Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Measuring lähetti-RNA (mRNA) tasot käyttäen käänteistranskriptio kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) on yleinen käytäntö useissa laboratorioissa. Erityinen joukko mRNA: iden sisäisen valvonnan viitteenä geenejä pidetään paras strategia normalisoida RT-qPCR data. Oikea valinta viite geenien on kriittinen kysymys, erityisesti syöpäsoluja, jotka tehdään eri

in vitro

manipulointia. Nämä käsittelyt voivat johtaa dramaattinen muutokset geeniekspressiotasot, jopa olettaa viite geenejä. Tässä tutkimuksessa arvioimme ekspressiotasot 11 yleisesti käytetty viittaus geenien sisäisen valvonnan normalisoimiseksi 19 kokeet, jotka sisältävät neuroblastooma, T-ALL, melanooma, rintasyöpä, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCL), akuutti myelooinen leukemia (AML ), eturauhassyöpä, kolorektaalisyöpä, ja kohdunkaulan syöpä solulinjoja altistettiin eri häiriöitä.

tulokset

geNorm algoritmi ohjelmistopaketti Qbase + käytettiin sijoitus ehdokas viittaus geenit mukaan niiden ilmaisun vakautta. Havaitsimme, että vakaus useimmat ehdokas viittaus geenit vaihtelee suuresti häiriön kokeita. Ilmaisi Alu toistot osoittavat suhteellisen vakaa ilmentyminen riippumatta koeolosuhteissa. Nämä Alu toistot ovat rankattu paras viittaus määritykset kaikissa häiritseekin kokeiluja ja näyttää hyväksyttävää keskimääräinen ilmaisun vakautta arvot (M 0,5).

Johtopäätökset

Ehdotamme käyttöä Alu toistaa referenssinä määritys suoritettaessa syöpäsolun hämminki kokeita.

Citation: Rihani A, Van Maerken T, Pattyn F, Van Peer G, Beckers A, De Brouwer S, et al. (2013) Tehokas Alu Toista RT-qPCR normalisointi in Cancer Cell häiritsemisestä Kokeilut. PLoS ONE 8 (8): e71776. doi: 10,1371 /journal.pone.0071776

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 05 helmikuu 2013; Hyväksytty: 3. heinäkuuta 2013. Julkaistu: 14 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Rihani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Ali Rihani tukee PhD apurahan Gentin yliopiston tutkimuksen rahasto (BOF; 01D02210). Joni Van der Meulen ja Evelien Mets tukee PhD apurahan päässä Research Foundation – Flanders (FWO, 1116412N ja 3G020209, vastaavasti). Anneleen Beckers tukee PhD apurahan Institute edistävä innovaatio tieteen ja teknologian Flanderissa (sisävesiliikenteen, 101506). Tom Van Maerken, Pieter Mestdagh ja Pieter Rondou tukee post doc apurahoja FWO. SDB tukee tutkijatohtorin Ghent University (GOA UGent; 01G01910). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Taustaa

Käänteiskopiointireaktioita kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) on osoittautunut luotettava menetelmä määrittää geenin ilmentymistä. Oikein normalisointi on kriittinen kysymys tarkan tulkinnan RT-qPCR tuloksia. Tämä voidaan saavuttaa käyttämällä useita strategioita kuten varmistamaan samanlainen määrä soluja, samanlaisia ​​määriä RNA-soveltaen sisäinen ohjearvo geenejä kuten ribosomaalisen RNA: t (rRNA) tai RNA: iden (mRNA: t), tai sulautuvat useita strategioita yhdessä protokolla [1], [2].

käyttö mRNA sisäisen valvonnan viitteenä geenit normalisoimiseksi RT-qPCR data haetaan laajasti [2] – [6]. Kuitenkin tämä strategia olisi toteutettava huolellisesti, koska sen tarkkuus riippuu suoraan ilmaisun vakautta valitun viite geenit. Mukaan Minimi Tietoa julkaiseminen Quantitative Real-Time PCR Kokeet (MIQE suuntaviivat) [7], se ei enää hyväksytä katsoa, ​​että tietyt viittaus geenit ovat vakaita sopimuksen mukaan. Ryhmämme on aiemmin raportoitu strategian tarkka normalisointia RT-qPCR tiedot perustuvat geometrisen keskiarvon useiden pysyvästi ilmensivät sisäisen valvonnan geenien [4]. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että valinta luotettavan sisäisen valvonnan on erityisen tärkeä kokeissa, joissa häiriön syöpäsoluja. Hoitoon syöpäsolujen kanssa terapeuttisten aineiden tai RNAi-välittäjinä siRNA tai shRNA molekyylit aiheuttaa dramaattisia muutoksia ekspressiotasot monien geenien kuten yleisesti käytössä oleviin geenejä. Tämä ilmiö johtuu (epäspesifinen) off-tavoite vaikutuksia, joita kohdataan toimituksen näiden molekyylien [8], tai välillinen sääntely hoidon jälkeen. Siksi arvioimme ilmaus yleisesti käytetty viite geenejä ja ilmaistaan ​​Alu toistojen sisäisen valvonnan normalisoinnin kokeissa, jotka sisältävät häirityn syöpäsolun linjat. Alu toistoja löytyy transloimattomilta alueilta useita tuhansia tunnettuja proteiinia koodaavan geenejä, ja niitä on raportoitu olevan käyttökelpoinen yhdessä normalisointitekijä RT-qPCR reaktiot [9].

Tulokset

Cancer Cell häiritsemisestä Kokeet

hoito nutlin-3.

Nutlin-3 on pieni molekyyli, joka voi spesifisesti estää p53-MDM2, joka johtaa aktivaatio ja stabilointi p53 [ ,,,0],1], [2], [10]. Hoito nutlin-3 indusoi apoptoosia (kuvio 1A), solusyklin pysähtymisen, erilaistumista tai vanhenemista neuroblastoomakasvaimissa soluissa villityypin

TP53

[2] – [6], [11].

(A), nutlin-3 käsiteltyjen NGP soluja, 16 uM (oikealla) ja ajoneuvon hallinnan (vasemmalla). (B), ATRA käsiteltiin NGP solujen pitkänomainen neuriittien (oikealla) ja ajoneuvon hallinnan (vasemmalla). (C), solujen elinkelpoisuus määritystä IMR-32: n ja SK-N-SH-solujen käsittelyn jälkeen kasvavien pitoisuuksien kanssa withaferin-A: ssa 24 tuntia. Virhepalkkien, SD (n = 3). (D), solunelinkykyisyysmääritys käsittelyn jälkeen CLB-GA ja SK-N-SH-soluja kasvavien pitoisuuksien kanssa TAE-684: ssa 24 tuntia. Virhepalkkien, SD (n = 3). (E), RT-qPCR ilmentymisen tiedot PTK9 SH-EP, SK-N-SH, SH-SY5Y, ja SK-N-BE (2c) transfektion jälkeen miR-1 matkivat tai salattu miRNA jäljittele, joka toimii negatiivisena kontrollina (NC). Virhepalkkien, SEM (n = 2). (F), RT-qPCR ilmentymisen tiedot T-UCR uc. 73 (vasen) ja T-UCR- uc.460 (oikealla) 24 tuntia transfektion jälkeen ja SH-EP-solujen siRNA vastaan ​​T-UCR uc. 73 ja siRNA vastaan ​​T-UCR uc. 460 vastaavasti. Virheet baareja, SEM (n = 2).

hoito ATRA.

All

trans

retinoiinihappo (ATRA) on pieni lipofiilinen molekyyli [7 ], [12], joka estää proliferaatiota ja indusoi erilaistumista neuroblastoomasoluja [4], [13] – [15]. Käsittelimme CLB-GA ja NGP solujen 0 tai 5 uM ATRA yhden ja viiden päivän ja totesi, että ATRA indusoi seuraus neuriittien (kuvio 1 B).

Hoito withaferin-A.

Withaferin-A on steroideihin laktoni puhdistettu lääkekasvin

rohtokoisio

. Tämä yhdiste indusoi apoptoosia neuroblastoomasoluja, ja on anti-angiogeeninen aine [8], [16]. Käsittelimme SK-N-SH ja IMR-32 neuroblastoomasoluihin kanssa withaferin-A ja havaittujen vähensi solujen elinkelpoisuuden annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 1 C). Sitten käsiteltiin SK-N-SH ja IMR-32-solujen kanssa on 0 tai 1 uM withaferin-A yhden päivän stabiilisuuden arvioimiseksi viitteen geenejä.

hoito neuroblastooma solulinjojen TAE-684.

TAE-684 on pieni molekyyli estäjä aktivoitu anaplastinen lymfooma kinaasin (ALK) [9], [17] ja vähentää solujen elinkelpoisuus

ALK

mutatoitunut neuroblastoomasoluja [18]. Käsittelyn jälkeen SK-N-SH ja CLB-GA solujen TAE-684, havaitsimme vähensi solujen elinkelpoisuuden annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 1 D). Sitten käsiteltiin nämä 2 solulinjoissa 0, 0,1, 0,3 ja 1 uM TAE-684 3, 6, 12, 24, ja 48 tuntia stabiilisuuden arvioimiseksi viitteen geenejä.

Käsittelemällä NSCLC solulinjan TAE-684.

H3122 on NSCLC solulinja

EML4-ALK

fuusiogeeni, joka käsiteltiin TAE-684 samalla tavalla kuin edellä kuvattiin.

ohimenevä transfektiosta neuroblastoomasolu- linjat miR-1 matkivat.

miR-1 tavoitteet 3′-UTR

PTK9

mRNA johtavat

PTK9

hajoamista [19]. MiR-1 käytetään usein positiivisena kontrollina kokeissa miRNA matkivat transfektiot arvioida kohdegeenin mRNA alas sääntelyä qPCR. Suoritimme ohimenevä transfektiosta SK-N-BE (2c), SK-N-SH, SH-EP, ja SH-SY5Y neuroblastoomasoluihin kanssa miR-1 matkivat, negatiivinen kontrolli (salatun miRNA matkivat), tai vedos transfektio 24 tuntia (kuvio 1 E).

ohimenevä transfektiosta SH-EP-solujen siRNA vastaan ​​puhtaaksi ultraconserved alueilla.

Transfektoimme SH-EP solujen siRNA vastaan ​​molemmat juosteet T-UCR uc.460 ja siRNA vastaan ​​negatiivisen juosteen T-UCR- uc.73.The pudotus tehokkuus on esitetty kuviossa 1F. Lisätietoja kokeen suunnittelusta löytyy File S1.

Ohimenevä transfektio leukemian solulinjoja miR-223 matkivat.

MiR-223: n havaittiin olevan erittäin ilmaistaan ​​T-solujen akuutteja lymfaattinen leukemia (T-ALL) [20]. Kuitenkin kolme T-ALL solulinjoissa, HPB-ALL, ALL-SIL ja TALL-1 esitetään alhaisen miR-223 tasolla. Odotimme, että yli-ilmentyminen onkogeenisiä miR-223 näissä solulinjoissa lisäisi proliferatiivista kapasiteettia solujen ja todistaa onkogeeninen potentiaali miRNA (tietoja ei esitetty).

optimointi pitoisuus

PHF6

-targeting siRNA T-ALL solulinjoissa.

Transfektoimme

PHF6

villin tyypin T-ALL-solulinja JURKAT ja arvioi knockdown hyötysuhde mRNA tasolla (kuva 2). Seuraavaksi transfektoitiin lyhytaikaisesti HSB-2 ja PF-382 T-ALL-solulinjoja (sekä PHF6 villityypin) ja PHF6 kohdistaminen siRNA. Merkittävät PHF6 kaataa varmistettiin qPCR (kuvassa 2). Lisätietoja kokeen suunnittelusta löytyy File S1.

JURKAT solulinjan transfektion jälkeen

PHF6

-targeting siRNA tai salattu siRNA (negatiivinen kontrolli: NC). Virhepalkit, SEM (n = 2).

Ohimenevä transfektio on melanoomasolulinjan siRNA vastaan ​​syklofiliini-B.

WM9 on melanooma solulinjaa, joka oli transfektoitu tilapäisesti 20 nM ja 50 nM siRNA vastaan ​​syklofiliinistä-B (PPIB), tai salattu negatiivinen kontrolli siRNA.

rintasyövän, AML, eturauhassyöpä ja peräsuolen syöpä sekä neuroblastoomasolu- linjat JQ1.

JQ1 on pieni molekyyli, yhdiste, joka inhiboi bromodomain proteiinin BRD4. Kohdistumista tämän onkogeenin johtaa kasvun estäminen syövän solulinjat. Eräs tunnettu mekanismi on kautta downregulation MYCN. Olemme käsiteltiin kaksi rintasyövän solulinjat (MCF-7 ja SKBR3), yksi AML solulinja (K562), yksi eturauhassyöpä-solulinjaa (PC-3), yksi peräsuolen syövän solulinja (SW-620) ja yksi neuroblastoomasolulinja ( SJNB-12) ja 1 uM JQ1 24 ja 48 tuntia.

MCF-7 ja HeLa transcriptome PCR Arrays

Käytimme kaupallisesti saatavilla valmiita käyttää cDNA levyt MCF7 (rintasyöpä solulinja) ja HeLa (kohdunkaulan syöpä solulinja). Jokainen cDNA näyte on syntetisoitu RNA: ta solulinja, joka oli altistettu yhden 90: stä eri kemiallisia inhibiittoreita. Nämä kemialliset estäjät kohdentaa laaja valikoima erilaisia ​​reittejä johtaa eri häiriöiden kahden laajalti käytetty syöpäsolulinjoilla. Kemialliset estäjät ja geenit niiden kohteena on lueteltu taulukossa S1.

Alu toistaa ovat kaikkein vakaasti ilmaistuna referenssisekvenssissä

mRNA-tasoja 11 ehdokkaan viite määrityksissä mitattiin kaikista edellä kuvatut kokeet ja keskimääräinen ilmentyminen vakauden laskettiin geNorm algoritmia. GeNorm riveissä viittaus geenit niiden vakauden arvo (kutsutaan M-arvo) ja laskee optimaalisen määrän geenejä voidaan käyttää normalisointia tietyssä kokeessa käyttäen V-arvo (Kuva S1). M-arvoja voidaan käyttää sijoitus geenien pienimmästä vakain yksi [4].

13 19 häiritseekin suoritetuissa kokeissa, Alu toistaa (Alu-Sq) on rankattu kolmen vakain viite määritykset (kuva 3). Tämä havainto sai meidät analysoimaan edelleen mahdollinen arvo Alu toistuu vakaiksi viitteenä ehdokkaita.

X-akseli esittää sijoitusta viittaus geenien, ja Y-akseli esittää geNorm M-arvoja. (A), nutlin-3 käsiteltyjen neuroblastoomasolujen. (B), ATRA käsiteltiin neuroblastoomasoluihin. (C), withaferin Käsitelty neuroblastoomasoluihin. (D), TAE-684 käsiteltyjen neuroblastoomasoluihin. (E), neuroblastooma, jotka on transfektoitu siRNA: t vastaan ​​T-UCRs. (F), neuroblastoomasolut, jotka oli transfektoitu miR-1 matkivat. (G), T-ALL solulinjoja (HPB-ALL, ALL-SIL, ja TALL-1) oli transfektoitu miR-223 matkivat tai negatiivinen kontrolli miR matkivat. (H), T-ALL-solulinja JURKAT transfektoitu

PHF6

-targeting siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA. (I), T-ALL-solulinjojen (HSB-2 ja PF-382) transfektoitiin

PHF6

-targeting siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA. (J), NSCL solulinja (H3122) käsiteltiin crizotinib. (K), melanoomasolulinjaa (WM-9) transfektoitiin siRNA vastaan ​​Syklofiliiniesimerkkeihin-B. (L), AML solulinja (K562) käsiteltiin JQ1. (M), rintasyövän solulinjan (MCF-7), käsiteltiin JQ1. (N), rintasyöpäsolulinja (SKBR-3), joita hoidettiin JQ1. (O), eturauhassyöpä-solulinjaa (PC-3), joita hoidettiin JQ1. (P), peräsuolen solulinja (SW-620) käsiteltiin JQ1. (Q), neuroblastoomasolulinjasta (SJNB-12) käsiteltiin JQ1. (R), MCF-7, käsiteltiin 90 erilaiset kemialliset estäjät. (S), kohdunkaulan syöpä solulinja (HeLa) käsiteltiin 90 erilaisia ​​kemiallisia estäjiä.

listalla yhdistämismenetelmä perustuu äänestykseen teoriaan (Borda count) käytettiin yhdistämään 19 sijoittui luettelot viite ehdokkaista [21]. Tämä menetelmä yrittää löytää järjestetyn listan viite määritykset mahdollisimman lähellä kaikkien yksittäisten tilata luettelot laskemalla painotettu Spearmanin footrule etäisyyden, ja käyttäen rajat entropian Monte Carlo algoritmi tai geneettinen algoritmi [21]. Analyysi 19 koko geeni luetteloita, syntyy 19 eri kokeissa, johti Alu toistoja sijoittui ensimmäisessä asennossa (kuva 4). Tämä vahvisti, että Alu toistoja edustavat vakain viittaus määrityksen kaikissa aineistoja.

Rank aggregaatiota tuloksen käyttämällä ristin entropia algoritmi Spearmanin jalka-sääntö painotettu etäisyydellä, joka esittää konsensus järjestystä viittaus geenien kaikkein vakaista vähiten vakaa.

keskustelu

RT-qPCR on yleisimmin käytetty menetelmä määrittämään geenien ilmentymistä ja tarkka normalisointi on tulkittava RT-qPCR tietoja oikein. Normalisointi käyttäen endogeenisen kontrolligeenin on laajalti käytetty menetelmä, korjaamaan tekniset muutokset, jotka tapahtuvat aikana RT-qPCR reaktioita. Viime aikoihin asti, yksi ei-validoitu viite geeni on rutiininomaisesti käytetty sisäisenä kontrollina. Olemme aiemmin raportoitu, että tämä strategia voi johtaa virheellinen tieto virhe jopa 3-kertaiseksi 25%: ssa tapauksista [4]. Useiden viite geenien sisäisen valvonnan normalisoimiseksi RT-qPCR tiedot sekä käyttämällä asianmukaisia ​​viittaus geenit tiettyjä kokeellisiin tarkoituksiin on jo puoltanut kirjallisuudessa [2], [22]. Validoinnissa stabiili ilmentyminen viite geenien on tärkeä kysymys jokaisessa yksittäisessä koejärjestelyjen koska solun manipulointia kuten käsittelyä terapeuttiset yhdisteet voivat vaikuttaa huomattavasti heidän ilmaisua.

Tässä tutkimuksessa Korostamme sitä, että oikea valinta viite geenit on tärkeää tulkinta RT-qPCR tiedot ja osoittaa, että Alu toistoja edustavat vakain viittaus määritystä monenlaisia ​​koeolosuhteissa kahdeksassa eri syöpätyyppejä.

Valitsimme 11 viitaten geenejä, jotka ovat laajalti käytetyt kirjallisuudessa ja jotka kuuluvat eri toiminnallisia luokkia välttää yhteissääntelyä. Valitsimme rakenne liittyvät geenit (

ACTB

,

RPL13A

), aineenvaihduntaan liittyvien geenien (

HPRT

,

GAPDH

), ja transkriptio liittyvien geenien (

TBP

). Loput geenit ei luokitella erikseen yhdessä toimintakykyluokituksessa. Olemme myös mukana ilmaisi Alu toistaa, joita runsaasti lomassa läpi genomin. Yleisesti käytetty normalisointitekijällä RT-qPCR kokeiluja kirjallisuudessa on 18S rRNA. RRNA muodostaa yli 90% kokonais-RNA, ja tämä seikka johtaa monet tutkijat käyttää 18S rRNA kontrollina normalisointia geeniekspression tietoja. Kuitenkin on osoitettu, että yhtä suuri jakeet rRNA ei välttämättä tasapuolisesti jakeet mRNA [23]. Tämä huoli on vielä suurempi merkitys syöpäsolujen häiritseekin kokeista nämä häiriöt saattavat johtaa erilaiseen ekspressioon RNA-polymeraasi I ja /tai II, tai ero hajoaminen kaksi RNA populaatiot [24], ja näin ollen voi johtaa edelleen epätasapainoa rRNA /mRNA-suhde. Lisäksi suuri määrä rRNA verrattuna mRNA on vaikea vähentää taustan fluoresenssi data-analyysi RT-qPCR tietoja [4]. Näistä syistä johtuen, käyttämällä 18S-rRNA kontrollina RT-qPCR kokeita voisi johtaa virheelliseen tulkintaan geeniekspression tietoja. Olemme siis ole arvioinut 18S rRNA Tutkimuksessamme.

RT-qPCR suoritettiin 11 viite analyysit 21 syöpäsolulinjoissa peräisin 9 eri syövän yksiköiden, SYBR vihreää teknologiaa. Solulinjat olivat alttiina ankarissa hoidon olosuhteissa, tuottaa 19 eri aineistojen, joissa on yhteensä 418 näytettä. Soluja käsiteltiin erilaisilla kemiallisilla estäjien pro-apoptoottisten yhdisteiden ja, erilaistumista indusoivia aineita, tai transfektoitu miRNA jäljittelee tai siRNA. Käyttämällä geNorm [4] toteutetaan Qbase + [1], laskimme vakautta arvon tai M-arvo. M-arvo on keskimääräinen pareittain vaihtelu (standardipoikkeama) log-transformoituja suhteet ekspressiotasot pariksi ehdokas viite geenejä. Tätä arvoa ei vain saa meidät listalla viittaus geenien suhteen niiden vakautta, vaan myös verrata vakautta näiden viite geenien eri koeolosuhteissa. M-arvoja ja rankingissa viitteen geenien kaikki tiedot sarjasta esitetään taulukossa 1. M-arvot alle 0,5 luokitellaan hyviä arvoja [1]. Leviäminen M-arvot jokaisen geenin joukossa kaikki kokeet esitetään rasiakuvaajan kuvassa S2.

Kun olet laskenut M-arvot ja sijoitusta viittaus geenejä, huomasimme, että Alu toistoja rankattu vakain viittaus geenien valtaosa aineistoja ja yleensä alhainen M-arvoja. Sitten soveltanut listalla yhdistäminen strategia [3], joka määrittelee optimaalisen sijoitusta viittaus geenien kaikissa 19 aineistoja. Tämä analyysi vahvisti, että Alu toistoja edustavat vakain viittaus määrityksessä hyväksyttävien M-arvoja. Kaikki geenien ilmentymisen mittaukset tehtiin käyttäen SYBR vihreä. Erilaiset teknologiat ovat tällä hetkellä saatavilla, ja useat tutkimukset ovat tehty vertailuja eri alustojen käytetty [25]. Tulokset ovat osoittaneet, että SYBR vihreä on erittäin hyvä yhdenmukaiset laajasti käytössä TaqMan geeniekspression määrityksiä. Nykyisessä tutkimuksessa olemme käyttäneet solulinjoja, jotka antavat hyvän tuoton RNA ja täydellinen laatu (testattu käyttäen Experion järjestelmän Bio-Rad). Uskomme, että käyttämällä tällaisia ​​laadukkaita RNA materiaalista ja niin runsas viittaus geenit tuottavat toistettavia tuloksia riippumatta alustan käytössä. Tuloksemme voimakkaasti korostavat oikea valinta viite geenien erilaisia ​​kokeellisia asetelmia. Lisäksi osoitimme, että Alu toistuu voi toimia vakaana viittaus useimmissa koeolosuhteissa.

Johtopäätökset

Luotettavuutta RT-qPCR data perustuu tarkka normalisoitumista syntyvän dataa sisäisiä geenejä. Vakautta ja soveltuvuus oletettujen endogeenisen kontrolligeenin on välttämättömyys tarkka normalisoinnin ja oikean tulkinnan geenien ilmentyminen tietoja. Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että joukossa 11 yleisesti käytetty viittaus geenejä, Alu toistot ovat vakain referenssijaksoa solulinjoissa 9 eri syövän tyyppejä, jotka joutuivat eri häiritseekin kokeita. Siksi suosittelemme sisällyttää Alu toistetaan ensimmäisenä ehdokas normalisointia RT-qPCR data.

Materiaalit ja menetelmät

Vertailun valinta geenien

Valinta sisäisten ohjaus geenit arvioitiin tässä tutkimuksessa (taulukko 1) perustuu aiempaan julkaiseman tutkimuksen ryhmämme [2], [4] – [6]. Nämä geenit ovat yleisesti käytetään viitteenä geenejä kirjallisuudessa ja kuuluvat eri polkuja välttää yhteissääntelyn näiden geenien kun erilainen kohtelu olosuhteissa. Laajensimme tämän valinnan sisältämään ilmaisi Alu toistuu.

solulinjojen ja Soluviljely

käytetyt solut ovat vakiintuneet solulinjat 9 kasvaintyypit, neuroblastooma, T-ALL, melanooma, rintasyöpä , akuutti myelooinen leukemia, eturauhasen syöpä, peräsuolen syöpä, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, sekä kohdunkaulan syövän. Yksityiskohtaiset tiedot viljely solulinjojen, ja niiden lähde mainitaan File S2.

lääkehoito ja Cell elinkelpoisuusarviointi

Soluja käsiteltiin 16 uM nutlin-3 (Cayman Chemical, USA) tai ajoneuvon ohjaus (etanoli) 1 ja 5 päivää, 16 uM ATRA (Sigma-Aldrich, Belgia), tai ajoneuvon hallinnan (DMSO), 1 uM withaferin-A tai ajoneuvon ohjaus (etanoli), 0,1 uM, 0,3 uM tai 1 uM TAE -684 (Novartis, Sveitsi) tai ajoneuvon hallinnan (DMSO), 1 uM JQ1 (Cayman Chemical, USA) tai ajoneuvon hallinnan (DMSO) ja edellä mainitun ajankohtina. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttämällä CellTiter-Glo (Promega, Belgia) luminscent ATP-määrityksessä.

Transfektio siRNA: t ja miRNA Mimics

SK-N-BE (2c), SK-N -SH, SH-EP, ja SH-SY5Y-solut transfektoitiin miR-1 matkivat käyttäen Dharmafect-2 (Dharmacon, Iso-Britannia) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 500,000 solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille antibiootteja väliaineessa ja toimitetaan 10% vasikan sikiön seerumia. 24 tuntia myöhemmin, solut transfektoitiin käyttäen lopullinen pitoisuus 100 nM miR-1 matkivat ja 0,2% Dharmafect-2. Solut kerättiin sitten 48 tunnin kuluttua.

SH-EP-solut transfektoitiin siRNA: t vastaan ​​T-UCRs (uc.73 ja uc.460) käyttäen Dharmafect-2 ohjeiden mukaisesti valmistajan. Lyhyesti, 100,000 soluja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla ja transfektoitiin käyttäen lopulliseen pitoisuuteen 50 nM siRNA: iden ja 0,2% Dharmafect-2. Solut kerättiin talteen 15, 24, 48 ja 72 tuntia.

T-ALL-solulinjoja elektroporaatio arvoilla 250 V ja 1000 iF (eksponentiaalista pulssi) (GenePulser II, Bio-Rad, Hercules, CA , USA) 400 nM, 100 nM, 25 nM ja 10 nM

PHF6-

kohdistaminen siRNA (oN-TARGETplus SMARTpool; Dharmacon, Lafayette, CO, USA) Jurkat-soluja ja 400 nM

PHF6-

kohdistaminen siRNA varten HSB-2 ja PF-382. ALL-SIL, T-ALL-1, ja HPB-ALL tehtiin elektroporaatio 600 nM miR-223 matkivat. Kontrollina, me elektroporoitiin solut, joilla on samanlaiset pitoisuudet salattu siRNA (ON-TARGETplus Non-kohdistaminen Pool, Dharmacon, Lafayette, CO, USA) tai ilman siRNA. Me korjattu HSB- 2, PF-382, ALL-SIL, T-ALL-1, ja HPB-ALL-solut 1, 24, 48, 72, ja 96 tunnin kuluttua elektroporaatio ja Jurkat-soluissa 48 tunnin kuluttua.

WM-9-solut transfektoitiin 20 nM, ja 50 nM siRNA pool vastaan ​​PPIB tai salattu siRNA (oN-TARGETplus Non-kohdistamista allas, Dharmacon, Lafayette, CO, USA).

luettelo kemialliset estäjät, jota Qiagen hoitoon MCF-7 ja HeLa-soluissa ja niiden luettelo kohdegeenien on lueteltu taulukossa S1.

RT-qPCR

uutto kokonais-RNA, DNaasikäsittely, cDNA synteesi, ja SYBR Green I RT-qPCR päässä häirityn soluja suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [4], [7]. Valmiita käyttöön cDNA levyt MCF-7 ja HeLa tilattiin Qiagen, Alankomaat. Seuraavat alukesekvenssit ovat käytettävissä RTPrimerDB tietokantaan (https://www.rtprimerdb.org) [4], [26]: ACTB (RTPrimerDB ID # 1), B2M (# 2), GAPDH (# 3), HMBS (# 4), HPRT1 (# 5), RPL13A (# 6), SDHA (# 7), UBC (# 8), YWHAZ (# 9). Sekvenssi Alu-Sq toistaa alukkeet ovat CATGGTGAAACCCCGTCTCTA että eteenpäin-aluketta ja GCCTCAGCCTCCCGAGTAG että reverse-aluketta. Alukkeen sekvenssit TBP alukkeet olivat, kuten on kuvattu [8], [27]. RNA Laatuindeksi (RQI 8) arvioitiin 20 satunnaisnäytteille käyttäen Experion (ohjelmistoversio 3.2, Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgia).

Statistical Mittaukset ja data-analyysin

GeNorm saatavilla Qbase + (Biogazelle, https://www.qbaseplus.com) käytettiin laskemaan M-arvot ja määrittää geenin ilmentyminen tietoja. GeNorm on algoritmi, joka laskee geeniekspressiovektoria vakauden mitta (M-arvo) valitun viite geenit. Tämä tehdään laskemalla pareittain vaihtelu (standardipoikkeama transformoidaan logaritmisesti ilmentymisen suhde) kunkin viite-geenin kaikkien muiden viitaten geenejä. Pienin M-arvo osoittaa geenin, jolla on korkein ilme vakautta. Vaiheittainen syrjäytyminen geenin, jolla on korkein M-arvo mahdollistaa sijoitusta geenien suhteen ilmaisun vakautta. Analyysi kaikkien yksittäisten sijoittui geeni listojen tehtiin käyttäen listalla yhdistäminen R paketti nimeltään ”RankAggreg” [21]. RankAggreg käytettiin määrittämään vakain viitegeenin kaikissa kokeissa. Rankaggreg on R paketti listalla yhdistäminen analyysiä. Käytimme tätä pakettia analysoida yksittäisiä sijoittui geenin luetteloita. Nämä geeni luettelot rankattiin mitattuna niiden M-arvot ja sijoitus yhdistäminen analyysi antoi meille mahdollisuuden löytää mahdollisimman lähellä listan kaikkien yksittäisten jotka on luotu yksittäisten kokeita. Tarkemmin sanottuna käytimme Cross-Entropy (CE) Monte Carlo algoritmi toteutetaan tämän paketin joka alkaa tuottamalla satunnainen luetteloita ja sitten suppenee kohti parasta optimaalista listan kautta Iterointimenettelyn joka käyttää etäisyyden funktio. Painotettu Spearmanin footrule etäisyyttä käytetään tähän tarkoitukseen ja meidän tapauksessamme paino on käytetty M-arvon tuottama GeNorm algoritmin jokaisen geenin yksittäisten luetteloihin.

tukeminen Information

Kuva S1.

GeNorm V-arvoja yksittäisten kokeiden

. GeNorm V-arvoa käytetään määrittämään optimaalinen määrä viite geenejä. GeNorm laskee pareittain vaihtelu 2 peräkkäisen normalisointikertoimia (NFS). Normalisointitekijä on geometrinen keskiarvo ilmentymisen valitun viite geenit. Normalisoituminen NF

n + 1 on geometrinen keskiarvo NF

n lisättynä viittaus geeni. V

2/3 on vaihtelusta NF

2 ja NF

3, ja niin edelleen. Vandesompele

et al.

[4] ehdottanut 0,15 kuin raja, jonka alapuolella ei ole tarpeen lisätä uusi viite geeni. (A), nutlin-3 käsiteltyjen neuroblastoomasolujen. (B), ATRA käsiteltiin neuroblastoomasoluihin. (C), withaferin Käsitelty neuroblastoomasoluihin. (D), TAE-684 käsiteltyjen neuroblastoomasoluihin. (E), neuroblastooma, jotka on transfektoitu siRNA: t vastaan ​​T-UCRs. (F), neuroblastoomasolut, jotka oli transfektoitu premiR-1. (G), T-ALL solulinjoja (HPB-ALL, ALL-SIL, ja TALL-1) oli transfektoitu premiR-223 tai negatiivinen kontrolli premiR. (H), T-ALL-solulinja JURKAT transfektoitu

PHF6

-targeting siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA. (I), T-ALL-solulinjojen (HSB-2 ja PF-382) transfektoitiin

PHF6

-targeting siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA. (J), NSCL solulinja (H3122) käsiteltyjä soluja crizotinib. (K), melanoomasolulinjaa (WM-9) transfektoitiin siRNA vastaan ​​syklofiliini-B. (L), AML solulinja (K562) käsiteltiin JQ1. (M), rintasyövän solulinjan (MCF-7), käsiteltiin JQ1. (N), rintasyöpäsolulinja (SKRB-3), joita hoidettiin JQ1. (O), eturauhassyöpä-solulinjaa (PC-3), joita hoidettiin JQ1. (P), peräsuolen solulinja (SW-620) käsiteltiin JQ1. (Q), neuroblastoomasolulinjasta (SJNB-12) käsiteltiin JQ1. (R), MCF-7-soluja käsiteltiin 90 erilaiset kemialliset estäjät. (S), kohdunkaulan syöpä solulinja (HeLa) käsiteltiin 90 erilaisia ​​kemiallisia estäjiä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0071776.s001

(TIF) B Kuva S2.

hajonta M-arvojen

. Rasiakuvaaja osoittaa dispergoitumisen M-arvot viittauksia geenien poikki al aineistoja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0071776.s002

(TIF) B Taulukko S1.

Chemical inhibiittorit. Luettelo 90 kemiallisia estäjiä ja geenit niiden kohteena.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0071776.s003

(XLSX)

Tiedoston S1.

Experimental suunnittelu ja manipulointi solulinjoissa.

Ohimenevä transfektiosta SH-EP-solujen siRNA vastaan ​​puhtaaksi ultraconserved alueita, ja optimointi pitoisuus

PHF-6

-targetting siRNA: illa in T-ALL solulinjoissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0071776.s004

(DOCX)

Tiedoston S2.

Solulinjat ja Soluviljely

. Tietoa lähde ja viljelyolosuhteet solulinjoista.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0071776.s005

(DOCX) B

Kiitokset

Haluamme kiitos Nurten Yigit, Aline Eggermont, ja Katrien Vanderheyden niiden teknistä apua.