Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

perhe sinkkisormipolypeptidi sisältävä GATA transkriptiotekijöiden pelaa kriittinen rooli solulinjaan selityksessä aikana alkion varhaiskehityksen ja urut muodostumista. GATA4 ja GATA6 todettiin usein menetetty munasarjasyöpä, ja menetys on ehdotettu tilille erilaistamattomuuden syöpäsolujen.

Menetelmät /Principal Havainnot

tutki tarkemmin ilmaisun GATA4 ja GATA6 munasarjan pintaan epiteelin vaurioiden ja histologisia alatyyppejä munasarjakarsinoomat immunovärjäyksellä. GATA4 ja GATA6 havaittiin olevan poissa suuresta määrästä (80 ja 90%) vakavien, kirkas solu, ja endomet- munasarjasyöpä tutkittu. Sitä vastoin sekä havaittiin positiivinen 11 ulos 12 tapausta mucinous karsinoomien, mikä viittaa siihen, ilmentyminen GATA tekijät voivat erottaa mucinous syövän muista histologisia alatyyppejä. GATA4 oli usein menetetty esiuudiskasvuisissa vauriot kuten morfologisesti normaali osallisuuden kystat ja epiteelin liikakasvun vieressä pahanlaatuisia soluja. Menetys GATA6 korreloi tiiviisti neoplastisen morfologinen transformaatio munasarjojen pinnan epiteeli. Kulttuuri, GATA4 ilmentyminen alenevaa päälle viemällä primääri munasarjojen pinnan epiteelisolujen, joka korreloi muutoksiin histoni muuttaminen GATA4 lokuksen. Alentunut GATA6 geeni annostus kuin GATA6 (+/-) hiirille lisäsi pre-neoplastisia muutoksia ja osallisuutta munasarjarakkuloita, mikä viittaa menetys GATA6 myötävaikuttaa munasarjasyöpään kehittämiseen.

Johtopäätökset /Merkitys

Tämä tutkimus viittaa siihen, että ilmaisun tilan GATA4 ja GATA6 voi sanella selvä patologisen johtavia reittejä serous tai mucinous munasarjojen karsinoomat. Helposti menetys GATA4 ilmaisun muutosten chromatin konformaatiossa ehdottaa mahdollisia ei-fenotyypin alkutapahtumasta, mikä johtaa myöhemmin menetykseen GATA6, morfologinen transformaatio, ja lopullinen kasvaimen kehittymisen.

Citation: Cai KQ, Caslini C, Capo- chichi CD, Slater C, Smith ER, Wu H, et al. (2009) menetys GATA4 ja GATA6 Expression Määrittää munasarjasyöpä histologinen alatyyppi ja edeltää neoplastisen muuttumisen Munasarjojen Surface epiteelin. PLoS ONE 4 (7): e6454. doi: 10,1371 /journal.pone.0006454

Editor: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Lasten Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2009; Hyväksytty: 23 Kesäkuu 2009; Julkaistu: 31 heinäkuu 2009

Copyright: © 2009 Cai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Näitä tutkimuksia tukivat varoja avustuksista R01 CA095071, CA79716 ja CA75389 XX Xu, ja varat munasarjasyöpä SPORE P50 CA83638 (RF Ozols, PI), ja Core Grant # CA006927. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjojen epiteelin syöpä on yleisesti ajatellaan syntyvän coelomic epiteelin kattaa munasarjojen pinnan [1], [2] tai osallisuudesta kystat, jotka ovat myös arvellaan johtuvat munasarjojen pintaepiteelissä [3], [4 ]. On kuitenkin olemassa myös vahvoja perusteluja, että ainakin joidenkin munasarjojen epiteelin syövän peräisin muita soluja kuin pinnan epiteeli [5], [6], [7]. Useita erillisiä histologisia alatyyppejä voidaan luokitella solumorfologiaan: nämä ovat vakavien, mucinous, kirkas solu, ja endometroid alatyyppejä [8], [9]. Yksi idea selittämään erilaisia ​​histologisia alatyyppejä on, että munasarjojen pinnan epiteelisolujen läpi metaplasiaa hyväksyä erilaisia ​​histologisia ominaisuuksia siirtymäkauden aikana [2], [8]. Toinen ajatus on, että munasarjasyöpä voi aiheutua jäännökset mullerian kanavan rakenteita [6], jotka ovat esiasteita munanjohtimet, kohdunkaula, kohtu, jne, ja voi ilmetä kaikki histologinen alatyyppi kasvaimissa. Itse asiassa viime havaintoja johtaa oletukseen, että merkittävä osa vakavien munasarjakarsinoomat voivat olla peräisin munanjohtimet [5], [7], joka on vakavien kuten epiteelisolujen.

Vaikka jotkin ominaisuudet esiastesolujen voi säilyttävät eroa syöpäsolujen esiastesolujen on ilmeistä, ja useita tunnusmerkkejä neoplastiset solut on tunnistettu [10]. Ainutlaatuinen geneettiset mutaatiot ovat perustana neoplastisen fenotyyppien [11] – [13], ja lisäksi syöpäsolujen esiintyvät usein sopimattomasti eriytetty vaiheessa ja termi ”erilaistamattomuuden” käytetään usein [14] – [16]. Fenotyyppi kuvattu ”erilaistumaton” tai ”dedifferentoituneiden” munasarjasyövän viitataan usein ilmenee muutoksia syöpäsolujen kohti vähemmän epiteelin kaltainen morfologia tai poikkeamaan esiastesoluista. Tarjota molekyyli- tulkinta ”erilaistamattomuuden” syöpäsolujen, voidaan harkita käsitteen solulinjan erilaistumisen ulkoneva kehitysbiologian, jossa alkukantainen solu muuttuu samalla globaalin geeniekspressioprofiili kohti tiettyä kypsä solutyypin. Vastaavasti, erilaistamattomuuden syöpäsolujen voi johtua menetys yhden tai useamman kriittisen geenejä, jotka ovat keskeisiä indusoimaan erilaistumista ensiarvoisen solutyypin, jolloin saatiin munasarjojen pinnan epiteelisolujen. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, menetys transkriptiotekijän GATA6 ja GATA4 munasarjasyövän voi selittää menetys epiteelin ominaisuudet ja voi olla taustalla mekanismi ”erilaistamattomuuden” munasarjasyövän solujen [17], [18].

Euroopan GATA transkriptiotekijät sitoutuvat yksimielisyyteen A /TGATAA /G järjestyksessä promoottoreita ja ovat konservoituneita hyönteisten ja selkärankaisten välillä lentää ihmiseen [19]. GATA4 ja GATA6 ilmaistaan ​​useimmissa elimissä, ja kriittisiä rooleja kehittämisessä nämä elimet [20], [21]. GATA4 ja GATA6 ensin ilmaistaan ​​muodostumisen aikana extraembryonic Endodermi erotettava Alkion pluripotenttien kantasolujen ja sisäsolumassasta alkupuolella alkionkehityksen [22] – [25]. GATA tekijät eivät ole kudosspesifisiä, vaan toiminto selityksessä ja erilaistumista solulinjojen elimessä, kuten erilaistumista epiteelisolu sukua stroomasoluissa. GATA4 ja GATA6 ilmaistaan ​​ihmisen munasarjan pintaepiteelisolujen [17], [18], ja oletettavasti, GATA4 ja GATA6 ovat tärkeitä muodostumista ja ylläpitoa eriytetyn tilan munasarjojen pinnan epiteelisolujen. GATA4 ja GATA6 usein menetetään munasarjasyöpäsoluja [17], [26], ja se on arveltu, että menetys näiden kehityksellisesti tärkeitä transkriptiotekijät voivat olla taustalla olevan mekanismin erilaistamattomuuden [17], [18].

Onko GATA6 on tärkeää muodostumista munasarjojen pinnan epiteeli ei tunneta, koska vähän tiedetään johtaminen munasarjojen pinnan epiteelisolujen. Sekä GATA4 ja GATA6 ilmennetään munasarjojen pinnan epiteelisolujen, mutta puuttuu useimmista munasarjasyöpäsoluja [17], [18], [26]. Olemme saapuvat ChIP määrityksen, että histoni H3 ja H4 asetylaatio GATA4 lokuksen väheni suuresti syöpäsolujen vertaamalla GATA4-positiivinen ei-kasvainsoluihin [18]. Sen sijaan, histoni H3 ja H4 asetylaatio GATA6 lokuksen monissa syöpäsolut eivät vähentyneet ja jälkiä GATA6 mRNA voidaan havaita RT-PCR: llä, mikä osoittaa, että GATA6 geeni ei transkriptionaalisesti vaimennettu mutta viesti on tukahdutti muu mekanismi (s ) [18].

Harvat transkriptio tavoitteet GATA tekijöitä on tunnistettu, ja Disabled-2 (DAB2) on tunnettu transkriptio tavoite GATA6 [27]. DAB2 todettiin myös menetettiin munasarjasyöpä [28], korreloi puuttuminen GATA6 ja morfologinen transformaatio [18]. DAB2 puute hiirillä johtaa alkion alkuvaiheen kuolleisuutta [29] – [31], ja heterotsygoottinen DAB2 mutanttihiirillä kehittää pre-neoplastisia vaurioita munasarjojen pinnasta epithelia [32]. DAB2 on adapteri proteiini osallistuu endosyyttisiin ihmiskaupan ja DAB2 on rooli perustamisesta epiteelin polaarisuus ja pinta paikannus [33]. Menetys DAB2 uskotaan aiheuttavan morfologinen transformaatio munasarjojen pinnan epiteeli [34], [35]. Siten spekulointi on, että menetys GATA6 johtaa menetykseen DAB2 ja neoplastisten morfologinen transformaatio munasarjojen pinnan epiteeli.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme analysoitava tarkemmin yksityiskohdista GATA4 ja GATA6 ilmaisun munasarjakudoksessa ja syöpä ja tutkittiin vaikutusta vähentämiseen GATA6 hiirillä on munasarjojen pinnan epiteelisolujen muutosta.

tulokset

ilmentäminen GATA4 ja GATA6 munasarjasyövän histologinen alatyyppi

Aikaisemmin molemmat GATA4 ja GATA6 havaittiin olevan voimakkaasti ilmaistaan ​​primääri munasarjojen pinnan epiteelisolujen, mutta puuttuu viljellyissä munasarjasyövän soluihin sekä Western blot tutkia proteiinin tai Northern blot mitata mRNA [17], [18].

edelleen vasta-aineiden kehittymistä ja hienosäätö värjäyksen menettelyn, suoritimme immunohistokemiallista analyysiä varten ilmaus GATA4 ja GATA6 paneelissa munasarjojen ei-neoplastisia ja syövän kudosten kudoksen microarray (Taulukko 1). Muita 26 ei-munasarjasyöpä kudoksia ennalta ehkäisevää oophorectomies käytettiin myös tässä tutkimuksessa. Nämä munasarjojen kudokset saatiin sekä korkea ja normaali riskin omaavia naisia, mutta ei mikroskooppinen syöpä todettiin [36]. 111 informatiivinen munasarjakarsinoomat kudokseen microarray Tässä tutkimuksessa käytetyt koostuvat 82 vakavien, 12 mucinous, 12 kirkas solu, ja 5 endomet- alatyyppeihin (taulukko 1). Normaalissa yksikerroksista munasarjojen pinnan epiteeli, kaikki munasarjojen pinnan epiteelisolujen värjättiin positiivisia ydin- GATA4 ja GATA6 (kuvio 1A). Vaikka GATA4 ja GATA6 värjäystä ovat poissa tai vähentää merkittävästi useimmissa munasarjakarsinoomat (taulukko 1). Niistä informatiivinen tapauksissa menetys GATA4 havaittiin 81/82 (99%) vakavien karsinoomien, 1/12 (8,3%) mucinous karsinoomien, 11/12 (92%) kirkasta solukarsinoomat, ja 5/5 ( 100%) endometroid karsinoomien. Menetys GATA6 havaittiin 55/82 (67%) vakavien karsinoomien, 1/12 (8,3%) mucinous karsinoomien, 10/12 (83%) kirkasta cell carcinoma, ja 5/5 (100%) endometroid karsinoomat. Esimerkkejä immunovärjäyksiin on esitetty kuviossa 1, varten GATA4- ja GATA6-negatiivisia vakavien karsinooma (kuvio 1 B), joka on GATA4-negatiivisia, mutta GATA6-positiivisia vakavien karsinooma (kuvio 1C), joka on GATA6-negatiivisia, mutta GATA4-positiivisia serous karsinooma (kuvio 1 D), ja GATA4 ja GATA6-positiivisia mucinous karsinooma (kuvio 1E). On myös huomattava, että jotkut GATA4 ja /tai GATA6 värjäytyminen on läsnä stroomasoluissa sekä normaaleissa ja arka munasarjat, vaikka useimmat näistä värjäystä eivät ole niin voimakas kuin epiteelisolujen. Joissakin tapauksissa, kuten nähdään kasvaimen kuviossa 1B, pieniä stroomasolut, todennäköisesti immuuni- ja lymfosyyttisolujen, osoittaa vahvaa tuman värjäytymisen ja GATA4.

immunovärjäyksin of GATA4 ja GATA6 suoritettiin 111 munasarjakarsinoomissa, mukaan lukien 4. histologinen alatyyppi. Tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. A. Normaali munasarjojen pinnan epiteelisolujen ovat positiivisia sekä GATA4 ja GATA6 tumassa. 200-kertainen suurennus. B. Esimerkki Sekä GATA4- ja GATA6-negatiivinen vakavasta karsinooma. 40 x suurennus. C. Esimerkki GATA4-negatiivisten ja GATA6-positiivisia vakavasta karsinooma. 40 x suurennus. D. Esimerkki GATA4-positiivisten ja GATA6-negatiivinen vakavasta karsinooma. 40 x suurennus. E. Esimerkki Sekä GATA4- ja GATA6-positiivisia mucinous karsinooma. 40 x suurennus. E, epiteelin; T, kasvain; S, strooman.

Yksi silmiinpistävä piirre GATA4 ja GATA6 värjäytyminen on, että vaikka GATA4 ja GATA6 menetetään useimmissa munasarjasyövän (pääasiassa vakavien alatyyppi), karsinoomat mucinous alatyypin ovat enimmäkseen GATA4 – ja GATA6-positiivinen (taulukko 1). Siten ilmaus GATA4 ja GATA6 erottaa mucinous karsinoomat muista histologisia alatyyppejä.

menetys GATA4 edeltää menetys GATA6 pre-neoplastisia munasarjojen pinnan ja kystan epiteelin

GATA4 ilmentyminen puuttuu, että valtaosa vakavien munasarjasyövän, ja GATA6 on myös poissa monissa mutta myös positiivisia joissakin tapauksissa (taulukko 1). Negatiiviset GATA6 ja positiivinen GATA4 olemassa vain harvoissa tapauksissa munasarjojen karsinoomat. Näin ollen menetys GATA4 näyttää olevan yleisempiä kuin menetys GATA6 munasarjasyövän.

Aiemmin mikroskooppisen karsinoomat ja pre-neoplastisia morfologisia muutoksia havaittiin profylaktinen oophorectomies, osoittaa hyödyllisyyttä näiden kudosten tutkimalla aloittamista munasarjasyövän epiteelin syöpä [37]. Nykyisessä analyysi, 26 tapauksessa munasarjojen kudosten profylaktisen oophorectomies havaittiin sisältävän mitään mikroskooppisia kasvaimia, mutta niillä on morfologisesti muuttunut vaurioita, jotka ovat peräisin munasarjojen pinnan tai kyst epiteelissä [36]. Joissakin avoin munasarjakarsinoomat, morfologisesti normaali yksikerroksiset epiteelisolujen löytyy vieressä pahanlaatuisia soluja. Vain siksi fyysisen läheisyyden, nämä morfologiset normaali epiteelisolujen voi jakaa joitakin ominaisuuksia neoplastiset solut. Immunovärjäyksellä, olemme havainneet, että useimmissa tapauksissa GATA4 on poissa ja GATA6 on positiivinen yksikerroksinen, morfologisesti hyvänlaatuisiin vaurioihin, kuten on esitetty esimerkkinä (kuvio 2A). Toisessa esimerkissä, munasarjojen epiteelisolujen pinnalla ovat positiivisia GATA6 ja negatiivisia GATA4, ja epiteelin kystat pinnan alla menettänyt molemmat GATA4 ja GATA6 ilmentymistä (kuvio 2B).

Jokainen dioja 26 näytteiden sisältää vaihtelevia määriä vaurioita vaihteleva astetta morfologisten muutosten. Olemme tutkineet noin 80 näistä leesioista tehdä useita yleisiä kuvauksia: GATA4 on negatiivinen noin 80% pinta-epiteeli, ja GATA4 puuttuu lähes kaikissa ilmeinen vaurioita ja myös noin puolet morfologisesti normaalista yksisolukerrosten. GATA6 on yleensä läsnä (70%) on epiteelin vaurioita, ja menetys GATA6 korreloi neoplastisten morfologisia muutoksia (useita epiteelin layering) noin 90%: ssa tapauksista. Siten GATA4 menetys usein edeltää GATA6 menetys, ja menetys GATA4 ja GATA6 tapahtuu ennen pahanlaatuisiksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen.

immunoväriäys GATA4 ja GATA6 morfologisesti normaalin munasarjan pinta- ja /tai kysta epiteelin löytyy munasarjan karsinoomat. A. munasarjojen pinnan epiteeli on positiivinen GATA6 ja negatiivinen GATA4. Positiivinen GATA4 värjäystä strooman on huomattava. B. Munasarjojen pintaepiteelissä on positiivinen GATA6 ja negatiivinen GATA4. Sekä GATA4 ja GATA6 menetetään kysta epiteelisolujen pinnan vieressä. 200-kertainen suurennus. E, epiteelin; C, kysta; S, strooman.

katoaminen GATA4 ja /tai GATA6 läheisesti korreloi epiteelin morfologinen transformaatio

Vuosien varrella olemme koottu kokoelma 12 munasarjakarsinoomat jotka sisältävät vaurioiden vierekkäisiä epithelia yhdistää morfologisesti hyvänlaatuinen epiteelisolujen ilmeistä syöpäsoluja [35]. Tällaiset vauriot ovat myös kuvattu aiemmin mucinous ja vakavien munasarjojen cystadenocarcinomas [38]. Päättelimme, että kun läsnä on siirtyminen hyvänlaatuisia pahanlaatuinen voi olla hyödyllistä määrittää osallistumista kandidaattigeenien munasarjaepiteelisolujen tuumorigeneesiin. Itse asiassa kaikki 12 tapauksissa hyvänlaatuinen neoplastisten siirtymät analysoitiin menetys GATA4 ja /tai GATA6 läheisesti assosioituu neoplastisen morfologinen transformaatio. Ensimmäisessä esimerkissä (kuvio 3A), GATA4 on jo poissa hyvänlaatuinen yksikerroksista; GATA6 on positiivinen yksikerrossoluissa mutta on menetetty viereisen syöpäsoluja. Menetys GATA6 tiiviisti korreloi menetys sen transkription kohde- DAB2 (kuvio 3A). Toisessa esimerkissä, GATA4 ja GATA6 ilmentyminen menetetään samanaikaisesti tiiviisti menetys DAB2 ja morfologiset muutosta (kuvio 3B). Laajentunut hyvänlaatuinen neoplastisten siirtyminen päällä (kuvio 3B, alempi paneeli) osoittaa, että GATA4 äkillisesti katoaa, ja GATA6 vähenee huomattavasti siirtymisestä.

Esimerkkejä ihmisen munasarjasyövän värjättiin GATA4, GATA6, ja DAB2 vuonna viereisten tuumorisektioiden. A. munasarjojen pinnan epiteeli, joka koostuu morfologisen normaalin pintaepiteelissä (nuoli pää) contiguously yhdistää pahanlaatuisia soluja (nuoli), jotka ovat joko tunkeutunut osaksi strooman tai laajeni alueilla ympäri munasarja. GATA4 on negatiivinen sekä morfologisia normaalissa tai neoplastisten epiteelisolujen. Epiteelisolujen morfologiset normaalin epiteelin ovat positiivisia GATA6 ja DAB2, ja pahanlaatuiset solut ovat negatiivisia GATA6 ja DAB2. Jotkut hajallaan solut strooman ovat DAB2 positiivinen, mutta negatiivinen GATA6. Nämä solut ovat makrofagit, joissa DAB2 ilmaisu ei ole GATA6 riippuva. B. Tässä munasarjasyövän epiteelin solujen morfologisia normaalin epiteelin ovat positiivisia GATA4, GATA6, ja DAB2, ja viereisen pahanlaatuiset solut ovat negatiivisia GATA4, GATA6, ja DAB2. Kuvat on otettu mikroskoopilla, jossa on 100-kertainen suurennus. Värjäykset varten GATA4 ja GATA6 siirryttäessä paneelissa B esitetään suurennettuna (400 ×) alempaan paneelit. E, epiteelin; C, kysta; S, strooman; T, kasvain.

Näin ollen menetys GATA6 ilmaisun korreloi läheisesti neoplastisen transformaation munasarjojen pinnan epiteeli, jota on havaittu vierekkäisiä munasarjojen pinnan epiteeli yhdistää morfologisesti normaali pahanlaatuisten solujen (kuvio 3). Aikaisemmissa tutkimuksissa [18], [35], munasarjojen pinnan epiteeli välittömässä läheisyydessä kasvaimen alueita pidettiin pre-neoplastisia. Nämä pre-neoplastisia vaurioita puuttuu usein ehjä tyvikalvon kuten puuttuminen kollageeni IV ja laminiini värjäys sekä menetys DAB2 ilmaisun [35]. Vuonna morfologisesti normaalin epiteelin välittömässä läheisyydessä kasvain alueilla sekä GATA6 ja DAB2 ovat positiivisia. Kuitenkin contiguously kytketty neoplastiset solut ovat negatiivisia sekä GATA6 ja DAB2 värjäystä. Neoplastiset solut transformoitiin epiteelin, joka on välittömästi liitetty morfologisesti normaalista munasarjan pintaepiteelisolujen ovat todennäköisesti eniten samanlainen kuin normaali, ja näin ollen pidetään alussa kasvainsoluja. Tällainen analyysi viittaa siihen mahdollisuuteen, että menetys GATA6 on yksi syiden selvittämiseksi munasarjan epiteelin muutosta.

Havainnot ihmisen munasarjasyövän kudoksiin viittaa siihen, että menetys GATA4 ilmaisun usein edeltää menetys GATA6, ja tappio of GATA6, korreloi menetys DAB2, kumppaniaan epiteelin morfologinen transformaatio.

vähentäminen GATA tekijän ilmentymisen kun siirrostamalla munasarjojen pinnan epiteelisolujen primaariviljelmissä

Yli viimeisen 5 vuoden aikana tutkimukset GATA tekijöiden munasarjojen pinnan epiteelisolujen ja kulttuuri soluja, olemme havainneet, että GATA4 puuttuu useimmissa munasarjasyövän solulinjoissa ja SV-40-transfektoidut, ”kuolemattomaksi” munasarjojen pinnan epiteelisolujen [17], [18]. Lisäksi GATA4 ilme oli vaihteleva ensisijainen Ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen. Niinpä spekuloida, että ilmaus GATA4 ei ole vakaa munasarjojen pinnan epiteelisolujen ja saattaa vähentää asteittain ajan myötä.

Voit testata tätä ajatusta, emme tarkkaan seuranneet kohdat primääri munasarjojen pinnan epiteelisolujen kulttuuri yli- ja seurataan ilmentymistä GATA4, GATA6, ja DAB2 geenejä. Munasarjojen pinnan epiteelisolujen kerättiin munasarjoja profylaktisen oophorectomies kuten aiemmin on kuvattu [17], [18]. Kudokset tutkittiin ja määritettiin olevan morfologisesti normaali ja mitätön mikroskooppisen kasvaimia. Kennon kaksinkertaistaa aika oli noin kaksi viikkoa ja lyhentää yhteen viikkoon 5 päivää myöhemmin kohtia. Olemme toteuttaneet kohdat letkun solun valmiste (ROE 1005816) ja kanava 10 yli kahden kuukauden aikana ja solut olivat edelleen erittäin proliferatiivisen lopussa. Tyypillisesti solut voivat kasvaa viljelmässä noin 20 kappaleita yli 6 kuukauden jakson aikana ennen leikkausta monistus vanhenemista. Jokaisen kanavan, puolet solut kerättiin ja käytettiin ilmentämiseen analyysiä, ja toinen puoli pidettiin jatkuvasti viljelmässä.

Ensinnäkin muutoksia morfologiaan munasarjojen pinnan epiteelisolujen olivat ilmeisiä. Aluksi solut näyttivät olevan pyöreä ja tasainen, jossa on ”mukulakivi” morfologia, ja yhä solut tuli pitkänomainen ja kara kaltaisia, ja useimmat dramaattisia muutoksia havaittiin passage 4 (kuvio 4A). GATA4 mRNA-tasot havaittiin pienentää nopeasti, ja siitä tuli havaita johtamalla 4 (kuvio 4B, C). Ilmaus GATA6 ja sen transkription kohde- DAB2, vähennetään vähitellen ajan mittaan, ja mRNA-tasot sekä geenit olivat 20-30% alkuperäisestä solujen (kuvio 4C). Kontrollina house-keeping gene TBP (TATA sitoutuva proteiini, hakunumero NM_003194) ilmentymistaso oli merkityksetön muutoksia aikana kulttuurin, ja vaihtelu heijastaa todennäköisesti erilaisia ​​Analyysin virhemarginaalin.

ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen eristettiin morfologisesti normaalista ihmisen munasarjat saatu oophorectomy leikkausta. Solut siirrostettiin 10 kertaa yli 3 kuukauden ajan, ja solut kerättiin kustakin kanavan mRNA: n analyysi. A. Morfologia solujen passage # 1, 2, 4, 6, 8, 10. B. Kokonais-RNA käytettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR-määritystä mRNA-tasoja. Tulokset esitetään ”lämpö-kartan”. C. mRNA: n määrä suhteessa passage 1 kvantitoitiin ja esitetään pylväskaaviona.

Näin ollen kaikki GATA4, GATA6, ja DAB2 mRNA-tasot vähenevät kun siirrostamalla ensisijaisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen kulttuuriin. Menetys GATA4 edeltää menetys GATA6 (ja DAB2), samanlainen havainto, että pre-neoplastisia munasarjojen epiteelin vieressä munasarjojen karsinoomat, jossa GATA4 usein menetetään ennen GATA6. Aiemmin menetys GATA4 ja GATA6 munasarjasyövän ja epiteelisolujen osoitettiin olevan, että mekanismi hypoacetylation histonien H3 ja H4 ja menetys histoni H3 /lysiini K4 trimethylation niiden promoottorien [18]. Geenin ilmentyminen määritetään kuvio liittyy histonimodifikaation, tunnettu histoni koodit [39]. Menetys histoni asetylaatio johtaa kompaktimpi chromatin rakenne ja tappio transkriptionaalisen aktiivisuuden [40], ja histoni H3 /lysiiniä K4 metylaatio kumppaniaan aktiivinen geenit [41], [42]. Helposti menetys GATA4 ja GATA6 ilmaisun ehdottaa epävakaus epigeneettiset valtioiden /kromatiinin konformaatiota, sopusoinnussa varhainen menetys GATA tekijöitä munasarjojen kasvaimien syntyyn.

muuttaminen kromatiinin muunnos GATA4 lokuksessa liittyy menetyksen ilmaisun yhteydessä siirrostamalla munasarjojen pinnan epiteelisolujen primaariviljelmissä

syyn vähentäminen GATA tekijän ilmentymisen primaariviljelmissä, ensin määritellä ilmaisun suuressa paneelissa munasarjojen pinnan epiteelisolujen ja syöpäsoluja. Kokonais-RNA eristettiin 8 valmisteet ensisijaisen HOSE soluja (7 henkilöä, tässä, C.47 ja d.47 jaettiin samasta HOSE valmisteita, mutta viljeltiin eri laboratorion henkilökunta), 6 HIO linjat, jotka ovat LETKUNPÄÄ soluja, jotka on transfektoitu SV40-T-antigent pidentää viljely elinikää, ja 6 riviä munasarjasyövän soluja (kuvio 5). RNA tehtiin semikvantitatiivinen RT-PCR: llä (kuvio 5A) ja reaaliaikainen RT-PCR: llä (kuvio 5B) määrittämiseksi mRNA-tasot GATA4, GATA6, dAb2 ja GAPDH tai BHD kuin lastaus valvontaa. GATA4 ilmentyminen on vähennetty joissakin HOSE valmisteissa ja HIO linjat, ja on poissa kaikki syövän linjojen määritettynä sekä semikvantitatiivinen RT-PCR ja reaaliaikainen RT-PCR: llä (kuvio 5A, B). Vähentäminen GATA6 ja DAB2 ilmentymistä HIO ja syövän linjat on selvemmin reaaliaikaisella RT-PCR: llä (kuvio 5B).

Ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen eristettiin morfologisesti normaalista ihmisen munasarjat saatu oophorectomy leikkausta. Useita HIO linjat Lisäksi perustettiin transfektoimalla ensisijainen solujen SV-40 T-antigeenin pidentää elinikää kulttuureissa. Kokonais-RNA eristettiin kokoelma ensisijaisen HOSE, HIO, ja syöpäsolut käytettiin: A. Puolikvantitatiivinen RT-PCR: llä, ja B. Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR: llä, määrittämään mRNA-tasot GATA4, GATA6, DAB2, ja GAPDH (semikvantitatiivinen RT-PCR) tai BHD (reaaliaikainen RT-PCR), kuten lastaus valvontaa. Riittävä RNA saatiin HOSE.96 (tai C.96), passage # 3; HOSE.47 soluja, passage # 5; ja HOSE.63 solut, passage # 12; CHIP määritystä. C. sijainti alukkeiden F3 ja R3 on GATA4 geeni PCR sirulle määrityksessä esitetään. D. Lysaatit HOSE.96, HOSE.47, HOSE.63, ES2, SKOV3, A2780, OVCAR3, ja OVCAR10 valmisteltiin CHIP määritystä. Chromatin precipitations mukaan vasta Ac H3, Ac H4, Me

2H3K4, Me

3H3K4, Me

2H3K9, Me

2H3K27, ja HPγ1 käytettiin monistamaan PCR: llä käyttämällä alukkeita F3 ja R3. Tulosignaali ( ”in”, 2% koko kromatiini Immunosaostukseen käytettyjen), ei vasta-ohjaus ( ”ei”), eikä mallin ohjaus ( ”H

2O”) sisällytettiin. Kirkkaan kentän kuvat semi-kvantitatiivisia PCR-tuotteet näkyvät. E. sijainti alukkeiden F2 ja B2 GATA6 geeni PCR siru määrityksessä esitetään. F. Lysate alkaen HOSE.96, HOSE.47, A2780, OVCAR3, ja OVCAR10 valmisteltiin CHIP määritystä. Kirkkaan kentän kuvat on semikvantitatiivinen PCR-tuotteet näkyvät.

Pystyimme hankkimaan riittävästi 3 ensisijaisen HOSE soluja (HOSE.96, HOSE.47, ja HOSE.63) edelleen tutkimus muutokset kromatiinin muuttaminen GATA4 ja GATA6 lokukseen ChIP määrityksen aikana solujen siir- viljelmissä. Ilmentymistasojen GATA4 korreloivat käänteisesti kulkua solujen lukumäärä: HOSE.96 (tai C.96-solut), kanava # 3, on korkea GATA4 ilmaisu; HOSE.47 soluja, passage # 5, on alhaisempi GATA4 tasolla; ja HOSE.63 solut, passage # 12, on paljon pienempi ekspressiotason (kuvio 5B).

jälkeen aiemmin vahvistetun protokollan siru määrityksen GATA4 ja GATA6 geenit [18], huomasimme, että todellakin, at sivuston välittömästi ylös-virtana GATA4 eksoni 1 (kuvio 5C), väheneminen GATA4 ekspressiotasoja korreloi menetys asetylaatio histoni H3 ja H4 (kuvio 5D). Ei merkittäviä muutoksia nähtiin di ja tri metylaation H3K4, merkkiaineita aktiivinen chromatin konformaatioon [41], [42]. Kuitenkin dimetyloimalla histoni H3 lysiinin 9 ja 27 (Me

2H3K9, Me

2H3K27) ja HP1 on poissa, mikä viittaa vaiennettu GATA4 geeniä ei sisällytetty heterochromatin [43].

Rinnalla alennettu asetylaatio histoni H3 ja H4 A2780 soluissa, kuviot histonimodifikaation klo GATA6 lokuksen (kuvio 5E) on samanlainen HOSE solujen ja syöpälinjojen OVCAR3 ja OVCAR10 (kuvio 5F), mikä viittaa muuttaminen histonimodifikaation at GATA6 locus ei ole yleinen tapahtuma munasarjojen epiteelin ja syöpäsoluja.

munasarjojen kasvain altis fenotyyppi GATA6 heterogeeninen hiirten

löytäminen läheinen korrelaatio menetys GATA6 ja epiteelin muutos sai meidät spekuloida, että menetys GATA6 voi olla kausaalinen muutoksessa munasarjojen pinnan epiteelisolujen. Edellä havainnot viittaavat myös siihen, että menetys GATA6 saattaa olla kriittisempi kuin menetys GATA4 edistämisessä munasarjojen epiteelin muutosta. Voit selvittää seuraus menetys GATA6 munasarjojen pinnan epiteeli, tutkimme munasarjan fenotyyppiä GATA6 (+/-) hiiriä, koska homotsygoottinen hiiret ovat alkion tappavia [24], [25]. Olemme saaneet ja ylläpitää yhdyskunta GATA6 hiirten viime 2 vuotta. Munasarjojen kudokset kerättiin hiiristä noin vuoden ikäisiä, ja morfologia munasarjoja poikuesisaruksia of GATA6 (+/-) ja villityypin verrattiin. Silmiinpistävän, kaikki munasarjat GATA6 (+/-) genotyyppi esiintyi joitakin poikkeavuuksia (taulukko 2): Joissakin munasarjat on laaja proliferatiivinen vaurioita pinnan epiteeli (kuva 6A), ja muut ovat suuret munasarjakystat, jotka ovat positiivisia sytokeratiini (kuvio 6B ). Munasarjojen fenotyyppi muistuttaa Niille

DAB2

(+/-) hiirillä [32], sopusoinnussa DAB2 kuin GATA6 transkription kohde- ja välittäjänä [27].

munasarja- morfologia GATA6 (+ /-) ja villityypin littermates noin vuoden ikäisiä verrattiin. Sytokeratiini värjäystä käytettiin markkerina epiteelisolujen. A. Tyypillinen esimerkki villityypin munasarjojen esittää lukuisia munarakkuloita eri kehitysvaiheissa suljettu sisällä kerros pintaepiteelissä. Edustava GATA6 (+/-) munasarja osoittaa, että läsnä on seuraus epiteelisolujen pinnasta (nuoli). B. Suuri osa GATA6 (+/-) munasarjat osoittaa myös suuria kystia sisällä munasarjat. Epiteelisoluihin kystat ovat sytokeratiini positiivisia (alempi paneeli). Kaikki kuvat on otettu mikroskoopilla, jossa on 100-kertainen suurennus.

Näin ollen tämä tulos viittaa siihen, GATA6 puutos vaikuttaa munasarjojen pinnan epiteeli, mahdollisesti edistää muutosta, vaikka kudosspesifisen poistetaan GATA6 munasarjojen pinnan epiteelisolujen solut on parempi testi, kun GATA6 ehdollinen hiirten tulevat saataville.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin ilmentymisen GATA 4 ja GATA6 munasarjan pintaepiteelisolujen ja karsinoomien yksityiskohtaisesti, ja sen on todettu että menetys GATA4 on laajalle levinnyt ja usein edeltää GATA6 muutoksessa munasarjojen pinnan epiteeli. Menetys GATA6 kuitenkin korreloi läheisesti morfologisiin muutosta epiteelin. Helposti vähentäminen GATA4 ja GATA6 ilmaisun kun viljely munasarjojen pinnan epiteelisolujen ehdottaa epävakaus epigeneettiset valtion /kromatiinin konformaatiota GATA4 ja GATA6 lokuksen, sopusoinnussa varhainen menetys munasarjojen kasvaimien syntyyn. Varhainen menetys GATA4 ja GATA6 ja läheinen korrelaatio neoplastisten muutosta munasarjojen pinnan epiteeli viittaa kausaalinen rooli, jota tukee esiintyvyys munasarjojen epiteelin vaurioiden GATA6 heterotsygootteja hiirissä [32].

Verrattuna muihin histologinen alatyyppi, mucinous munasarjakarsinoomat yleensä ovat positiivisia GATA4 ja GATA6 ilme. Todellakin, morfologia mucinous munasarjakarsinoomat on hyvin ainutlaatuinen, että syöpäsolut näyttävät säilyttää apikaalisella napaisuus ja usein esiintyä yksikerroksisen epiteelin.

nopeasti menetys GATA4 vuonna siirrostamalla primaaristen solujen kulttuuri on kiehtova. Menetys GATA4 ilmentymisen siirrostamalla ensisijaisen soluviljelytutkimuksista assosioituu menetys H3 ja H4 histoni asetylaatio klo GATA4 promoottori lokuksessa. Menetys GATA4 syöpäsolulinjoissa näyttää välittävät myös vähentää H3 ja H4 histoni asetylaatio promoottorin lokukseen.