Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on kaikkein tappava syöpäsairauksia suurella etäpesäke ja uusiutumisriski, mikä johtuu todennäköisesti olemassaolosta keuhkosyövän kantasolujen (CSCS). CSCS monissa kasvaimissa mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on tunnistettu käyttäen tartunta molekyyli CD44, joko yksin tai yhdessä muiden merkki (s). MikroRNA (miRNA) säätävät sekä normaalit kantasolujen ja CSCS ja dysregulaatio miRNA on tuumorigeneesiin. Äskettäin miR-34a havaittiin vaimentua NSCLC soluissa mutta biologinen toimintojen miR-34a säätelyssä NSCLC solussa käyttäytyminen ei ole laajasti tutkittu. Tässä osoitamme, että transfektio synteettisen miR-34a, mutta ei negatiivisen kontrollin (NC) miRNA oligonukleotidit (oligot) kolmessa NSCLC solulinjoissa, eli A549, H460, ja H1299, esti niiden holoclone muodostumista, klonogeenisten laajennus, ja kasvaimen palautuminen in vivo. Lisäksi lentivirusvektorilla välittämää yli-ilmentymisen miR-34a puhdistettua CD44

hi H460 soluja esti myös kasvaimen kasvulta. Sitä vastoin ilmaus miR-34a antagomirs (eli antisense oligot) on CD44

lo H460-solujen edistää kasvainten kehittymiseen. Tutkimuksemme osoittaa, että miR-34a on negatiivinen säätelijä kasvaimia ominaisuuksien NSCLC-solujen ja CD44

hi keuhko CSCS, ja perustetaan vahvat perusteet kehittää miR-34a uutena terapeuttisena aineena NSCLC.

Citation: Shi Y, Liu C, Liu X, Tang DG, Wang J (2014) microRNA miR-34a Estää ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kasvu ja CD44

hi Stem-Like NSCLC solut. PLoS ONE 9 (3): e90022. doi: 10,1371 /journal.pone.0090022

Toimittaja: Gokul M. Das, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 marraskuu 2013; Hyväksytty: 24 tammikuu 2014; Julkaistu: 04 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81141096 ja Grant nro 81372512) ja Key projektivientirahastoa Shanghai Science and Technology Association, Kiina (Grant nro 05119554) ja J. Wang, ja NIH (R01- CA155693), Department of Defense (PC120817), CPRIT (RP120380), ja MDACC Center for Cancer Epigenetiikka ja RNA Center Laura John Arnold Foundation myöntää PO. Tang. C. Liu tuettiin, osittain DOD tohtorintutkinnon apurahan (PC121553). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä kantasolut (CSC), eli syöpäsolujen tiettyjen kantasolujen ominaisuuksia, on raportoitu monissa ihmisen kasvaimissa ja niiden ajatellaan olevan vastuussa kasvaimen aloittamista, hoidon vastus, eteneminen, uusiutuminen, ja etäpesäkkeiden [ ,,,0],1] – [3]. MikroRNA (miRNA), pienet ei-koodaavaa RNA: t säätelevät noin 20% -30%: n geenien ihmisen genomin, ja ovat sekaantuneet säätelyyn lisääntymistä, erilaistumista, muuttoliike, ja apoptoosin kautta estämällä proteiinin translaation ja /tai indusoimaan messenger hajoamista sitoutumalla komplementaariset sekvenssit 3′-alueen (3′-UTR) niiden kohde-mRNA: iden [4], [5]. miRNA voi toimia sekä onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille [6], [7], ja niistä on tullut tärkeitä säätelijöitä CSCS samoin.

microRNA-34a (miR-34a) toimii tuumorisuppressorina [ ,,,0],8] ja on vaimentua joissakin ihmisen syövissä, mukaan lukien rintasyövän [9], eturauhassyöpä [10], osteosarkooma [11], ja keuhkosyöpä [12], [13]. Keuhkosyöpä on kaikkein vaarallisin maligniteetti maailmanlaajuisesti. Työ aiemmin useita vuosia osoittaa, että sekä pienisoluinen (SCLC) ja ei-pienisoluisessa (NSCLC) keuhkosyövässä sisältävät CSCS [14], [15]. Kuten useimmissa muissa kasvaimissa, mahdollisten keuhkojen CSCS ovat rikastuneet, ja puhdistettiin käyttäen funktionaalisia määrityksiä [16] – [18] sekä solun pinnan markkereita, kuten CD133, CD34, CD90, ja CD44 [3]. CD44 on kalvoon sitoutunut glykoproteiini, joka välittää runsaasti erilaisia ​​toimintoja. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että CD44

+ soluja rikastetaan kasvaimeen lisäys kapasiteettia ja että CD44 on potentiaalinen CSC markkeri NSCLC [19]. Liu

et ai

ovat osoittaneet, että miR-34a voi estää eturauhasen CSCS ja etäpesäkkeiden suoraan tukahduttaa CD44 [20]. Tunnistaminen CD44 suorana ja toiminnallisesti asiaankuuluvat miR-34a tavoite paljastaa aikaisemmin unappreciated signalointireitin [20].

Vaikka on olemassa todisteita siitä miR-34a pienenee NSCLC, biologisten toimintojen tämän miRNA NSCLC jäävät niukasti tutkittu. Tässä tutkimuksessa, käyttäen erilaisia ​​biologisia määrityksiä yhdistettynä laajaan ksenografti kasvaimen kokeissa raportoimme, että miR-34a säätelee negatiivisesti CSC liittyviä ominaisuuksia sekä kasvaimen aloittamista kapasiteetti kolme NSCLC-soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet ja eläinkokeista

immuuni-puutosta NOD-SCID (ei-lihavien diabeettisten vakava yhdistetty immuunijärjestelmän puutosta) hiiret tuotettiin pääasiassa omasta Kasvatuslaitoksessa ja ylläpidetään standardiolosuhteissa mukaan vakiintuneiden ohjeiden. Kaikki eläinten terveyteen liittyvien tutkimusten tässä projektissa on hyväksynyt MD- Anderson Cancer Center IACUC (Institutional Animal Care ja käyttö komitea; ACUF # 08-05-08132). Nykyinen tutkimus ei liity koehenkilöillä (eli elävät yksilöt tai tunnistettavissa yksityisiä tietoja). Kaikki muut tutkimukset esitellään tässä olivat tutkinnan aloitti ja ei vaadi hyväksyntää muiden sääntelyelinten.

Solut ja perus koetoimenpiteet

Kolmen ihmisen NSCLC solulinjoissa (A549, H460, ja H1299 ) saatiin ATCC: stä. Kaikki soluja ylläpidettiin Media suosittelemat ATCC lisätty 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Invitrogen-Life Technologies). Soluja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa mukana 5% CO

2. Soluja ylläpidettiin rutiinisti 75 cm

2 kudosviljelypulloihin (Corning Incorporated, USA) ja kerättiin käyttäen 0,05% trypsiiniä. Useimmat perus koetoimenpiteet on kuvattu aiemmissa julkaisuissa [20], [21].

Transient transfektio synteettiset oligonukleotidit (oligot) B

Transfektoimme irtotavarana soluja tai puhdistettua CD44

+ NSCLC-solujen kanssa 33 nM miR-34a tai ei-kohdistaminen negatiivinen kontrolli miRNA (miR-NC) oligoja (Ambion, Austin, TX) käyttämällä Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Vaihtoehtoisesti transfektoimme puhdistettua CD44

– NSCLC-solujen kanssa 33 nM anti-miR-34a (anti-34a) tai anti-miR-NC (anti-NC) oligot (Ambion). Me yleensä korjattu transfektoitujen solujen in vitro tai in vivo sen jälkeen, kun oli viljelty 48 tuntia.

Lentivirusvektorikonstruktit-välitteisen yliekspressio miR-34a

lentivirusvektori, joka koodaa pre-miR-34a (lenti -34a) ja ohjaus- vektorin (lenti-ctl) saatiin Systems Biosciences (SBI) [20]. Lentivirukselle tuotettiin 293FT pakkaus soluissa ja tiitterit määritettiin GFP käyttämällä HT1080 soluja. NSCLC-solut infektoitiin MOI 25 läsnä ollessa 8 ug /ml polybreenin ja korjataan 48-72 h infektion jälkeen.

kvantitatiivinen RT-PCR

Kypsät miRNA ja CD44 mRNA-tasoja kvantitoitiin käyttäen TaqMan MicroRNA määritykset (Applied Biosystems) [20]. Lyhyesti, kokonais-RNA eristettiin käyttäen Mirvana PARIS miRNA Isolation Kit (Ambion). Quantitative miRNA ekspressiotietojen normalisoituivat sisäinen ”taloudenhoito” miRNA eli miR-24 ja miR-103. Kvantitatiivinen mRNA ekspressiotietojen normalisoituivat sisäinen ”taloudenhoito” mRNA, ts GAPDH. Erot positiivisen ja vastaavan negatiivisen populaatiot, eli ddCt arvot, kunkin miRNA tai mRNA: t muutettiin prosenttiosuus ilmentymisen kaavalla 2

-ddCt [20].

Clonal ja klonogeenisten määrityksissä

holoclone määrityksiä [22], me kullattu NSCLC-solut kloonitiheydessä (eli 50 solua /kuoppa) 6-hyvin lautasen laskettuina määrä holoclones useita päiviä myöhemmin, ja esitteli prosenttiosuus solut, jotka perustettiin holoclone kuin kloonaustehokkuuden. Sillä klonogeenisten määrityksiä [20], ensinnäkin voimme sekoitetaan metyyliselluloosa (MC), joissa seerumia, jota oli täydennetty 5 ug ml-1 insuliinia, 20 ng ml-1 EGF: ää ja 10 ng ml-1 bFGF (Sigma). Sitten päällystetty soluja yleensä 1000 solua /kuoppa MC seokseen 1:10 24 kuopan ultra-low kiinnitys (ULA) levyt ja luetteli pesäkkeet 2-3 viikkoa jälkeen pinnoituksen. Kaikkien edellä kokeissa otamme vähintään kolmen kuopan kunkin kunnossa ja toistetaan kokeet aina kun mahdollista.

Virtaussytometrianalyysi ja fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) B

Expression CSC markkereita arvioitiin virtaussytometrillä. Solut värjättiin elää värjäytyminen, joka sisälsi BSA: ta ja FITC-konjugoitua monoklonaalista anti-CD44 (klooni # G44-26, BD Bioscience), tai PE-konjugoitu monoklonaalinen anti-CD133 (klooni # AC133; Miltenyi Biotech) pitoisuutena suosittelemia valmistajille. Vastaava isotyypin hiiren immunoglobuliineja vastaan ​​käytettiin negatiivisina kontrolleina (BD Bioscience). Vähintään 10000 solut analysoitiin. Solujen lajittelu, merkitseminen solunpintamarkkereiden suoritettiin alle steriloitiin olosuhteissa ja solut lajiteltu BD FACSVantage Cell lajittelija (BD Bioscience). Top 10% eniten kirkkaasti värjättyä, ja pohja 10% eniten himmeästi värjätyt solut valittiin positiiviset ja negatiiviset populaatiot, vastaavasti. Lajittelu puhtaus yli 90% varmistettiin edelleen in vitro ja in vivo kokeissa. Kaikki tiedot analysoitiin Flowjo (versio 7.6.1).

Aldefluor määritys

Aldefluor Assay Kit (Aldagen, Inc. Durham, NC) käytettiin profiloida aldehydidehydrogenaasille ( ALDH) aktiivisuus NSCLC soluissa [23]. Soluja inkuboitiin Aldefluor määrityspuskuriin, joka sisälsi ALDH proteiinin substraatin BODIPY-aminoasetaldehydi (BAAA) ja 40 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut, jotka voisivat katalysoida BAAA sen fluoresoiva tuote BODIPY-aminoasetaatti (BAA) katsottiin ALDH

+. Lajittelu portit FACS laadittiin suhteessa solujen perustason fluoresenssi, joka määritettiin lisäämällä ALDH spesifisen inhibiittorin diethylaminobenzaldehyde (DEAB) inkubaation aikana ja DEAB-käsiteltyjen näytteiden toimi negatiivisena kontrollina. Ei-elävät solut tunnistettiin propidiumjodidia (PI) positiivisuutta. Solut lajiteltu BD FACSVantage Cell lajittelija.

kasvaimen siirron kokeet

Solut injektoitiin 60 ui medium:Matrigel seosta (01:01) ihon alle (sc) osaksi NOD /SCID-hiirten ( ikä 6-8 viikkoa). Transfektoimme bulk H460, A549, tai H1299 soluja miR-34a tai miR-NC oligoja (33 nM). 48 tuntia myöhemmin, kolme erilaista soluannosten 500000, 50000, tai 5000 istutettiin. Sillä H460-soluja, lisää 2000000 solujen kunkin (n = 7) istutettiin. Lisäksi oligo transfektion, myös tartunnan muutamia soluja lenti-34a tai lenti-CTL vektorit (MOI 25) [20], ja 48 tuntia myöhemmin, kolme soluannosten 500000, 50000, 5000 istutettiin. Lopuksi transfektoitu puhdistettua CD44

lo H460-solujen anti-34 tai anti-NC oligoja (33 nM) ja myös tartunnan puhdistetaan CD44

hi H460-solujen kanssa lenti-34a tai lenti-CTL vektorit (MOI 25). 48 tuntia myöhemmin, solut eri annoksina istutettiin. Kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain ja yksittäisten kasvainten tilavuudet mitattiin käyttämällä digitaalista paksuuden ja arvioida kaavalla V = 1 /2AB

2 (a ollessa pitkä halkaisija ja b lyhyt halkaisija kasvaimen). Lopussa kokeissa hiiret tapettiin ja kasvaimet otettiin talteen, mitattiin ja valokuvattiin.

Tilastollinen

Käytimme parittomia kaksitahoiset Opiskelijan

t

-testi on vertailla eroja solujen määrä, kloonaustehokkuuden kasvain painot ja muut asiaan liittyvät parametrit. Meillä työskentelee Chi-square testi verrata esiintyvyys ja latenssi. Käytimme ANOVA (F-testi) vertailla eroja useisiin ryhmiin. Kaikissa näissä analyyseissä,

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset ja keskustelu

miR-34a estää NSCLC solujen holoclone muodostumista ja klonogeeniset kapasiteetti

miR-34a on osoitettu olevan kasvaimen heikentävän toiminnot [8], [20], [21], [24] – [33] ja olla alle ilmaistu joissakin kasvaimissa sekä tiettyjä tuumorigeenisia -alapopulaatioiksi [ ,,,0],10], kuten CD44

+ eturauhasen CSCS [20]. miR-34a on suora p53 tavoite [32] ja sen promoottori vaimentuu joissakin syöpäsoluissa [30]. Jonkin verran on kokeellista näyttöä siitä, että miR-34a on vaimentua NSCLC soluissa [12], [13]. Valaisemiseksi mahdollinen biologinen seuraus menetys miR34a ilmaisun NSCLC soluissa, ensin transfektoituja kolme NSCLC-solut, A549 (p53 villityypin), H460 (p53 villityypin), ja H1299 (p53 mutantti), synteettisellä kypsä asennuspalveli- 34a tai miR-NC oligoja (33 nM) [20], 48 tuntia, ja sitten maljattiin solut kolmena rinnakkaisena klonaalisen tiheys (eli 50 solua /kuoppa) 6-kuoppaisilla levyillä. Sitten arvioitiin muodostumista holoclones, jotka on osoitettu satama itseuudistuvien CSCS, joka voi pitkän aikavälin levittää kasvaimia [22], 12 päivää (d) sen jälkeen, kun pinnoitus. Kuten kuvassa 1 (A-C), miR-34a yliekspressio inhiboi merkittävästi holoclone perustaminen kaikissa kolmessa NSCLC mallia. On tärkeää, vaikka miR-NC transfektoitujen NSCLC solut muodostivat suuria ja tiiviisti pakattu holoclones, MIR-34a transfektoitujen NSCLC-solujen perustettu paljon pienempiä ja /tai löysästi pakattu paraclones (katso kuvio 1 B esimerkit). Sen jälkeen, teimme tiukempia, kiinnittymisestä riippumaton, klonogeenisten analyysit metyyliselluloosa (MC), joka on laajasti käytössä solun itsenäinen toiminta mahdollisten CSCS [3]. Kuten klonaalisia määrityksissä, miR-34a yli-ilmentymisen suuresti esti palloja muodostavan kapasiteetin irtotavarana A549, H460 ja H1299 soluja (kuvio 1D-E).

(A-C) Clonal määritykset. Solut, jotka on transfektoitu miR-34a tai miR-NC oligoja (33 nM) maljattiin kolmena kappaleena 50 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä. Koe lopetettiin 12 d ja kaivot olivat Giemsa-värjätty (A). Näkyy B ovat edustavia kuvia. Tulokset on esitetty A ja B olivat edustavat kahden riippumattoman kokeen. (C) kvantitatiivinen tulosten esittäminen A. Pylväät edustavat keskiarvoa ± S.D. (D-E) klonogeeninen määrityksissä MC. Kaikkiaan 1000 solua kuoppaa kohti maljattiin klonogeeniset määritystä. Kuvat otettiin d 15 jälkeen pinnoitus ja esitetään D edustavat kenttiä. (E) kvantitatiivinen tulosten esittäminen D. Pylväät edustavat keskiarvoa ± S.D.

Edellä Koetulokset osoitettava, että palauttaminen miR-34a ilmentymisen NSCLC soluissa estää sekä klonaalinen ja klonogeeniset ominaisuuksia. Koska 3 NSCLC soluilla eri p53 tila, tulokset viittaavat myös siihen, että estäviä vaikutuksia miR-34a ovat p53-riippumattomia. Kuten odotettua, transfektoitujen solujen miR-34a oligoja osoitti dramaattisesti lisääntynyt miR-34a tasot arvioitiin qPCR analyysi kypsän miR-34a (kuvio 2A). Mielenkiintoista kuitenkin 3 NSCLC solutyyppejä näkyy laaja vaihtelu lisääntyi miR-34a tasossa, H1299 solujen säilyttää korkein määrä eksogeenisen miR-34a 48 h transfektion jälkeen (kuvio 2A). Kuten aiemmin, miR-34a on suora transkription kohteena p53 [32] ja H1299 solut ovat mutantti p53. Yksi mahdollisuus on, että sekä p53 ja miR-34a tasoa keuhkosyöpään solut on erittäin tiukasti kontrolloitua. Näin ollen A549 ja H460-soluissa, jotka on villityyppinen p53, vaikka ulkopuolelta annetuille p53 huononee nopeasti, kun taas p53-mutantin H1299 solut, transfektoidut kypsä miR-34a oligoja hengissä paljon kauemmin (kuvio 2A).

(A) NSCLC-solujen tuoreita transfektoitu miR-34a oligoja osoitti miR-34a tasoa moninkertaisesti suuremmat kuin transfektoitu miR-NC oligoja. Ilmoitettu NSCLC-solut transfektoitiin miR-34a tai miR-NC oligoja, ja 48 tuntia myöhemmin, otettiin talteen ja käytetään kasvaimen kokeissa (alla), kun taas pieni määrä soluja syrjään ja joita käytetään qRT-PCR mittaus asennuspalveli- 34-mRNA-tasot. Näkyy ovat keskiarvo miR-34a tasoa (log asteikko; n = 2) in miR-34a transfektoiduissa soluissa suhteessa kuin MIR-NC transfektoiduissa soluissa (todelliset keskiarvoja ilmoitettu baareissa). (B-D) miR-34a oligo transfektio esti A549 kasvaimen kasvua. Todennäköiset ovat kasvaimen esiintymistiheys (kasvaimia kehittyi /numerot injektiot,%), sadonkorjuun aika (mukaan lukien todellinen injektio ja eroamispäivämäärät), kasvaimen keskipaino (grammoina), ja

P

arvot kasvainten painot. Gross kasvain kuvat eivät ole samassa mittakaavassa. (E-G) miR-34a oligo transfektio esti H460 kasvaimen kasvua. (H-L) miR-34a oligo transfektio esti H1299 kasvaimen kasvua.

Evidence että miR-34a yliekspressio estää myös kasvainten kehittymiseen

sitten arvioineet kasvainta estäviä vaikutuksia miR-34a kolmeen NSCLC solutyypeistä in vivo (kuvio 2). Olemme transfektoitiin 33 nM miR-34a tai miR-NC oligoja A549-soluja 48 tunnin ajan, ja sitten istutetaan 50000 (50 k) soluja ihon alle (s.c.) tulee immuunijärjestelmän puutosta NOD /SCID-hiiriin. Kuten on esitetty kuviossa 2B-D, miR-34a transfektoiduissa soluissa kehitetään kasvaimia, jotka olivat vain noin puolet koot miR-NC kasvaimia ja entisen kasvoivat hitaammin. On huomattava, että ero kasvaimen paino ei ollut tilastollisesti merkittävä, koska suhteellisen pieni näyte koot. Samoin miR-34a yliekspressoivia H460 soluja kehitetty paljon pienempi ja hitaammin kasvavien kasvainten verrattuna miR-NC transfektoiduissa H460-soluissa (kuvio 2E-G). H460-soluja, jotka on infektoitu miR-34a lentivirusvektorilla (ts lenti-34a) on myös regeneroitu pienempi ja hitaammin kasvava kasvaimia kuin kontrollivektorin infektoituneissa soluissa (kuvio S1A-C). Tärkeää on, miR-34a yliekspressio H460-soluissa vähensi kasvainten esiintymistiheys (75% vuonna miR-NC vs. 50% miR-34a,

P

0,01; kuvio 2E). Lopuksi suoritimme rajoittavan laimennuksen kasvaimen määrityksessä istuttamalla 5 k, 50 k, tai 500 k miR-NC tai miR-34a transfektoitujen H1299 soluja NOD /SCID-hiirissä ja jokaisen solun annoksella havaitsimme pienempi ja hitaammin kasvava kasvaimia johdettu alkaen miR-34a yliekspressoivia soluja verrattuna kasvainten miR-NC transfektoidut H1299-solut (kuvio 2 H-L). Jälleen miR-34a yliekspressio vähensi kasvainten esiintymistiheys kahdella soluannosten istutettu (eli 5 k ja 500 k,

P

0,01; kuva 2I). Itse asiassa, miR-34a transfektoitujen H1299-solut osoittivat merkitsevästi pienempi kasvaimen aloittamista taajuus (TIF) kuin vastaavat miR-NC kontrolleihin (

P

= 4.64E-179), kuten määritetään käyttämällä Limdil funktio Statmod paketin (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html). Suhteellisen vahvempi kasvaimen estäviä vaikutuksia miR-34a H1299-solujen suhteen kasvaimen esiintymistiheys todennäköisesti liittyy paljon korkeampi eksogeenisen miR-34a transfektoiduissa H1299-soluissa (kuvio 2A).

Kuten A549-solujen, erot kasvaimen painot miR-34a vs. miR-NC transfektoitujen H460 ja H1299 solut eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä, mikä johtuu todennäköisesti suhteellisen pienestä otoksesta (kuvio 2E ja 2I, vastaavasti), joka on hyvin yleinen ilmiö tällaisissa ksenograftin kasvaimen määrityksissä. Toinen uskottava selitys on, että transfektoidut oligot tuli vähitellen hajoaa in vivo, kuten olemme toistuvasti havaittu vastaavia kasvaimen kokeita käyttäen miR-34a [20] ja anna-7 [21] oligojen. Tueksi, jäljellä kasvaimia, jotka ovat peräisin miR-34a transfektoiduissa soluissa ei havaittu kasvua miR-34a (tietoja ei esitetty), toisin kuin juuri transfektoiduissa soluissa (kuvio 2A). Yksi mielenkiintoinen havainto oli, että p53-mutantin H1299-solut säilyvät merkittävästi korkeampi eksogeenisen miR-34a (kuvio 2A), mikä näytti myös ilmentyä vahvin kasvainta estäviä vaikutuksia tässä solulinjassa (vertaa kuvio 2 I vs. kuvio 2B ja 2E ).

miR-34a yliekspressio inhiboi CD44

hi H460 kasvain palautuminen taas anti-34a edistää kasvaimen kasvua puhdistettua CD44

lo H460 soluja

on ollut vahvaa kokeellista näyttöä siitä, että miR-34a voi ilmetä kasvainta estäviä vaikutuksia kohdentamalla CSCS [10], [20], [21] ja NSCLC soluviljelmissä on osoitettu satama varsi kaltainen syöpäsoluja [3], [14] – [19]. Siksi meidän kysyä, onko biologisista vaikutuksista miR-34a on 3 NSCLC-solut (kuvio 1 ja 2) saattavat liittyä sen toimintaa varsi kaltaisia ​​syöpäsoluja. Käsitellä tätä kysymystä, ensin määritetty prosenttiosuus positiivisten solujen Aldefluor, CD44, ja CD133, määrityksiä tai markkereita käytetään usein rikastuttaa keuhkojen CSCS. Havaitsimme ~1-2% Aldefluor positiivinen H460 ja H1299-solut, jotka olivat suurelta osin ”ablatoitu” läsnäollessa että ALDH-inhibiittoria DEAB (kuvio 3). Tuntemattomasta syystä useat toista kokeet osoittivat, että 90% A549-solut olivat Aldefluor-positiivisia ja osuus ei vaikuttanut DEAB (kuva 3). Lähes 100% A549, H460, ja H1299-solut olivat CD44-positiivisia (keskiarvot on 97,2%, 99,3%, ja 99,2%, vastaavasti; n = 3) (kuvio 3). Sen sijaan ei ollut juuri lainkaan ilmentymistä CD133 näissä kolmessa NSCLC solulinjoista (kuvio 3C). On mielenkiintoista, että nämä määritykset voivat tunnistaa päällekkäisiä populaatioiden kantasilmukan kuten NSCLC solujen puhdistettu ALDH

hi H1299 solut osoittivat korkeampaa CD44 mRNA (kuva S1D). Alustavissa tutkimuksissa olemme istutettu 5 k tai 10 k puhdistaa ALDH

hi ja vastaava ALDH

lo H1299 soluja NOD /SCID-hiiriin. 5 k, ALDH

hi ja ALDH

lo solujen kehitetty 4/5 (1,22 g, 0,32 g, 0,24 g, ja 0,12 g) ja 1/7 (0,99 g) kasvaimia, vastaavasti. Klo 10 k, ALDH

hi ja ALDH

lo solujen kehitetty 3/8 (0,36 g, 0,2 g, 0,1 g) ja 1/8 (0,03 g) kasvaimia, vastaavasti. Nämä alustavat tulokset viittaavat siihen, että ALDH

hi H1299 soluilla korkeampi kasvaimen uudistava kapasiteetin tärkeä CSC piirre.

(Top) Aldefluor määritys 3 NSCLC soluissa. DEAB-käsiteltyjen näytteiden toimi negatiivisena kontrollina. ~1-2% H460 ja H1299-soluja Aldefluor-positiivisia kun taas 90% A549-solut olivat Aldefluor-positiivisia. (Lähi) edustaja virtaussytometrialla profiilia CD44 (FITC) ilmentyminen 3 NSCLC soluissa. Lähes 100% A549, H460, ja H1299-solut olivat CD44-positiivisia (keskiarvot on 97,2%, 99,3%, ja 99,2%, vastaavasti; n = 3). (Pohja) Virtaussytometrianalyysi of CD133 (PE) ilmentyminen 3NSCLC soluissa. Ei ollut juuri lainkaan ilmentymistä CD133 näissä kolmessa NSCLC solulinjoista.

PC3 eturauhasen syöpäsoluja, lähes 100% soluista on positiivisia CD44 [34]. On kuitenkin olemassa PC3-soluja, jotka ilmentävät erittäin korkea solun pinnalla CD44 (eli CD44

hi) ja ne, alhainen CD44 (eli CD44

lo). On tärkeää, CD44

hi PC3-solut osoittivat merkitsevästi korkeampi klonaalinen ja klonogeeniset potentiaalit kuin isogeenisissä CD44

lo PC3-solujen [34]. Piirustus tämä analogia, me puhdistettu pois CD44

hi (eli top 10%) ja CD44

lo (eli pohja 10%) H460 soluja (kuvio 4A). Kuten odotettua, CD44

hi H460 solut ilmensivät korkeampia CD44 mRNA kuin CD44

lo H460-solut (

P

= 0,0009) (kuvio 4B). Huomattavan, lentivirus–välitteinen miR-34a yli-ilmentymisen CD44

hi H460-soluissa inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua (kuvio 4C, E ja F). Enemmän näyttävästi, anti-miR-34a antagomirs [20] dramaattisesti edistää kasvaimen uudistumista ja kasvaimen kasvu CD44

lo H460 soluja kaikissa kolmessa soluannosten (100 k, 10 k, ja 1 k) testataan (Kuva 4D , G-J).

(A-B) CD44 ilmentymistaso. (A) edustaja kaaviot virtaussytometria analyysi CD44 (FITC) ilmentyminen H460-soluissa. (B) CD44 mRNA-tasot puhdistetussa CD44

hi ja CD44

lo H460-soluissa arvioitiin qRT-PCR. (C, E, F) miR-34a yliekspressio puhdistettua CD44

hi H460-soluissa lentiviraalinen infektio esti kasvaimen uudistumista. (C) Indikoitu ovat kasvaimen esiintymistiheys (kasvaimia kehittyi /numerot injektiot,%), sadonkorjuun aika (mukaan lukien todellinen injektio ja eroamispäivämäärät), kasvaimen keskipaino (grammoina, F), ja

P

arvot kasvaimen painot. Gross kasvain kuvat eivät ole samassa mittakaavassa. (E) Kasvaimen kasvukäyrä. (D, G-J) Anti-miR-34a edistänyt kasvaimen kasvua puhdistettua CD44

lo H460-soluissa. (D) Indikoitu ovat kasvaimen esiintymistiheys (kasvaimia kehittyi /numerot injektiot,%), sadonkorjuun aika (mukaan lukien todellinen injektio ja eroamispäivämäärät), kasvaimen keskipaino (grammoina, G), ja

P

arvot kasvaimen painot. Gross kasvain kuvat eivät ole samassa mittakaavassa. (H-J) tuumorin kasvun käyrää kolmessa eri soluannosten.

Yhteenvetona, olemme osoittaneet, että miR-34a yli-ilmentyminen estää NSCLC solujen holoclone muodostumista ja klonogeenisten laajentaminen in vitro, ja tärkeintä, kasvaimen uudistumista in vivo. Näitä estäviä vaikutuksia miR-34a saattaa johtua sen vaikutukset varsi kaltaisia ​​NSCLC soluissa. Tämän tueksi mahdollisuutta, täytäntöön ilmentyminen miR-34a erityisesti CD44

hi H460 soluja suuresti esti niiden kasvaimeen uudistava aktiivisuus taas antagonistit miR-34a dramaattisesti edistää kasvaimen uudistumista CD44

lo H460-soluissa. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​CD44 on suora ja toiminnallinen kohde miR-34a eturauhasessa [20], ja joitakin muita syövän [31] soluja, ja ehdottaa, että miR-34a säätelee negatiivisesti kasvaimeen aloittamista kapasiteetti NSCLC CSCS. Tulevaisuuden työ pyritään selvittämään taustalla olevien mekanismien ja vuorovaikutukset miR-34a ja CD44 ilmaisun NSCLC soluissa.

tukeminen Information

Kuva S1.

miR-34a estää H460- kasvaimen kasvua ja ALDH

hi H1299 ilmentävät korkeampia CD44 mRNA-tasoja. (A-C) Lentivirusvektorikonstruktit-välitteisen miR-34a yliekspressio H460-soluissa inhiboi kasvaimen kasvua. (EN) päätepiste kasvain painoja. (B ja C) Kasvaimen kasvu käyrät kahdella eri solujen annosta. (D) CD44 mRNA tasot puhdistettiin ALDH

hi ja vastaavat ALDH

lo H1299 solut arvioitiin qRT-PCR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0090022.s001

(TIF)

Kiitokset

Kiitämme T. Davis apua kaikissa kasvain kokeita ja P. Whitney FACS. Kiitämme myös muita jäseniä Tang laboratorioon hyödyllisiä keskusteluja ja tukea.