (Novo Nordisk) on C37 ° C: ssa, 5% CO

2, 95% kosteutetussa ilmakehässä. Sen jälkeen elatusaine korvattiin DMEM: llä, joka sisälsi 2% BSA: ta (rasvahappo-free) joko läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM forskoliinia ja 25 uM Hi-76-0079 ja inkuboitiin vielä 60 min 37 ° C: ssa. Määräosat keskipitkän poistettiin ja analysoitiin FFA ja glyserolin käyttäen kaupallisia sarjat (HR sarja NEFA-HR (2), Wako Diagnostics). Proteiinin määrityksiä, rasvatyynyt pestiin perusteellisesti PBS: llä ja hajotettiin 0,3 N NaOH /0,1% SDS. Proteiini mittaukset suoritettiin käyttäen BCA-reagenssia (Pierce).

Quantitative Real-Time PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta käyttäen SuperScript III satunnaisia ​​alukkeita (Invitrogen) ja oligo (dT) 12-14 (Invitrogen). Kaikki alukesekvensseissä räjäytettiin vastaan ​​NCBI hiiren genomisen sekvenssin tietokanta varmistaa spesifisyyden vastaavan geenin. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1. qPCR-reaktiot sisälsivät 1,25 ng cDNA: ta, 300 nM geenispesifisiä alukkeita ja 12 ui SybrGreen (Invitrogen). Kaikki reaktiot suoritettiin käyttäen Corbett Roottorin Gene 6000 (Corbett Life Science). Suhteelliset mRNA-tasot laskettiin vertaileva kynnyssykli menetelmää käyttäen

36B4

,

TFRC

ja

Hmbs

geenien taloudenhoito valvontaa.

Western blotting

Koko-solu-uutteista peräisin rasvakudoksesta saatiin käyttäen RIPA Lysis Buffer täydennetty fosfataasi ja proteaasinestäjien (Roche) käyttäen lasi-homogenisaattoria ja konsentroitiin keskipakoisvoiman suodattimen yksiköiden mukaan valmistajan protokollien (Cell Signaling Technologies, Millipore) ja sittemmin kvantitoitiin BCA proteiini happo iinianalyysikitissä (Pierce). Proteiineja (20 ug) erotettiin 10% Tris-HCl geelit (Bio-Rad), ja blotattiin (iBlot, Invitrogen), kuten on kuvattu valmistajat. Solulysaatit analysoitava seuraavilla ensisijainen vasta: kanin anti-fosfo-p44 /42-mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) -Thr202 /Tyr204, kanin anti-p44 /42-MAPK, kanin anti-fosfo-p38 MAPK-Thr180 /Tyr182, kanin anti-p38 MAPK, kanin anti-signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3), kanin anti-fosfo-STAT3-Ser727, kanin anti-ATGL kanin anti-hormoni-sensitive- lipaasia (HSL), jäniksen anti -phospho-HSL-Ser563, kanin anti-asetyyli-CoA–karboksylaasin (ACC), kanin anti-perilipin, kanin anti-AMP-aktivoitu proteiinikinaasi α (AMPKα), kanin anti-fosfo-AMPKα-Thr172, kanin anti-raptor , kanin anti-nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR), kanin anti-fosfo-mTOR-Ser2481, kanin anti-eukaryoottitranslaatioon initiaatiofaktoria 4E-sitovan proteiinin 1 (4EBP1), kanin anti-fosfo-4EBP1-Thr37 /46, kanin anti -phospho-4EBP1-Thr70, kanin anti-fosfo-4EBP1-Ser65, kanin anti-3-hydroksiasyyli CoA-dehydrogenaasi (EHHADH /PBE) ja kanin anti-beta aktiini. Kaikki anti-fosfo ensisijainen vasta-aineet laimennettiin 1:500 loput vasta-aineet laimennettiin 1:1000. Proteiinit saatiin näkyviin käyttäen vuohen anti-kani-HRP sekundaarinen vasta-aine (1:2000) ja länsi-femto (Pierce). Lukuun ottamatta EHHADH (Abcam) loput vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technology.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM. Tilastolliset analyysit tehtiin parittomia Studentin t-testejä. Analyysi välillä 3 ryhmää (kontrolli, paksusuoli-26 ja saava) suoritettiin käyttäen Yksisuuntainen Anova Post Hoc Turkki testi. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä P 0,05.

Tulokset

vaikutus C26 karsinooma on Epidydimal Valkoinen rasvakudos

Colon26 karsinooma on vakiintunut malli syöpäkakeksialle hiirillä, joilla merkittävä laihtuminen, lihasten kuihtumista, rasva ehtyminen ja asteittaisen vähentämisen ravinnonoton 14 päivän kuluttua kasvaimen implantti. Suostumuksella aikaisempien raporttien, massa epididymal WAT oli huomattavasti vähäisempää kuin vapaan ruokitaan ja saava ohjaimet (kuvio 1A). Tutkimme, onko tämä dramaattinen väheneminen rasvakudosmassan näkyi mikroskooppisella tasolla. Hema- /Eosiini värjäys osoitti merkittävien morfologisten muutosten. Valkoinen adiposyyttien verrokkihiirten näkyvissä yhden kuusikulmainen lipidivakuolit jotka olivat pienempiä saava eläimiä ja esiintyi pyöreämpiä kakektisilla hiirissä (kuvio 1 B-D). Morfometrisiin analyysi osoitti lisäksi merkittävä lasku poikkipinta-ala ja ympärysmitta valkoinen adiposyyttien C26 kakektisia hiiristä verrattuna

ad lib

ja saava ei ollut kasvainta laakeri ohjaus hiirillä (kuvio 1 E-1F). Pieneneminen WAT paino liittyi kohonneisiin plasman esteröimättömään rasvahappoja (NEFA) kakektisilla hiirissä (kuvio 1G) ja se laski plasman triglyseridien tasoja (kuvio 1 H). Tutkia osuus lipaasien mobilisointiin triglyseridien rasvakudoksesta, määritimme lipidien mobilisointi toimintaa WAT ​​eksplanttien. Nopeus vapaan rasvahapon (FFA) julkaisu oli 5 kertaa suurempi WAT on C26 kakektisissa hiirillä verrattuna ohjaamaan muita kuin kasvain hiirille (kuvio 1 i) ja vastaava lisäys glyseroliin release (kuva 1J). Lisäyksen HSL-spesifisen inhibiittorin (Hi 76-0079) vain marginaalisesti vähentää FFA julkaisu osoittaa, että ATGL on hallitseva lipaasi vastuussa rasvakudoksen lipolyysiä (kuvio 1 i). Vaikutusten arvioimiseksi kakeksian kokonaispainosta lipidien hydrolyyttinen kapasiteetti jälkeen hormonistimulaatioon, WAT kudos käsiteltiin forskoliinilla. Toinen lisäys FFA julkaisu oli ilmeinen sekä valvontaa ja C26 kakektisia hiiriä, joissa kakektisia hiirillä saavuttaa maksiminopeudella FFA tuotannon 250 nmol /h * mg proteiinia verrattuna 100 nmol /h * mg hallinnassa hiirillä (Kuva. 1K) . Glyserolia julkaisu osoitti myös korkeampi maksimaalinen verokantaa C26 verrokkihiireen verrattuna stimulaation jälkeen WAT eksplanttien forskoliinilla (kuva 1L), joka osoittaa korkeampaa lipolyyttinen kapasiteetti WAT eksplanttien välillä C26 kakektisia hiirillä.

(A) lisäkiveksistä rasvakudos painot alkaen kakektinen eläimistä 14. päivänä tuumorin istuttamisen jälkeen (

*** P 0,001,

¥¥¥ P 0,001 vs saava); (C-E) hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys ja (B-F) määrällinen adiposyytti kooltaan kakektisia ja pari-ruokitaan hiirillä. (G) verenkierrossa ei-esteröityjen vapaiden rasvahappojen plasmassa kakektisissa eläinten (* P 0,05, kontrolliryhmään verrattuna); (H, I) vapaa rasvahappo (FFA) ja glyserolia vapautuminen WAT eksplanttien saatu ohjaus ja C26 on kasvain perusolosuhteissa läsnä ja poissa ollessa HSL estäjän Hi 76-0079; (J, K) vapaa rasvahappo (FFA) ja glyserolia vapautuminen WAT eksplanttien alle forskoliini- kannustanut olosuhteissa yhdessä tai puuttuessa Hi 76-0079. A, arvot esitetään keskiarvona ± s.e.m. 8-10 eläintä ryhmää kohti. B, C ja D edustavat kuvat näkyvät H E kuvaa otettu 4 eläintä per ryhmä. E ja F-arvot esitetään keskiarvona ± s.e.m. 4 eläintä ryhmää kohti. Noin 250 rasvasolut laskettiin eläintä kohti antaminen yhteensä 1000 rasvasolut kustakin ryhmästä. G ja H arvot on esitetty keskiarvona ± s.e.m. 4 eläintä ryhmää kohti. I-K-arvot esitetään keskiarvona ± s.e.m. 5 eläintä ryhmää kohti.

aktivointi IL-6 signalointireitille vuonna C26 Kuihtuminen

kuten IL-6 näyttävät olevan keskeisiä vaikuttajia tuhlaaminen prosessin tässä syöpäkakeksialle malli [12]. Voit selvittää, mitä aktiivisia sytokiinisignaloinnin on läsnä adiposyyttien kakektisia hiiristä tutkimme vuorokautinen mRNA ilmaus SOCS3, ja fosforylaatiota STAT3 (kuva 2). Transkriptin tasot SOCS3 mRNA lisääntyi merkittävästi kaikissa aikapisteissä kakektisilla hiirillä. On myös parannettu fosforylaatiota STAT3-proteiinin (Ser727), kun läsnä on C26 kasvain. Nämä tiedot osoittavat aktiivisen signalointi alavirtaan IL-6-reseptorin WAT on kakektisissa hiirillä, jotka voivat vaikuttaa lipidimetaboliaan reittejä kakektisilla hiirillä.

päivittäiset mRNA: n ilmentymisen on SOCS3 mRNA valkean rasvakudoksen verrokkihiiristä (valkoinen ympyrä) ja kakektinen hiiret (musta neliö) (

* P 0,05,

** P 0,01,

*** P 0,001 vs kontrolli). 6 aamulla arvot monistaa kaaviossa havainnollistaa vuorokausivaihtelua rytmiä. mRNA: n ekspression arvot ovat keskiarvoja ± s.e.m. suhteessa kontrolleihin 4-6 eläintä ryhmää kohti. Western blot ja densitometrinen analyysi STAT3 proteiinin ja fosfo-STAT3 (Ser727), valkean rasvakudoksen päässä kakektisia ja ohjaus eläimiä.

vaikutus syöpäkakeksialle on päivittäiset ekspressiokuviota lipogeneesiin Pathway

tarkastella vaikutuksia syöpäkakeksialle on

de novo

synteesiä rasvahappojen WAT tutkimme vuorokautinen ilmaus profiilia metabolisen geenien ja ydin- transkriptio tekijöitä rasvanmuodostukseen. Lipoproteiinilipaasi- (LPL) on keskeinen entsyymi osallistuu TG hydrolyysiin lipoproteiinien vapauttaa rasvahappoja sisäänottoa soluihin. Kontrollihiirillä sen transkriptitasot ei esiintynyt vuorokausirytmi kun kakektisilla hiirillä ekspressiotasot olivat merkittävästi kostutetulla korkeintaan ajankohtina (kuva 3). Yhdessä

LPL

, ilmaus

Ap2

alennettiin samalla

CD36

ei muuttunut WAT of kakektisissa hiirillä osoittaa jonkin verran sorron oton tai intrasellulaarisen käsittelyn rasva hapot (Kuva S1). PPAR on vallitseva tumatranskriptiotekijä säätelevä Rasva-aineenvaihdunnan rasvasolut. Verrokkihiirten

PPAR

ja liittyvät kohdegeenien

Fas

ja

Dgat2

huipussaan aikana valosyklissä, kun taas kasvain kakektisiin eläimillä rytmiä katosi ja mRNA-tasoja olivat merkittävästi vähentynyt enimmillään ajankohtina. Samoin

Scd1

näytteillä vähennetään mRNA ilmaisun kakektisilla hiirillä. C /EBPα on tärkeä adipogeneesi ja normaali adiposyyttien toiminta. Kontrollihiirillä

C /ebpα

ei esiintynyt vuorokausivaihtelua ilmentymiskuvio kun kakektisilla hiirillä transkriptin tasot olivat merkittävästi vähentää koko päivän. Mielenkiintoista suoraan vertailuja geeniekspressiotasot varten

Fas

ja

C /ebpα

välillä saava hiirillä ja kakektisia hiiret osoitetuista merkittäviä eroja 2 am ajankohtana osoittaa, että lipidisynteesiin saattaa vaikuttaa lähinnä aikana kuihtuminen ja ei niin paljon aikana kalorien rajoittaminen.

mRNA analyysi

PPARy

,

C /ebpα

,

LPL

,

Fas

,

Scd1

,

Dgat2

, eristetty WAT valvonnan (valkoinen ympyrä), ja C26-hiirille (musta neliö); Arvot ovat keskiarvo ± s.e.m. esitettiin prosentteina suhteessa ohjaimet 4-5 eläintä ryhmää kohti (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 C26 vs. kontrolli). 6 aamulla arvot kopioidaan kussakin kuvaajan havainnollistaa täydellisen 24-tunnin aikana.

PKA aiheuttama Lipolyyttisiä Pathway ei tehostettu vuonna syöpäkakeksialle

stimulointi FFA vapautumisen triglyseridi oli ajatellaan ensisijaisesti välittyvän proteiinikinaasi A (PKA), joka fosforyloi suoraan perilipin ja hormonin lipaasin (HSL) ja vaikuttaa myös rasvakudoksen triglyseridilipaasin (ATGL), vaikkakin epäsuorasti. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet AMPK välittämän fosforylaation ATGL ja vuorovaikutusta CGI-58 asema merkittävinä maksimaalisen ATGL hydrolaasiaktiivisuutta [27]. Olemme arvioineet lipolyysiä välittyy PKA-reitin aikana köyhtyminen WAT syövän kuihtuminen. Kuten kuviossa 4A, havaitsimme lievää laskua fosforyloidun PKA ja koko PKA tasot 2 am, kun taas neljätoista mitään ilmeistä muutoksia havaittu välillä ohjaus ja kakektisia eläinten (kuva S2). mRNA ekspressiotasot näyttivät pienentää samalla koko ja fosfo-HSL proteiinin tasot olivat ennallaan joko ajan vaiheessa syöpäkakeksialle. Mielenkiintoista on geeniekspression tasolla mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu ohjaus ja parin ruokitaan hiirillä (kuva S3), kun taas proteiinin tasolla, havaitsimme fosforylaatio lisääntyy sekä PKA ja HSL 2 am (kuva S3). Perilipin on keskeinen lipidejä pinnoitteen proteiinia rasvapisaran muodostumista ja vaikuttaa suoraan PKA. Me tutkimme, syöpäkakeksialle vaikuttanut mRNA ja proteiini tasoilla perilipin ja löytänyt mitään ilmeistä vuorokausirytmi litteraattiin tasot perilipin verrokkihiirten vaikka ilmentyminen väheni kakektisissa eläimillä (kuvio 4B). Kuitenkin Western-analyysi osoitti kohonneita perilipin proteiinin molemmissa aikapisteissä (kuvio 4C, kuva S2). ATGL on kriittinen lipaasi, joka aloittaa ensimmäinen askel triglyseridien hajoamista. Emme havainneet vuorokausirytmin rytmiä on tämän geenin ilmentyminen ja ei ollut vaikutusta ATGL mRNA aikana syöpäkakeksialle. Kuitenkin Western-analyysi paljasti lisääntynyt ATGL proteiinin taso sekä aika-pistettä WAT välillä C26 kasvain eläimillä (kuvio 4, kuva S2). Samanlainen näennäinen ristiriita on perilipin proteiinia ja mRNA-tasoja, näyttää siltä, ​​että ATGL on pääasiassa säännellään jälkeisen transkription tasolla kuihtuminen. Nämä tiedot osoittavat, että aikana myöhäisessä vaiheessa kuihtuminen, rasvan mobilisaation WAT of C26 hiirten ei indusoi PKA-reitin edistää HSL välittämää lipolyysiä, mutta liittyy lisääntynyt ATGL proteiinia.

(A) mRNA analyysi

Hsl

geenien ilmentyminen ja Western blot-analyysi fosfo-PKA (Thr197), yhteensä PKA, fosfori-HSL ja koko HSL proteiinit 2 am ja neljätoista; (B) mRNA-analyysi

Atgl

ja

Perilipin

geenin ilmentymisen WAT valvonnan (valkoinen ympyrä), ja C26 on kasvain (musta neliö); Arvot ovat keskiarvo ± s.e.m. esitettiin prosentteina suhteessa ohjaimet 4-5 eläintä ryhmää kohti (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, C26 vs kontrolli). 6 aamulla arvot kopioidaan kussakin kuvaajan havainnollistaa täydellisen 24-tunnin aikana; (C) Western blot-analyysi ATGL ja PERILIPIN proteiinien neljätoista ja 2 am.

Levoton vuorokausirytmi ilmaus rasvahapon hyödyntämisen väylän kakektisissa hiirillä.

Tärkeä tehtävä WAT on lipidejä kulutus aktivoinnin avulla rasvahapon β-hapettumisen mitokondrioita ja peroksisomeissa. Ymmärtää rooli WAT synnyttämisessä vapaiden rasvahappojen polttoaineena aikana syöpä kuihtuminen, tutkimme diurnal ilmentymistä transkription tekijöitä säännellään rasvahappojen kataboliaa ja vastaavien kohdegeenien (kuvio 5A). Sopusoinnussa aikaisempien raporttien,

PPARa

näytteillä vuorokausirytmin värähtely taas

PPARS

eivät osoittaneet rytmiä hallinnassa hiirillä. Ei ollut mitään merkittävää muutosta ilmeistä joko

PPARa

tai

PPARS

välillä ohjaus ja kakektisia hiirillä. Samoin

Pgc1α

oli erottuva vuorokausirytmi kuvio ilmaisun, mutta oli muuttumaton WAT of kakektisissa hiirillä.

Nrf1

keskeinen säätelijä metabolisen osallistuvien geenien mitokondrion hengitystä, eivät osoittaneet vuorokausirytmin värähtely, mutta se oli merkitsevästi kasvanut tiettyinä aikoina 24 tunnin jakson aikana. Tfam on mestari säätelijä mitokondrioiden biogeneesin. Sen transkriptipitoisuuksissa ei näy rytmiä ja merkittävät muutokset eivät olleet ilmeisiä aikana syöpäkakeksialle. Samoin kuin

Tfam

, ilmentyminen karnitiinin palmitoyyli transferaasin 1α (

Cpt1α)

soluunottoon pitkäketjuisten rasvahappojen mitokondrioissa pidettiin C26 kasvain eläimiä. PPAR kohdegeenin peroxisomal bifunktionaaliset entsyymi (

PBE

) mukana peroxisomal rasvahappojen β-hapetus, osoittaa vuorokausirytmi huippu klo 10 pm pimeässä syklin terveillä hiirillä. WAT alkaen kakektinen hiiret osoittivat korkeampia runsaasti

PBE

mRNA korkeintaan aikoina, samoin kuin merkittävä 12 tunnin vaiheen ennakkoon, korkeimmillaan kello 10 (kuvio 6A). Lisäksi merkittäviä muutoksia ei havaittu kakektisia hiirillä ja saava hiirillä neljätoista (kuva S4). Lisätodisteita tehostetun peroksisomaalisen β-hapettuminen on suurempi proteiini tason PBE kakektisilla eläimillä sekä 2 am ja neljätoista (kuvio 5B, kuvio S4). Kuitenkin näyttää siltä, ​​että muut rasvahapon käyttöä, kuten AOX, HADHA ja HADHB ovat muuttuneet (kuvio S5).

(A) mRNA: n analyysi

PPARa, Pgc1α, PPARS

,

Nrf1, Tfam, Cpt1α

ja

PBE myynnissä maassa WAT ​​valvonnan (valkoinen ympyrä) ja C26 kasvain -pitoista hiiriä (musta neliö); Arvot ovat keskiarvo ± s.e.m. esitettiin prosentteina suhteessa ohjaimet 4-5 eläintä ryhmää kohti (* P 0,05; ** P 0,01; C26 vs. kontrolli). 6 aamulla arvot kopioidaan kussakin kuvaajan havainnollistaa täydellisen 24-tunnin aikana; (B) Western blot-analyysi PBE proteiinia neljätoista ja 2 AM ajankohtina.

(A) mRNA analyysi

Ampkα1, Ampkα2

ja

Acc

alkaen WAT valvonnan (valkoinen ympyrä), ja C26-hiirille (musta neliö); (B) Western blot-analyysi fosfo-AMPK (Thr192) ja yhteensä AMPK klo neljätoista ja 2 am; Immunoblottianalyysi Phospho-ACC ja yhteensä ACC neljätoista WAT ​​näytteitä. (C) mRNA-analyysi

mTOR

ja

4Ebp1; myynnissä maassa WAT ​​valvonnan (valkoinen ympyrä), ja C26-hiirille (musta neliö); (D) Western blot analyysi fosfo-mTOR (Ser2448) yhteensä mTOR, fosfo-4EBP1 (Ser65), fosfori-4EBP1 (Thr37 /46) ja yhteensä 4EBP1 klo neljätoista ja 2 am. Arvot ovat keskiarvo ± s.e.m. esitettiin prosentteina suhteessa ohjaimet 4-5 eläintä ryhmää kohti (* P 0,05; ** P 0,01; C26 vs. kontrolli). 6 aamulla arvot kopioidaan kussakin kuvaajan havainnollistaa täydellisen 24-tunnin aikana.

Aktivointi AMPK Pathway in C26-laakeri Eläimet

AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) on tärkeä säätelijä energian homeostaasiin, vastaa lisääntynyt AMP: ATP-suhteet stimuloimalla rasvahappojen hapettumista ja lisäämällä glukoosin soluunottoa [32]. Yksi tärkeimmistä rooleista AMPK on fosforylaation ja sen seurauksena esto asetyyli-CoA-karboksylaasin (ACC), nopeutta rajoittava entsyymi rasvahapon synteesiä.