Krooninen sairaus

tiivistelmä

Metabotrooppiset glutamaattireseptori 1 (GRM1) signalointi on osallisena hyvän- ja pahanlaatuiset sairaudet kuten eturauhassyöpä (PCA ). Tutkimaan edelleen rooli geneettisiä muutoksia on

GRM1

PCA, me seulotaan koko ihmisen

GRM1

geenin, joka sisältää koodaavan sekvenssin, eksoni-introniliitokset, ja reunustavat transloimattomat alueet (UTR) varten mutaatioiden läsnäolon ja yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) useilla PCa solulinjoissa ja sovitetun kasvaimen normaali kudoksia valkoihoinen amerikkalaiset (CA) ja Afrikkalainen amerikkalaiset (AAS). Käytimme kaksisuuntainen sekvensointi, alleeli-PCR, ja bioinformatiikan sen geneettisen muutokset

GRM1

ja ennustaa niiden toiminnallista roolia. Romaani missensemutaatio tunnistettu C1744T (582 Pro Ser) asema

GRM1

geenin ensisijainen AA-PCa solulinja (E006AA) ennustettiin vaikuttavan proteiinin vakauteen ja toimintoja. Toinen uusi mutaatio tunnistettiin eksoni-introni risteyksessä eksonin 8 C4-2B solulinjassa johti muuttaminen

GRM1

liittämiseen luovuttajan sivusto. Lisäksi löysimme missense SNP at T2977C (993 Pa Pro) asemassa ja useita ei-koodaavat mutaatioita ja SNP 3′-UTR

GRM1

geeni PCA solulinjoissa ja kudoksissa. Nämä uudet mutaatiot voivat myötävaikuttaa sairauden muutoksilla

GRM1

geeninsiirrot, reseptorin aktivoitumisen, ja post-reseptorin alavirran signalointia.

Citation: Ali S, Shourideh M, Koochekpour S (2014) tunnistaminen Novel

GRM1

mutaatiot ja yhden nukleotidin polymorfismit eturauhassyöpäsolulinjoissa ja kudokset. PLoS ONE 9 (7): e103204. doi: 10,1371 /journal.pone.0103204

Editor: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 25 heinäkuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat R01MD005824, R21CA183892 ja R21CA181152 avustuksia tohtori Shahriar Koochekpour. Lisätukea saatiin Roswell Park Cancer Institute ja National Cancer Institute avustuksen # P30 CA016056. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Glutamaatti signalointi johtaa aktivoitumiseen useiden alavirran signalointikaskadien. Nämä alavirran signalointikaskadien ovat (i) aktivointi ligandin ionikanavissa (tunnetaan ionotrooppisiin glutamaattireseptorit (iGluR: t)) ja tulva Ca

2+ ja /tai K

+ ioneja Keski- ja ääreishermoston [ ,,,0],1], (ii) aktivointi metabotrooppisten glutamaattireseptorien (mGluR) tunnetaan G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) ja toinen messenger reittejä kuten fosfolipaasi C (PLC), fosfoinositidi 3 kinaasi /retrovirus AK thymoma /mTOR (PI3K /AKT /mTOR) [2], ja (iii) aktivointi G-proteiini-riippumaton signaalintransduktioreitteihin, mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) ja proteiinikinaasi C: n (PKC) /ERK1 /2 polkuja [3], [4]. Kaksi viimeistä signa-, PI3K /AKT /mTOR ja MAPK /ERK ovat laajalti sekaantuneet useisiin ihmisen syövissä ja korostavat glutamaatin signalointi kasvainten synnyssä [4].

mGluR käsittävät perusominaisuus arkkitehtuuria: suuri bi-lohko ekstrasellulaarisen aminoterminaalisen domeenin (ATD), tunnetaan myös nimellä ”KÄRPÄSLOUKKU” tietyn sekvenssin 24 aminohapon glutamaatin sitoutumiskohdan, 70 aminohapon runsaasti kysteiiniä sisältävän domeenin (CRD), joka tarvitaan dimerisaation aktivoinnin jälkeen, minkä jälkeen klassiseen seitsemän alfahelikaalisen transmembraanidomeeni, ja solunsisäinen sytoplasminen häntä domain (CTD) [5]. Eri isomuotoja ryhmän I mGluR (mGIuR1) on tunnistettu pituudesta riippuen C-terminaalista domeenia [5]. Tämä C-terminaalinen domeeni sisältää runsaasti proliinia Homer1 sitova motiivi (isoformin a), joka sisältää in monimutkainen proteiini-proteiini-vuorovaikutusten ja kompleksin muodostumisen alavirran molekyylien [6]. Katkaisemisen CTD johtaa menetykseen Homer1 sitovan motiivin isomuotoja b-d ja siten vaikuttaa vuorovaikutusta muiden alavirran molekyylejä ja reitit [5]. Läsnäolo eripituisia isomuotoja

GRM1

geeni vaihteleva rooli myöhemmissä aktivoituminen alavirran signalointireittien, korostavat silmukoinnin mekanismit

GRM1

geenien toiminnan [5].

mGluR signalointia alun perin osallisena solujen lisääntymistä glioomasoluihin [7] ja melanooma kehittämiseen [8] joko

in vitro

tai

in vivo

tutkimuksissa ja sen jälkeen tämä reseptori osoitettiin pelata keskeinen rooli erilaisten syöpien [9], [10], [11], [12] onkogeeninen funktiona mGluR1 osoitettiin induktion transformoidun fenotyypin yliekspressioon

GRM1

geenin melanosyyttien [13] . Vastaavasti edellisessä tutkimuksessa selvitimme ilmaus mGluR1 perus- ja metastaattinen PCa solulinjoissa ja kudoksissa [10]. Eturauhassyövän soluja kasvun riippuvuus

GRM1

-signalling osoitettiin myös glutamaatin saarto tai käyttöä Rilutsoli, kuten GRM1 antagonistina tai estäjänä glutamaatin vapautumista. Rilutsoli vähensi PCA solujen lisääntymisen, migraation, invaasion, ja indusoi apoptoosin mikä näkyy lisääntynyt ekspressiotaso pilkkoa kaspaasi-9, -7, -3, PARP, ja phopho-H2AX

ser139 [10].

Somaattiset mutaatiot on tunnistettu eri aloilla on mGluR, kuten ligandisitoutumisdomeenista, transmembraanidomeeni ja sytosolin domain eri syöpätyyppien [4]. Missensemutaatioita of mGluR tunnistettu eri aloilla voi olla biologista merkitystä syövissä. Itse asiassa, somaattiset mutaatiot mGluR on raportoitu edistää rintasyövän, melanooma, ja munuaissolukarsinooma kasvua ja etenemistä

in vivo

[11], [12], [14]. Esseltine ja kollegansa [15] tutki toiminnallista seurauksia useiden missensemutaatioita tunnistettu eri aloilla on mGluR useaan eri syöpiä, kuten keuhko- adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä, korkea-asteinen astrosytooma, ja rintasyöpiä. Nämä missensemutaatioita eri aloilla on mGluR vaikuttavat reseptorin ilmentymisen ja antaa valikoivan edun eri alavirran signalointireiteissä (esim PI3K /Akt /mTOR, ERK1 /2 aktivointi) ja muutokset solun morfologiassa.

Harvat raportteja olemassa GRM1 mutaatiot ja yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) PCA solulinjoissa tai kudoksissa. Nämä tutkimukset on rajoitettu koko, exome sekvensointi ja transcriptome analyysi. Nämä suuren kapasiteetin määritykset ovat pystyneet tunnistamaan intronin eksoniliitokset tai ei-koodaava variantteja ja vaativat vielä kokeellinen validointi tunnistettu mutaatioita. Lisäksi nämä tutkimukset eivät sisältäneet Afrikkalainen amerikkalainen (AA) -PCa näytteet ja solulinjoja GRM1 mutaation tai SNP havaitsemiseen. Voittaa nämä rajoitukset, me seulotaan täyspitkä GRM1 geenin, joka sisältää kaikki eksonit, eksoni-introniliitokset, ja reunustavat ei-koodaavat 5′- ja 3′-alueet (UTR) tunnistaa geneettisiä muutoksia useissa PCa solulinjoissa ja Hyväksytty kasvain Normaalissa kudosten AAs ja valkoihoinen amerikkalaiset (CA). Havaitsimme uusia mutaatioita ja SNP GRM1 geenissä. Toiminnalliset seuraukset näistä mutaatioista ennustettiin käyttämällä saatavilla verkossa bioinformatiikan työkaluja.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

seulotaan genomisen DNA: n kymmenen PCa solulinjojen (PC-3 , E006AA, DU-145, MDA-PCa2b, 22RV1, LAPC4, Vcap, CWR-R1, LNCaP, C4-2B) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen mutaatioiden havaitsemiseksi ja polymorfismien koodaavan alueen, reunustavat transloimattomat alueet (5′- ja 3’UTR), ja eksoni-introniliitokset täyspitkän

GRM1

geeni.

nipistämässä vastustuskykyisten (PC-3, DU-145, MDA-PCa2b, VCAP, ja 22RV1) ja androgeenin stimuloidaan (LNCaP ja LAPC4) PCa solulinjat ostettiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) [16], [17]. Normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (NL-Pr.EC) ja C4-2B solulinjat Clonetics (Bio Whittaker, Walkersville, MD) ja UROCOR (Uroscience Group, Oklahoma City, OK), vastaavasti. E006AA perustettiin peräisin AA potilaan kanssa elimeen rajoittunut PCa [16]. CWR-R1-solulinja saatiin lahjana tri Elizabeth Wilson (University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) [18]. PC-3, DU-145, ja Vcap solulinjoja pidettiin yllä DMEM naudan sikiön seerumia (FBS, 10%) ja antibiootteja (1%). E006AA, 22RV1, CWR-R1, C4-2B, ja LNCaP solulinjoja viljeltiin RPMI1640 kanssa FBS: ää (10%) ja antibioottia (1%). MDA-PCa2b solulinjaa viljeltiin määritellä väliaineessa kuten valmistajan suosittelema (ATCC, Manassa, VA). LAPC4 solulinjat oli kulttuurin IMDM täydennetty 10% FBS: ää ja 1% antibiootti.

kasvainnäytteestä ja Eettinen linjaus

arvioimiseksi geneettisten muutosten

GRM1

geeni, olemme mukana yhteensä 21 sovitetun eturauhasen normaalia kasvaimen näytteestä saatujen AAS (n = 10) ja CA (n = 11). Kaikki kudokset biospecimens saatiin biospecimen ydin laitokseen Louisianan Cancer Research Consortium (LCRC) sidoksissa Tulane Medical School ja School of Medicine, Louisiana State University Health Sciences Center (LSUHSC, New Orleans, LA). Pre-tietoisen kirjallisen suostumuksen muodossa saatiin kustakin potilaasta näytteen keräämistä varten käyttöön niiden näytteiden tieteellisiä löytöjä ja hyväksyi tutkimuksen Institutional Review Board (IRB) at LSUHSC. Vastaaviin normaaleihin-tuumorikudoksista oli saatavilla kahdeksassa tapauksessa (N3-T3, N4-T4, N5-T5, N13-T13, N21-T21, N35-T35, N52-T52, N71-T71) varmenteiden ja kuusi tapausta (N2 -T2, N6-T6, N26-T26, N27-T27, N32-T32, N38-T38) AA potilailla.

Genomisen DNA: n eristäminen, Polymerase Chain Reaction, ja sekvensointi

GRM1

Gene

Genominen DNA: t eristettiin eturauhasen kudoksia ja solulinjoja käyttämällä AllPrep DNA /RNA Quigen (Qiagen, Valencia, CA). Täyspitkä

GRM1

geeni (isoformin α) valittiin (NM_000838.3) suunnittelemaan alukkeita kattaa kaikki eksonit, eksoni-introniliitokset, ja 5′- ja 3′-UTR. Tämä transkripti koostuu yhteensä yhdeksän eksonia. Perustuen mutaatioita ja SNP löydetty eksonissa-8 ja -9 PCA solulinjoissa, valitsimme nämä alueet edelleen yhdistelmistä on sovitettu kasvain-normaali kudoksia. Primer suunnittelu tehtiin käyttämällä PrimerSelect väline DNASTAR Lasergene 9 ydin puku (DNASTAR, Madison, WI). Kaikkiaan 9492 bp monistettiin kuusitoista amplikonien lukien reunustavat 50-100 bp, jotka kattavat eksonin-introni. Primer tiedot (sekvenssi, sulamislämpötila, ja amplikonin koko) on esitetty taulukossa S1. Jokainen genomi-DNA-näytteen (yhteensä 25 ng) monistettiin 32 sykliä 10 ul: n kokonaistilavuudessa polymeraasiketjureaktio (PCR), joka sisältää spesifisiä alukkeita (0,2 uM), dNTP: itä (0,2 mM), MgCl2: lla (1,5 mM); GoTaq DNA-polymeraasia (0,75 U) 1x PCR-puskuria (Promega, Madison, WI, USA). PCR-tuotteet puhdistettiin käsittelemällä 5 U eksonukleaasi-I (Exo-1) ja 2 U katkaravun alkalisella fosfataasilla (SAP) yhdessä 1 x puskurissa 37 ° C: ssa 2-3 tuntia ja sen jälkeen kuumainaktivoimista entsyymien 85 ° C: ssa 20 minuuttia. Sen jälkeen, kun Exo-SAP hoitoon, PCR-tuotteet laimennettiin 15 ng /ul pitoisuuteen. PCR-tuotteen spesifisyys, määrä ja laatu analysoitiin 1,2% agaroosigeelielektroforeesilla. Kaksisuuntainen sekvensointi PCR-tuotteiden suoritettiin genominen ydin laitos (RPCI, Buffalo) käyttämällä ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA). Tiedot analysoitiin käyttämällä sekvenssianalyysiohjelmistoa ja tarkastettava silmämääräinen tutkimus tunnistetut variantit elektroferogrammi.

alleelispesifinen genotyypin C1744T mutaatio Tuumorinäytteissä

Kehitimme alleelispesifinen PCR-pohjainen genotyypitysmenetelmää arvioida kuin synonyymi mutaatiosta suoralla sekvensoinnilla

GRM1

geenin C1744T (582 Pro Ser) asema E006AA solulinjassa. Kaksisuuntaista vahvistus tämän tietyn mutaation, neljä alukkeet suunniteltiin (taulukko S1, Primer numerot 19-22), kaksi ulompaa alukkeita ja kaksi alleelispesifinen (AS) sisempi alukkeita niiden 3′- pää spesifisyys kullekin alleelin (C T). C-alleeli monistuu yhteen suuntaan AS sisempi pohjamaali ja ulompi alukeparia (# 19 ja # 20; amplikonin koko 439 emäsparia), kun taas mutantti T-alleeli monistuu vastakkaiseen suuntaan muiden sisä- ja ulko-alukeparia (# 21 ja # 22; amplikonin koko 297 emäsparia). Kaksi ulompaa alukkeita myös monistamaan vakio fragmentti (# 20 ja # 22; amplikonin koko 736 emäsparia), jotka toimivat positiivisina kontrolleina PCR. Kaikki neljä aluketta käytettiin yhdessä reaktiossa ja PCR-olosuhteet optimoitiin säätämällä konsentraatio kutakin aluketta ja hehkutus lämpötilassa (Taulukko S1). Jokaisessa PCR-reaktion, olemme mukana positiivinen ja negatiivinen kontrollinäyte tarkkailla tehokkuutta AS-genotyypityksen.

bioinformatiikka- analyysi Tunnistaa Novel

GRM1

Mutaatiot

Novel mutaatiot tunnistettiin

GRM1

geeni testattiin bioinformatically eri mahdollisia vaikutuksia proteiinien rakenne, toiminta, ja silmukointikohtaan variantti. Vaikutus missensemutaatio (seriinin proliini) at 582 aa asemassa testattiin verkkotyökaluja; (I) PolyPhen2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) [19], (ii) SIFT (https://sift.jcvi.org/) [20], ja (iii) Phd- SNP (https://gpcr2.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/PhD-SNP/PhD-SNP.cgi) [21].

ennustamiseksi potentiaali rakenteellinen seuraus tunnistettu mutaatio eksonissa -intron liittymissä eksonista-8

GRM1

geeniä, käytimme kahta eri online bioinformatiikan työkaluja: (a) ihmisen liitos löytäjä (https://www.umd.be/HSF/) [22] ja ( b) ESEfinder (https://rulai.cshl.edu/tools/ESE/) [23]. DNA-sekvenssi, joka käsittää villityypin tai mutantti alleeli käytettiin kyselyn Human Splice Finder työkalu ennustaa liittämiseen luovuttajan tai akseptorikohdassa.

Tulokset

tunnistaminen Novel

GRM1

mutaatiot ja SNP eturauhassyövän solulinjoissa

sekvensointi koko eksonien

GRM1

geenin 10 PCa solulinjoissa osoitti 18 geneettisiä muutoksia, jotka ovat hiljattain määritetty ei-synonyymi mutaatioita, liitos-site muunnelmia, non-synonyymi synonyymi, ja ei-koodaavan polymorfismien (kuva 1 ja 2, taulukko 1-2). A novel non-synonyymejä mutaation C1744T (582 Pro Ser) asema eksonin 8 havaittiin E006AA, ensisijainen AA-PCa-solulinja (kuvio 1). Tämä mutaatio ilmestyi heterotsygoottinen tila (CC CT) ja sijaitsee lähellä transmembraanidomeeni lisämaksua solun reunassa GRM1 reseptorin ja johti proliini (hydrofiilinen aminohappo, kodoni-CCT) ja seriini (neutraali aminohappo, kodoni-TCT) amino hapon muutosta (kuvio 2). Toinen uuden mutaation tunnistettiin eksoni-introni risteyksessä eksonin 8 C4-2B, joka on kastraatiotason kestävä PCa solulinja (kuvio 1, taulukko 1). Tämä mutaatio johti G T muuntaminen alkaessa introni-8 ja ilmestyi heterotsygoottinen kunnossa. Viisi ei-koodaavat mutaatioita havaittiin myös 3′-UTR-alueen eksoni-9

GRM1

geenin kahden eri PCa solulinjoja (LAPC4 ja MDA-PCa2b) (taulukko 2). Yksi näistä mutaatioista sijaitsee 2149 emäsparia alavirtaan lopetuskodonista vuonna LAPC4 ja raportoidaan NCBI tietokannasta (dbSNP rakentaa 139) kuin rs41285865. Vaikka muut neljä mutaatiota sijaitsee 221 emäsparin, 486 emäsparin, 2664 bp ja 2737 bp alavirtaan lopetuskodonista MDA-PCa2b solulinja (taulukko 2). Nämä mutaatiot raportoitu NCBI tietokannasta (dbSNP rakentaa 139) kuin rs362827, rs6918099, rs79394543 ja rs362829 vastaavasti.

Näiden mutaatioiden yksi missense SNP (rs6923492 ) tunnistettiin 993 aminohapon asema solulinjoissa tutkittiin. Homotsygoottinen TT genotyyppi havaittiin PC-3, 22RV1, CWR-R1 solulinjoissa, ja NL-Pr.EC. Heterotsygoottinen TC genotyyppi löydettiin MDA-PCa2b ja VCAP solulinjoissa, ja homotsygoottinen CC genotyypin E006AA, DU-145, LAPC4, C4-2B, LNCaP solulinjat. Tässä lokuksessa, muutos T: stä C nukleotidin johti seriini (TCC) ja proliini (CCC) muuntaminen. Tämä missense polymorfismi sijaitsee sytoplasminen domeeni GRM1 reseptorin välillä transmembraanidomeeni ja kelataan kela-motiivin (kuvio 2). Neljä aiemmin raportoitu synonyymi polymorfismien havaittiin myös koodaava sekvenssi eksoni-9 931 (rs2942), 1056 (rs6923864), 1071 (rs1047006) ja 1165 aminohappoa (rs9373491) asemissa (taulukko 1). Kuusi ei-koodaavan SNP löytyivät 3′-UTR

GRM1

geeni ja nämä polymorfismit sijaitsevat 637 emäsparin (rs362819), 1277 bp (rs3804294), 1278 bp (rs3804293), 1369 bp (rs362820) , 2392 bp (rs362821) ja 2616 bp (rs362822) alavirtaan lopetuskodonista (taulukko 2).

tunnistetiedot

GRM1

Mutaatiot ja SNP eturauhassyöpäkudoksille

Sequencing valittujen eksonien-8 ja -9 on

GRM1

geenin eturauhasen kasvain kudoksissa osoitti useita geneettisiä muutoksia. Homotsygoottinen genotyyppi tila (CC-genotyyppi) verrattuna heterotsygoottinen genotyyppi (CT-genotyyppi) viereiseen normaaliin kudokseen on 637 bp alavirtaan (rs362819) lopetuskodoniin todettiin AA kasvain (N38-T38 näytteitä, taulukko 3). Toiset kaksi genotyyppiä (CC ja GA) löydettiin 3′-UTR alue ainoastaan ​​AA näytteitä asemassa 221 bp (rs362827, N2-T2) ja 486 emäsparin (rs6918099, N6-T6, N32-T32 ja N38-T38) alavirtaan lopettaa kodonin. Nämä muutokset ovat ituradan alkuperää. Koska heterotsygoottinen genotyyppi (GA rs6918099) 486 bp alavirtaan lopetuskodonista todettiin 3 ulos 11 Aas se näyttää olevan etninen-erityinen genotyyppi. Homotsygoottinen CC genotyyppi (rs362827) joka on olemassa vain yksi AA-potilas voi olla satunnaista ituradan mutaation tai harvinainen variantti.

Samanlainen solulinjaan sekvenointitulosten tunnistimme missensemutaatio polymorfismi ( rs6923492) at 993 aminohappoasemassa johtavat seriini proliiniksi aminohapon muutos ja havaittiin 7 10 AA: laiset (N2-T2, N26-T26, N27-T27, N32-T32, T62, T25, T11) ja 5 ulos 11 CA (N3-T3, N5-T5, N21-T21, T20, T34) kudoksissa (taulukko 3). Ei-koodittava SNP (rs362819) löydettiin 637 bp alavirtaan lopetuskodonista. Genotyyppi tila Näiden SNP: kasvainkudoksissa on sama viereiseen normaaliin kudokseen, mikä osoittaa, sukusolujen polymorfismien (taulukko 3). Kaksi synonyymi polymorfismit löydettiin myös eksonissa-9 sekä AAs ja CA populaatiot. Nämä sijaitsivat 931 aminohappoasemassa (rs2942) ja koodi lysiinitähteeksi taas toinen synonyymi polymorfismi sijaitsee 1056 aminohappoasemassa (rs6923864) koodi glysiinijäännös.

Käyttämällä alleelispesifinen (AS) PCR-alukkeet ja suora sekvensointi in Hyväksytty kasvaimeen normaaleissa kudoksissa, me genotyyppi äskettäin tunnistettu ei-synonyymejä mutaatio C1744T (582 Pro Ser) sijainti (E006AA) ja mutaatio eksoni-introni risteyksessä eksonin-8 (in C4-2B) . Nämä mutaatiot ei havaittu missään pahanlaatuisten eturauhasen kudoksissa (kuvio 3).

läsnäolo C-alleelin osoitti monistaminen 439 bp: n fragmentti ja sen läsnä ollessa T-alleelin osoitti monistaminen 267 bp: n fragmentin. Epäspesifiseen fragmentti 706 bp monistettiin kaikissa näytteissä.

Ennustettu toiminnot Tunnistetut

GRM1

mutaatioita

ennustaminen toiminnallista roolia novel non-synonyymi (582 Pro Ser) mutaatiosta

GRM1

suoritettiin käyttäen erilaisia ​​työkaluja. PolyPhen-2 ennusti haitallinen Bayes posteriori todennäköisyys pisteet arvo 0,60 tälle mutaatio. Tämä ennustus pistemäärä perustuu usean sekvenssin linjassa homologisen sekvenssin tämän geenin tietokantaan ja osoittavat, että mutaatio vaikuttaa proteiinin stabiilisuuteen tai sen toiminta.

Riippumatta analysoitu, lajittelu Intoleranssi alkaen Suvaitsevainen (SIFT) algoritmi myös ennusti intoleranssi pisteet arvo 0,02 aminohapposubstituutio tunnistettu tässä lokuksessa. Perustuen proteiinisekvenssin säilyttäminen koko evoluutio, SEULOA ennusti 582 Pro Pa aminohapposubstituutio voi myös vaikuttaa proteiinin toimintaan. Lisäksi käytimme FT-SNP menetelmä, jossa käytetään käytettävissä sairauteen liittyvien SNP tietokanta ja koneoppimisen tekniikka ennustaa nsSNP liittyen ihmisten sairauksien. Tämä analyysi paljasti taudista asiaa on 582 Pro Ser mutaatio joiden luotettavuus indeksin arvo 3.

Koska pistemutaatiot eksoni-introni tai introni-eksoni-risteyksestä voi johtaa eksonin liukastuminen tai vaihtoehtoisen silmukoinnin, olimme kiinnostunut analysoimaan mitä vaikutuksia uuden mutaation löydettiin eksoni-introni risteyksessä eksonin 8 C4-2B solulinjassa. Tätä varten käytimme Human Jatkaminen Finder (HSF) ja eksonin Jatkaminen Enhancer (ESE) löytäjä työkaluja ennustaa seuraus siitä silmukoitumiskohta motiivi kahdella eri alleelin tunnistaa mutaation [22], [23]. Olemme havainneet, että läsnäolo T-alleelin voimakkaasti ennustaa mahdollisuutta silmukointidonorin motiivin (caaGtgagt), korkea yksimielisyys arvo 88,26. Kuitenkin vaihdosta T- ja G-alleelin johti menetys tämän silmukointidonorin motiivi (kuvio 4A ja 4B). Samoin ESEfinder ennustettu korkeat pisteet (9,49) motiivi (eksoni-liitos tehostajana) ja sekvenssin G-alleelin eksoni 8-introni risteyksessä

GRM1

geeni. Kuitenkin tämä pisteet alennetaan -7,52 varten motiivi peräkkäin mutantti T-alleelin.

Kaksikymmentä yksi emäsparin sekvenssi, joka reunustaa mutaatio sivuston villin tyypin (A) ja mutantti alleeli (B) testattiin ennustamiseen liittämiseen motiivin (tai -akseptori).

keskustelu

GRM1 signalointi on osallisena useiden pahanlaatuisten syöpien, kuten paksusuolen adenokarsinooma, melanooma, keuhkokarsinooma, kilpirauhasen syöpä, rintasyöpä, astrosytooma, neuroblastooma ja rabdomyosarcoma [4], [5], [24]. Glutamaattireseptori- saavuttanut erityistä kiinnostusta antanut muuttamassa potentiaali ja saatavuus sen ligandin, glutamaatti, yhteydessä kasvaimen mikroympäristön ja helposti saatavuuden reseptorin pinnalla syöpäsoluja. Differentiaalikaavojen, aktivoinnin tilan tai signaalin uudelleenohjelmointi glutamaattireseptoriantagonistien kasvainsoluissa voi edistää syövän kehittymisen ja etenemisen. Nämä muutokset voivat johtua erityisistä muutoksista somaattisten ja ituradan geneettisiä muutoksia, kopioiden määrä vaihtelua, epigeneettiset, ja translaation jälkeiset muutokset johtavat muuttuneeseen ilmentymiseen tai aktivointi ja siten parantaa kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [25].

Deep sekvensointi tutkimukset ovat osoittaneet, että G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori (GPCR) on muuntunut noin 20% kaikista syövän ja glutamaattireseptori- perhe edustaa toiseksi useimmin mutatoitunut GPCR: perheenjäsen [26]. Somaattisista mutaatioista in

GRM1

on raportoitu laaja lajikkeiden kasvaimia, kuten melanooma, rintasyöpä, paksusuolen karsinooma, keuhkon adenokarsinooma, aivokasvaimia, heamatopoitic, ja imukudoksen [15].

GRM1

geeni koostuu eri aloilla erityisiä toimintoja, kuten ligandisitoutumisdomeenista, kysteiinirikas domain dimeroimista, transmembraani- ja C-terminaali verkkotunnus vuorovaikutusta loppupään signalointimolekyylien. Mutaatiot näissä konservoituneita tähteitä saattaa olla mahdollinen rooli sitoutumisen GRM1 reseptorin ligandin, signalointi aloittamista, siirto signaalin tai lopettamisesta tai voitto toiminnon fenotyypit. Nämä mutaatiot voivat paitsi osalliseksi kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen, mutta myös vaikuttaa etäpesäke mukaan lukien solun liikkuvuus ja angiogeneesin edistäminen.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatiot eri G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori, CCK2R ja GRM1 liittyvät muuttuneeseen reseptorin toimintaa, loppupään signalointi polkuja, muuttunut solun morfologiassa, muuttoliike, ja edistää angiogeneesiä, joka parantaa tumerogenesis [15], [27]. Esseltine

et al

tutkittu toiminnallista roolia

GRM1

mutaatiot sijaitsevat glutamaatti-sitoutumiskohta (A168V), glutamaatti-sitova domeeni (R375G), kysteiini-rikas alue (G396V), G- proteiinia sitovan alueen (R696W), Homer sitova alue (P1148L) on karboksiterminaalinen hännän GRM1 reseptorin [15]. Ohimenevä ekspressio mutatoidun

GRM1

liittyi joko alentunut ekspressio solun pinnalla tai pohjapinta /kiskalaatti–stimuloitu aktivointi inositolifosfaatin (IP) ja /tai ERK1 /2 aktivointi [15]. Mutaatio Homer sitovan alueen (P1148L) oli osoitettu muuttavan solun morfologiassa ja saattavat vaikuttaa solujen siirtoa.

Vaikka useita mutaatioita on raportoitu

GRM1

geenin eri ihmisen syövissä [4], vain rajallinen määrä suurikapasiteettisten tutkimuksiin koko exome sekvensointi tai transcriptome analyysit suoritettiin ja tunnistettu muutamia

GRM1

mutaatioita PCa näytteissä [28], [29]. Kaksi novel mutaatiota (R868H ja G144S) in

GRM1

(taulukko S2) tunnistettiin sekvensoimalla exomes 50 tappava catrate vastustuskykyisten PCa, 11 korkea-asteen ensisijainen elin-confind PCa näytteistä (aiemmin hoitamattomilla) ja 11 Eturauhassyövän solulinjat [29]. Exome sekvensointi 112 eturauhasen kasvain /normaali parit tunnistettu kaksi missensemutaatioita (A573E ja R681H) in

GRM1

geeni [28]. Hölynpölyä mutaatio raportoitiin myös eksonissa-2

GRM1

geeni (TCGA: https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/).

Exome tai transcriptome sekvenssi analyysi on omat rajoituksensa lukien kyvyttömyys havaita mutaatioita eksoni-introniliitokset tai ei-koodaava alue ja tarvetta kokeellinen validointi tunnistetuista mutaatioista [28]. Lisäksi näissä tutkimuksissa ei kuuluu AA-kasvain näytteet tai niiden solulinjoja. Näiden rajoitusten vuoksi, seuloimme, ensimmäistä kertaa, koko eksoni-alueella

GRM1

geenin, joka sisältää reunustavat 5′- ja 3′-UTR-alueet ja eksoni-introni-liitoskohtien kymmenen yleisesti käytetty PCa solulinjoja, mukaan lukien kaksi perustettu AA-PCa solulinjoissa (E006AA ja MDA-PCa2b), ja 21 Hyväksytty eturauhasen kasvain-normaali kudoksia 11 varmenteiden ja 10 AAs potilasta.

tässä tutkimuksessa tunnistimme kaksi uutta mutaatiota E006AA ja C4 2B solulinjat. Nämä mutaatiot eivät tunnistettu aiemmissa tutkimuksissa perustuvat niiden tutkimuksen suunnittelu tai solulinjoja mukana sekvensointi [29]. Non-synonyymi mutaatio (C T) 582 aminohappoasemassa johti proliini ja seriini muutokseen. Tämä mutaatio sijaitsee lähellä transmembraanidomeenin ekstrasellulaarinen puolella. Bioinformatics ennustaminen toiminnallista roolia tämän mutaation, käyttämällä useita analyyttisiä työkaluja, osoitti konversion hydrofiilisten (seriini) vapaalle (proliini) aminohappo on joko suvaitsematon tai johtaa vahingollista vaikutusta proteiinin stabiilisuuteen ja toiminta. Muuntaminen seriini ja proliini aminohappo voi myös lujuutta signaalin lähetyksen jälkeen ligandin sitoutuminen ja GRM1 reseptorin aktivoitumisen. Toinen mutaatio tunnistettu eksonissa-intronin rajan

GRM1

eksonin-8 C4-2B solulinjassa.

bioinformatiikan analyysi käyttämällä kahta erilaista verkkotyökaluja ennusti, että G: stä T nukleotidin muuntaminen tähän asemaan johtanut hajoamiseen silmukoinnin luovuttaja sivuston. Häiriöt silmukoinnin-motiivin at eksoni-introni risteyksestä eksoni-8 asema voi muodostaa perustan luomiseksi eri silmukointivarianteista in

GRM1

geeni. Eri isomuotoja

GRM1

geenin eri proteiiniin pituus liittyy ero aktivointi alavirran signaalit joko muutoksia signaalin voimakkuuden tai vuorovaikutusta muiden soluliman proteiinien [30]. Lisätutkimuksia tarvitaan vahvistamaan toiminnallista roolia uusien mutaatioiden

GRM1

geeni tunnistettu tässä tutkimuksessa ja ne toiset tutkijat [28], [29]. Neljä ylimääräistä mutaatiota tunnistettiin MDA-PCa2b ja yksi mutaatio LAPC4 solulinjassa sijaitsee 3′-UTR

GRM1

geeni ja nämä mutaatiot on raportoitu NCBI tietokannasta (dbSNP Build 39) eri väestöissä. Nämä mutaatiot tapahtui ituradan muutoksia Tuumorinäytteissä tutkitaan ja havaitsimme, että taajuus Näiden mutaatioiden on korkea AA kasvain näytteissä verrattuna CA. Korkean taajuuden Näiden mutaatioiden havaittu AA näytteitä voidaan yhdistää ero

GRM1

ilmentymistä ja toimintaa, joka saattaa johtaa etenemiseen tai useamman taudin vaikeudesta. AA väestö on osoittanut yleisyydestä ja kuolleisuus ja esittelee kliinisesti aggressiivisempi sairaus kuin CA. Toiminnallista roolia näiden mutaatioiden ei ole raportoitu kirjallisuudessa [31].

missensemutaatio polymorfismi (rs6923492 T C) tunnistettu eksonissa-9

GRM1

geeni PCA solulinjoissa ja kasvaimia johti seriini ja proliini muutosta 993 aminohapon kannan soluliman lopussa reseptorin. Aiempi tutkimus käyttäen 1000 rintasyöpäpotilaiden osoitti yhdistyksen tämän SNP ER + /PR + duktaalikarsinooma TT-genotyyppi operaattorin kanssa myöhemmin ikä diagnoosin (4,9 vuotta) verrattuna joko TC ja CC-genotyyppi harjoittajille [32]. Ei kuitenkaan havaittu yhteyttä melanoomaa herkkyys [33]. Suurempi kasvainnäytteestä tutkimus on vahvistaa yhdistyksen tämän SNP alttiuteen eturauhasen syövän synnyn, aggressiivisuus ja etenemiseen.

Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa tunnistimme uusia mutaatioita

GRM1

geenin lisäksi aiemmin raportoitu mutaatioita ja SNP PCa solulinjoissa ja myös osajoukko pahanlaatuisen eturauhassyövän kudoksiin. Nämä uudet mutaatiot ennustettiin olevan tärkeä rooli geenien toiminnan lukien proteiini vakautta ja silmukoinnin eri isoformeja. Toiminnallinen validointi näistä mutaatioista vahvistaa entisestään roolia geneettisiä muutoksia on

GRM1

geenin eturauhasen syövän synnyn ja etenemisen.

tukeminen Information

Taulukko S1.

tiedot käytettyjen alukkeiden sekvensointi

GRM1

geenin. Genomiset sekvenssit alukkeiden käytettiin PCR ja sekvensointi mukaisesti Human Genome Assembly (

GRM1

geenin liittymisen # NM_000838.3).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0103204.s001

(DOC )

Taulukko S2.

tiedot somaattisten mutaatioiden

GRM1

tunnistetun geenin kokonaan exome tai transcriptome sekvensointi tutkimuksia eturauhassyövän solulinjoissa ja kasvaimet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0103204.s002

( DOC) B