Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Apoptoosi on keskeinen rooli patogeneesissä keuhkoahtaumataudin (COPD), ja tätä prosessia voidaan säädellä mitokondrioiden transkriptiotekijä A (mtTFA). Epigenetiikka on mukana sääntelyn ja muuttaminen osallistuvien geenien keuhkosyövän ja keuhkoahtaumataudin. Tässä tutkimuksessa määritimme ilmaus mtTFA ja sen metylaatiotasoilla COPD potilailla, joilla on keuhkosyöpä.

Methods

Kaksikymmentäyksi okasolusyöpä keuhkosyöpäpotilaita, 11 COPD ja 10 ilman COPD, jolle suoritetaan pneumonectomy otettiin. Apoptoottiset indeksi (AI) keuhkojen verisuonten endoteelisolujen analysoitiin välittämällä deoksiuridiinista trifosfaatti-biotiini nick end merkintöjä määrityksessä. Ilmentyminen mtTFA mRNA ja proteiini mitattiin käyttäen PCR, immunohistokemia ja Western-blot. Metylointi

mtTFA

promoottori havaittiin käyttäen bisulfiitin sekvensointia PCR.

Tulokset

Verrattuna ei-COPD ryhmä, AI oli suurempi, ja ilmaus mtTFA mRNA ja proteiini oli pienempi COPD ryhmässä (

P

0,001). Ilmentäminen mtTFA proteiinin korreloi positiivisesti FEV

1 /Pre (

r

= 0,892,

P

0,001), ja korreloi negatiivisesti AI (

r

= -0,749,

P

0,001) ja savu-indeksi (

r

= -0,763,

P

0,001). Prosenttiosuus

mtTFA

promoottori metylaatio COPD potilailla oli merkitsevästi suurempi kuin ei-COPD potilailla (

P

0,05).

Johtopäätös

Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus mtTFA mRNA ja proteiini on säädellä vähentävästi keuhkokudosanalyysin keuhkoahtaumatautipotilaiden potilaalla on okasolusyöpä keuhkosyöpä, ja taso mtTFA proteiinin liittyy apoptoosin keuhkojen verisuonten endoteelisolujen. Poikkeava

mtTFA

metylaatio voi myös olla tärkeä rooli COPD: n patogeneesissä.

Citation: Peng H, Yang M, Chen Z-y, Chen P, Guan C-x, Xiang X-d, et al. (2013) Expression ja metylointi mitokondrio transkriptiotekijä A keuhkoahtaumataudin hoitoon Potilaita, joilla on keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (12): e82739. doi: 10,1371 /journal.pone.0082739

Editor: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, France

vastaanotettu: 28 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 28 lokakuu 2013; Julkaistu: 18 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30800503, nro 30770931 ja nro 81070039) ja National Natural Science Foundation of Hunan (nro 09JJ3036). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

krooninen keuhkoahtaumatauti (COPD) on yksi yleisimmistä kroonisista sairauksista. Maailmanlaajuinen esiintyvyys aikuisilla yli 40-vuotiaita on arviolta 10% [1]. Monet mekanismit, kuten krooninen tulehdus, proteinaasi /anti-proteinaasi epätasapaino, ja oksidatiivisen stressin mukana COPD: n patogeneesissä [2], ja ne ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa aikana taudin kehitystä. Viimeaikaiset tiedot sekä eläinmalleissa ja ihmisillä tehdyt tutkimukset [3] – [6] viittaa tärkeä rooli endoteelin apoptoosin patologisia keuhkoahtaumataudin.

Mitokondrioiden transkriptiotekijä A (mtTFA, TFAM) on ydin-koodattu proteiini, joka sitoo ylävirtaan valon säikeen promoottori (LSP) ja raskas lohkon promoottori (HSP) mitokondrion DNA (mtDNA). mtTFA edistää transkriptio mtDNA ja säätelee mtDNA replikointi [7]. Häiriöt

mtTFA

geeni hiirissä johtaa ehtyminen mtDNA, mitokondrion selostukset, heikentyvän ketjun hengityksen, apoptoosia, ja vähentäminen mtDNA-koodattuja polypeptidejä [8], [9]. Toisaalta, yliekspressio mtTFA voi parantaa väheneminen mtDNA kopioluvun ja apoptoosin siirtogeenisissä (Tg) hiirillä [10]. Remels ym [11] totesi, että määrä mtTFA proteiinia oli merkitsevästi pienempi quadriceps lihasten potilaiden, joilla on kohtalainen-to-hyvin vaikea keuhkoahtaumatauti kuin kontrolleilla. He myös kertoivat, että määrä mtTFA mRNA ja proteiini oli merkitsevästi pienempi potilailla, joilla kakektisissa COPD verrattuna sekä ei-kakektisia potilaita ja verrokkien [11]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että häiriöt mtTFA liittyy luustolihasten poikkeavuuksia potilailla, joilla on COPD. Kuitenkin ilmaus mtTFA keuhkoissa COPD potilasta ei ole tutkittu ja taustalla mekanismeja ei ole selvitetty.

Epigenetiikka viittaa periytyviä muutoksia geenien funktio, joka tapahtua muutoksia kromatiinirakenteeseen ilman muutoksia DNA-sekvenssi. Yksi tärkeimmistä epigeneettiset mekanismit on DNA: n metylaatio, joka tukahduttaa geenin transkriptiota, ja muuttaa ydinhistonien alentuneiden DNA kromosomissa. DNA: n metylaatio voi johtaa joko aktivaation tai repression geenien [12]. Ajan tasalla, useimmat tämän alan tutkimuksen keskittyy syövän, solujen kehitystä ja erilaistumista. On kuitenkin yhä enemmän näyttöä siitä, että epigenetiikka voi myös olla tärkeä rooli sääntelyn liittyvien geenien astman ja keuhkoahtaumataudin [13]. Demeo et al havaitsivat, että vaihteleva DNA: n metylaatio liittyy COPD ja keuhkojen toimintaa [14]. He totesivat myös, että

Alu

ja LINE-1 hypometylaatio liittyy keuhkojen alaosaan toiminta ja /tai nopeaan keuhkotoiminnan heikkeneminen iäkkäillä potilailla [15]. Siksi epigeneettiset etiologia olevan uusi kohde astman ja keuhkoahtaumataudin [16].

Tupakansavu on keskeinen riskitekijä keuhkoahtaumatauti. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että tupakointi voi muuttaa DNA: n metylaatio. Yksi edellinen raportti osoitti, että oli ainakin yksi poikkeava geeni metylaation 32 prosenttia keuhkoputkien harja näytteen henkilöiltä, ​​joiden tupakoinnin historia [17]. Kikuchi et al [18] todettiin myös TSLC1 /IGSF4 metylaatio korreloi tupakoinnin indeksi. Tupakointi ja aikaväli raittiina liittyy ero DNA: n metylaatio poikki ihmisen genomin [19]. Sekvenssianalyysi paljasti, että on olemassa 67 mahdollisia CpG metylaatio loci välillä -2246 bp ja +132 bp ihmisen

mtTFA

promoottori, mikä viittaa siihen, että sytosiini metylaatio saattaa olla rooli säätelyssä mtTFA ilmaisua. Choi et al [20] löytynyt lusiferaasiaktiivisuus pGL2-hTfam väliaikaisesti transfektoiduissa HepG2-soluissa vaimennetaan site-specific metylaation. Tämä

in vitro

tutkimus osoitti, että metylaatio ydin- hengitysteiden tekijän 1 (NRF-1) sitova alue vahvasti inhiboi

mtTFA

promoottorin väliaikaisesti transfektoiduissa HepG2-soluissa.

Tässä tutkimuksessa testasimme hypoteesin, että muutokset ilmentyminen mtTFA ja poikkeavien

mtTFA

metylaatio voisi olla tärkeä rooli COPD: n patogeneesissä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethic lausunto

tutkimus hyväksyi institutionaalisten eettinen komitea toisen Xiangya sairaala Keski-Etelä-yliopisto ja kirjallinen suostumus saatiin kaikki aiheet ennen niiden tutkimukseen osallistumiseen.

potilaat ja heidän yleistietoa

tutkimus koostui 11 okasolusyöpä keuhkosyöpäpotilaita (vaihe II) COPD ja 10 okasolusyöpä keuhkosyöpäpotilaita (vaihe II) ilman COPD jolle tehtiin pneumonectomy. Keuhkokudoksen 5 cm: n etäisyydelle kasvain marginaalia käytettiin meidän tutkimuksissa. Kaikkien COPD potilaat kärsivät kroonisesta ilmavirtauksen, määritellään bronkodilataation uloshengityksen sekunnin yli vitaalikapasiteetti (FEV

1 /FVC) on 70%, ilman vaihtoehtoisia syitä. Kaikki potilaat eivät olleet saaneet keuhkosiirrännäisen, sädehoito, kemoterapia tai hengitettynä kortikosteroidiannoksen. Koehenkilöiden ei ollut muita confoundable sairaudet, kuten ruoansulatuskanavan, munuaisten, hormonaaliset, aineenvaihdunnan ja tulehdussairaudet. FEV

1 ja FVC arvioitiin virrasta tilavuudeltaan käyrä saadaan käyttämällä spirometrin (Sensormedics Autobox-6200D, USA). Keuhkojen toiminta parametrit ilmaistiin prosenttiosuutena vertailuarvoista. Yleinen potilaan ominaisuudet esitetään taulukossa 1. Ei ollut eroja iän tai sukupuolen näiden kahden ryhmän välillä (

P

0,05). Verrattuna ei-COPD ryhmä, tupakointi indeksi COPD ryhmässä oli merkittävästi suurempi (

P

0,001), kun taas molemmat FEV

1 /Pre (%) (prosenttiosuus FEV

1 todellinen of FEV

1 lähdettävä) ja FEV

1 /FVC (%) oli pienempi COPD ryhmässä (

P

0,001).

Methods

histologiset tutkimukset.

Parafiini upotettujen leikkeiden ihmisen keuhkokudoksen poistettiin parafiini ja nesteytyksestä on ksyleenin ja etanolin. Leikkeet lyhyesti pesty, värjättiin Harris hematoksyliinillä ratkaisu 5 10 minuuttia, erilaistuvat 1% happoa alkoholia 30 sekuntia, ja sitten pestiin. Sitten leikkeitä vastavärjättiin in eosiini-magdalanpuna ratkaisu 30 sekuntia 1 minuutti, kuivattu 95% alkoholia ja 2 muutokset absoluuttista alkoholia 5 min, seulotut 2 muutoksia ksyleeniä 5 min, ja asennettu ksyleenillä perustuu kiinnitysväliaine . Histologia arvioitiin patologi sokkona. Koska keuhkolaajentuma on rakenteellinen häiriö ominaista tuhoaminen keuhkorakkuloiden seinämien ja laajentuminen alveolaarinen tilojen laajentuminen keuhkorakkuloiden tilojen arvioitiin määrällisesti keskimääräinen lineaarinen leikkauspiste (MLI) ja tuhoaminen keuhkorakkuloiden seinämien mittaamalla tuhoisa indeksi (DI). MLI, mitta välinen keuhkorakkuloiden seinäetäisyys, määritettiin valomikroskoopilla klo yhteensä suurennus 100 x. Kentät, jotka sisältyvät suuria hengitysteiden tai alukset poistettiin analyysistä. MLI määriteltiin kokonaispituus rajat linjan jaettuna määrä keuhkorakkuloiden seinämien leikkaavien testi linjat, kuten on kuvattu julkaisussa Xu et ai [21]. DI laskettiin mittana parenkymaalista tuhoaminen käyttäen mikroskooppisen piste-count tekniikka [22]. Analyysi suoritettiin kahtena satunnaisesti laskemalla yli 3000 keuhkorakkuloihin 50 HE osaa kustakin potilaasta suurennuksella 200 ×.

mittaus apoptoosin.

Terminal Deoxynucleotidyltransferase välittämää dUTP Nick End merkinnät (TUNEL) Pitoisuus käytettiin mittaamaan apoptoosin endoteelisolujen keuhkoissa COPD potilailla. Kryostaatti kudosleikkeet keuhkojen fiksoitiin 1% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. TUNEL värjäys suoritettiin

In situ

Cell Death Detection Kit-POD (Roche). TUNEL positiivisia ja negatiivisia solujen koko jakson laskettiin patologi sokkona, ja apoptoottisen indeksi laskettiin määrä Tunel-positiivisten endoteelisolujen /koko endoteelisolujen.

käänteistransskriptaasi-polymeraasiketjureaktio reaktio (RT-PCR).

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia yhden askeleen uuttomenetelmällä (Invitrogen, USA). RNA-pitoisuus määritettiin spektrofotometriä käyttämällä, ja laatu varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. RNA: ta (2 mg per näyte), tehtiin käänteistranskriptio tehdä täydentäviä DNA (cDNA) mukaisesti valmistajan ohjeiden (RT kit, Fermentas, USA). cDNA monistettiin PCR: llä käyttäen Platinum Taq DNA-polymeraasia (Invitrogen, Breda, Alankomaat) on lämpösyklilaitetta laite (Applied B PE4500, USA). Lämpökäsittelyyn olosuhteet suunniteltiin seuraavasti: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 35 sykliä 94 ° C 30 sekuntia ja 55 ° C: ssa 45 sekunnin ajan, ja laajennus vaihe 5 minuuttia 72 ° C: ssa. Alukeparit käytettiin PCR olivat seuraavat: 5′-TATCAAGATGCTTATAGGGC-3 ’ja 5′-ACTCCTCAGCACCATATTTT-3′ ja mtTFA (amplikonin odotettu koko: 441 bp); 5’-ACCCACACTGTGCCCATCTAC-3 ’ja 5′-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3’ varten β-aktiini (amplikoni odotettu koko: 103 emäsparia). Transcript taso konstitutiivisen taloudenhoito geeni β-aktiini kvantitatiivisesti mitattiin kontrollina RNA lastaus. Geenien ilmentyminen kvantitoitiin ja ilmaistaan ​​mielivaltaisina yksikköinä (AU).

Reaaliaikainen RT-PCR: llä (qRT-PCR).

eristetty RNA käänteistranskriptio cDNA: ksi RT-PCR: llä. cDNA monistettiin PCR: llä käyttäen Platinum Taq DNA-polymeraasia (Invitrogen, Breda, Alankomaat), Bio-Rad iCycler laite (Bio-Rad, USA). Lämpökäsittelyyn olosuhteet suunniteltiin seuraavasti: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 10 sekuntia ja 57 ° C: ssa 20 sekunnin ajan, ja laajennus vaihe 5 minuuttia 72 ° C: ssa. Alukeparit käytettiin PCR olivat seuraavat: 5′-GAACAACTACCCATATTTAAAGCTCA-3 ’ja 5′-GAATCAGGAAGTTCCCTCCA-3′ ja mtTFA; 5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3 ’ja 5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3’ ja β-aktiini. Odotettu amplikoni koot olivat 95 bp ja 97 bp. Spesifisyys vahvistus varmennettiin sulaa käyrä analysointi ja arviointi tehokkuuden PCR vahvistusta. Transkriptipitoisuuksissa konstitutiivisen taloudenhoito geenituotteen β-aktiini kvantitatiivisesti mitattiin valvontaa varten lastaus. Suhteelliset muutokset transkriptio runsaasti ilmaistiin ACk

T-arvot (ACk

T = ACk

T viittaus -ΔC

T kohde), jossa higherΔC

T-arvot ovat korkeammalla transkriptio runsaus.

Western blot-analyysi.

yhteensä 40 ug proteiinia kustakin näytteestä erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä, ja sähkön avulla polyvinylideenifluoridi kalvo. Membraani blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä, joka sisälsi 0,05% Tween (PBST) 1 tunnin ajan. PBST: llä, kaivoa inkuboitiin kanin monoklonaalista mtTFA vasta-ainetta (1:100; Abcam, USA) yön yli 4 ° C: ssa. Kalvo pestiin neljä kertaa ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (anti-kani, 1:10,000; Santa Cruz, CA) 1 tunnin ajan. Filmi kehitettiin tehostetulla kemiluminesenssidetektiolla järjestelmä (ECL, BestBio Pharmacia Biotech). Tasot konstitutiivisen taloudenhoito geenituotteen β-aktiini mitattiin myös kontrollina lastaus. Proteiini ilmentyminen kvantifioitiin ja ilmaistiin mielivaltaisina yksikköinä (AU).

immunohistokemia.

Parafiini upotettujen leikkeiden ihmisen keuhkokudoksen poistettiin parafiini ja nesteytyksestä on ksyleenin ja etanolin. Antigeeni haku suoritettiin käyttäen mikroaaltouuni menetelmää sitraattipuskurilla 20 minuuttia. Avidine ja biotiini lohko tehtiin, ja endogeeninen peroksidaasi pysäytettiin 3% vetyperoksidia. Kun oli salvattu 5% normaalia vuohen seerumia, kanin anti-humaani-mtTFA-vasta-aine (1:100) (Abcam, USA) käytettiin yön yli 4 ° C: ssa. Leikkeet pestiin PBS: llä, jossa oli 0,05% Tween ja inkuboitiin biotinyloidun vuohen antirabbit IgG (1:10,000; Santa Cruz, CA). Pesun jälkeen leikkeet värjättiin ABC Vectastatin reagenssien (Wuhan Boster Biotekniikka Corporation Ltd) ja DAB (Beijing Zhong Shan-Golden Bridge Biotekniikka Corporation). Sitten leikkeitä tekee patologi sokkona (lukumäärä mtTFA-positiivisten endoteelisolujen /100 endoteelisolujen per tapaus) mtTFA värjäytymistä kapillaareja, small /medium valtimoissa.

bisulfiittimodifiointi Sequencing PCR (BSP).

Genominen DNA eristettiin keuhkokudoksesta käyttäen DNeasy DNA eristäminen (Qiagen, Valencia, CA) ja sen jälkeen EcoRI: llä pilkkomalla. Bisulfiittimodifikaatio genomista DNA: ta suoritettiin käyttäen EZ DNA Metylointi-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA) seuraten valmistajan ohjeita. Lyhyesti, 1 ug puhdistettua DNA: ta (20 ui) inkuboitiin 130 ul: ssa CT Conversion reagenssia 98 ° C: ssa 10 minuuttia ja 64 ° C: ssa 2,5 tuntia, jolloin konversio metyloitumattomien sytosiinien urasiiliksi. Sen jälkeen, kun DNA: n puhdistus, bisulfiitti-modifioitua DNA: ta monistettiin käyttäen PCR: ää. Alukkeet suunniteltiin käyttäen online-ohjelma MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/): PCR-alukkeita, 5′-TATTAGAATTTGTTAAATTTTGGGGAAT-3 ’ja 5′-ACAAACAATCCTACATCCAAAACC-3’. PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 3 min 94 ° C: ssa; 35 sykliä 30 s 94 ° C: ssa, 30 s 56 ° C: ssa, ja 40 s 72 ° C: ssa; ja laajennus vaihe 5 min 7 ° C: ssa. PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä elektroforeesilla 1% agaroosigeeleillä (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen), talteen tai käyttämällä etanolisaostuksella, ja kloonataan sitten käyttäen ligaatiolla pCR 2.1-TOPO kloonausvektorit, jossa TA-kloonaus (Takara, USA) ja sen jälkeen käyttämällä kompetentteihin DH5a bakteerit (Human Key Laboratory of Medical Epigenomics, toinen Xiangya sairaala, Keski-Etelä-yliopisto). Plasmidi-DNA eristettiin vähintään viisi kloonia, kutakin PCR-reaktion tuote alistettiin DNA-sekvenssin analyysi Shanghai bioteknologian Company. Verrattuna alkuperäiseen genomisen mtTFA DNA-sekvenssin, metylaatio CpG määritettiin esiintyy konvertoitumaton sytosiinit CpG sivustoja bisulfiitti-modifioitua DNA: ta.

Tilastollinen analyysi.

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS versio 13.0. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SD. T testi verrattuna eroa ryhmien. Lineaarinen korrelaatio analyysi tehtiin käyttäen Pearsonin tuotteen hetki korrelaatioita. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, jos

P

0,05.

Tulokset

histologinen analyysi keuhkojen kudoksia

patologinen muutos keuhkokudoksessa.

oli huomattavia patologisia eroja ei-COPD ryhmä ja COPD ryhmä. Morfologia keuhkokudoksessa oli normaali ei-COPD ryhmä. Alveolaarinen rikkoutuminen olivat ehjiä ja oli vain vähän inflammatorisen solun infiltraatiota (kuvio 1A). Mutta COPD ryhmässä oli vakava tulehduksellinen tunkeutuminen sekä hengitysteiden ja keuhkorakkuloihin. Kuten kuviossa 1B on esitetty, cilium defluxion ja pikarisoluproliferaation havaittiin hengitysteissä, välin tuhoaminen ja alipaine- havaittiin keuhkorakkuloihin COPD potilailla. Verrattuna ei-COPD ryhmä, MLI ja DI olivat merkittävästi suuremmat COPD ryhmässä (MLI: 70 ± 23 um

vs.

43 ± 6 pm,

P

0,001; DI: 55 ± 4%

vs.

16 ± 3%,

P

0,001).

fotomikrograafeja keuhkokudosanalyysin ei-COPD ryhmä (paneeli A) ja COPD-ryhmän (paneeli B) (suurennus: 100 x). Keskimääräinen lineaarinen leikkauspiste (MLI) ja tuhoisa indeksi (DI) on COPD ryhmässä olivat huomattavasti korkeammat verrattuna ei-COPD ryhmä (

P

0,001).

patologiset muutokset keuhkojen verisuoniston.

morfologia keuhkojen verisuoniston sen ulkopuolelle COPD ja keuhkoahtaumataudin välillä oli erilainen. Keuhkoverisuonissa oli normaali ja siellä oli vähän tulehdussolujen tunkeutuminen ei-COPD ryhmä (kuvio 2A). Kuitenkin COPD ryhmässä, astian seinät olivat paljon paksumpi, etenkin sileän lihaksen kerros. Ontelo oli kaventunut seurauksena lisääntynyt paksuus verisuonen seinämän COPD ryhmässä (kuvio 2B).

fotomikrograafeja keuhkoverisuoniin ei-COPD (paneeli A) ja COPD-ryhmän (paneeli B) (suurennus: 100 x). Histologinen esittäminen keuhkoverisuonissa välillä COPD ryhmä ja ei-COPD ryhmä oli erilainen.

Keuhkojen verisuonten endoteelin apoptoosin

apoptoosin keuhkojen verisuonten endoteelisolujen ei-COPD ja COPD ryhmät analysoitiin TUNEL määrityksessä. Apoptoottiset positiiviset solut värjättiin keltainen ruskea Tunelin määrityksessä. Apoptoottisen indeksi keuhkojen verisuonten endoteelisolujen COPD ryhmässä oli paljon suurempi kuin ei-COPD ryhmä (

P

0,001) (kuvio 3 ja taulukko 2).

positiiviset solut värjättiin keltainen ruskea TUNEL määrityksessä. Mikrovalokuvia TUNEL värjättyä keuhkojen kudosta ei-COPD ryhmä (paneeli A) ja COPD-ryhmän (paneeli B) (suurennus: 400 x). Lukumäärä TUNEL positiivisia keuhkojen verisuonten endoteelisolujen COPD ryhmässä oli paljon suurempi kuin ei-COPD ryhmä.

ilmentyminen mtTFA mRNA ja proteiini keuhkokudoksessa ei-COPD ja COPD potilaat

Keuhkokudosta

mtTFA

mRNA detektoitiin RT-PCR: llä ja qRT-PCR: llä.

Analysoimme ilmentymisen

mtTFA

mRNA keuhkojen kudoksissa semikvantitatiivinen RT-PCR. Agaroosigeelielektroforeesi osoitti ilmentymistä

mtTFA

mRNA keuhkojen kudosta keuhkoahtaumatautipotilaat oli pienempi verrattuna että ei-COPD potilailla (kuvio 4A). Lisäksi ilmaus

mtTFA

mRNA keuhkokudoksen määritettiin myös qRT-PCR: llä. Suhteellinen määrä

mtTFA

mRNA ilmaisun COPD potilailla oli pienempi kuin ei-COPD potilasta (COPD ryhmä: 0,59 ± 0,07

vs.

Kuin COPD ryhmä: 0,78 ± 0,09,

P

0,001) (kuvio 4B).

Expression of keuhkojen

mtTFA

mRNA mitattiin RT-PCR: llä (paneeli A). Linja 1, 2 ja 3 olivat ei-COPD potilaiden ja linja 4, 5 ja 6 olivat COPD potilailla. Taso mtTFA mRNA keuhkojen kudokset COPD ryhmässä oli pienempi verrattuna ei-COPD ryhmä. Expression of keuhkojen

mtTFA

mRNA mitattuna qRT-PCR (paneeli B). Rasiakuvaajien näyttää erilaisia ​​ja jakelu datan ylemmän, alakvartiilit, ja mediaani suurin ero on

mtTFA

mRNA ei-COPD ryhmä ja COPD ryhmä. Mediaani Kunkin aineisto viittaa myös keskilinjan. Expression of mtTFA proteiini (paneeli C): Linja 1 ja 2 olivat ei-COPD potilaat ja linja 4 ja 5 olivat keuhkoahtaumatautipotilaat. Kvantitatiivinen analyysi Proteiinin tiheys on myös esitetty (paneeli D).

ilmentäminen mtTFA proteiinin keuhkokudoksessa ei-COPD ja COPD potilasta.

Seuraava mitattu ilmaus n mtTFA proteiinin keuhkokudoksessa Western blotilla. Suhteellinen mtTFA proteiinin ilmentymistä COPD ryhmässä oli alhaisempi kuin ei-COPD ryhmä (COPD: 0,32 ± 0,07

vs.

Kuin COPD: 0,55 ± 0,09,

P

0,001) (kuvio 4C 4D). Edelleen karakterisoimiseksi lokalisaation keuhkojen mtTFA proteiinin immunohistokemiallinen värjäys on keuhkojen kudosleikkeiden käyttäen spesifistä vasta-ainetta mtTFA suoritettiin. mtTFA proteiini pääasiassa lokalisoitu endoteelisolujen verisuonten, ja yhdenmukaisia ​​Western blot seurauksena, sen ilmentyminen oli pienempi COPD ryhmässä verrattuna ei-COPD ryhmä (kuva 5).

mtTFA proteiinin ilmentymistä ei-COPD ryhmä (paneeli A) ja COPD-ryhmän (paneeli B) (suurennus: 400 x). mtTFA proteiini oli keltainen ruskea DAB värjäystä. Verrattuna ei-COPD ryhmä, ilmaus mtTFA proteiini oli alhaisempi COPD ryhmässä.

metylaatiostatuksen

mtTFA

promoottori keuhkokudoksessa ei-COPD

vs

. Keuhkoahtaumatautipotilailla

lisäksi määrittää tilan

mtTFA

promoottori metylaation keuhkokudoksen ei-COPD ja COPD potilaan BSP ja DNA-sekvenssianalyysillä.

mtTFA

promoottori mety- keuhkojen kudoksia ei-COPD ja COPD potilasta on esitetty kuvassa 6A ja 6B. Prosenttiosuus

mtTFA

promoottori metylaatio (%) COPD potilailla oli suurempi kuin ei-COPD potilaat (COPD: 38,6 ± 14,7

vs.

Ei-COPD 27,8 ± 8,8;

P

0,05) (kuva 7).

malli mtTFA metylaation ei-COPD ryhmä (paneeli A) ja COPD-ryhmän (paneeli B).

Rasiakuvaajat näyttää ääripäitä, ylä- ja alakvartiilit, ja mediaani suurin ero ei-COPD ja COPD ryhmiä. Mediaani Kunkin aineisto osoittaa keskilinjalle,

P

arvo metyloinnin prosenttiosuus

mtTFA

promoottori oli 0,013 välillä ei-COPD ja COPD ryhmä.

korrelaatioanalyysiä

korrelaatio analyysi endoteelisolujen apoptoosin keuhkojen toimintaa ja tupakointi index.

endoteelisolujen apoptoottinen indeksi korreloivat negatiivisesti FEV

1 /FVC (

r

= -0,796,

P

0,001) ja FEV

1 /Pre (

r

= -0,827,

P

0,001) (Kuva 8A 8B) ja korreloi positiivisesti tupakointi indeksi (

r

= 0,703,

P

0,001) (kuvio 8C).

scatterplot korrelaation analyysi endoteelin solujen apoptoottista indeksiä ja FEV

1 /FVC (

r

= -0,796,

P

0,001) (paneeli A). Scatterplot korrelaation analyysi endoteelisolujen apoptoottisten indeksin ja FEV

1 /Pre (

r

= -0,827,

P

0,001) (paneeli B). Scatterplot korrelaation analyysi endoteelisolujen apoptoottisten indeksin ja tupakointi indeksi (

r

= 0,703,

P

0,001) (paneeli C).

Euroopan korrelaatio analyysi keuhkokudoksen mtTFA proteiinia ja FEV

1 /Pre, tupakointi indeksi, endoteelisolujen apoptoottiset indeksi.

Expression of mtTFA proteiinin keuhkokudoksen korreloi positiivisesti FEV

1 /Pre (

r

= 0,892,

P

0,001) (kuvio 9A), korreloi negatiivisesti verisuonen endoteelisolujen apoptoottista indeksiä (

r

= -0,749,

P

0,001) ja tupakointi indeksi (

r

= -0,763,

P

0,001) (kuvio 9B 9C).

scatterplot korrelaation analyysi keuhkojen kudosten mtTFA proteiinia ja FEV

1 /Pre (

r

= 0,892,

P

0,001) (paneeli A). Scatterplot korrelaation analyysi keuhkokudoksen mtTFA proteiinia ja endoteelin apoptoottista indeksiä (

r

= -0,749,

P

0,001) (paneeli B). Scatterplot korrelaation analyysi keuhkokudoksen mtTFA proteiinia ja tupakointi indeksi (

r

= -0,763,

P

0,001) (paneeli C).

keskustelu

tässä tutkimuksessa havaittiin, että verisuonten endoteelisolujen apoptoottista indeksiä COPD potilailla oli paljon suurempi verrattuna ei-keuhkoahtaumatautipotilailla ja se oli negatiivinen korrelaatio FEV

1 /Pre, mutta korreloivat positiivisesti tupakoinnin indeksi. Olemme osoittaneet, että 1) ilmentymistä mtTFA mRNA ja proteiini oli pienempi keuhkokudoksen COPD potilailla, joilla on levyepiteelikarsinooma keuhkosyöpä verrattuna squamous keuhkosyöpäpotilaita ilman COPD; 2) ilmentymistä mTFA korreloi positiivisesti verisuonten endoteelisolujen apoptoottisia indeksi; 3), mutta oli negatiivinen korrelaatio tupakointi indeksi. Huomasimme myös, että prosenttiosuus

mtTFA

promoottori metylaatio oli suurempi COPD ryhmässä verrattuna ei-COPD ryhmä.

COPD on johtava syy krooniseen sairastavuus ja kuolleisuus kaikkialla maailmassa, ja se on aiheutti huomattavaa taloudellista ja sosiaalista taakkaa [23]. Useat mekanismit patogeneesiin liittyvien sairauksien. Niitä ovat 1) tulehduksellinen infiltraatio; 2) epätasapainossa proteolyyttisten ja anti-proteolyyttisen aktiivisuuden; 3) oksidatiivisen stressin; ja 4) apoptoosin /leviämisen epätasapainosta [3]. Yksi seuraus seuraavat näitä prosesseja on solujen apoptoosin, monimutkainen ja hyvin säännelty prosessi, joka johtaa solukuolemaan. Läsnäolo korkeamman apoptoottisten tason ihmisen emphysematous keuhkojen on raportoitu [24], [25]. On ehdotettu, että epiteeli- ja endoteelisolujen kuolemaan johtuen vähentää solujen ylläpito tekijät saattavat olla vastuussa kehittämiseen keuhkolaajentuma. Tämän mukaisesti käsite, keuhkoahtaumatauti voidaan uudelleen tuotetaan indusoimalla keuhkojen endoteelin apoptoosin eläinmalleissa [26], [27]. Samanlaisia ​​Näiden havaintojen löysimme lisääntynyt määrä apoptoottisten keuhkojen endoteelisolujen COPD potilailla verrattuna ei-COPD potilailla. Apoptoottiset indeksi korreloi positiivisesti FEV

1 /Pre, FEV

1 /FVC ja tupakointi index [6], [28]. Nämä tulokset osoittavat, että keuhkojen endoteelin apoptoosin voi olla tärkeä rooli COPD: n patogeneesissä.

mtTFA on tärkeä tekijä säätelevä mitokondrioiden biogeneesin. Se aktivoi transkriptiota ja replikaatiota mtDNA [29]. Se on erittäin tärkeä rooli sääntelyn mitokondrion hengitystä, anti-oksidatiivisen stressin ja solujen apoptoosin. Aiempi tutkimus Remels et al [11] ehdotti, että mtTFA saattaa olla mukana COPD: n patogeneesissä. Huomasimme, että ilmaus mtTFA mRNA ja proteiini väheni keuhkojen kudoksissa COPD potilailla verrattuna ei-COPD potilailla. Ilmentyminen mtTFA korreloi positiivisesti FEV

1 /Pre ja FEV

1 /FVC, ja negatiivinen korrelaatio tupakoinnin indeksin ja verisuonten endoteelisolujen apoptoottisia indeksi. Yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen, tuloksemme osoittavat myös roolin mtTFA että apoptoosin keuhkojen endoteelisolujen ja COPD: n patogeneesissä. Kuitenkin taustalla olevien mekanismien vastuussa tästä tunnetaan huonosti. On kertynyt todisteita siitä, että epigenetiikka voi olla tärkeä rooli patogeneesissä joidenkin hengityselinten sairaudet, kuten astma ja COPD [13]. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että prosenttiosuus

mtTFA

promoottori metylaatio keuhkokudoksessa on okasolusyöpä keuhkosyöpä Keuhkoahtaumapotilailla on paljon suurempi verrattuna okasolusyöpä keuhkosyöpäpotilaita ilman COPD, mikä viittaa epigeneettiset asetus voi olla vastuussa ilmaus mtTFA.

COPD ja keuhkosyöpä ovat pääasiallisia syitä sairastuvuutta ja kuolleisuutta maailmanlaajuisesti. Niillä on yhteinen ympäristöriski tupakansavun altistumisen ja geneettinen taipumus. Riski keuhkosyövän COPD-potilaiden on ehdotettu yli 30 vuotta [30], ja vaikka tupakkaa pitoisuus pysyy tärkeänä sekoittavia muuttuja, riippumaton yhdistys todennäköisesti olemassa. Punturieri et ai [31] Ehdotetaan, että keuhkosyöpä ja COPD voi olla kaksi puolta saman kolikon. Koska DNA: n metylaatio, histonien deasetylointi, ja proteiinin fosforylaation patogeneesiin liittyvien keuhkosyövän [32] – [34], on ehdotettu, että epigeneettisiä modifikaatioita voidaan myös määrite COPD: n patogeneesissä, joko yksinään tai liittyy keuhkosyövän [ ,,,0],35], [36]. Demeo ym [14] totesi, että DNA metylaatiostatuksen erillisiä CpG loci liittyi sekä läsnäolo ja vakavuus COPD ja keuhkojen toimintaa, mikä viittaa siihen, että DNA: n metylaatio saattaa olla biomarkkereiden COPD ja voi ilmetä uusia polkuja keuhkoahtaumataudin synnyssä.

Poikkeava metylaation promoottorialueen onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille on tärkeä rooli patogeneesissä keuhkosyöpää ja metylaatiostatuksen liittyy läheisesti tupakoinnin [37], [38]. On monia karsinogeeneja tupakansavusta. Lisäksi tupakan savu on limakalvon ärsyttävä joka indusoi tulehdusta, jolloin sukupolven happea vapaita radikaaleja. Lisäksi tupakointi lisää aktiivisuutta DNA metyylitransferaasi [39], joka ohjaa

de novo

hypermetylaatiota alttiita loci [40]. Nämä suorat tai epäsuorat vuorovaikutukset voisivat olla mukana parannetun DNA-metylaation runsaasti tupakoivat. Kahdessa tuoreessa tutkimuksessa raportoitu molekyylitason muutoksia spontaani yskös syöpää vapaa runsaasti tupakoivat [41], [42]. Athough on erilaisia ​​mielipiteitä vaikutuksesta savusta DNA: n metylaatio [43] – [45].