Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli määrittää korrelaatiota HIF-1α ja miR-27a ilmaisun ja arvioida vaikutuksia esto HIF-1α ilme miR-27a ilmaisun ja lääkeresistenssin mahasyövän (GC). Esillä olevassa tutkimuksessa, reaaliaikainen PCR ja Western blot suoritettiin ekspression havaitsemiseksi HIF-1α GC kudoksissa ja solulinjoissa. Sitten OCUM-2MD3 /L-OHP-solut transfektoitiin HIF-1α-siRNA, joka on miR-27a matkivat tai pcDNA-HIF-1α, ja solujen eloonjääminen määritettiin kautta MTT-määrityksellä. Ilmaisu HIF-1α, miR-27a, ja MDR-liittyviä geenejä mitattiin kautta reaaliaikainen PCR ja Western blot. Siru ja dual lusiferaasiaktiivisuus analyysit suoritettiin arvioimiseksi transkription säätely HIF-1α ja miR-27a. Tulokset osoittivat, että transfektio HIF-1α-siRNA merkittävästi vähentynyt tasot miR-27a, mikä dramaattisesti parantaa inhibitio leviämisen määrä OCUM-2MD3 /L-OHP-soluja. Verrattuna ei-transfektoituja soluja, eloonjäämisaste oli merkitsevästi pienempi transfektoiduissa soluissa HIF-1α-siRNA-käsittelyn jälkeen L-OHP. Solun eloonjäämisaste oli merkitsevästi lisääntynyt OCUM-2MD3 /L-OHP transfektoitu miR-27a matkivat, kun taas HIF-1α yliekspressio ei aiheuttanut mitään selvää muutosta solujen eloonjäämistä. Tulokset kahden lusiferaasiaktiivisuuden määritys osoitti, että HIF-1α parantaa transkriptionaalisen aktiivisuuden miR27a promoottorin transfektoiduissa soluissa reportteriplasmidi, joka sisältää ylävirran promoottorialue miR27a yhdessä pcDNA-HIF-1α. ChIP-analyysi ehdotti, että HIF-1α sitoutuu suoraan promoottorialueen miR27a. Esto HIF-1α tai miR27a ilmaisu vähentynyt MDR1 /P-gp: n, LRP, ja Bcl-2: n ilmentymisen in OCUM-2MD3 /L-OHP soluissa. Niinpä huomasimme, että HIF-1α on tiiviisti mukana MDR GC ja että HIF-1α voi tukahduttaa MDR1 /P-gp: n, LRP ja Bcl-2: n ilmentymisen estämällä miR-27a ilme.

Citation: Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fan Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α Aiheuttaa monilääkeaineresistenssin mahasyövän indusoi- MiR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10,1371 /journal.pone.0132746

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 05 tammikuu 2015; Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 20 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat seuraavat avustus: osavaltion Natural Science Foundation of Hebei (nro H2013206311 kohteeseen Qun Zhao).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yleisimpiä syöpäsairauksia, aiheuttaen vakavaa vahinkoa maailmanlaajuisesti [1, 2] vuosien teknologinen kehitys diagnosointiin ja hoitoon GC, sen esiintyvyys ja kuolleisuus on vähentynyt maailmanlaajuisesti, mutta ovat edelleen korkealla Aasian maissa [3, 4]. Tällä hetkellä mahalaukun resektion on ainoa käytettävissä oleva menetelmä parannuskeinoa GC. Kuitenkin on vaikea saavuttaa täydellisen kovettumisen vaikka kirurginen poisto kasvain, koska useimmat potilaat kärsivät pitkälle GC kun diagnoosi [5, 6]. Siksi kemoterapia on erittäin merkittävä rooli kattavan hoidossa GC. Vaikka kemoterapia suuresti eteni suhteen edenneen GC, [7, 8] ennustetta GC edelleen puutteellinen, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 30% [9]. Tämä ennuste johtuu pääasiassa usealle lääkkeelle resistenssiä (MDR) GC soluja. MDR GC johtaa usein epäonnistumiseen kemoterapiaa [10-12]. Siksi on kiireesti tarpeen kehittää uusia lupaavia hoitostrategioita tehokkaasti vähentää MDR GC.

hapenpuute on yleistä kiinteitä kasvaimia ja liittyy erilaisia ​​biologisia toimintoja. Tällä hetkellä hypoksia-indusoituva tekijä (HIF) -1α katsotaan tiiviisti hypoksiaa. HIF-1α ilmentyy voimakkaasti erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [13, 14], ja toimii olennainen tekijä säätelemään mukauttaminen kasvainsolujen hypoksia [15]. HIF-1α on ehdotettu olla tiiviisti mukana GC MDR [16, 17]. On kuitenkin epäselvää, mikä polku välittää rooli HIF-1α GC MDR.

Viime vuosina rooli MikroRNA (miRNA) syövän on tullut laajalti tutkittu kasvainten aloittamista ja hoidon. miR-27a, jäsen miRNA perhe, on osoitettu vaikuttavan MDR GC [18]. Lisäksi ilmaus miR-27a suurennetaan hapenpuuteympäristössä [19]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että HIF-1α voi säätelemään miR-27a ja vaikuttavat GC MDR. Kuitenkin spesifinen sääntelymekanismien ole vielä selvitetty. Tämä tutkimus osoitti, että ilmentyminen HIF-1α ja miR-27a olivat merkitsevästi säädellään ylöspäin GC kudoksissa ja solulinjoissa, erityisesti kestävä solulinjoissa.

Transfektio tietyn Sirna estää endogeenisen HIF -1α johti vähenemiseen miR-27a ilmaisun ja lieventämiseen MDR GC solulinjoissa. Nämä uudet havainnot viittaavat siihen, että inhibitio HIF-1α ilmentyminen estää transkription MDR liittyvien geenien MDR1 /P-gp, LRP, ja Bcl-2 vaimentavat MDR GC-solujen tukahduttamiseen miR-27a ilmentymisen.

Materiaalit ja menetelmät

1,1 Materiaalit

Mahalaukun solulinja OCUM-2MD3 oli professori Masakazu Yashiro Japanissa Oita Medical Surgery [20]. Vakaa lääkeresistenttiä solulinja OCUM-2MD3 /L-OHP2 saatiin kautta viljelyn ja valinnan meidän tutkimusryhmä. GSE-1 solulinja hankittiin Cell Resource Center Shanghai Institutes for Biological Sciences Kiinan tiedeakatemia. RPMI 1640 elatusaineessa ja trypsiini hankittiin Gibco Company; Trizol reagenssi ja Lipofectamine 2000 transfektioreagenssi ostettiin Invitrogen. Käänteistranskriptioprosessi kit ja fluoresenssia kvantitatiivinen PCR-reagenssit saatiin Promega Corporation. PCR-alukkeet ja Sirna syntetisoitiin Shanghai Biological Engineering Company. Proteiini Extraction Kit saatiin Beyotime Company, Kiina. Ensisijainen vasta-aineita HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2, TS tai GAPDH ostettiin Santa Cruz. MTT saatiin Sigma. Tutkimuksemme hyväksyi eettinen komitea neljännen Affiliated sairaala Hebein Medical University.

1.2 Kliiniset näytteenvalmistus

Kaikki 65 potilasta, joilla GC valittiin jälkeen mahalaukun resektion ja patologinen vahvistus neljännessä Hospital Hebein Medical University, mukaan lukien 42 urosta ja 23 naarasta vuotiaiden 60,5 ± 8,1 vuotta, jotka eivät olleet saaneet ennen leikkausta sädehoitoa tai kemoterapiaa. Syöpä ja para-syöpäkudosten (noin 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) otettiin jokaiselle potilaalle, ja näytteet jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja sen jälkeen siirrettiin -80 ℃ säilyttämiseen. Kaikki osallistujat allekirjoitti tietoisen suostumuksen.

1.3 Soluviljely ja transfektio

OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP ja GSE-1 solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 väliaineessa täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä. Huomattavaa on, että väliaine OCUM-2MD3 /L-OHP-soluja käsiteltiin L-OHP pitoisuutena 75 ug /ml säilyttää lääkeaineen-fenotyyppi, joka on yksi viikko ennen leikkausta lopettaa hoito. Soluja inkuboitiin kostutetussa 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa.

kolme HIF-1α-siRNA sekvenssit suunniteltiin käyttäen BLOCK-IT RNAi Designer (sarja 1: GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; järjestyksessä 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; sekvenssi 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), joista kukin oli hehkutettu niiden komplementaarisen sekvenssin ja transfektoitiin vastaavasti osaksi OCUM-2 MD3 /L-OHP GC-soluja. Ei-spesifinen siRNA-sekvenssin (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) käytettiin negatiivisena kontrollina. MiR27a mimeetti sekvenssi oli 5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 ’. Ihmisen täyspitkää HIF-1α CODEN sekvenssi subkloonattiin pcDNA3.1 vektoriin. pGL3-miR27a-luc, pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic ja PRL-TK plasmidit ja konservoituneita laboratoriossamme.

GC-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen transfektiota at tiheys 4 x 10

5 solua /ml. Plasmidivektorit, siRNA tai miR27a matkivat transfektoitiin GC soluihin tai huumeiden-resistenttien solujen käyttämällä transfektioreagenssia Lipofectamine seuraten valmistajan ohjeita. Sitten solut pestiin seerumittomalla RPMI 1640 puuttuu antibiootteja. Transfektion tehokkuus mitattiin 24 tuntia myöhemmin, ja sen jälkeen myöhemmissä kokeissa.

1,4 MTT-määritystä

GC kudosten ja normaali para-karsinooma Kudos homogenoitiin valmistamiseksi yhden solun suspensiot suodattamalla läpi 300 -mesh kupari verkkoon. GC-solut hajotettiin käyttäen 0,02% EDTA-0,25% trypsiiniä ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /ml 96-kuoppaisille levyille. Kun solut saavuttivat noin 60% konfluenssiin, HIF-1α-siRNA transfektoitiin tai kemoterapeuttinen lääkeaine (150 ug /ml L-OHP) levitettiin. Jokainen ryhmä koostui kuudesta kaivoja. Sitten 20 ui 5 mg /ml MTT lisättiin 4 h ennen kokeen loppuun. Soluja viljeltiin 4 tuntia, ja sitten elatusaine heitettiin pois. Seuraavaksi 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja OD-arvot mitattiin 490 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa ravistelun jälkeen levyn 15 min huoneen lämpötilassa. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

1,5 RNA: n eristys ja kvantitatiivinen RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol yksivaiheista menetelmää, ja 2 ug RNA: ta käytettiin käänteistranskriptioon tuottaa templaatti-cDNA. Suhteellinen mRNA-tasot määritettiin kautta kvantitatiivinen PCR, GAPDH toimi sisäisenä viitteenä geenin. PCR-parametrit olivat seuraavat: 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 45 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 30 s ja pariutuminen 60 ° C: ssa 30 s. Alukesekvenssejä suunniteltiin käyttäen Primer 5,0 ja etsittiin spesifisyyden. Alukesekvenssit ovat seuraavat: HIF-1α (93 bp): (F) 5′-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 ’ja (R) 5′-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3′; MDR1 (126 bp): (F) 5’-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 ’ja (R) 5′-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3′; GST-π (151 bp): (F) 5’-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 ’ja (R) 5′-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3′; Bcl-2 (98 bp): (F) 5’-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 ’ja (R) 5′-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3′; LRP (129 bp): (F) 5’-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 ’ja (R) 5′-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3′; TS (129 bp): (F) 5’-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 ’ja (R) 5′-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3′; ja GAPDH (138bp): (F) 5’-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 ’ja (R) 5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’. Kvantitatiivinen PCR Tulokset laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä.

1.6 Western blot

kudosten ja solujen näytteet lysoitiin käyttäen RIPA lyysipuskuria: 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 0,5% NP-40. Yhtä suuret määrät proteiinia näytteet erotettiin 10% polyakryyliamidi- SDS-geeleissä (SDS-PAGE) ja siirrettiin sähköllä polyvinylideenifluoridiin (PVDF) kalvo (Amersham Pharmacia Biotech). Membraanit blokattiin 5% BSA: ssa 2 h ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa. Membraaneja inkuboitiin 2 tuntia piparjuuren peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Kohde vyöhykkeet havaittiin käyttäen vahvistettua kemiluminesenssiä (ECL) havaitseminen kit (Santa Cruz, USA). β-aktiini käytettiin endogeenista ohjaus geenin. Koe toistettiin kolme kertaa.

1,7 Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

ChIP-kokeet suoritettiin menetelmällä, Wang et ai. [21]. Solut, joilla on erilaiset hoidon fiksoitiin 1% formaldehydiä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja päätetään lopulliseksi pitoisuudeksi 0,125 M glysiiniä. Sitten solut lyysattiin käyttäen 300 ui hajotuspuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoksikolaattia, ja proteaasi-inhibiittorit). Solulysaatit sonikoitiin jäävesihauteessa antamaan chromatin fragmenttien noin 600 ep, arvioituna agaroosigeelielektroforeesilla. Kun oli sentrifugoitu 13000 rpm: ssä 10 minuutin ajan, supernatantit otettiin ja esipuhdistettiin 15 min 4 ° C: ssa inkuboimalla kanssa 30 ui proteiini A-Sepharose-helmiä ja lohen maidin DNA: ta. Kun oli sentrifugoitu 13000 rpm: llä 5 minuutin ajan, supernatantit jaettiin kolmeen yhtä suureen osaan: yksi tulo, muut kaksi immunosaostuksella tai ilman HIF-1α-vasta-ainetta. Seuraavana päivänä, immuunikompleksien saostettiin proteiini-A-Sepharose-helmiä ja lohen maidin DNA: ta, sen jälkeen helmet kerättiin sen jälkeen pestiin kahdesti pesupuskurilla I (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,1% SDS: ää, 1% Triton X-100 ja 2 mM EDTA), jota seurasi pesu puskurilla II (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 ja 2 mM EDTA) ja pesupuskurilla III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M LiCI:, 1% Nonidet P-40, 1% deoksikolaattia, ja 1 mM EDTA), ja lopullinen pesupuskurilla IV (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, ja 1 mM EDTA). Immunopresipitaatit eluoitiin 200 ui eluointipuskuria (1% SDS: ää ja 0,1 M NaHCO

3), mitä seurasi inkubointi 65 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä DNA kunkin näytteen eristettiin, ja PCR suoritettiin monistamaan promoottorin segmentit sisältävät HIF-1α sitoutumiskohta.

1,8 Lusiferaasimäärityksiä

Soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin ja sitten transfektoitiin kolmena rinnakkaisena pGL3-miR-27a-luc, pcDNA-HIF-1α tai pGL3-Basic, sekä PRL-TK. 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut kerättiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan protokollaa. Lusiferaasiaktiivisuus PRL-TK oli toimi sisäisenä kontrollina.

1,9 Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvoina ± S.D. ANOVA, ja Dunnettin testi suoritettiin käyttäen SPSS 11.5 ohjelmistolla.

Tulokset

1 HIF-1α ja miR27a ilmentyvät eri välillä mahan para-karsinooma kudosta ja GC kudos

ilmentyminen HIF-1α GC kudoksessa verrattuna mahalaukun para-karsinooma kudosta määritettiin kautta qRT-PCR ja Western blot, ja herkkyys L-OHP soluihin määritettiin kautta MTT-menetelmää. HIF-1α (kuvio 1A, 1B ja 1C, qPCR ja Western blot) ja miR27a (kuvio 1D, qPCR tulokset) olivat säädellään ylöspäin GC kudoksessa verrattuna mahalaukun para-karsinooma kudosta. MTT määrityksessä osoitti, että solujen eloonjäämisaste oli suurempi GC kudoksessa kuin mahalaukun para-karsinooma kudokseen, kun L-OHP lisättiin yksisoluiset Kudossuspensioista (kuvio 1 E, histogrammi tulokset).

Kliininen maha- Tuumorinäytteet sekä normaali kontrolli kudosten saatiin ja alistettiin RT-qPCR (A) ja Western-blottauksella (B ja C) ekspression määrittämiseksi HIF1α, miR-27a määritettiin qPCR (D). RT-qPCR ja Western blotting määritykset, β-aktiini käytettiin endogeenista viittaus yhtenäistää mRNA ja proteiini ekspressiotasot. Single-solususpensiota tehty syöpäsoluissa ja syövän vieressä normaaleissa kudoksissa ja viljeltiin MTT-määritys. Solut käsiteltiin kemoterapeuttisten aineiden (L-OHP, 150 ug /ml), kun ne saavuttivat 80% konfluenssin ja käytettiin MTT-määrityksellä (E). 6 kahtena kappaleena kullekin hoitoon tehtiin. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3). * P 0,01 verrattuna syöpää viereisten normaalit kudokset ryhmä.

2 HIF-1α ja miR27a ilmentyvät eri välillä mahalaukun limakalvo epiteelisolulinja ja GC solulinja

ilmentyminen HIF-1α oli korkein OCUM-2MD3 /L-OHP ja OCUM-2MD3 solujen peräkkäin ja oli alhaisin GES-1-soluissa (kuvio 2A, 2B ja 2C, qPCR ja Western blot). Lisäksi ilmaus miR27a näytetään sama suuntaus, jossa OCUM-2MD3 /L-OHP soluilla korkein ilmentymä, jonka jälkeen OCUM-2MD3 soluja, ja GSE-1-solut näkyvät alimman ilmentymisen miR-27a (kuvio 2D, qPCR tulokset). MTT-määritystä osoitti, että kun L-OHP lisättiin kolme solulinjoja, OCUM-2MD3 /L-OHP-soluja, osoitti suurinta solun eloonjäämisaste, jonka jälkeen OCUM-2MD3 soluja, ja että GSE-1-soluissa esiintyi alhaisin solujen eloonjäämistä korko (kuvio 2E, histogrammi tulokset).

Normaali ohjaus ihmisen mahalaukun limakalvon epiteelisolujen linja GES-1 sekä mahasyövän solulinjat OCUM-2MD3 ja OCUM-2MD3 /L-OHP alistettiin RT-QPCR (A) ja Western-blottauksella (B ja C) verrata ilmentymisen HIF1α in vitro. miR-27a määritettiin QPCR (D) .For RT-QPCR ja Western blotting määritykset, β-aktiini käytettiin endogeeninen kontrolli standardoida mRNA ja proteiinin ilmentymisen tasot. MTT-määritystä käytettiin määrittämään eloonjäämisaste mahalaukun syövän solulinjojen käsittelyn jälkeen L-OHP soluissa OCUM-2MD3 /L-OHP, OCUM-2MD3 ja GSE-1 (E). Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3). * P 0,05 verrattuna syöpää viereisten normaaleissa kudoksissa tai GES-1-soluissa. Kuvissa edustajia vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

3 HIF-1α-siRNA: n ekspressiota vähentävän miR27a ja lääkeresistenssin OCUM-2MD3 /L-OHP-solut

Western blot-analyysi osoitti, että mRNA ja proteiini tasoilla HIF-1α laski eriasteisesti OCUM-2MD3 /L-OHP transfektoiduissa soluissa kolme paria HIF-1α-siRNA, kun taas HIF-1α ilme ei muuttunut soluissa transfektoitu kontrolli-siRNA. HIF-1α ilmaus näyttäisi laskevan eniten jyrkästi, noin 90%, käyttäen HIF-1α-siRNA-2 (kuvio 3A). Kuten on esitetty kuviossa 3B, HIF-1α ilmentyminen väheni näissä soluissa annoksesta riippuvalla tavalla, jossa HIF-1α ilmentyminen väheni yli 95% soluissa, jotka oli transfektoitu 80 nM HIF-1α-siRNA-2, kun HIF- 1α-siRNA-2 transfektoitiin lisäksi annoksella 20 nM, 40 nM tai 80 nM. Lisäksi maksimaalinen estävä vaikutus havaittiin 48 h transfektion jälkeen (kuvio 3C).

OCUM-2MD3 /L-OHP-solut transfektoitiin joko HIF1α-siRNA tai NS-siRNA (A), tai transfektoitu 20, 40 tai 80 nM HIF1α-siRNA-2 (B), tai transfektoitu 80 nM HIF1α-siRNA-2 24, 48 tai 72 h (C), sitten solut kerättiin Western blotting määrityksiä laskea pudotus tehokkuutta . miR-27a-tasot määritettiin qPCR (D). Eloonjäämisaste OCUM-2MD3 /L-OHP arvioitiin MTT: llä. (E) Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3). * P 0,01 verrattuna NS-siRNA ryhmä.

miR27a ilmentyminen väheni huomattavasti seuraavien transfektio OCUM-2 MD3 /L-OHP solujen HIF-1α-siRNA-2 (kuvio 3D) . MTT-määritys osoitti, että solujen eloonjäämisaste oli merkittävästi vähentynyt käsittelyn jälkeen HIF-1α-siRNA-2-transfektoiduissa OCUM-2 MD3 /L-OHP-solut L-OHP verrattuna ei-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3E).

4 vaikutukset miR27a on MDR on OCUM-2MD3 /L-OHP solujen

ilmentymistä miR27a oli säädellään ylöspäin OCUM-2MD3 /L-OHP solujen kun miR27a matkivat oli yhteis- transfektoidaan nämä lääkeresistenttiä GC soluissa, jotka oli transfektoitu HIF-1α-siRNA (kuvio 4A). Kuitenkaan mitään merkittävää eroa ilmentymisen HIF-1α havaittiin OCUM-2MD3 /L-OHP-solujen transfektion jälkeen (kuvio 4B ja 4C, qPCR ja Western blot).

OCUM-2MD3 /L-OHP solut transfektoitiin miR27a analogit 48 h (A), sitten solut kerättiin, miR27a ja HIF1α tasot havaittiin RT-qPCR ja Western blot määritykset (A, B ja C). Eloonjäämisaste OCUM-2MD3 /L-OHP laskettiin MTT: llä (D). Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3). * P 0,01 verrattuna kontrolliryhmään.

MTT-analyysi osoitti, että eloonjäämisaste OCUM-2MD3 /L-OHP soluja oli selvästi lisääntynyt transfektion jälkeen kanssa miR27a matkivat (kuvio 4D, histogrammi tuloksia ).

5 HIF-1α indusoi transkriptiota miR27a in OCUM-2MD3 solujen

ilmentyminen HIF-1α oli merkittävästi lisääntynyt OCUM-2MD3 transfektoitujen solujen eukaryoottisen ekspressioplasmidin pcDNA- HIF-1α 48 tuntia (kuvio 5A). Lisäksi miR27a ilme oli selvästi sääteli (kuvio 5B). Täten nämä tulokset viittaavat siihen, että HIF-1α on kriittinen tekijä, joka vaikuttaa transkriptioon miR27a. Näin ollen, loimme lusiferaasireportterigeeniin plasmidi kuljettaa 2 kb ylävirtaan promoottorialueen miR27a, joka oli ko-transfektoitiin pcDNA-HIF-1α soluihin. DLA tiedot osoittivat, että HIF-1α tehostettu promoottorin aktiivisuutta miR27a seuraavista kotransfektiojärjestelmää (kuvio 5C). ChIP-analyysi vahvistivat lisäksi, että HIF-1α suoraan sidottu promoottorialueen miR27a (kuvio 5D). Tulokset osoittivat, että HIF-1α voi edistää transkriptiota miR27a in OCUM-2MD3 soluihin suoraan sitovia promoottorialueen miR27a.

OCUM-2MD3 solut transfektoitiin pcDNA-HIF-1α, taso HIF-1α ja miR27a määritettiin Western blot ja RT-qPCR (A ja B) 48 tunnin kuluttua transfektion. Dual lusiferaasireportterigeenin määritys suoritettiin transfektoimalla toimittaja sisältävän plasmidin miR27a promoottorin ja pcDNA-HIF-1αin OCUM-2MD3 soluissa (C), ja ChIP-määritys suoritettiin testata sitoutumisen HIF-1α, että promoottori miR27a in OCUM -2MD3 soluja. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3). * P 0,01 verrattuna pcDNA tyhjän vektorin kontrolliryhmään.

6 esto HIF-1α käyttämällä siRNA estää ilmaisua lääkeresistenssin liittyvien geenien

Kuten kuvassa 6, inhibitiota HIF-1α dramaattisesti tukahdutti ilmentymisen MDR1 /P-gp, LRP, ja Bcl-2 OCUM-2MD3 /L-OHP soluissa, mutta ei merkittävästi muuttanut ilmentymisen GST-π tai TS. (Kuvio 6).

OCUM-2MD3 /L-OHP-solut transfektoitiin 80 nM HIF1α-siRNA tai ei-kohdennettu siRNA tai käsitelty ainoastaan ​​Lipofectamine 2000: ssa 48 tuntia, sitten tehtiin RT-qPCR (A) ja Western-blottauksella (B, C) havaitsemiseksi ekspressiotasoja MDR1 /P-gp, LRP, Bcl-, GST-π ja TS. β-aktiini käytettiin endogeenista viittaus standardoida proteiinin ekspressiotasoja. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3). * P 0,01 verrattuna ei-kohdistettuja siRNA ryhmä.

7 esto miR27a vähentää resistenssin liittyvän geenin ilmentymistä OCUM-2MD3 /L-OHP solujen

miR27a oli tukahdutettu lääkeresistenttiä GC OCUM-2MD3 /L-OHP transfektoitujen solujen anti-miR27a sekvenssin (kuvio 7A). Lisäksi seuraavien transfektion ilmentyminen MDR1 /P-gp, LRP: n ja Bcl-2 väheni huomattavasti, kun taas mitään merkitsevää eroa ei havaittu ilmentymistä GST-π tai TS (kuvio 7B, 7C ja 7D, qPCR ja Western blot). (Kuvio 7) B

OCUM-2MD3 /L-OHP-solut transfektoitiin anti-miR27a (A), ilmentymisen tasojen MDR1 /P-gp, LRP, Bcl-, GST-π ja TS havaittiin RT-qPCR (B) ja Western-blottauksella (C, D). β-aktiini käytettiin endogeenista viittaus standardoida proteiinin ekspressiotasoja. Tulokset esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3). * P 0,01 verrattuna ei-kohdistettuja siRNA ryhmä.

Keskustelu

Vaikka maailmanlaajuinen esiintyvyys GC näyttää viime vuosina vähentynyt, esiintyy paljon GC jatkuu, vaarantavat vakavasti ihmisten terveyttä Aasiassa [22]. MDR GC solujen edistää huono ennuste GC, jossa hapenpuute on keskeisessä asemassa. Tässä tutkimuksessa, loimme vakaa OCUM-2MD3 /L-OHP solulinja, joka on vastustuskykyinen L-OHP. Tuloksemme osoittivat, että GC kudoksissa ja solulinjoissa näytteille vahvempi lääkeresistensseihin kuin normaali mahan epiteelikudoksissa ja solulinjoissa. Olemme myös havainneet, että lääkeresistenttiä solut kehittävät paljon vahvempi MDR. Tuloksemme osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä HIF-1α GC kudoksissa ja solulinjoissa, ja korkein ilmentymä HIF-1α havaittiin lääkeresistentti solulinjassa. Siksi suosittelemme, että HIF-1α edistää kehitystä MDR GC-soluissa.

HIF-1α-geeni koodaa proteiinia, joka koostuu 826 aminohaposta, joiden molekyylipaino on 120 kDa. [23] Monet tutkimukset ovat vahvistaneet, että lisääntynyt ilmentyminen HIF-1α liittyy vahvasti esiintyminen ja kasvainten kehittymisen [24-28]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen HIF-1α parantaa lääkeaineille ominaisuuksia erilaisten kasvainsolujen [29-32]. Lisäksi meidän tutkimus osoitti, että GC kudoksissa ja solulinjoissa osoittavat vahvempia kemoterapeuttisia lääkkeitä kuin mahan para-karsinooma kudosten ja mahan limakalvon solulinjat. Olemme myös havainneet tehokkain lääke-resistenssi GC soluissa. Kuitenkin mekanismit, joilla HIF-1α säätelee MDR ei ole vielä selvästi yksilöity GC soluissa. Siksi olemme edelleen tutkineet vaikutuksia HIF-1α on MDR ominaisuuksista GC solujen kautta geenin häiriöitä ja kloonaus tekniikoita. RNA-interferenssi (RNAi) on osoittanut etuja spesifisyys, tehokkuutta ja kestävyyttä säätelyyn kohdegeenin ilmentymisen [33]. Tuloksemme osoittavat, että esto HIF-1α vähensi merkittävästi lääkeresistenssin OCUM-2MD3 /L-OHP soluissa. Lisäksi olemme osoittaneet, että lääkeresistenssi on kasvanut dramaattisesti, kun pcDNA-HIF-1α, jota käytettiin yli-ilmentämään HIF-1α, transfektoitiin lääkettä ei-resistenttejä GC solulinjoja. Tuloksemme osoittivat, että HIF-1α olennainen rooli kehitettäessä MDR GC.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että MDR liittyy läheisesti miRNA kasvaimissa [34-36]. Hu on ilmoittanut, että inaktivoimalla miR-27a voi kumota MDR ominaisuuksia GC solujen [18]. Lisäksi on raportoitu, että miR-21, miR-27a, miR-210 ja miR-181B olivat sääteli kautta HIF väylän hapenpuuteympäristössä perustuu geeni-siru määritys [19]. Mukaisesti tuloksemme, HIF-1α positiivisesti liittyy ilmaus miR-27a GC kudoksissa ja solulinjoissa, ja estämällä HIF-1α laski miR-27a. Sitä vastoin yli-ilmentyminen HIF-1α indusoidun ilmentymisen miR-27a. Nämä tulokset osoittivat, että HIF-1α säätelee ilmentymistä miR-27a. Lisäksi meidän tutkimus osoitti, että miR-27a jäljittelee pelasti lääkeresistenssideterminantit ominaisuudet HIF-1α-pudotus soluissa. Tärkeintä on, HIF-1α suoraan sitoutuu ja edistää miR27a transkriptio, mikä osoittaa, että HIF-1α säätelee MDR GC kautta miR-27a.

ominaista geenien ilmentymistä, jotka liittyvät läheisesti MDR, kuten MDR1 /P-gp: n, GST-π, LRP, Bcl-2 ja TS, ennen ja jälkeen modulaatio HIF-1α ilmentymistä GC solujen selvittämiseksi mekanismi, jolla HIF-1α-miR-27a reitti säätelee MDR GC . Olemme osoittaneet, että esto HIF-1α ilmaisun vähensi ilmaus MDR1 /P-gp: n, LRP ja Bcl-2. Ilmentymistasojen näiden geenien lisääntyi merkittävästi, kun solut transfektoitiin miR-27a matkivat, kun taas ekspressiotasot GST-π ja TS eivät muuttuneet merkittävästi. Tämän mukaisesti havainnon, yli-ilmentyminen HIF-1a voimakkaasti sääteli ilmentymistä MDR1 /P-gp: n, LRP, ja Bcl-2: n GC OCUM-2MD3 solulinjassa. Siksi meidän tiedot osoittavat, että HIF-1α-miR-27a-reitin välittää MDR kiinteistöt GC indusoimalla MDR1 /P-gp: n, LRP ja Bcl-2: n ilmentymisen.

tutkimukset osoittavat, että HIF-1α ja miR -27a ovat säädellään ylöspäin GC kudoksissa ja solulinjoissa. HIF-1α toimii ylävirtaan säätelijänä miR-27a. HIF-1α-miR-27a signalointi parantaa ominaisuuksia MDR indusoimalla ilmaus MDR1 /P-gp: n, LRP ja Bcl-2 in GC. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HIF-1α-miR-27a polku on keskeinen rooli aloittamisen MDR ihmisen GC, joka voi toimia uutena terapeuttisena kohteena MDR GC.

tukeminen Information

S1 tiedosto. Tiedot MTT ja Länsi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0132746.s001

(ZIP) B