Krooninen sairaus

tiivistelmä

häiriöstä tiukka liittymissä (TJS) liittyy usein ihmisen sairauksiin kuten syövän synnyn ja viimeaikainen tutkimukset tukevat rooli TJ olennainen proteiinien säätelyssä epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT). Tässä suhteessa, ilmentyminen klaudiini-1, keskeinen ainesosa TJs, on erittäin lisääntynyt paksusuolen syövän ja on syy-yhteydessä kasvaimen kasvua ja etenemistä. Kuitenkin mekanismi /s oleva sääntely klaudiini-1 ilmentymisen suolen epiteelisolujen edelleen huonosti. Tutkimuksissamme olemme tunnistaneet oletetun sitoutumiskohtia suoliston transkriptiotekijöiden Cdx1, -2 ja GATA4 5′-reunustavan alueen klaudiini-1-geenin. Meidän lisätutkimukset käyttämällä täyspitkää ja /tai Deleetiomutantin rakentaa kahdella eri ihmisen paksusuolen syövän solulinjoissa, SW480 ja HCT116, osoitti keskeinen rooli Cdx1, Cdx2 ja GATA4 säätelyssä klaudiini-1-mRNA ilme. Kuitenkin yli-ilmentyminen Cdx2 oli voimakkain vaikutus klaudiini-1 mRNA: n ilmentymisen ja promoottorin aktiivisuutta. Myös, paksusuolen syövän potilaiden näytteitä, havaitsimme merkittävää ja yhdensuuntaisesti korrelaatio klaudiini-1 ja Cdx2 ilmaisuja. Kromatiinin immunosaostus (chip) määritys vahvisti Cdx2 sitova klaudiini-1 promoottori

in vivo

. Käyttämällä Cdx2 deleetiomutantilla konstruktioita, me edelleen kartoitettiin Cdx2 C-pään domeeni olevan tärkeitä säätelyssä klaudiini-1 promoottorin aktiivisuutta. Mielenkiintoista on, että co-ilmentyminen aktivoituneiden β-kateniinin edelleen indusoi Cdx2 riippuvainen ylössäätely klaudiini-1-promoottorin aktiivisuuden, kun taas ekspressio hallitseva negatiivinen (dn) -TCF-4 kumotaan tämän aktivoitumisen. Yhdessä voimme päätellä, että homeodomain transkriptiotekijöiden Cdx1, Cdx2 ja GATA4 säädellä klaudiini-1-geenin ilmentymistä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Lisäksi toiminnallinen välinen ylikuuluminen Wnt-signalointi ja transkription aktivaation liittyvä caudal liittyviä homeobox (CDX) proteiinien ja GATA-proteiinien on osoitettu säätelyssä klaudiini-1 promoottori-aktivointia.

Citation: Bhat AA, Sharma A, Pope J, Krishnan M, Washington MK, Singh AB, et al. (2012) Caudal Homeobox Protein CDX-2 Tekee yhteistyötä Wnt Pathway säännellä Claudin-1 ilmentäminen koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 7 (6): e37174. doi: 10,1371 /journal.pone.0037174

Editor: Frederic Andre, Aix-Marseille University, Ranska

vastaanotettu: 06 tammikuu 2012; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2012; Julkaistu: 15 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Bhat et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) avustus CA124977 (P. Dhawan) ja DK088902 (AB Singh). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tight liittymissä (TJS), apikaalisimmasta solu-soluadheesion, auttaa säätelemään napaisuus ja eriytetty tilan epiteelisolujen. Häiriöt solujen soluliitos yhdessä samanaikaisen muutoksia ilmaus liittyvien proteiinien auttaa aiheuttaa hyökkäyksen ja metastasointiin syövässä. Klaudiini proteiinien perhe on olennainen rakenne ja toiminta tiukka liittymissä, ja muuttunut ilmentyminen klaudiini perheenjäsenten; vaikka kudosspesifisellä tavalla, on havaittu useita syöpiä. Useat tekijät osoittavat, että klaudiini-1 on tärkeä ainesosa TJs [1], [2], ja osallistuu suoraan esteen ja aidan toiminnot TJs [3], [4]. Lisäksi tutkimukset myös meidän ovat osoittaneet, että klaudiini-1 ilmentyminen väärin säädellystä erilaisia ​​syöpiä, kuten peräsuolen syöpä [3], [5]. Olemme lisäksi osoittaneet, käyttämällä suurta kohortin paksusuolen syövän potilaille, jotka klaudiini-1-mRNA: n ilmentyminen on myös hyvin kasvanut paksusuolisyövän [25]. Se on edelleen arvoinen tässä huomata, että paksusuolen syöpä, säädeltyyn klaudiini-1 ilmentymisen kumppaniaan kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [5]. Myös klaudiini-1 on kohteena β-kateniinin /Tcf signalointi, keskeinen säätelijä paksusuolen homeostaasin ja neoplastisen kasvun /eteneminen [6]. Kuitenkin yksityiskohdat kopioinnin säätely paksusuolen klaudiini-1 ilmentymisen ei ymmärretty.

. Western blot-analyysi Cdx1, Cdx2, GATA4, klaudiini-1 ja klaudiini-4-proteiinin ekspressiota SW480-soluissa. SW480-soluja transfektoitiin ohimenevästi Cdx1, Cdx2 ja /tai GATA4 ekspressiovektoreihin ja 20 ug koko solu-uutteet analysoitiin. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. B. Densitometria for klaudiini-1 ja klaudiini-4 ilme. C. Quantitative Real-Time PCR-analyysillä. SW480-soluja kotransfektoitiin Cdx1, Cdx2 ja GATA4 ekspressiovektorit läsnä osoitetun reportteri konstruktit, ja kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, kokonais-RNA eristettiin ja sille suoritettiin reaaliaikainen PCR: llä käyttämällä geenispesifisiä alukkeita. Tulokset esitettiin graafisesti keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta ja esitetään kertainen muutos. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 verrokkiin verrattuna. Erot kahden ryhmän analysoitiin kaksisuuntaisella Studentin t-testi ja yli kaksi ryhmää yksisuuntaisella ANOVA post-hoc Bonferronin monivertailutestillä.

homeodomain proteiinit Cdx1 ja Cdx2 ovat jäseniä kaudaalisesta liittyvien homeobox geeniperheen [7] – [9]. Tutkimukset tukevat rooli Cdx1 ja Cdx2 säätelyssä varhaisen erilaistumisen ja ylläpito suolen epiteelisolujen. Tutkimukset käyttäen epiteelisolujen suoliston alkuperää ovat osoittaneet, että modulaatio ilmentymisen Cdx1 ja /tai Cdx2 on merkittäviä toiminnallisia vaikutuksia suoliston erilaistumiseen [10], [11], leviämisen [10], [12], ja suolisto-geenistä transkription ohjelma [13] – [16]. On huomattava, että Cdx1 ja Cdx2 sitoo useampia suolistossa-promoottorit säädellä suolistossa-geenistä transkription [13] – [15], [17], [18]. Myös GATA4, sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijä, on mukana sääntelyn lisääntymistä ja erilaistumista suolen epiteelisolujen ja auttaa säätelemään alkion kehitystä ruoansulatuskanavassa [19]. Tutkimukset ovat lisäksi osoittaneet, että vuorovaikutukset GATA4 kanssa Cdx2 ja HNF-1α auttaa säätelemään ilmentymistä useiden solun soluadheesiota geenejä, mukaan lukien E-kadheriinin ja klaudiini-2 [19], [20].

Tässä raportissa osoitimme, että paksusuolen klaudiini-1-geenin ilmentyminen on myös kohde transkription sääntelyä Cdx1, Cdx2 ja GATA4 jossa Cdx2 näytti olevan tehokkain vaikutus kuin indusoi paksusuolen klaudiini-1 ilme. Olemme lisäksi tarjota tukevat tiedot rinnakkain korrelaatiota klaudiini-1 ja Cdx2 ilmentymisen paksusuolisyöpäpotilaalta näytteitä. Tärkeintä on, meidän tiedot osoittivat, että Cdx2 säätelee klaudiini-1 ilmentymisen yhteistyössä Wnt-signalointi, tunnettu säätelijä klaudiini-1 ilmentymisen.

sekvenssi klaudiini-1-promoottori ja tunnistaminen transcription- aloituskohta on aiemmin kuvattu [21]. Otaksuttu merkittävä konsensus sitovat kohdat on alleviivattu. B. Cdx1, Cdx2 ja GATA4 sääntely klaudiini-1 lusiferaasireportterigeenillä. SW480 (B), HCT116 (C), MCF-7 (D) ja MDCK (E) soluja transfektoitiin ohimenevästi 1,2 kb klaudiini-1-lusiferaasireportteriplasmidi yhdessä Cdx1, Cdx2 ja /tai GATA4 ekspressiovektoreihin. Tyhjät pGL3-basic vektoria käytettiin valvontaa varten. Epäspesifinen plasmidi-DNA: ta käytettiin ylläpitämään yhtä suuret määrät DNA: ta kaikissa transfektion näytteissä. Tulokset ilmaistaan ​​taittuva aktivointi suhteellinen lusiferaasin aktiivisuuden jälkeen normalisoinnin

Renillaa

aktiivisuutta 3 erilliselle kokeelle, ja arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 verrokkiin verrattuna. Erot kahden ryhmän analysoitiin kaksisuuntaisella Studentin t-testi ja yli kaksi ryhmää yksisuuntaisella ANOVA post-hoc Bonferronin monivertailutestillä.

Tulokset

Pakko Expression of Cdx1, Cdx2 tai GATA4 indusoi Claudin-1 ilmentäminen koolonkarsinoomasoluissa

tutkia Cdx1, Cdx2 ja /tai GATA4 auttaa säätelemään paksusuolen klaudiini-1 ilmentymisen, määritimme vaikutus yli-ilmentymisen edellä transkriptiotekijöiden upon endogeenisen klaudiini-1 ilme. Tätä tarkoitusta varten käytimme SW480 paksusuolen syöpäsoluja, jotka ilmentävät alhaisia ​​endogeenisen klaudiini-1 [5]. Nisäkkään ekspressioplasmidin konstrukteja, jotka sisältävät täyspitkän Cdx1, Cdx2 tai GATA4 transfektoitiin ohimenevästi sisään SW480-soluissa. Tyhjä ekspressioplasmidit toimi kontrollina. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen kerättiin ja alistettiin valmistamiseksi lysaatin tai kokonais-RNA-uutetta. Immunoblottauksella käyttämällä antigeeni-spesifistä vasta-ainetta tehtiin vahvistaa yli-ilmentymisen ja samalla tasolla yli-ilmentymisen antigeenejä tutkitaan (kuvio 1A). Kuten kuviossa 1B on esitetty, havaitsimme vahvaa ylössäätely klaudiini-1 soluissa, jotka yliekspressoivat Cdx1 (3,8-kertainen ± 0,451), Cdx2 (6,5-kertainen ± 0,854) tai GATA4 (3,3-kertainen ± 0,115) on proteiinin tasolla. Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti samanlaista induktio klaudiini-1-mRNA: n ilmentymisen, kun yli-ilmentyminen kaikki edellä mainitut transkriptiotekijöiden ja jälleen tämä induktio oli enintään soluissa yli-ilmentävät Cdx2 (kuvio 1C). Tämä vaikutus Cdx1, Cdx2 tai GATA4 kun klaudiini-1 ekspressio oli spesifinen, koska ilmentymisen klaudiini-4, vielä yhden klaudiini perheenjäsen, ei vaikuttanut pakko ilmaus tahansa edellä transkriptiotekijöiden (kuvio 1A B).

SW480-solut ko-transfektoitiin eri yhdistelmiä Cdx1, Cdx2 ja GATA4 ekspressiovektorit, kun läsnä on ilmoitettu reportterikonstrukteja, ja lusiferaasin määritykset suoritettiin. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut hajotettiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Tulokset esitettiin graafisesti keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta ja normalisoitu lusiferaasiaktiivisuus kussakin solulinjassa esitettiin suhteellisena lusiferaasiaktiivisuus. Keskiarvo transfektoitujen solujen pGL3-perusvektoriin ilman ekspressiovektoreiden asetettiin 1 B ja C. Western blot-analyysi klaudiini-1-proteiinin ilmentymisen SW480-soluissa. SW480-soluja transfektoitiin erilaisilla yhdistelmillä Cdx1, Cdx2 ja GATA4 ekspressiovektorit ja 20 ug proteiinit analysoitiin. ** P 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 verrattuna ohjaus. Erot kahden ryhmän analysoitiin kaksisuuntaisella Studentin t-testi ja yli kaksi ryhmää yksisuuntaisella ANOVA post-hoc Bonferronin monivertailutestillä.

. Reportteri konstruktit sisältävät peräkkäin poistettu 5′- reunustavan fragmentteja 1,2 kb klaudiini-1 (-1160 /-260), valmistettiin ja transfektoitiin SW480 (B) ja HCT116 (C) solut, kuten on kuvattu kohdassa ”Kokeelliset menetelmät”. Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisena lusiferaasiaktiivisuutta kolmesta eri kokeet suoritettiin kolmena kappaleena (keskiarvo ± S.D.). Erot kahden ryhmän analysoitiin kaksisuuntaisella Studentin t-testi ja yli kaksi ryhmää yksisuuntaisella ANOVA post-hoc Bonferronin monivertailutestillä.

Cdx1, Cdx2 ja GATA4 Asetus klaudiini-1 Gene transkriptio koolonkarsinoomasoluissa

edellä tutkimuksissa pakko ilmaus Cdx1, Cdx2 tai GATA4 johti lisääntymiseen klaudiini-1-proteiinia ja mRNA ilmaisuja. Siksi olemme edelleen määritetään onko Cdx1, Cdx2 ja /tai GATA4 auttaa säätelemään klaudiini-1 transkriptio. Tässä suhteessa olemme suoritetaan lusiferaasireportterigeenin määritys käyttäen ihmisen klaudiini-1-promoottori (-1160 /+ 160) -luciferase reportteri-konstrukti on kuvattu aiemmin [21] nimitystä pGL3 /-1.2Cld-1 (kuvio 2A) läpi käsin. -1160-160 Bp alueen ihmisen klaudiini-1: n promoottori sisältää oletetun cdx, HNF ja GATA sitoutumiskohdat sekä oletetun sitoutumiskohtia TCF /Lef-1 (kuvio 2A). SW480-soluja transfektoitiin ohimenevästi pGL3 /-1.2Cld-1 tai pGL3-basic (pelkkä vektori) yhdessä viitataan reportteriplasmidilla. Lusiferaasiaktiivisuus pGL3 /-1.2Cld-1 oli normalisoitu pGL3-basic lisäksi referenssivektoria. Ektooppinen ilmentyminen Cdx1 tai GATA4 ei muuttanut ilmentymistason Cdx2, eikä Cdx2 yli-ilmentyminen on havaittavissa vaikutus Cdx1 tai GATA4 proteiinin lausekkeita (kuvio 1A). Yli-ilmentyminen joko Cdx1 tai GATA4 johti ~ 3-kertainen promoottorin aktiivisuutta pGL3 /-1.2Cld-1. Kuitenkin samanlaiset yli-ilmentyminen Cdx2 johti 6-kertainen aktiivisuuden saman konstruktin (kuvio 2B). Havaitsimme samanlainen suuntaus induktion pGL3 /-1.2Cld-1-ajettu lusiferaasiaktiivisuuden HCT116 paksusuolensyöpä, joka oli 2,5-3-kertainen, kun yli-ilmentyminen Cdx1 ja GATA4 ja ~ 4-kertainen, kun yli-ilmentyminen Cdx2 (kuvio 2C). Saimme samanlaisia ​​tulos käyttämällä pidempää 3,3 Kb (-3140-160) klaudiini-1: n promoottori reportteri määritys, joka ei ollut merkittävästi erilainen verrattuna 1,2 Kb klaudiini-1-promoottori (Kuva S1). Siksi jatkoimme käyttöä 1,2 Kb klaudiini-1 promoottori lisätutkimuksia. Meidän lisätutkimuksia tuettu spesifisyys meidän edellä havainnot yli-ilmentyminen vielä toinen transkriptiotekijän HNF-1α ei vaikuttanut klaudiini-1 promoottorin aktiivisuutta joko SW480-soluissa (kuvio S2). Olemme edelleen vahvistaneet spesifisyyden meidän havaintonsa paksusuolen klaudiini-1 ilmentymisen samankaltaisina ohimenevä yli-ilmentymisen Cdx1, Cdx2 tai GATA4 ihmisen rintasyövän soluja (MCF-7) tai munuaisten epiteelisoluja (MDCK II solut) eivät lisänneet klaudiini-1 promoottori aktiivisuutta (kuvio 2D A, B, C: konservoituneita domeeneja. B. Lusiferaasiaktiivisuutta jälkeen kotransfektion Cdx2 villityypin ja katkaisu mutantteja. Poistetaan Cdx2 C-terminaalissa (Cdx2CD) merkitsevästi (***

p

0,001) pienentää klaudiini-1 reportteriaktiivisuutta. C. Western blot -analyysillä käyttäen anti-Flag-vasta-aineen tarkistaa vastaavan ekspression Cdx2 katkaisu mutanttien SW480-soluja transfektoitiin ohimenevästi Cdx2 katkaisu mutantti ekspressiovektorit. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. D. Cdx2 sitoutuminen 5′-reunustavan alueen klaudiini-1-geenin promoottorin esitetty ChIP määrityksessä. Formaldehydi silloitettu chromatin valmistettiin 5 x 10

7 SW480-soluja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa Cdx2 tai IgG: tä (negatiivinen kontrolli). Silloitus Immunosaostumien päinvastaiseksi ja DNA puhdistettiin ja analysoitiin käyttäen spesifisiä alukkeita joko klaudiini-1-promoottorialueen tai glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi. Tulokset osoittavat, että induktio klaudiini-1-promoottorin aktiivisuuden Cdx2 vaatii Cdx2-C-päähän domeenin.

Cdx1, Cdx2 ja GATA4 transkriptiotekijöiden toimivat synergistisesti ekspression säätelemiseksi eri geeniä [19]. Niinpä määritettiin onko samanlainen synergia olemassa keskuudessa Cdx1, Cdx2 ja GATA4 säätelyssä klaudiini-1-geenin transkription. Voit testata, me kotransfektoidaan Cdx1 kanssa Cdx2, Cdx1 kanssa GATA4 ja Cdx2 kanssa GATA4 in SW480-soluissa. Todellakin, koekspressoimalla Cdx1 kanssa Cdx2, Cdx1 kanssa GATA4 tai Cdx2 kanssa GATA4, kaikki johti merkittävään kasvuun (9-13-kertainen) in klaudiini-1 promoottorin aktiivisuutta (kuvio 3A). Tämä synergia sääntelyssä klaudiini-1 ilmentymisen edelleen vahvistettiin proteiinin tasot jossa klaudiini-1 indusoitiin (8-10-kertainen) verrattuna (3-6-kertainen) kanssa Cdx1, Cdx2 tai GATA4 yksinään (kuvio 3B 0,01) käyttäen Yates chi square testi. B. edustava värjäys klaudiini-1 (a) ja Cdx2 (b) paksusuolen syövän potilaiden näytteitä. Leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä määrittää rakenteellisia yksityiskohtia.

C-terminaalinen Domain tarvitaan Cdx2 aktivaatioon Claudin-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden

Yllä tutkimukset viittasivat roolin Cdx1 , Cdx2 ja GATA4 säätelyssä klaudiini-1 promoottori. Kuitenkin Cdx2 näytti olevan tehokkain vaikutus klaudiini-1 promoottorin aktiivisuutta. Siksi lisätutkimukset, määritimme Cdx2 verkkotunnus, tarvitaan transkription aktivoituminen klaudiini-1 promoottori. Tässä suhteessa, testasimme vaikutus Cdx2 deleetiomutantin konstrukteja niiden kyky indusoida klaudiini-1-promoottorin aktiivisuuden (kuvio 5A). [22] Immunoblot-analyysillä käyttäen anti-flag-vasta-ainetta vahvistettiin samanlaiset ekspressiotasot Cdx2 deleetiomutantin konstruktiot (kuvio 5C). Tulokset osoittivat, että poistetaan kanoninen transkription aktivaatiodomeeni (Cdx2 δ55-136), N-terminaalista domeenia (Cdx2 δ15 tai Cdx2 δ50) tai alueen aminohappojen 140 ja 180 (Cdx2 δ140-180) ei ollut merkittävää vaikutusta klaudiini -1 promoottorin aktiivisuutta. Sen sijaan, poistetaan Cdx2 C-pään 244-311 (Cdx2CD) alennetaan klaudiini-1-promoottorin aktiivisuuden 5-kertaisesti verrattuna villityypin Cdx2 (kuvio 5B). Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että Cdx2 C-pää domeeni vaaditaan Cdx2 riippuvan induktion klaudiini-1-promoottorin aktivaation.

edelleen määrittää, onko Cdx2 sitoutuu klaudiini-1-promoottori

in vivo

, suoritimme ChlP analyysi ja verrattiin SW480-solut yli-ilmentävät Cdx2 kanssa SW480-soluja transfektoitiin tyhjällä ekspressioplasmidivektoriin. Kuviossa 5D esittää tuloksena DNA vedettävä alas anti-Cdx2 vasta-aine, joka sisältää sekvenssi, joka reunustaa CDX sitoutumiskohtaan. Tämä viittasi siihen, että Cdx2 sitoutuu CDX-sekvenssin elementtien 310 bp klaudiini-1-promoottori, ja tämä sitoutuminen kasvaa, kun yli-ilmentyminen Cdx2 in SW480-soluissa, mikä puolestaan ​​lisää klaudiini-1-promoottorin aktiivisuutta. Edelleen määrittää, onko C-pääte on tärkeää Cdx2 sitoutumisen klaudiini-1-promoottorin, me yli-ilmentynyt Cdx2CD (C-terminaalinen deleetio mutantti) tai N- terminaalinen deleetio mutantin, joka ei vaikuta klaudiini-1 transkriptionaalista aktiivisuutta (Cdx2 δ50 ) in SW480-soluissa ja suorittaa ChIP analyysi. Siru-analyysi osoitti, että lisääntynyt sitoutuminen johtuu täyspitkän Cdx2 yliekspressio kumottiin, kun yli-ilmentyminen Cdx2CD, mutta ei N-pään deleetion (Cdx2 δ50) mutantti (kuvio 5D). Nämä havainnot ehdottivat, että Cdx2 C-terminaalinen domeeni on tärkeä sitoutumisen Cdx2 ja klaudiini-1-promoottori ja Cdx2 riippuva induktio klaudiini-1-promoottorin aktiivisuutta.

Toimiva Päällepuhuminen Wnt Merkinanto ja CDX liittyvät transkription aktivointi Säätelee Claudin-1 promoottori Activity

Claudin-1 on tunnettu tavoite Tcf /Lef-1 signalointi [6] ja Tcf /Lef-1 elementit ovat läsnä sisällä -1160–850 alueella claudin- 1 promoottori. Testata vaikutuksen β-kateniinin /Tcf /Lef-1, klaudiini-1-promoottori altistettiin samanaikaisesti transfektion läsnä tai poissa ollessa aktivoitu β-kateniinin (S33Y) yhdessä Cdx1, 2 tai GATA4. Lyhytaikaisissa transfektioissa tehtiin SW480 ja HCT116-solut ja lusiferaasiaktiivisuus pGL3 /-1.2Cld-1 normalisoitiin pGL3-Basic lisäksi referenssivektoria. Yliekspressio aktivoitu β-kateniinin (S33Y) kanssa Cdx1, Cdx2 tai GATA4 johti atleast kaksinkertaiseksi edelleen induktio klaudiini-1: n promoottori-välitteisen geenin ilmentymisen verrattuna Cdx1, Cdx2 tai GATA4 yksinään (kuvio 6A B). Käänteisesti, kun yli-ilmentynyt Cdx1, Cdx2 tai GATA4 kanssa dnTcf-4, induktio klaudiini-1-promoottori on kumottu viittaa mahdollisten ylikuulumista näiden tekijöiden välillä (kuvio 6C 0,01) välillä klaudiini-1 ja Cdx2 ilmaisuja 36:50 (72%) paksusuolensyöpä näytteitä (Fig. 7A). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen suoraa korrelaatiota ilmauksia Cdx2 ja klaudiini-1 peräsuolen karsinoomat.

Keskustelu

häiriöstä colonocyte erilaistumisen ytimessä paksusuolen syövän synnyn. Klaudiini-1 ekspressio on erittäin lisääntynyt paksusuolen syövän ja on syy-yhteydessä kasvaimen kasvuun ja etenemiseen [5]. Kiinnostaa, sen lisäksi, että säädeltyyn proteiinin ilmentymisen ja lokalisaation klaudiini-1 mRNA: n ilmentymisen nostaa myös paksusuolensyöpä [25]. On myös syytä huomata, että geneettinen manipulointi klaudiini-1 ilmentymisen koolonkarsinoomasoluissa johti teräviä ja käänteinen muutoksista niiden erilaistumiseen asema myös E-kadheriinin ilmentymisen [5], [24]. Myös induktio epiteelin erilaistumista in koolonkarsinoomasoluissa käyttäen histonideasetylaasi (HDAC) estäjiä liittyy tiettyyn väheneminen klaudiini-1 ilmentymisen keskuudessa klaudiini perheenjäsenten [25]. Yhdessä klaudiini-1 ilmentyminen näyttää vaikuttavan paksusuolen karsinogeneesin modulaation kautta koolonin epiteelisolujen erilaistumisen. Siksi tutkimme rooli transkriptiotekijöiden tärkeitä säätelyssä suolen epiteelisolujen erilaistumisen sekä paksusuolen syövän syntymistä säätelyssä klaudiini-1-mRNA transkriptio. Keskeinen tulos tutkimuksemme kahdella eri ja laajalti käytetty koolonsyöpäsolulinjaa olivat (i) Cdx1, Cdx2 ja GATA4 auttavat säätelemään klaudiini-1-geenin transkription ja tämä asetus oli erityinen soluihin paksusuolen alkuperää, (ii) Cdx2 on useimmat indusoi tehokkaasti klaudiini-1-promoottorin aktiivisuuden kesken Cdx1, Cdx2 ja GATA4, ja fyysisesti sitoutuu CDX-konsensus sitoutumiskohta /s klaudiini-1-promoottorin, määritettynä chIP-analyysi, (iii) Cdx1, Cdx2 ja GATA4 säädellä paksusuolen klaudiini-1 ilmentymisen kautta mahdollisia synergia keskenään-muita ja sitä kautta mahdollisen cross-talk Wnt-signalointireitin. Yhdessä tässä raportissa tarjoamme ensimmäistä oivalluksia monimutkainen transkription aktivaation tapahtumia, jotka säätelevät paksusuolen klaudiini-1 ilmentymisen.

caudal homeobox proteiini Cdx1 saadaan pääasiassa krypta, kun taas Cdx2 proteiini on havaittiin sekä krypta ja villus osastot [26]. Tärkeää on, lopputulos useista tutkimukset viittaavat siihen, että rooli Cdx1 ja Cdx2 säätelyssä suolen homeostaasiin on usein täydentävää ja voi riippua kypsymisen suolen epiteelisolujen [27]. Nämä havainnot täydennetään esittelyn melko erillisiä roolia Cdx1 säätelyssä suolen epiteelisolujen proliferaatiota, kun taas Cdx2 olla tärkeä rooli sääntelyn eriyttäminen tilan suolen epiteelisolujen [28]. GATA4 myös kuuluu perheeseen transkription tekijöitä, jotka on tärkeä rooli sääntelyn alkionkehityksen ja mahdollisesti varhainen kypsyminen suolen epiteelisolujen [29]. GATA4 yhdessä GATA5 /6 on liitetty solujen eloonjäämistä, solujen lisääntymistä, ja neoplastisen transformaation eri solutyyppien [8] – [15]. Erityisesti joukossa ruoansulatuskanavan syöpien, GATA4 monistetaan -10% ruokatorven adenokarsinoomista ja Barrett metaplasiaa [30]. Rooli GATA4 säätelyssä paksusuolen syövän synnyn ei ole hyvin tutkittu vaikka rajallinen tutkimukset ehdotti, että se voi toimia tuumorisuppressorina paksusuolen syöpä [31]. Kuitenkin yksi tarvitse olla varoitti, että erityinen toiminnallinen muotoilua kuten transkriptiotekijöiden kuten niiden toiminta /s ovat usein yhteydessä riippuvaisia ​​ja vuorovaikutus muiden transkription sääntelyviranomaiset ovat myös tärkeitä.

Mielenkiintoista, rooli Cdx2 transkriptiotekijän sääntelyä paksusuolen syövän synnyn pysyvät kiistelty ja tutkimukset viittaavat rooliaan positiivinen tai negatiivinen kasvain modulaattori ”. Tässä suhteessa, hiirillä, jotka ovat heterotsygoottisia-null varten Cdx2 geenin kehittää paksusuolen hamartoomat jälkeen jäljellä Cdx2 alleeli menetetään [32], [33]. Nämä heterotsygoottinen-null Cdx2 hiiret ovat myös herkkiä azoxymethane (AOM) aiheuttama koolonin adenokarsinooma [34]. Myös yhdiste heterozygootit varten Cdx2 ja adenomatoottisen polypoosin coli (APC) geenien kehittää adenomatoottisten polyypit paksusuolessa verrattuna niiden heterotsygoottinen

APC

littermates [35]. Yhdessä edellä havainnot ehdottaa funktio Cdx2 kuin paksusuolen kasvain vaimennin. Kuitenkin immunohistokemiallinen analyysi on havainnut vahva Cdx2 ilmaisun ~90% ihmisen paksusuolen syöpä näytteitä [38], [39]. Edelleen, Cdx2-yli-ilmentymisen koolonkarsinoomasoluissa indusoi ankkurista riippumaton kasvu ja solujen eloonjäämistä [36]. Kiinnostaa, Cdx2 edistää ankkurista riippumaton kasvu kautta transkription tukahduttaminen IGFBP-3 [37]. Näin ollen kasvaimen edistämisen rooli Cdx2 paksusuolen syöpä voidaan harkita. Yhdessä voidaan väittää, että rooli Cdx2 säätelyssä paksusuolensyöpä voi riippua erilaistumista tilan koolonkarsinoomasoluissa ja vuorovaikutus muiden transkriptiotekijöiden.

Havainnot useista tutkimukset ovat paljastettiin olemassaolo monimutkainen vuorovaikutusta Cdx1, Cdx2, GATA4 ja HNF-1α induktioon suoliston geeniekspression lukien klaudiini perheenjäsen, klaudiini-2 [40], [41]. On tärkeää huomata, että samanlainen klaudiini-1, klaudiini-2: n ilmentymisen on myös ylösajettu koolonin karsinogeneesissä [42]. Cdx2 on osoitettu pelata rooli sääntelyn muiden solu-solu adheesioproteiineja kuten LI-kadheriinin, klaudiini-3 ja klaudiini-4 [20]. Meidän nykyinen tutkimuksessa olemme tunnistaneet konsensus CDX-sitomiskohta sekä GATA-sitoutumiskohta ihmisen klaudiini-1 promoottori. Se seikka, että pakko ilmentyminen Cdx1, Cdx2 tai GATA4 indusoi ei pelkästään klaudiini-1-proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen, mutta myös indusoi lusiferaasin-reportterin aktiivisuus riippuu täyspitkä ihmisen klaudiini-1-promoottori (-1160-160) tukee syy rooli edellä transkriptiotekijöiden säätelyssä klaudiini-1 ilme. Erityisesti, poistetaan klaudiini-1 promoottorisekvenssin -1160–840 bp (310 bp: n poistuman) 5′-reunustavan alueen, joka sisältää Cdx- ja GATA4 sitoutumiskohdat kumosi kasvu lusiferaasiaktiivisuuden havaittujen käyttäen täyspitkän promoottorikonstruktiin. Edelleen, meidän havainto, että Cdx1, Cdx2 tai GATA4 riippuva induktio klaudiini-1 promoottorin aktiivisuutta voidaan edelleen parantaa, kun edellä transkriptiotekijöiden olivat koekspressoi tukee monimutkainen keskinäinen riippuvuus Näistä transkriptiotekijöitä säätelyssä klaudiini-1 ilmentymisen . Se, että samanlaisia ​​pakko ilmentyminen HNF-1α ei vaikuttanut klaudiini-1 ilmentymisen tekee spesifisyydellä havaintomme (kuvio S2). Lisäksi meidän havainto, että samanlaisia ​​yliekspressio Cdx1, Cdx2 tai GATA4 munuaisen epiteelin ja rintasyövän soluja ei ollut selvää vaikutusta klaudiini-1 ilmentymisen viittaavat siihen, että tämä ei ole yleinen mekanismi klaudiini-1 ekspressio ja on melko koolonspesifisen. On mahdollista, että nämä tekijät voivat vaatia muita kofaktoreita olla aktiivinen, jotka ovat läsnä vain koolonkarsinoomasoluissa.

Tulokset viittasivat myös siihen, että joukossa transkriptiotekijät tutkittavana Cdx2 on kaikkein indusoi of klaudiini-1 ilme. Todellakin, tutkimuksemme avulla ChIP analyysi osoitti suoran assosiaatiosta Cdx2 kanssa klaudiini-1-promoottori ja siten ehdotti, että klaudiini-1 on suora kohde Cdx2 riippuvaisen transkription säätelyyn.