Krooninen sairaus

tiivistelmä

Androgeenireseptorin (AR) on jäsenenä ytimen reseptorin perheen transkriptiotekijöiden. Sitoutuessaan androgeenien, AR tulee transkriptionaalisesti aktiivinen säätelemään kohdegeenien että satama androgeenin vaste-elementit (ARE:) niiden promoottorien ja /tai tehostajia. AR on olennaista kasvua ja selviytymistä eturauhassyöpäsolujen ja siten tavoite nykyisen ja seuraavan sukupolven hoitomuodot eturauhassyöpää vastaan. Patofysiologisesti asiaan proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen verkoissa, joissa AR on kuitenkin huonosti. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet proteiini sulatettu /kulkeutua liposarkooma (FUS /TLS) kuin AR-vuorovaikutuksessa proteiinin samanaikainen immunosaostus endogeenisen proteiinin LNCaP ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. Hormonaalisen vasteen FUS ilmentymisen LNCaP-soluissa osoitettiin muistuttavat muiden AR co-aktivaattoreita. FUS näkyy voimakas luontainen transaktivaatiota kapasiteetti eturauhasen syöpäsolujen kun lieassa pohjapinta promoottorit käyttäen GAL4 järjestelmää. Kromatiinin immunosaostus kokeet osoittivat, että FUS palkattiin ARE III tehostaja alueen

PSA

geeni. Tiedot kohdunulkoinen yli-ilmentymisen ja ”knock-down” lähestymistavat osoittaneet, että AR-transkriptionaalisen aktiivisuuden tehostettiin FUS. Ehtyminen FUS vähensi androgeeniriippuvaisen leviämisen LNCaP. Siten FUS on uusi co-aktivaattori AR eturauhasen syöpäsoluja.

Citation: Haile S, Lal A, Myung JK, Sadar MD (2011) FUS /TLS on Co-aktivaattori androgeenireseptorin vuonna Eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 6 (9): e24197. doi: 10,1371 /journal.pone.0024197

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 02 elokuu 2011; Julkaistu: 1. syyskuuta 2011

Copyright: © 2011 Haile et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Canadian Institutes of Health Research myöntää MOP-79308. www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Androgeenireseptorin (AR) tarvitaan säilymisen ja kasvun eturauhasen syöpäsoluja. Näin ollen edennyt eturauhassyöpä voidaan hoitaa androgeeniablaatio hoitoja. Valitettavasti nämä terapiat lopulta epäonnistuvat ja tauti tulee tappava, kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC). Laajimmin tuettu mekanismin taustalla CRPC liittyy AR. Aminopäässä domeeni (NTD) AR tarvitaan sekä ligandista riippuvaa ja ligandista riippumaton reseptorin aktiivisuutta (katso tarkastelua [1]). Siten nykyiset pyrkimykset kehittää tehokkaampia lääkkeitä vastaan ​​CRPC keskittyvät tehokkaampia tukkiminen androgeenisynteesin, antiandrogens että kilpailukykyisesti sitovat AR ligandisitoutumisdomeenista (LBD), jossa paljon suurempi affiniteetti [2], ja estäjät AR NTD [3 ]. Jatkuva pyrkimys kehittää lääkkeitä hyötyisivät parempaa ymmärtämistä proteiini-proteiini vuorovaikutuksen verkostoja, joihin AR. Tätä varten käytimme proteomic lähestymistapa ja tunnistaa uusia endogeenisen AR vuorovaikutusta kumppanien eturauhassyövän solut, jotka sisältävät ryhmän jäsenten kutsuttujen proteiinien FET /TET. Tämä proteiinien perhe sisältää: fuusioitu sarkooma (FUS) /kulkeutua liposarkooma (TLS), Ewig sarkooma proteiini (EWS), ja TATA sitova proteiini-liittyvänä tekijänä, TAF15.

FET proteiinien näkyviin erilaisia ​​toimintoja kuten transkription modulaatio, liittämiseen, solu leviää, ja DNA: n korjaukseen. FET proteiineilla on samanlainen transkription aktivaatiodomeeneista (tāds) niiden NTD ja RNA tunnustamista motiivi (RRM) ja toistojen tripeptidin RGG niiden karboksyyliterminuksesta [4], [5]. TAD FET proteiinien sisältää XYXXQ-rikas aihe, X on pieni aminohappo (Gly, Ala, Ser tai Pro) [6]. Tämä motiivi on myös jaettu proto-onkoproteiinin SYT, ihmisen ytimen reseptorin koaktivaattori SYT-vuorovaikutuksessa Protein /Co-aktivaattori Activator (SIP /CoAA), ja SWI /SNF /BAF250 [6]. FET NTDS, mukaan lukien voimakas tāds, on fuusioitu DNA: ta sitovia domeeneja (DBDS) eri transkriptiotekijöitä alaluokka sarkoomat ja muiden syöpien [5], joka johtaa hyperactivation vastaavien transkriptionaalisen aktiivisuuden. Kehittyvät näyttöä siitä, että natiivi, täyspitkät FET proteiinit sitoutuvat ja aktivoi toimintoja tiettyjen transkriptiotekijöiden osittain rekrytoimalla kofaktoreita, kuten CBP /p300 [4] – [5].

Tulokset

AR ja FUS löytyy saman proteiinin monimutkainen

LNCaP ihmisen eturauhassyövän solulinja [7] esitetään yhteenveto tärkeimmistä ominaisuuksista eturauhassyövän, mukaan lukien ekspressio sekä prostataspesifisen antigeenin (PSA) ja AR sekä koska herkkyys androgen. Meidän aloitusnäyttö, käytimme ydin- lysaatit LNCaP hoidettiin synteettisen androgeenin R1881 (10 nM) 3 tuntia. Lysaatit immunosaostettiin anti-AR-vasta-aine ja näytteet altistettiin moniulotteinen proteiinin tunnistaminen tekniikka (vääntelehtien mutakuopassa) [8]. Massaspektrometrinen analyysi tunnistaa FUS, joka kuuluu FET perheen proteiinien kanssa vuorovaikutuksessa AR (kuva 1 A, kuvio S1, kuvio S2 ja taulukko 1). Samanaikainen immunosaostus (co-IP) kokeissa seurasi Western blot analyysi validoitu vuorovaikutus AR ja FUS (kuvio 1 B). AR co-immu- (co-IP) kanssa FUS, kun taas immunosaostus isotyyppis- IgG-ohjaus ei vedä alas AR tai FUS. Käänteinen yhteistyössä IP anti-AR seurasi Western blot -analyysillä anti-FUS-vasta osoitti myös, että AR vuorovaikutuksessa FUS (kuvio 1 C). Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien hoito R1881 kohonneelta AR proteiinin.

In vivo

yhdistys FUS AR vahvistettiin käyttäen otteet LNCaP ksenografteista jotka kasvatettiin hiirillä ennen tai jälkeen kastraation (kuvio 1 D). Yhdessä nämä tiedot tukevat että AR ja FUS osakkuusyritys samassa monimutkainen eturauhasen syöpäsoluja.

(A) tunnistaminen FUS kuin AR-vuorovaikutuksessa proteiinin yhteistyössä immunopreciptation (Co-IP) ja sen jälkeen massaspektrometrialla ( NEITI). MS /MS-spektrit m /z 1660,77 (alkaen 831,39, 2+) on FUS ja kaksi muuta esitetty oheismateriaali olivat yksiselitteisesti osoitettu tunnistetun sekvenssin LKGEATVSFDDPPSAK, APKPDGPGGGPGGSHMGGNYGDDR, ja TGQPMINLYTDR, vastaavasti. (B) validointi AR-FUS vuorovaikutus käyttäen Co-IP seurasi western blot-analyysi. LNCaP-soluille indusoitiin 10 nM R1881 6 tuntia ja koko lysaatit käytettiin IP anti-FUS-vasta sen jälkeen anti-AR western blot (WB) analyysi. (C) Reverse IP anti-AR seurasi WB anti-FUS vasta-aine. (D) IP endogeenisen komplekseja AR ja FUS ihonalaisesta LNCaP ksenografteja. Kasvaimet kerättiin ehjä hiiristä (I), 10 päivän kuluttua kastraation (C10) tai 30 päivän kuluttua kastraation (C30). Lysaatit nämä kasvaimet olivat erikseen käytössä IP anti-AR-vasta sen jälkeen WB kanssa osoitti vasta-aineilla.

solunosasijaintia FUS eturauhassyöpäsoluissa

FET proteiinit voivat lokalisoitu divergentisti tumassa ja /tai solulimassa [5], [9]. Immunofluoresenssimikroskopia käyttäen vasta-aineita suunnattu vastaan ​​endogeenisiä proteiineja suoritettiin LNCaP. FUS oli yksinomaan tumassa (kuvio 2A). FUS näytti lokalisoitu erillisiä pilkkuja tumassa (kuvio 2A, B). Heterogeenisyys sub-ydin- jakelun FUS solupopulaation joukossa havaittiin (kuvio 2A, B). Dual värjäys osoitti kolokalisaation AR FUS (kuvio 2B) LNCaP-soluissa, joita oli käsitelty 10 nM R1881: ssa 3 tuntia. Pearsonin kerroin lähestyi 0,8 joissakin soluissa tietyillä alueilla ytimeksi.

(A) Nuclear paikallistaminen FUS LNCaP-soluissa. Soluja käsiteltiin R1881 (10 nM), 3 tuntia. Confocal immunof- suoritettiin käyttäen anti-FUS-vasta-aine (vihreä) ja solut vastavärjättiin DAPI (sininen). (B) rinnakkaispaikantumisen AR ja FUS. Dual värjäys osoittaa kolokalisaation AR (punainen) kanssa FUS (vihreä) LNCaP-soluissa käsitellään 10 nM R1881: ssa 3 tuntia. Insertti oikeassa paneelissa edustaa solu nimetyn kanssa (*) jälkeen kynnys gating poistaa valoisa vihreä paikalla.

FUS on luontainen transaktivaatiota aktiivisuus eturauhasen syöpäsolujen

tāds FET proteiinit voivat antaa vankan transkription transaktivaatiota joissakin kasvaimissa [4] – [5], mutta tätä ei ole tutkittu eturauhassyövän soluissa. Täällä, käytimme GAL4 transaktivointimääritys tutkia jos transaktivaatio aktiivisuus voisi johtua FUS eturauhasen syöpäsoluja. Kimeeriset konstruktit kätkeminen täyspitkän FUS (tai fragmenttien siinä) fuusioitu Gal4-DBD käytettiin tässä määrityksessä (kuvio 3A). PC3 eturauhasen syöpäsoluja, puuttuu funktionaalinen AR, olivat kotransfektoitiin kunkin Gal4 fuusiorakenteita, ja reportterigeeni, joka sisältää minimaalisen Gal4-sitoutumiskohtia (p5 × Gal4UAS-TATA-lusiferaasi). GAL4-DBD yksin käytettiin negatiivisena kontrollina, ja se oli vain vähäinen aktiivisuus (kuvio 3B). Sen sijaan, Gal4-FUS indusoi lusiferaasin aktiivisuutta merkittävästi (kuvio 3B), joka oli yhdenmukainen sen kanssa, jonka sisäinen transaktivaation aktiivisuutta. Alkaa hahmotella mikä domain (t) tili tälle luontaisen transaktivaation kapasiteetti, käytimme kaksi konstruktioita. Ensimmäinen konstrukti oli NTD transaktivaatiodomeenin (FUS-N), ja toinen sisältää karboksyylipään RRM ja RGGs (FUS-C) (kuvio 3A). Molemmat fragmentit näytetään toimintaan, joka oli verrattavissa täysipituisen FUS (kuvio 3B). Arvioida hakijan yhteydessä riippuvuutta Näiden toimien, käytimme eri toimittaja, joka sisältää minimaalisen GAL4 sitoutumiskohdat ja TATA-elementti, jotka rinnakkain osaksi E1a promoottori. Vastaavia, vaikkakin yleensä korkeampi, transaktivaa- kapasiteetin havaittiin yhteydessä tämän promoottorin kuin minimaalinen promoottori (kuvio 3C). Vahva transaktivaation kapasiteetti GAL4-FUS fuusioiden osoitettiin myös LNCaP-soluissa (kuvio 3D).

(A) Kimeeriset konstruktit täyspitkän FUS, N- tai C-fragmentteja FUS fuusioitu Gal4-DBD . TAD = transaktivaatiodomeenin; RRM = RNA tunnustamista motiivi; RGG = toistot tripeptidin, joka sisältää arginiinia ja kaksi glycines. (B) transaktivointi aktiivisuus FUS PC3-eturauhassyöpäsoluissa. PC-3-solujen 6-kuoppaisilla levyillä kotransfektoitiin kanssa 50-100 ng Gal4-kimeeran, ja 1 ug reportterigeenin pFR-LUC, joka sisältää GAL4: n sitoutumiskohdat ja TATA-elementin. GAL4 DBD yksin toimi negatiivisena kontrollina. 2 ug pGL2 tyhjää plasmidia lisättiin kaikkiin DNA sekoituksia. (C) Kuten (B), mutta reportteri plasmidi sisälsi Gal4-sitoutumiskohtiin ja TATA-elementti rinnakkain osaksi E1a promoottori. (D) Kuten (B), mutta LNCaP sijasta PC-3-soluja. Sarakkeet = keskiarvo ± keskihajonta. * P 0,05, n = 3.

FUS edistää AR transkriptioaktiviteettia eturauhassyöpäsoluissa

Kun osoitti transaktivaatiota kapasiteetti FUS joka oli riippumaton promoottorin eturauhassyöpäsoluissa kuten edellä on kuvattu, seuraavan kerran arvioitiin osallistumista FUS erityisesti AR transkription aktiivisuus kohde- geenien. Kaksi eri siRNA kohdistaminen riippumaton alueilla sukulais-mRNA käytettiin tyhjentää tasot FUS. AR-aktiivisuus mitattiin kotransfektoitiin LNCaP-soluissa käyttäen PSA (6,1 kb) -luciferase reportterigeenirakenteen. Tämä toimittaja sisältää PSA ja -vahvenne alueiden kätkeminen useita ARE jotka antavat induktion androgeenien [10] – [11] AR-riippuvaisella tavalla [12] – [13]. Suhteessa kontrolliin, R1881 induktio lusiferaasiaktiivisuus merkittävästi vähentynyt, kun ehtyminen FUS heikentämättä tasoja AR (kuvio 4A). Vahvistavan näiden havaintojen kanssa yli-ilmentyminen lähestymistapa, me kotransfektoitiin AR Ekspressiovektorissa ARR3-tk-LUC reportteriplasmidilla, ja eri määriä plasmidi mahdollistaa His-merkitty FUS ilmentymisen HEK293-soluihin. ARR3-tk-LUC toimittaja sisältää kuusi ARE ja on erittäin indusoitavissa androgeenien. Yliekspressio FUS lisääntynyt AR transkriptionaalista aktiivisuutta mitataan lusiferaasin aktiviteetin ARR3-tk-LUC annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B, ylemmän ja keskimmäisen paneelit). His-FUS ei merkittävästi muuttanut transkription aktiivisuus PRL-tk-LUC, joka pelkästään sisältää tymidiinikinaasi (tk) pohjapinta promoottori (kuvio 4B, alempi paneeli).

(A) ehtyminen FUS korrelaatit on alentunut AR aktiivisuutta. Tasot FUS määrä väheni LNCaP-soluissa käyttäen siRNA: iden kohdistaminen kaksi eri alueilla vastaavien mRNA: iden ja tämän jälkeen transfektoitiin 1 ug: lla plasmidi PSA (6,1) -luciferase. 2 ug p-LUC tyhjällä plasmidilla lisättiin kaikkiin siRNA /DNA sekoituksia. Määrät ovat kuoppaa kohti 6-kuoppalevylle. Soluja käsiteltiin 10 nM R1881: n 24 tunnin ajan. Western blot-analyysi vastaavan näytteistä tasoilla FUS, AR, ja Actin. (B) ektooppinen ilmentyminen FUS parantaa AR aktiivisuutta. 293FT solujen 48 kuoppalevyllä transfektoitiin 15 ng AR-ekspressioplasmidin, 620 ng ARR3-tk-lusiferaasireportteriplasmidin, 62 ng Renilla lusiferaasiplasmidin ja osoitti määriä His-FUS ekspressioplasmidin. Lusiferaasiaktiivisuudet normalisoitiin tarkoin Renilla lusiferaasin joka sisältää minimaalisen TK-promoottori. Arvot kullakin musta palkki edustaa kansi-induktio R1881 normalisoinnin jälkeen (ylempi paneeli). Western blot-analyysi vastaavan näytteistä tasoilla FUS, AR, ja ACTIN (keskimmäinen paneeli). UT: transfektoimattomiin soluihin. Renilla lusiferaasiaktiivisuus samasta näytteistä normalisoitu kokonaisproteiinin toimi spesifisyyskontrol- (alempi kuva). Sarakkeet = keskiarvo ± keskihajonta. * P 0,05, n = 3.

Sen määrittämiseksi, FUS lisää endogeenisten geenien ekspression, proteiinin tasoja ja mRNA: n tunnettuja androgeenin geenien oli seuraava mitattiin.

PSA

mRNA: han ja mRNA: n viiden muun androgen indusoitavissa geenit olivat vähentyneet huomattavasti, kun väheneminen FUS (kuvio 5A).

TMPRSS2

mRNA väheni vain yksi siRNA: t, ja androgeenin-tukahdutettu geeni,

CAMK2N1

ei vaikuttanut tahansa siRNA: iden (tuloksia ei ole esitetty). Yhdenmukainen alhaisempia mRNA, tasot PSA-proteiinin vähensi merkittävästi LNCaP kun ehtyminen FUS (kuvio 5B). Sen määrittämiseksi, FUS rekrytoitiin DNA AR vastauksena androgen, kromatiinin immunosaostus (chip) analyysi suoritettiin. Immunosaostus rajat liittyvät proteiini-DNA-kompleksit käyttämällä vasta-ainetta FUS seurasi monistuksella ARE III

PSA

geeni ilmeni, että FUS rekrytoitiin tähän ARE (kuvio 5C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että FUS parantaa AR aktiivisuus, ainakin jossakin kohdegeenien, sopusoinnussa voimakas luontainen transaktivaatiofunktiota johtuvan FUS (Fig. 3).

(A) mRNA-tasot androgen säädeltyjen geenien. siRNA välittämä ehtyminen FUS vähenee sukulais-mRNA PSA ja useiden muiden AR-kohdegeenien. qRT-PCR: ää käytettiin mittaamaan mRNA-tasoja. Arvot edustavat suhde GAPDH-normalisoitu signaaleja, jotka ovat peräisin valetransfektoiduista LNCaP-soluissa. Soluja käsiteltiin 24 tuntia seuraavien siRNA transfektion. (B) PSA-proteiinin tasot. LNCaP-soluja käsiteltiin 8 tunnin ajan 10 nM R1881: n tai ajoneuvon seuraavan siRNA transfektion ja Western-blottaus suoritettiin mitata PSA-tasot. (C) FUS rekrytoimista tehostajana ARE III

PSA

geeni. LNCaP-soluja käsiteltiin 10 nM R1881: n 6 tunnin ajan. ChIP myöhemmin sovellettu ja kohde-DNA monistettiin qPCR. Arvot edustavat suhde signaalien anti-FUS sirun että IgG isotyyppiä ohjaus. Sarakkeet = keskiarvo ± keskihajonta. * P 0,05, n = 3.

kuluminen FUS vähentää niiden proliferaatiota LNCaP-solujen

AR on välttämätön kasvulle LNCaP-solujen [14]. Arvioida, laski AR aktiivisuutta kun ehtyminen FUS johtaisi vähentynyt proliferaatio, suoritimme solusyklin analyysi käyttäen virtaussytometria. Kuten odotettua, R1881 (0,1 nM) lisäsi populaatio soluja S-vaiheessa (tuloksia ei ole esitetty), joka väheni -30%, kun väheneminen FUS (kuvio 6A). Huomionarvoista, tiedot on saatu lyhytaikaista transfektiota siRNA johtaa suhteellisen tehoton ehtymiseen FUS (kuvio 6B). Nämä tiedot syyttää pro-kasvun funktiona FUS on androgeeniriippuvaisen leviämisen, joka on sopusoinnussa lisääntynyt AR transkriptionaalista aktiivisuutta.

(A) virtaussytometrinen kvantifiointia S-vaiheessa olevien solujen. siRNA-transfektoiduissa LNCaP-soluja käsiteltiin 0,1 nM R1881: ssa 48 tuntia. Solut leimattiin BrdU, värjättiin FITC-konjugoidulla anti-BrdU-vasta-ainetta ja DAPI ja alistettiin virtaussytometria. Käyrä oikealla edustaa kvantifiointiin S-vaiheessa olevien solujen suhteena vastaaviin kontrolleihin. * P 0,05, n = 3 (B) tasot FUS proteiinin käsitellyissä soluissa FUS siRNA. Western blot-analyysi tasojen FUS ja latauskontrollina aktiini vastaten näytteitä, joiden solusyklin profiili on piirretty (A).

Hormonien reagointikykyä FUS ilmaisun

Expression of joissakin AR co-aktivaattorit kuten steroidireseptoriperheen co-aktivaattorien (alakohtaisille kierrätysyhtiöille) moduloidaan androgeenien ja /tai AR [15] – [17] osana, mikä näyttää olevan verkoston rehu-eteenpäin ja palautemekanismit. FUS ilme, mRNA (kuvio 7A, yläpaneeli) ja proteiinin tasot (kuvio 7A, keskimmäinen paneeli), tukahdutettiin

in vitro

LNCaP-soluissa 48 tunnin käsittelyn jälkeen 10 nM R1881. Hoito LNCaP 0,1 nM R1881 varten vastaavan ajan (48 tuntia), oli kuitenkin vähäinen vaikutus ilmaus FUS ilmaisun (kuvio 7A, alempi paneeli). Immunohistokemiaa käytettiin arvioimaan FUS geeniekspression LNCaP ksenografteissa. Kasvaimen näytteet valmistettiin ehjä (kuohitsemattomat) ja kuohittu hiiret (10 päivää kastraation jälkeen). Yhdenmukainen

in vitro

data 10 nM R1881, kastraatio lisännyt ilmentymisen FUS (kuvio 7B).

(A) FUS mRNA-tasot vasteena androgeenien hoitoon. Ylempi paneeli: FUS ilmentyminen mitattiin qRT-PCR LNCaP käsitellään 10 nM R1881 varten ilmoitettuina ajankohtina. Middle paneeli: western blot-analyysi tasojen FUS, PSA ja Actin proteiineja osoitetuissa aikapisteissä. Alempi paneeli: western blot-analyysi tasoja FUS proteiinin LNCaP-soluissa, joita oli käsitelty 10 nM verrattuna 0,1 nM 48 tuntia. Virhepalkit = keskiarvo ± keskihajonta. * P 0,05, n = 3 (B) FUS tasoa vastauksena hormonaalista tila

in vivo

. LNCaP ksenografteissa korjattu ehjä (kuohitsemattomat) ja kuohittu hiiret (10 päivää kastraation jälkeen) värjättiin FUS ja AR proteiineja. (C) FUS tasot kliinisissä eturauhassyöpä versus vastaava hyvänlaatuinen kudosta. Tasot FUS mRNA kliinisissä näytteissä eturauhasen syöpä ja normaalissa eturauhasen kudosta analysoitiin uudelleen aiemmin saatuja aineistoja käyttäen Oncomine. Mustat palkit osoittavat tutkimuksissa, joissa FUS oli merkittävästi yli-ilmentynyt syövän versus hyvänlaatuinen kudosta. * P 0,05.

käyttänyt nopeaa ilmaisua yleensä korkeampi eturauhasen syöpä vs. hyvänlaatuisen kudoksen

Voit selvittää ilmaus FUS muuttuu syövän suhteessa hyvänlaatuinen eturauhasen kudosta, Oncomine tietokanta analyysi suoritettiin käyttäen seitsemää erilaista kliinistä ikäryhmät. Expression of FUS kohosi eturauhassyöpä verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen tietojen avulla kolmesta tutkimuksesta (kuvio 7C). Kuitenkin neljässä lisätutkimusten vastaavan kokoinen, ei ollut merkitsevää eroa tasojen FUS mRNA eturauhassyöpä verrattuna tasot eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksen.

Keskustelu

AR on tärkeää kaikissa vaiheissa eturauhassyövän etenemisen mukaan lukien päätteen CRPC vaiheessa. Taustalla rooli AR on dynaaminen vuorovaikutus erilaisten yhteistyössä aktivaattorit ja co-repressoreihin. Laajuus patofysiologisesti asiaan proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen, johon AR eturauhassyöpäsoluissa ei kuitenkaan ole täysin tunnettuja. Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että FUS vuorovaikutuksessa AR endogeenisesti eturauhassyövän soluissa ja edelleen paljasti seuraavat: (1) FUS oli luontainen transaktivaatiota kapasiteettia eturauhassyövän soluissa; (2) FUS parannettu AR-välitteistä transkriptiota; (3) ehtymisen FUS vähentää ekspressiotasot androgeenin indusoima geenien; (4) FUS rekrytoitiin ARE vastauksena androgeenireseptorin; (5) vähentäminen tasojen FUS rajoitetun androgeenin indusoima leviämisen; (6) tasot FUS muutettiin androgeenien tila

in vitro

ja

in vivo

; ja (7) tasot FUS olivat koholla kliinisissä näytteissä eturauhassyöpä.

DNA-sitovia domeeneja (DBD) steroidireseptorit näyttää korkea sekvenssihomologia (esim AR DBD on 77% ja 57% sekvenssin samankaltaisuus niihin glukokortikoidireseptorin ja estrogeenireseptori, vastaavasti), ja voivat olla vuorovaikutuksessa monia samoja koaktivaattoreiden. Käyttämällä yhdistelmä-proteiinit, FUS on osoitettu vuorovaikutuksessa DBDS on retinoidi-X-, estrogeeni, kilpirauhasen, ja glukokortikoidireseptoreihin, mutta AR ei tutkittu [18]. Sitoutuminen FUS on DBDS muiden hormonin reseptorien eivät häiritse DNA: ta sitovien toimintaa, vaikka rooli FUS niiden transkription toimintaa ei arvioitu [18].

Tässä osoitamme, että FUS satamat vahva transaktivointidomainien jotka olivat toiminnallisia eturauhassyöpäsoluissa. C-pään alue, joka sisältää nopean toiminnan ja RGG motiiveja EWS voi estää transaktivaation kapasiteetti NTD kanin munuaisesta peräisin RK-13-soluissa [19]. Sen sijaan, tässä ehkäisevästä funktio C-pään alueen havaittiin verrattaessa täyspitkä FUS on FUS 1-273 fragmentti, josta puuttuu C-terminaalinen RRM ja RGG motiiveja. Lisäksi FUS 274-526, joka sisältää nopean toiminnan ja RGG motiiveja, mutta ei TAD, näkyy vahva transaktivaatiota kapasiteetti. Samanlaisia ​​rakenteen ja toiminnan suhteen tietoihin liittyy FUS raportoitiin aiemmin käyttämällä ihmisen sikiön munuaisen 293-soluja [20]. Näin ollen on olemassa toiminnallisia transaktivointidomainien in FUS muissa kuin löytyy sen NTD ainakin eturauhassyövän ja 293-soluja. Eroavaisuudet kirjallisuudessa välillä FUS ja EWS transaktivointidomainien voi olla soluspesifisiä tai heijastavat domain poikkeaminen (45% identiteetti, 64% samanlaisuus) [5] välillä EWS (a 699 aa pitkä proteiini) ja FUS (526 aa pitkä proteiinia).

Expression erilaisia ​​co-säätelijöitä AR reagoi androgeenien kenties osana palautemekanismit [15] – [17]. Expression of FUS reagoi hormoni tila eturauhassyöpäsoluissa. Fysiologisessa androgeenivaikutuksen, FUS ilmentyminen oli kuitenkin merkittävästi vähentää LNCaP-soluissa käsitelty 48-96 tuntia 10 nM mibolerone [21] kuten myös kuvassa 10 nM R1881 (Fig. 7A). Kuitenkin alhaisempi pitoisuus androgeenireseptorin, 0,1 nM R1881, ei merkittävästi muuttanut tasoa FUS

in vitro

, ja

in vivo

kastraatiotasojen androgeenivaikutuksen liittyivät kohonneeseen FUS. Tämä ilmaus profiili muistuttaa aiemmin tunnettu AR yhteistyössä aktivaattoreita, joita vaatimattomasti tukahdutettu androgeenien [15] – [16]. Mielenkiintoista, tukahduttaminen kyseisistä yhteistyössä aktivaattorit by androgeeneinä on hitaampi kinetiikka, joka muistuttaa androgeenireseptorin reagoivan ilmentymä FUS. Analyysi tasot FUS mRNA eri eturauhas- ja ei-eturauhassyöpäsolulinjoissa ei paljastanut systemaattisia eroja (kuvio S3). Tämän mukaisesti Oncomine data mining mikrosirujen kliinisistä näytteistä erilaisten kiinteiden kasvainten tyypit eivät osoittaneet merkittäviä ylös tai alas-asetusta FUS tasot eturauhaskasvaimissa suhteessa muissa elimissä (Kuva S4). Sitä vastoin vertailussa mRNA tietojen hyvänlaatuinen verrattuna adenokarsinooma eturauhaskudoksiin paljasti säätelyn FUS kolmessa riippumattomien tutkimusten ja mitään merkittävää eroa neljä muuta. Ei tutkimus osoitti merkittävää laskua ilmaus FUS eturauhasessa adenokarsinooma verrattuna hyvänlaatuisen kudoksen.

AR transkriptionaalista aktiivisuutta tarvitaan ylläpitoa ja kasvua eturauhasen joka muodostaa perusteet androgeeniablaatio hoitomuotoja eturauhasen syöpä. Yhdenmukainen FUS ollessa koaktivaattorikompleksien AR ja sen ehtyminen vähentää AR transkriptionaalisen aktiivisuuden ja androgeeniriippuvaisissa kasvu kuten kuvassa, joukossa näkyvä fenotyyppejä FUS – /- hiirillä on hedesteriliteetti, ja pienempiä miehen sukupuolielimet kanssa näennäinen involuution joitakin näistä rakenteet [22]. Nämä fenotyypit muistuttavat AR – /- hiirissä, tai tarkempia verkkotunnus- ja solutyyppispesifiselle

AR

geenin häiriöitä [23] – [24]. Siten on mahdollista, että ehtyminen FUS pienenee AR transkriptioaktiviteettia näissä klassisen androgeeniriippuvaisissa kudosten kanssa tässä esitetyistä tiedoista. Nämä tiedot ovat ristiriidassa aiemman raportin, joka FUS yliekspressio LNCaP-soluissa, käyttäen tetrasykliini-indusoituva järjestelmä ja seuraava käsittely 10 nM mibolerone neljä päivää, johtaa syntyminen sub-G1 /apoptoottiset solut [21]. Kiinnostavaa, ei sub-G1 /apoptoottisia soluja havaittiin ilman androgeenin kanssa tai ilman FUS yliekspressio [21]. Siten näissä tutkimuksissa FUS yli-ilmentyminen johti androgen-indusoituva proapoptoottisten suojaavan vaikutuksen ilmentymisen solusyklin proteiineja [21].

Kaiken kun tarvitaan lisätutkimuksia ratkaisemiseksi roolia FUS eturauhasen syöpä taudin etenemiseen, tässä tutkimuksessa kävi ilmi, että: 1) FUS vuorovaikutuksessa AR; ja 2) FUS parantaa transkriptionaalista aktiivisuutta AR.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit, soluviljelmissä, ja transfektioiden

FUS ekspressioplasmideilla [20], p5 x Gal4UAS-TATA -luciferase [12], ja AR ekspressiovektori, ARO, [25] on kuvattu aiemmin. PFR-LUC saatiin Invitrogen, Carlsbad, CA, USA. AR toimittaja plasmidi, PSA (6,1 kb) -luciferase sisältää promoottori /tehostaja alueilla PSA-geenin ja saatiin tri J.-T. Hsieh (University of Southwestern Medical Center, Dallas, TX). ARR3-tk-LUC sisältää kolme kopiota androgen vastaus alueen rotan

probasiini

geenin fuusioituna pohjapinta tymidiinikinaasi (TK) promoottori [26].

LNCaP-solut, saatu Dr. Leland WK Chung (Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, CA, USA), kasvatettiin RPMI, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia (FBS) ja käytettiin passage 39-50. HEK293-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää. Ellei toisin mainita, soluja inkuboitiin seerumivapaassa, fenolipunattomalla media 24-48 tuntia ennen käsittelyä osoitetun pitoisuuksia R1881. Transfektio LNCaP-soluja suoritettiin käyttäen lipofektamiinia 2000 (Invitrogen) kokeissa, joissa siRNA: ita tai lipofektamiinin (Invitrogen) kaikille muille kohti valmistajan ohjeiden 0,2-0,4% ja 0,5% (v /v), vastaavasti. FUS (HSC.RNAI.N001170634.11.7, HSC.RNAI.N001170634.11.8) ja ohjaus siRNA (Invitrogen) käytettiin 10-50 nM pitoisuuksina. HEK293-solut transfektoitiin käyttäen lipofektamiini 2000 0,4% v /v. Tarkat määrät plasmideja per transfektio on esitetty Kuvatekstit.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Invitrogen). Kokonais-RNA (0,5 pg) oli käänteistranskriptoitu kautta oligo-dT-pohjustus käyttäen SuperScript III (Invitrogen). PCR suoritettiin käyttäen geenispesifisiä alukkeita, kun läsnä on SYBR Green Supermix (Invitrogen) käyttämällä ABI 7900 reaaliaikainen PCR-laite (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Termosyklisointireaktio-protokolla oli seuraava: 95 ° C 2 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 55 ° C 30 sekuntia. Ct (kynnyssyklin numero) arvot muutettiin tarkoittavan ilmaisun arvot suhteessa

GAPDH

tasojen mukaan Pfaffl menetelmällä. FUS alukkeita [5], ja kaikki muut alukkeita on aiemmin kuvattu [27] – [28].

Immunofluoresenssi

Solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 1% paraformaldehydillä PBS: ssä 30 minuutin ajan . Solut tehtiin läpäiseviksi 0,1% Trition X-100 PBS: ssä kahdesti 5 min. Blokkauksen jälkeen 30 minuuttia 2% BSA: ta PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Trition X-100, näytteitä inkuboitiin mainituilla vasta-aineilla (01:50) estopuskurissa 1 tunti. Solut pestiin blokkauspuskurilla 4 kertaa ja inkuboitiin sopivan sekundäärisen FITC tai rodamiini-konjugoidun IgG (1:100) estopuskurissa 45 minuutin ajan. Kun 4 pesua PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Trition X-100, DAPI sisältävä asennus lisättiin. Dioja visualisoitiin käyttäen Fluoview -konfokaalimikroskoopilla (Olympus, Markham, ON, Kanada).

samanaikainen immunosaostus ja Kromatiini immuunisaostustesti

LNCaP-soluja (2-3 x 10

6) maljattiin 15 cm ruokia RPMI, joka sisälsi 5% FBS. 24 tunnin kuluttua, media muutettiin serum- ja fenolipunaista RPMI ja soluja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin R1881 (10 nM) tai sen vehikkelin (etanoli) 6 tunnin ajan. Solut huuhdeltiin PBS: lla ennen sadonkorjuuta ja sitten hajotettiin 1 ml: aan lysis-puskuria (20 mM Tris-HCI, pH 7,8, 140 mM NaCl, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,5% Nonidet P-40) läsnä ollessa proteaasi-inhibiittorien (Roche, Mississauga, ON, Kanada). Lysaatit johdettiin 27-G neuloja viisi kertaa ja sittemmin esipuhdistettiin proteiini A /G-agaroosi-helmiä (5% v /v), ja seosta hiiren ja kaniinin IgG (2 ug /ml kutakin), 1 tunnin ajan. Saatu supernatantti inkuboitiin ilmoitetuilla spesifisten vasta-aineiden, mukaan lukien AR 441, AR C19, ja FUS (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) konsentraationa 1-2 ug /ml 16-24 tuntia. Proteiini A /G-agaroosi-helmiä (5% v /v) lisättiin myöhemmin, ja seosta inkuboitiin vielä 3 tuntia. Helmet pestiin 1 ml: lla lyysipuskuria viisi kertaa, ja sitten suspendoitiin uudelleen 40-80 ui standardi SDS-näytepuskuria.

Kromatiini immunosaostus määritys suoritettiin, kuten on kuvattu [27]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin R1881 (10 nM) tai vehikkeliä 6 tuntia ja myöhemmin kiinnitetty formaldehydillä, rajat linkin chromatin. Sen jälkeen sonication leikkausvoimien kromatiinin /DNA, lysaatit valmistettiin ja immunosaostettiin mainituilla vasta-aineilla. Kohde-DNA mitattiin reaaliaikainen PCR käyttäen ABI 7900 reaaliaikainen PCR-kone (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Normalisoitiin vastaan ​​signaalin kunkin IgG-ohjaus.

Western blot -analyysit

Näytteet ladattiin 10% Tris /glysiini-pohjainen SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Bedford, MA, USA) standardimenetelmien mukaisesti käyttäen Tris /glysiini-pohjainen siirto puskurin Bio-Rad: n sukellusvene järjestelmän (Mississauga, ON, Kanada). Blotteja koetettiin seuraavilla vasta-aineilla: AR PG21 (1:1000) (Upstate Biotechnology, Waltham, MA, USA); AR 441 (1:500), tai FUS 4H1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology Inc.).

Proliferaatiomääritys

LNCaP-soluja (5 x 10

5) 10